喀斯特^G12D系列和Nkx2-1型单倍体不足诱导肺粘液腺癌

肿瘤杯状细胞不依赖SPDEF/FOXA3转录程序。

粘液化生是各种慢性肺部疾病的一个突出特征，包括哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）和囊性纤维化（CF）。这些非肿瘤性疾病中的粘液化生与转录因子Sam点域Ets-like因子（SPDEF）和FOXA3以及各种粘蛋白（包括MUC5AC）和粘蛋白相关基因（包括AGR2）的表达增加有关(15). 评估杯状细胞是否与喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/––诱导的肿瘤与非肿瘤杯状细胞具有相同的特征，我们比较了突变体的免疫组化结果喀斯特–由屋尘螨（HDM）过敏原接触诱发的粘液肿瘤和粘液化生（图​（图3）。三). 黏液相关蛋白，包括MUC5AC、MUC5B和AGR2，很容易在肺肿瘤的杯状细胞中检测到喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/–小鼠和HDM激发小鼠的气道中，但在喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/+老鼠。在过敏原诱导的小鼠模型中，NKX2-1和FOXA2抑制杯状细胞分化，而SPDEF是气道粘膜化生所必需的(4,15,16). 与它们在杯状细胞分化中的抑制作用一致，NKX2-1和FOXA2在喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/–鼠标（图​（图2A2A和图​图3）。三). 如前所述，HDM暴露后，SPDEF和FOXA3均在气道杯状细胞中高表达(15,17)，但在喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/––诱发肿瘤（图​（图3三和补充图4）。

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图3

肿瘤杯状细胞不依赖SPDEF/FOXA3转录程序。

控制部分，喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/+,喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/–对HDM激发的肺和正常肠进行粘蛋白MUC2、MUC5AC、MUC5B和AGR2以及转录因子NKX2-1、FOXA2、FOXA3和SPDEF染色。在HDM激发的肺部杯状细胞中发现的FOXA3和SPDEF在HDM的肿瘤杯状细胞上没有表达喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/–老鼠。比例尺：100μm。

NKX2-1抑制突变Kras诱导的体内肿瘤发生。

为了直接评估NKX2-1在肺肿瘤发生中的作用，NKX2-2在呼吸道上皮细胞中有条件地表达(4). 该条件系统已广泛用于模拟小鼠肺部肿瘤的发生(12,18,19). 为了评估增加的NKX2-1是否足以启动肿瘤形成，给药组Scgb1a1-rtTA；[tetO]–旗帜–Nkx2-1小鼠约6-12个月后，表达NKX2-1的小鼠均未发生肺肿瘤(n个= 19; 数据未显示）。Kendall等人报告称NKX2-1型,NKX2-8型、和PAX9位于14q13.3位点，约10%的肺腺癌中扩增；体外数据表明，NKX2-1与NKX2-8或PAX9的结合是体外病毒转化人支气管上皮细胞集落形成所必需的(5). 我们生成了同时表达NKX2-1和NKX2-8或NKX2-1-和PAX9的转基因小鼠。给药4个月后，NKX2-1与PAX9或NKX2-8的共表达没有导致肿瘤发生（补充图5）。

评估NKX2-1是否影响Scgb1a1-rtTA；[tetO]–旗帜–Nkx2-1转基因小鼠（均为转基因小鼠；FVB/N背景），我们用乌拉坦（一种肺癌致癌物）治疗小鼠。给药16周后，FVB/N对照小鼠的肺表面容易检测到氨基甲酸乙酯诱导的肿瘤(20). NKX2-1的表达减少了氨基甲酸乙酯诱导的肿瘤数量（表​（表11和图​图4，4，A和B），这表明NKX2-1增加抑制肿瘤的发生。NKX2-1诱导的转基因小鼠组中发现的少数肿瘤(Scgb1a1-rtTA；[tetO]–旗帜–Nkx2-1Dox）不表达FLAG–NKX2-1（数据未显示），它们可能来源于不表达Scgb1a1-rtTA转基因。由于氨基甲酸乙酯诱发与喀斯特突变(21)，我们评估NKX2-1是否抑制突变喀斯特–通过制造Nkx2-1；喀斯特^G12D系列三重转基因小鼠(Scgb1a1-rtTA；[tetO]–标志–Nkx2-1；[tetO]-克拉斯4b^G12D系列). NKX2-1的共表达减少了喀斯特^G12D系列-诱发的肺部肿瘤（图​（图4，4，C和D），这表明NKX2-1表达的增加抑制了突变体喀斯特-诱导体内肿瘤的发生和发展。

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图4

NKX2-1抑制氨基甲酸乙酯和喀斯特^G12D系列-体内诱导肺肿瘤形成。

给药1周后，每周腹腔注射一次氨基甲酸乙酯，连续4周。首次注射氨基甲酸乙酯16周后，采集肺部标本，并对肿瘤进行计数。(A类)肺切片Scgb1a1-rtTA；[tetO]–标志–Nkx2-1小鼠用抗FLAG抗体染色。(B类)NKX2-1抑制了氨基甲酸乙酯诱导的肺表面肿瘤的数量。(C类)肺部肿瘤（箭头所示）Scgb1a1-rtTA；[tetO]-克拉斯4b^G12D系列和Scgb1a1-rtTA；[tetO]-克拉斯4b^G12D系列;[tetO]–旗帜–Nkx2-1小鼠，H&E和microCT检测。(D类)数量和体积喀斯特^G12D系列-通过microCT测量，NKX2-1减少了诱发的肺部肿瘤。所有结果均为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，Mann-Whitney试验。比例尺：100μm(A类); 1毫米(C类)。

表1

暴露于氨基甲酸乙酯后肺部肿瘤的发展

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我们还利用hTERT和CDK4表达产生的HBEC3人支气管上皮细胞来评估NKX2-1是否影响肺上皮细胞的增殖(22). 我们用含有标志——Nkx2-1型(4). NKX2-1的表达显著抑制了HBEC3细胞的增殖（补充图6），这表明NKX2-2可能通过抑制细胞增殖而影响肿瘤发生，至少部分是这样。

在EGFR期间，Nkx2-1的单倍体不足不会诱发粘液腺癌^l858年肿瘤发生。

表皮生长因子受体突变与人类黏液腺癌无关(1). 当变种人喀斯特NKX2-1在体内抑制了–诱导的肺肿瘤发生（本研究和参考文献。10)，是否突变表皮生长因子受体–诱导的肺肿瘤发生在体内受到NKX2-1的影响尚不清楚。突变活性表皮生长因子受体^L858R型在野生型或Nkx2-1型^+/–杂交小鼠Scgb1a1-rtTA；[tetO]-表皮生长因子受体^L858R型老鼠(18)使用Nkx2-1型^+/——老鼠(13); 这些小鼠在本文中称为表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/+和表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/–分别是。出乎意料的是，肿瘤数量和体积在表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/–小鼠与表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/+室友（图​（图5A），5A） 这表明肿瘤发生是由突变体介导的表皮生长因子受体NKX2-1增强。与罕见的表皮生长因子受体人肺粘液腺癌的突变(1)，两者都不是表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/+也不是表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/–小鼠发生粘液腺癌（图​（图5B）。5B） ●●●●。肺部肿瘤表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/–对小鼠进行MUC5B染色，但不进行阿尔西安蓝或MUC5AC染色。这些结果表明（a）NKX2-1在激活突变的情况下增强肿瘤发生表皮生长因子受体和（b）突变体表皮生长因子受体未诱导肿瘤杯状细胞Nkx2-1型^+/–老鼠。与这些鼠标数据一致KRAS公司突变相关的人腺癌细胞系表达高水平的MUC5AC公司mRNA，而所有细胞系表皮生长因子受体突变很少或没有表达MUC5AC公司mRNA（图​（图5C）。5C） ●●●●。的KRAS公司突变细胞系NKX2-1型表达了更高水平的MUC5AC公司和MUC5B公司mRNA比那些阳性的NKX2-1型（图​（图5C），5C） 这表明NKX2-1抑制突变株中黏蛋白基因的表达KRAS公司–相关肿瘤。

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图5

表皮生长因子受体^L858R型无论何种情况，小鼠都没有发展成肺粘液腺癌Nkx2-1型表达式。

(A类)显微CT测量的肺部肿瘤数量和体积在表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/–(n个=19）与表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/+(n个=13）小鼠给药4个月后。n个=16（控制）。(B类)肺切片用Alcian蓝、MUC5AC和MUC5B染色。在表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/–或表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/+老鼠。肺肿瘤细胞表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/+和表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/–小鼠没有用阿尔西安蓝或MUC5AC染色，而表皮生长因子受体^L858R型;Nkx2-1型^+/–用MUC5B染色的小鼠。(C类)MUC5AC公司mRNA在NKX2-1型–消极KRAS公司突变型肺癌细胞系（H2122和A549），但在表皮生长因子受体突变型肺癌细胞系。MUC5B公司mRNA在两种组织中均表达KRAS公司突变体（H2122和A549）和表皮生长因子受体突变（H3255）细胞系。所示为与H3255细胞mRNA表达相比的折叠诱导。结果为平均值±SEM(A类)每组三份的平均值±标准差(C类). N.D.，未检测到*P（P）< 0.05. 比例尺：100μm。

NKX2-1抑制粘液肿瘤中诱导的一组基因的表达。

为了确定肺粘液腺癌发病机制，使用喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/–小鼠肺部。一些mRNA在喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/–肺与HDM哮喘模型诱导的肺重叠（HDM激发小鼠；参考文献。23)，包括ADAM8公司,AGR2公司,ALOX15型,CHI3L4号机组,IGF1级,MUC5AC公司,MUC5B公司,RETNLA公司、和SAA3型（图​（图6，6以蓝色和绿色突出显示，以及补充表2），这支持了这样一个概念，即杯状细胞分化的某些方面在这些肺部疾病中是相同的。为了确定NKX2-1在黏液性肿瘤模型中调节的基因，对A549人肺癌细胞进行了mRNA分析，A549人肺肿瘤细胞携带一个NKX2-1mRNAKRAS公司突变和缺失NKX2-1型表达式（图​（图5C）。5C） ●●●●。使用慢病毒载体在A549细胞中表达NKX2-1（补充表3和参考文献。4). 确定了一组NKX2-1抑制基因在粘液肿瘤模型的肺部诱导，但在哮喘模型中未诱导（图​（图6，6，以红色突出显示）。这些基因可能是肿瘤标志物或作为肿瘤促进剂发挥作用。AGR2公司,LCN2型,MUC5AC公司,MUC5B公司、和RBP4模式也是NKX2-1抑制基因；然而，它们在粘液性肿瘤和HDM诱导的小鼠模型的肺中都有表达（图​（图6，6，以绿色突出显示）。

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图6

NKX2-1抑制粘液肿瘤模型和哮喘模型中诱导的基因子集。

所示为3组mRNA微阵列分析的结果（为简单起见，仅显示人类基因的符号）。为了分析粘液肿瘤诱导的基因，从对照组和喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/–小鼠和mRNA微阵列分析(n个=每组3人）。为了分析A549人肺癌细胞中NKX2-1调控的基因，从慢病毒中分离了mRNANkx2-1型–表达和控制A549细胞并进行mRNA微阵列分析(n个=每组3人）。为了分析哮喘诱导的基因，从对照组和HDM激发小鼠的肺部分离出mRNA，并进行mRNA微阵列分析(n个=每组3人）(23). 几种与粘液基因相关的mRNA-AGR2公司,MUC5AC公司、和MUC5B公司-在黏液性肿瘤和哮喘小鼠模型中均诱导，并在A549人肺癌细胞中被NKX2-1抑制。HNF4A型NKX2-1是一种非肺谱系转录因子，被肺谱系的转录因子NKX2抑制。SOX2标准在传导气道中表达，但在肺泡区不表达，也被NKX2-1抑制，并且在传导气道和肺泡中表达。

NKX2-1抑制与肺肿瘤发生相关的基因表达，并诱导那些参与细胞死亡的基因表达。

NKX2-1调控的基因在A549人肺癌细胞中的表达谱如图所示​图6，6，图​图7A，7A、 和补充表3。NKX2-1诱导表达SFTPA公司,SFTPB公司,灯3,CEACAM6号机组、和马来西亚比索(三,11,24). 的表达式MUC5AC公司,MUC5B公司、和SERPINE1系列(4,25)被NKX2-1抑制。基因本体分析表明，基因表达与蛋白激酶级联和酶联受体蛋白信号通路减少，并且与程序性细胞死亡增加了NKX2-1（补充图7）。NKX2-1被抑制FGFR1号机组,FGFR4公司,IGF1R型,CCND3号机组,CCNE2公司、和川东北6与癌症相关(26——31)，但诱导诱导程序性细胞死亡的基因表达，如船边交货和TIMP3公司(32,33). 尽管NKX2-1抑制了与肿瘤发生相关的基因，并诱导了与细胞凋亡相关的基因，但它并没有改变A549癌细胞的生存能力（数据未显示）。由于NKX2-1在人肺肿瘤中的表达与较好的预后相关(34)，我们评估了NKX2-1是否影响化疗诱导的A549细胞死亡。顺铂是一种化疗药物，临床上用于治疗突变型KRAS公司–相关肺癌(35). NKX2-1使A549细胞对顺铂诱导的凋亡敏感，这一发现通过检测凋亡标记物裂解PARP得到证实（图​（图7，7，B–D）。

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图7

NKX2-1抑制与肿瘤发生相关的信使核糖核酸，并诱导与细胞凋亡相关的信使核糖核酸。

(A类)从慢病毒中分离出mRNANkx2-1型表达和控制A549细胞，并进行mRNA微阵列分析。图中显示了mRNA的热图。绿色和红色分别表示NKX2-1的mRNA减少和增加。与粘液相关的mRNA(MUC5AC公司,MUC5B公司,MUC13公司、和AGR2公司)和致癌基因(FGFR1号机组和川东北6)被NKX2-1抑制。NKX2-1诱导的表面活性蛋白基因(SFTPA1公司和SFTPB公司)和凋亡基因(船边交货和TIMP3公司). (B类)慢病毒Nkx2-1型用顺铂（最终浓度，0–20μM）处理表达和对照A549细胞。治疗72小时后，使用MTS分析测定细胞活力(n个=每组3人）。顺铂治疗减少Nkx2-1型表达A549癌细胞活性显著高于对照A549细胞。(C类)控制和Nkx2-1型–20μM顺铂24小时后表达A549细胞（原始放大倍数，×20）。(D类)NKX2-1使A549细胞对顺铂诱导的凋亡敏感。顺铂治疗24小时后（20μM），从对照组或Nkx2-1型–表达A549细胞。IB.结果为平均值±标准差*P（P）<0.001与对照组。

ChIP-seq分析确定了A549肺癌细胞中的NKX2-1结合位点。

使用ChIP-seq分析从表达NKX2-1的A549细胞的染色质中确定NKX2-1~的潜在直接转录靶点。从大规模平行测序中获得的序列读取被映射到人类基因组上。ChIP-seq分析通过检测SFTPA1公司NKX2-1的已知下游目标(36,37). NKX2-1与SFTPA1公司基因（图​（图8A）。8A） ●●●●。NKX2-1抑制MUC5AC公司（图​（图66和图​图7A）7A） 与MUC5AC公司（图​（图8B），8B） ，暗示其作为转录抑制因子的活性。NKX2-1也与FGFR1号机组（图​（图8C），8C） ，已知致癌基因(26)、和已禁用FGFR1号机组A549细胞中的mRNA（图​（图77A） ●●●●。

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图8

通过ChIP-seq鉴定NKX2-1结合位点。

(A类)与基因启动子和第一内含子相关的NKX2-1SFTPA1公司在含有典型NKX2-1结合基序的位点（CAAG和CTTG）。(B类)NKX2-1与MUC5AC公司包含AP-1结合基序（TGACTCA）。(C类)NKX2-1与FGFR1号机组. (D类)NKX2-1上调或下调基因中NKX2-1-结合位点峰值的分布。(E类)NKX2-1 ChIP-seq峰中存在基序。(F类)按照方法所述转染H441肺腺癌细胞。结果显示，相对于对照组，轻单位的折叠激活归一化为β-半乳糖苷酶活性。NKX2-1抑制H441细胞AP-1活性(n个=每组3人）。(G公司)慢病毒Nkx2-1型–表达和对照A549细胞用AP-1诱导剂PMA处理，最终浓度为10 ng/ml。FGFR1号机组如方法中所述测量mRNA。PMA拯救了NKX2-1对FGFR1号机组mRNA表达。(H（H）)A549细胞稳定表达Nkx2-1型,FOSL1公司或两者都是使用慢病毒载体开发的。IB证实了NKX2-1和FOSL1的蛋白表达。根据使用稳定感染细胞和A549对照细胞进行的软琼脂试验（见方法），NKX2-1FOSL1诱导的集落形成受到抑制。n个=每组3个。结果为每组生物三倍体的平均值±SD*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.

NKX2-1结合元件存在于基因间、内含子、5′非翻译（5′UTR）和上游区域（补充图8）。本研究中观察到的NKX2-1结合位点的广泛分布与其他ChIP-seq分析一致，这些分析确定了基因组中的STAT1、GATA1和MYOD结合元件。已提出转录因子广泛结合在染色质环、染色质组织和核结构中的潜在调节作用；然而，它们的确切生物学作用尚不清楚(38). 为了评估NKX2-1与染色质直接关联的功能重要性，我们分析了那些由NKX2-2上调或下调的基因中10 kb内发生的ChIP-seq位置（图​（图6，6，图​图7A，7A、 和补充表3）。获得了每个基因亚区内的位置分布（图​（图8D）。8D） ●●●●。第一个内含子被视为一个单独的区域，因为它被认为参与人类基因组中的转录控制(39). 在NKX2-1上调基因中，46%的NKX2-2峰位于第二外显子上游，包括上游10kb、5′UTR和第一内含子。大约38%的峰位于其他内含子。相比之下，在NKX2-1下调基因中，39%的NKX21峰位于第二外显子上游，而43%的峰位于其他内含子（图​（图8D），8D） ，表明存在与第二外显子下游区域更密切相关的潜在抑制性NKX2-1调控位点。上调和下调基因与3′近端区域（包括3′UTR和下游10kb）的结合相似（14%对15%）。在第一外显子中未检测到NKX2-1结合位点。

肺肿瘤杯状细胞化生/增生的潜在机制。

调节气道杯状细胞分化的分子机制正在积极研究中。NKX2-1和FOXA2在非致瘤气道杯状细胞中下调(15,45)NKX2-1或FOXA2的转基因表达抑制了变应原诱导的气道杯状细胞化生(4,16). 在本研究中，NKX2-1和FOXA2在肿瘤杯状细胞中均被抑制喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/–小鼠，持续（或慢性）减少Nkx2-1型实现了。这一发现与它们在杯状细胞中的损失一致，杯状细胞与慢性肺病有关(4,45). 相反，SPDEF和FOXA3通常在肺部非肿瘤相关粘液化生过程中诱导(15,17)，在肿瘤杯状细胞中不表达喀斯特^G12D系列;Nkx2-1型^+/–这表明肿瘤杯状细胞中粘蛋白的产生并不依赖于SPDEF/FOXA3转录程序。同样，该转录程序与特发性肺纤维化杯状细胞化生无关(46)。

NKX2-1以上下文依赖的方式抑制突变KRAS肿瘤发生。

在10%的人肺腺癌中扩增的14q13.3染色体区域(5——7)包含MBIP公司,恒星。1,SFTA3公司,NKX2-1型,NKX2-1-AS1型,NKX2-8型、和PAX9（Ensembl基因组浏览器；http://useast.ensembl.org/index.html). 这种放大在肺肿瘤发生中的作用一直备受关注。体外功能丧失和功能获得研究NKX2-1型作为潜在致癌基因(5——9). 最近使用肺癌小鼠模型的研究不支持NKX2-1型作为组织特异性癌基因，但与NKX2-1作为抗转移因子有关(10,11). 此外Nkx2-1型体内诱导细胞增殖和促进致癌物诱导的甲状腺腺瘤(47). 在本研究中，NKX2-1抑制喀斯特肿瘤发生，但促进表皮生长因子受体肿瘤发生，在转基因小鼠模型中。在喀斯特^LSL–G12D/+;第53页^–/–NKX2-1小鼠具有抗转移因子的功能(10); 然而，在目前的研究中Nkx2-1型都没有引起喀斯特^G12D系列或表皮生长因子受体^L858R型小鼠体内模型（数据未显示）。喀斯特突变与第53页,第16页^INK4a公司，或磅1缺失导致小鼠肺肿瘤转移(48). 由于NKX2-1型14q13.3位点与预后不良相关，而NKX2-1蛋白水平与预后良好相关(49)，我们评估了位于14q13.3位点的其他基因是否有助于小鼠模型中的肺肿瘤发生。用NKX2.8或PAX9表达NKX2-1不会在转基因小鼠体内诱导肺肿瘤（补充图5）。这些结果与之前的报告一致Nkx2-8型1岁时，null小鼠出现气道发育不良(50)NKX2-8的表达抑制了一些肺癌细胞的体外生长(51)。

转基因小鼠与畜牧业。

Nkx2-1型^{+/——————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————}小鼠由S.Kimura（NIH，Bethesda，Maryland，USA；参考。13). 转基因小鼠[tetO]-表皮生长因子受体^L858R型(18)从国家癌症研究所小鼠库获得。转基因小鼠Scgb1a1-rtTA,[tetO]-克拉斯4b^G12D系列、和[tetO]–旗帜–Nkx2-1以前生成过(4,12). 转基因小鼠[tetO]–NKX2-8（人类）和[tetO]-PAX9（人类）是在辛辛那提儿童医院医疗中心的转基因和基因靶向核心产生的。从4-5周龄开始，向转基因小鼠提供含有Dox（625 mg/kg chow）的食物。用于氨基甲酸乙酯诱导的肿瘤发生、控制和Nkx2-1型在给予Dox后，每周向转基因小鼠腹腔注射1 mg/g体重的氨基甲酸乙酯，连续4周。首次注射氨基甲酸乙酯16周后，采集肺部，并用解剖显微镜对肿瘤进行计数(20). 参见动物维护的补充方法。

显微CT成像、肿瘤计数和体积测量。

见补充方法。

组织制备、免疫组织化学和免疫荧光显微镜。

如前所述，使用5μm石蜡包埋的肺切片进行染色（H&E、阿尔西安蓝和免疫组织化学）(15). 有关抗体信息，请参见补充方法。

细胞系。

见补充方法。

mRNA微阵列和表达分析。

如前所述进行RNA分离和微阵列分析(4). 使用随机变量确定不同表达的基因t吨测试(54). 如果P（P）值小于0.01，假发现率小于5%，折叠变化大于2.0。微阵列结果保存在GEO（登录号。{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE40508”，“term_id”：“40508“}}GSE40508标准和{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE40584”，“term_id”：“40584“}}GSE40584标准). 参见基因本体分析和定量RT-PCR的补充方法。

免疫印迹分析。

见补充方法。

瞬时转染分析。

见补充方法。

用顺铂或PMA治疗A549细胞。

见补充方法。

ChIP-seq分析。

根据制造商的方案（目录号9003；细胞信号技术），使用兔抗NKX2-1抗体（目录号WRAB-1231；Seven Hills生物试剂）和来自NKX2-1-表达A549肺癌细胞的染色质进行ChIP。ChIP富集DNA（10 ng）或输入DNA用于高通量DNA测序。根据Illumina的文库制备协议，这些样本是钝头的、A尾的，并用适配器连接。对长度约为250 bp的DNA片段进行大小选择和扩增。加州大学河滨分校使用Solexa/Illumina基因组分析仪II对富含ChIP的DNA样本和输入的DNA样本同时进行条形码和50个周期的测序。序列读取（6 bp连接器加上45 bp DNA）基于6 bp条形码进行解复用，并在对齐之前删除条形码。使用Bowtie将序列读数与人类参考（组件hg19）对齐(55). 生成ChIP-seq读取密度文件，并在综合基因组查看器（IGV；参考。56). 为了确定NKX2-1与基因组的结合位置，检测到富集峰，然后使用CisGenome软件将其映射到最近的注释基因(57). 关于基序频率分析，请参见补充方法。共识主题（图​（图8E8E和补充图9C）使用CisGenome提供的Gibbs Motif采样器使用默认参数进行计算。

软琼脂集落形成试验。

见补充方法。

统计。

使用Student’st吨测试（双尾和非配对）或Mann-Whitney测试。当P（P）所有小鼠试验和体外试验的值均小于0.05。

本研究由美国国家卫生研究院资助J.A.Whitsett（HL110964、HL095580和HL108907）和Y.Xu（HL105433）；由日本教育、科学和文化部向T.Tsuchiya、T.Fukazawa、Y.Naomoto和T.Nagayasu发送；辛辛那提大学博士后研究员研究项目授予Y.Maeda。作者感谢I.Fink-Baldauf、R.Pratt、I-C.Wang、G.Chen、S.Smith、L.Zhang、S.Wert、S.Kimura和J.Minna提供的材料和技术援助，感谢K.Wikenheiser-Brokamp、H.Miyoshi、T.Suzuki、M.Durbin和F.Sladek的讨论。