Oncol Lett公司。2012年10月；4(4): 783–791.
MACC1：一种与胰腺癌转移和化疗耐药相关的潜在分子
浙江大学医学院附属第二医院外科，浙江大学肿瘤研究所，浙江杭州310009，中华人民共和国
*平均出资
2012年2月14日收到；2012年5月11日接受。
摘要
有研究表明，新发现的与结肠癌-1（MACC1）相关的转移癌基因参与了癌症的进展和转移。一些研究表明，MACC1有潜力成为一种新的生物标记物。本研究旨在研究胰腺癌患者MACC1的功能和血清表达水平。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对60例癌症患者和49例对照者的血清样本进行血清MACC1检测。结果表明，MACC1的高表达与淋巴结转移、远处转移和晚期TNM分期有关。siRNA对MACC1的抑制显著抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移。此外，还发现MACC1的下调通过抑制Ras/ERK信号通路使胰腺癌细胞对吉西他滨治疗敏感。我们的研究结果表明，MACC1可能有助于胰腺癌的诊断，并作为潜在的治疗靶点。
关键词：结肠癌转移相关-1、转移、上皮-间质转化、化疗耐药
介绍
胰腺癌是世界上最具侵袭性的恶性肿瘤之一。它被列为美国第四大癌症死亡原因和中国第六大癌症死亡率原因(1). 2011年全球癌症死亡率分析显示，全世界每年约有138100名男性和127900名女性死亡(2). 由于其高度的局部侵袭倾向、远处转移以及诊断时缺乏早期检测方法，超过三分之二的病例表现为晚期或无法切除。因此，胰腺癌患者的五年生存率仍低于5%(三). 胰腺癌的发病机制是一个复杂的、多阶段的、多基因的过程，其确切机制尚不完全清楚。吉西他滨是一种细胞毒性核苷类似物，是目前晚期胰腺癌的治疗策略，但它对患者的生存没有显著优势(4). 因此，迫切需要确定新的致癌基因和临床应用的分子靶点来诊断和治疗这种疾病(5).
通过分析结肠癌的正常组织、原发肿瘤和转移病灶，对差异表达的基因进行全基因组搜索，确定与结肠癌1（MACC1）基因相关的转移(6). 已发现MACC1在细胞培养中以及在结肠癌患者中可诱导肿瘤增殖、侵袭和转移。此外，MACC1的表达在腺瘤向癌转变的关键阶段上调。此外，在远处转移中，MACC1主要从细胞质转移到细胞核中。值得注意的是，肝细胞生长因子（HGF）治疗也可能导致MACC1核移位，随后，MACC1与受体酪氨酸激酶Met的启动子结合并激活其转录。由此产生的Met上调增强了HGF/Met途径，MACC1起着关键调节器的作用(7). MACC1可能是MAPK信号通路的靶基因(6). 据报道，MACC1在各种癌症组织中升高，包括结肠癌(6,8)，肝癌(9)和肺腺癌(10,11)胃癌中也观察到其基因表达上调(12). 然而，直到最近，还没有研究表明血清MACC1可以作为癌症的生物标记物，并且对其在胰腺癌发展和耐药性中的作用知之甚少。
在本研究中，我们重点评估了血清MACC1对胰腺癌诊断的临床意义。除此之外，我们还研究了MACC1抑制对胰腺癌增殖、转移和吉西他滨敏感性的影响。我们还探讨了可能参与MACC1诱导吉西他滨耐药的潜在机制。
患者和方法
患者和血清
共分析了109份血清样本。该研究包括2010年1月至2011年12月期间在中国浙江大学第二附属医院外科住院的60名胰腺癌患者和49名健康对照。在手术前一天或新辅助化疗开始前一天获取血清样本，并在−80°C下保存，直至分析。患者的临床特征，包括性别、年龄和TNM分期总结如下根据国际癌症控制联盟（UICC）2002年胰腺癌TNM分期确定肿瘤的临床分期(13). 本研究得到了我院伦理委员会的批准，并在手术或采集血样之前获得了每位患者的知情同意。
表一。
血清MACC1表达水平与胰腺癌临床病理参数的相关性。
| | MACC1表达
| | |
|---|
| 临床病理参数 | 案件数量 | 低 | % | 高 | % | χ2 | P值 |
|---|
| 性别 | | | | | | 0.141 | 0.707 |
| 女性 | 20 | 13 | 65 | 7 | 35 | | |
| 男性 | 40 | 24 | 60 | 16 | 40 | | |
| 年龄（岁） | | | | | | 0.984 | 0.321 |
| ≤60 | 23 | 16 | 69.6 | 7 | 30.4 | | |
| >60 | 37 | 21 | 56.8 | 16 | 43.2 | | |
| 侵入深度 | | | | | | 0.242 | 0.623 |
| T1+T2 | 11 | 8 | 72.7 | 三 | 27.3 | | |
| T3+T4 | 49 | 29 | 59.2 | 20 | 40.8 | | |
| 淋巴结转移 | | | | | | 4.467 | 0.035 |
| 不 | 14 | 12 | 85.7 | 2 | 14.3 | | |
| 是的 | 46 | 25 | 54.3 | 21 | 45.7 | | |
| 远处转移 | | | | | | 7.944 | 0.005 |
| 不 | 24 | 20 | 83.3 | 4 | 16.7 | | |
| 是的 | 36 | 17 | 47.2 | 19 | 52.8 | | |
| TNM阶段 | | | | | | 5.107 | 0.024 |
| I+II级 | 18 | 15 | 83.3 | 三 | 16.7 | | |
| III+IV级 | 42 | 22 | 52.4 | 20 | 47.6 | | |
血清样本中MACC1的测定
根据制造商的说明，采用ELISA（中国武汉Uscn Life Science Inc.）检测MACC1的血清水平，所有检测均重复进行。A 100型μl将标准品（由制造商提供）、样品和空白品的每种稀释液的测量值添加到涂有MACC1抗体的96孔板中，并在37°C下孵育2小时。对每口井进行抽吸，然后使用清洗缓冲液（由制造商提供）进行清洗。在此之后，100μ向每个孔中添加1升检测试剂A，并在37°C下培养平板1小时。一旦去除任何未结合抗体，100μ向每个孔中添加1升检测试剂B，并在37°C下培养板30分钟。清洗过程结束后，90μ向微孔中添加1升基质溶液，并在37°C的黑暗环境中培养平板20分钟。然后用50终止反应μ我停止解决方案。使用微孔板阅读器在450 nm处立即测定每个孔的光密度。使用由双参数logistic曲线拟合分析生成的标准曲线来确定样品的MACC1浓度。
细胞培养和试剂
人胰腺癌细胞系（CFPAC-1、AsPC-1、PANC-1、MIA-PaCa-2和BxPC-3）和人结肠癌细胞系（SW480和SW620）购自美国型培养物收藏中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）。CFPAC-1细胞保存在Iscove's Modified Dulbecco’s Medium（IMDM）中，PANC-1和MIA PaCa-2细胞保存在Dulbecco's Modifeed Eagle's Medium中，AsPC-1、BxPC-3、SW480和SW620细胞保存在RPMI-1640培养基中。所有培养基均添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素。细胞在含有5%CO的增湿培养箱中单层培养2在37°C的空气中。吉西他滨购自Eli Lilly（Bad Homburg，Germany），溶于0.9%无菌氯化钠中，得到储备溶液。
siRNA转染
从上海基因制药有限公司（中国上海）获得了三个靶向人类MACC1的siRNA序列和一个阴性对照siRNA。MACC1和对照siRNA的序列分别为：MACC1 siRNA1正、5′-CAGGCUAUUGCAGAA GAATT-3′和反义、5′-UUCUUCUGCAAAUAGCCU GTT-3′；MACC1 siRNA2正、5′-GAGCAAGUAAU GUUAUGUTT-3和反义、5′-ACAUAAACAUU ACUGCUTT-3′；MACC1 siRNA3正、5′-GCAGUGC UAAGACAAGATT-3′和反义、5′-UGCUUGUC UUAGCACUGCTT-3′；阴性对照siRNA，5′-UUC UCCGAACGUCACGUTT-3′和反义，5′-ACGUGA CACGGGAGAATT-3′。细胞以2x10的密度接种在6孔细胞培养板中5细胞/孔，并在转染前一天培养至40%汇合。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）进行siRNA转染。通过western blot分析和流式细胞术分析转染对MACC1还原的影响。
RNA制备和定量实时PCR（qRT-PCR）
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从细胞培养物中分离出总RNA。用分光光度法测定RNA浓度。互补DNA由5μg总RNA，使用M-MLV逆转录酶（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。使用Light Cycler实时PCR系统（德国曼海姆罗氏），通过qRT-PCR测定了MACC1 mRNA相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达3次。MACC1和GAPDH的引物如下：MACC1正向，5′-TCTGTGAACTTATTGGCTC-3′和反向，5′-CATGGCAGGTTTCCACATC-3′；GAPDH正向，5′-TGCACACACATGCTTAG-3′和反向，5′-GAGGCAGGATGTTC-3′。
细胞增殖试验
使用3-（4,5-二甲基-噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）分析测定细胞活力（西格玛，密苏里州圣路易斯，美国）。将细胞以3000个细胞/孔的速度放置在96 well板中。在此之后，20μ将1 l MTT溶液（5 mg/ml）添加到每个孔中，并将平板在37°C下培养4 h。然后丢弃培养基，并将紫色的MTT甲醛沉淀物溶解在150中μl二甲基亚砜。将平板在旋转摇床上混合10分钟，并使用ELISA阅读器（ELx800；Bio-Tek Instruments，Inc.，Winooski，VT，USA）测量570 nm处的吸光度。
迁移分析
使用8.0的transwell过滤器在24孔板中进行迁移分析μm孔径和6.5 mm直径（美国纽约州康宁市康宁公司）。转染后第二天，对CFPAC-1细胞进行胰蛋白酶处理，并以1x10的密度接种5细胞/孔。上室有300个μ1个IMDM（0.5%FBS）和下室包含600个μIMDM的l（10%FBS）。培养48小时后，用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，用曙红染色10分钟。用湿棉签去除膜上侧的非迁移细胞。在放大倍数为x200的显微镜下，在至少5个视野中对膜下侧的染色细胞进行计数。
蛋白质印迹分析
收集培养的细胞，并将其置于低温RIPA裂解缓冲液（中国江苏省贝尤蒂姆生物技术研究所）中进行裂解，该缓冲液补充有一种完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏），该混合物由50 mmol/l NaF和1 mmol/l Na组成三VO（旁白）4。上清液通过在4°C下12000 x g离心20分钟进行分离，并使用BCA蛋白质检测试剂盒（美国Thermo公司）测定蛋白质浓度。在此之后，通过8–12%SDS-PAGE电泳将40 mg蛋白质分解，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。在室温下，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭转基因膜2小时，然后用适当的抗体孵育。本研究中使用的抗体如下：MACC1（Abcam，Cambridge，MA，USA）、Bcl-2、caspase-3、caspase9、E-cadherin、vimentin、β-actin（Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA）、PARP-1、Gab2、p-ERK1/2、ERK1/2（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）和Ras（Epitomics，Inc.，Burlingame，CA，USA。）。二级抗体购自中国北京中山金桥生物科技有限公司。使用增强化学发光（ECL）试剂盒（Beyotime）观察带状物，并将其暴露在X射线胶片上。
细胞凋亡的流式细胞术分析
CFPAC-1细胞（2x105)将其接种在6孔板中24 h，并转染siRNA。转染后，分别用0.5和0.5处理CFPAC-1细胞μ收集CFPAC-1细胞，用含有0.1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，并在500分钟内重新悬浮μl绑定缓冲液。然后，用5μl annexin V-FITC和10μl PI溶液在室温、黑暗环境中放置15分钟。随后，使用流式细胞仪（FACSCalibur；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）对样品进行凋亡评估。
统计分析
每项实验一式三份。数据显示为平均值±标准偏差（SD）。所有统计测试均使用社会科学统计程序（SPSS）软件18.0（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行。使用χ分析MACC1表达与临床病理特征之间的相关性2测试。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
胰腺癌患者血清MACC1水平与临床病理特征的相关性
对60例经病理证实的胰腺癌患者和49名健康对照者的血清样本进行了分析。患者的人口统计学特征总结如下我们使用商业ELISA试剂盒测量血清MACC1水平。为了确保免疫测定法适用于检测临床血清样本，对线性进行了检查，以证明与系列稀释液具有良好的线性。该试剂盒测得的人类MACC1的最小可检测剂量通常小于0.312 ng/ml。健康受试者中的MACC1水平过低，无法使用该ELISA试剂盒精确测量。在我们的研究中，当MACC1水平<0.312 ng/ml时，被视为阴性，当>0.312 ng/ml时，被认为是阳性。为了确定血清MACC1水平与临床特征之间的关系，将患者分为低水平（<4 ng/ml）和高水平（≥4 ng/ml）组。我们根据“最小P值法”确定了截止水平(14). 胰腺癌患者中MACC1阳性表达率为63.3%（38/60），健康受试者中为4.1%（2/49）(). 胰腺癌患者与健康受试者之间MACC1表达水平存在显著差异（χ2=40.763; P<0.001）。显示了血清MACC1水平与胰腺癌患者临床病理特征之间的相关性。在这些患者中，根据性别（P=0.707）、年龄（P=0.321）和浸润深度（P=0.623），血清MACC1水平无显著差异。然而，血清MACC1高水平表达与淋巴结转移（P=0.035）、远处转移（P=0.005）和晚期TNM分期（P=0.024）呈正相关。这些数据表明，血清MACC1可能是胰腺癌的一种新的诊断标志物。
用ELISA方法评估胰腺癌患者和健康受试者血清MACC1的频率。确定了最佳截止值，MACC1水平<0.312 ng/ml为阴性，>0.312 ng/ml为阳性。MACC1，结肠癌相关转移-1。
胰腺癌细胞系中MACC1的表达
先前的研究表明，尽管SW60细胞来源于SW480细胞系来源的同一肿瘤的转移，但MACC1在SW620细胞中过度表达，在SW480中几乎没有表达(6). 因此，我们检测了5种人胰腺癌细胞系中MACC1的表达。MACC1蛋白在来源于导管腺癌转移灶的CFPAC-1细胞中高表达，而在BxPC-3细胞中低表达。其余3个胰腺癌细胞株几乎没有MACC1表达(). 以人结肠癌细胞株SW480为阴性对照，SW620细胞株为阳性对照。我们还使用qRT-PCR检测了mRNA水平的表达。qRT-PCR扩增结果表明，在AsPC-1、PANC-1和MIA-PaCa-2细胞系中未检测到MACC1 mRNA。MACC1在BxPC-3细胞中的mRNA表达较低，而在高转移胰腺癌细胞系CFPAC-1中高表达，仅次于SW620细胞系(). 与非转移细胞系相比，转移细胞系呈现高水平的MACC1，表明MACC1与转移高度相关。因此，选择CFPAC-1细胞系进行后续实验。
MACC1蛋白在结肠癌和胰腺癌细胞系中的表达。（A） 结肠癌和胰腺癌细胞系中MACC1表达的Western blot分析。β-actin作为负荷控制。（B） 肿瘤细胞系中MACC1表达的实时定量PCR分析。MACC1在CFPAC-1细胞中的表达与来源于转移性结肠癌的SW620细胞中的表达相似。MACC1，结肠癌相关转移-1；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
siRNA对CFPAC-1细胞MACC1的抑制作用
本研究的重点是研究MACC1在胰腺癌细胞中的潜在功能。使用400 pmol的MACC1-siRNA进行MACC1沉默实验，72 h后通过qRT-PCR和western blot分析确认转染效果。我们的数据表明，与正常对照细胞和模拟转染细胞相比，MACC1在3个siRNA-转染细胞中的表达降低，特别是在MACC1-siRNA2转染细胞(). 结果与qRT-PCR实验数据一致()其中MACC1-siRNA2的抑制率最高。在最初的siRNA转染后4天，MACC1也出现下调。在接下来的实验中，使用MACC1-siRNA2下调CFPAC-1细胞中MACC1的表达。
RNA干扰抑制了CFPAC-1细胞中MACC1的表达。（A） 将指示的siRNA转染CFPAC-1细胞72 h，然后收集用于western blot分析。β-actin作为负荷控制。（B） 用定量RT-PCR测定siRNA处理后MACC1 mRNA表达的变化。MACC1 siRNA2是最有效的，并被选为后续实验的对象。数据显示为三个独立实验的平均值±SD。*与对照组和模拟组相比，P<0.05。MACC1，结肠癌相关转移-1；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；SD，标准偏差。
MACC1下调抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和抑制上皮-间充质转化（EMT）
为了评估MACC1下调对CFPAC-1细胞生长的影响，将正常细胞、模拟转染细胞和siRNA2转染细胞以3000个细胞/孔的密度接种在96个平板中，并使用MTT分析监测其生长4天。与对照细胞相比，模拟转染细胞产生了相似的生长速度，但MACC1-siRNA2转染细胞的生长速度显著降低()表明抑制MACC1可能抑制CFPAC-1细胞的增殖。为了检测MACC1-siRNA对细胞迁移的影响，进行了跨阱分析。在48小时的培养期后，对照组的迁移细胞数为374±18，模拟转染组为331±17，MACC1-siRNA2转染组是20±8。因此，与对照组和模拟转染组相比，MACC1抑制后，MACC1-siRNA2组的迁移率分别降低了95%和94%(). 进行蛋白质印迹分析以证实CFPAC-1细胞中的EMT表型被MACC1抑制所抑制。转染48小时后，相对于对照细胞和模拟转染细胞，MACC1-siRNA2转染细胞中E-cadherin蛋白水平显著上调，而波形蛋白水平似乎没有改变(). 总之，这些结果表明MACC1参与了胰腺癌细胞的EMT，其下调可能抑制EMT并抑制癌细胞迁移。
MACC1 siRNA对CFPAC-1增殖的影响。用MTT法测定转染或不转染siRNA的CFPAC-1细胞在不同时间的细胞生长曲线。MACC1 siRNA显著抑制细胞增殖。结果显示为三个独立实验的平均值±SD。*P<0.05。MACC1，结肠癌相关转移-1；SD，标准偏差。
MACC1下调抑制CFPAC-1细胞迁移并抑制EMT。（A） 按照患者和方法的指示，将转染或不转染siRNA的CFPAC-1细胞重新植入迁移跨阱室。48小时后对迁移的细胞进行染色，并在光学显微镜上进行计数和可视化（放大倍数为200倍）。（B） 每组中迁移的单元格数。数据显示为5个字段的平均值±SD。与对照组和模拟组相比，siRNA2组的迁移细胞显著减少。*P<0.05。（C） Western blot分析转染或不转染siRNA的CFPAC-1细胞中的MACC1、E-cadherin和vimentin。β-actin作为负荷对照。MACC1，结肠癌相关转移-1；上皮-间充质转化；SD，标准偏差。
MACC1致敏CFPAC-1细胞对吉西他滨的下调作用
目前，治疗晚期胰腺癌的最佳化疗药物是吉西他滨(15). 为了验证MACC1直接参与了化疗耐药的介导，在吉西他滨治疗之前，用抗MACC1的siRNA转染CFPAC-1细胞，以下调其表达。在随后的实验中使用了MACC1-siRNA2，并使用MTT分析评估了细胞活性。吉西他滨孵育24小时后，三组之间的抑制率没有显著差异。然而，在吉西他滨培养48小时后，与对照细胞和模拟转染细胞相比，在浓度为0.5μg/ml和5μ分别为g/ml(). 在这些浓度的吉西他汀孵育72小时后，MACC1下调导致对CFPAC-1细胞增殖的抑制作用增强。此外，我们使用流式细胞术研究了3个细胞组中吉西他滨治疗引起的细胞死亡程度。在没有吉西他滨的情况下，抑制MACC1导致存活细胞轻微减少，凋亡和死亡细胞百分比增加。用吉西他滨（0.5μ在48小时内，MACC1下调导致强烈的凋亡效应。MACC1-siRNA转染组、对照组和模拟转染组的活细胞百分比分别为29.7%、47.3%和49.5%。对照组和模拟转染组的凋亡率为0.5μg/ml吉西他滨分别为28.0%和28.3%，而MACC1沉默组的凋亡率为45.5%().
抑制MACC1对胰腺癌细胞化疗耐药的影响。（A） 用不同浓度（0.005-5）处理转染有或没有siRNA的细胞μg/ml）吉西他滨处理24、48和72小时，然后通过MTT测定分析活细胞。每个数据点表示为三个独立实验的平均值±SD。*P<0.05。（B） 使用或不使用吉西他滨治疗的凋亡细胞的流式细胞术分析。吉西他滨浓度为0.5μg/ml持续48小时。显示了具有代表性的结果。吉西他滨；MACC1，结肠癌相关转移-1；上皮-间充质转化；SD，标准偏差。
免疫印迹分析显示()，在吉西他滨治疗后，MACC1敲低诱导CFPAC-1细胞显著凋亡。前caspase-3、前caspase-9和PRAP蛋白的表达降低以及裂解caspase-3的生成增加证实了这一结果。吉西他滨刺激后，siRNA-介导的MACC1敲除也降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。未经吉西他滨治疗，MACC1基因敲除的这种化学增敏作用并不明显。在正常条件下，单独敲低MACC1可诱导轻微的细胞凋亡，这表明在应激情况下敏化的潜在作用。
MACC1-siRNA对吉西他滨诱导的细胞凋亡的影响。用模拟或MACC1-siRNA转染CFPAC-1细胞24小时，并用或不用吉西他滨（0.5μ获得总蛋白，并对样品进行各种细胞凋亡相关蛋白（Bcl-2、caspase-3、caspase9、PARP-1）的western blot分析。β-actin作为负荷控制。MACC1，结肠癌相关转移-1。
MACC1调节胰腺癌细胞的Ras/ERK通路
我们研究了MACC1对Ras/ERK通路是否有任何影响。MACC1基因敲除降低Ras和pERK1/2的表达，在吉西他滨治疗期间这种影响更为明显(). 沉默MACC1还导致Gab2的下调，Gab2是一种适配器蛋白，可增强Ras/ERK和PI3K/AKT通路的激活，并与乳腺肿瘤的发生和转移有关。我们发现，单独使用吉西他滨治疗可降低Gab2、Ras和pERK的激活，这可能归因于吉西他宾介导的MACC1下调。然而，还需要进一步的研究来证明MACC1和Ras/ERK通路之间的这种相关性。
吉西他滨联合MACC1-siRNA对Ras-ERK信号通路的影响。按照患者和方法中的指示处理CFPAC-1细胞的全部裂解物，用Ras、phosphone-ERK、ERK和Gab2抗体进行western blot分析。β-actin作为负荷控制。MACC1，结肠癌相关转移-1。
讨论
Stein首先通过qRT-PCR和数据库分析确定MACC1为结肠癌相关基因等(6). 这些作者揭示了MACC1是结肠癌转移和无转移生存的预后标志物(6). 自那时以来，利用免疫组织化学和qRT-PCR分析了MACC1水平与各种癌症风险和预后之间的关系。MACC1已被证明是结肠癌转移或预后不良的标志物(6,8)，胃癌(12)，肺腺癌(10,11)，肝细胞癌(9,16)和卵巢癌(17).
斯坦因等表明MACC1位于人类7号染色体（7p21.1）上，其作用是显著诱导细胞迁移、侵袭、集落形成和增殖(6). 我们观察到，在转移性病灶中，MACC1主要表达在肿瘤细胞的细胞核中，而在非转移性肿瘤细胞中，MACC1主要表达于细胞质中。此外，当用HGF处理时，MACC1能够从细胞质转移到细胞核，然后与Met启动子结合以调节其表达。这些发现表明MACC1是HGF/Met信号通路的主要调节因子。此外，Stein等表明MACC1可能参与MAPK信号通路(6).
据我们所知，这是首次使用ELISA方法研究人类胰腺癌患者血清MACC1的表达。在本研究中，我们发现胰腺癌患者的血清MACC1值显著升高，但在健康受试者中弱表达或不表达（P<0.001）。此外，我们发现MACC1的高水平通常与淋巴结转移增强、远处转移和晚期TNM分期相关。然而，MACC1血清水平与性别、年龄或浸润深度没有显著相关性。因此，血清MACC1水平被认为与侵袭性更强的胰腺癌相关，可能有助于诊断。
MACC1在胰腺癌中的作用尚未见报道，因此，我们检测了两种结肠癌细胞系和五种胰腺癌细胞系中MACC1的表达。选择表现出最高水平MACC1的CFPAC-1细胞系用于随后的实验。在我们的研究中，我们发现通过RNA干扰下调MACC1表达能够抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移，并增强吉西他滨诱导的细胞毒性。
EMT最初被确定为早期胚胎形态发生中转录和蛋白质修饰事件的高潮(18). 新的证据表明，EMT是一个涉及减少细胞间黏附和获得间充质细胞特征的发育过程。EMT在肿瘤转移、侵袭和癌变中起着重要作用(19). 先前的研究表明，对吉西他滨耐药的胰腺癌细胞获得了EMT表型，并且EMT可能维持人类胰腺癌细胞的耐药性(20–22). 在本研究中，我们发现MACC1的抑制不仅抑制CFPAC-1细胞的迁移，还导致上皮细胞表型标记物E-cadherin的上调。我们首次发现，抑制MACC1可逆转EMT表型，并可能增加药物敏感性。然而，应调查其他EMT标记物以确认结果。
Ras/ERK通路参与多种生物功能的调节，包括细胞增殖、存活和凋亡。除此之外，已确定Ras/ERK途径在大约30%的所有类型的癌症中发生突变，胰腺癌的发病率最高（90%）(23). Ras蛋白分布在多种质膜微结构域中，并在细胞间移位(24). 活化的K-ras突变被认为是胰腺导管癌变的初始步骤(25)RNA干扰对K-ras的敲除增强了吉西他滨诱导的胰腺癌细胞凋亡(26). 在本研究中，当联合吉西他滨治疗时，抑制MACC1能够抑制CFPAC-1细胞的生长，并诱导增强的凋亡。我们通过MTT、流式细胞术和western blot分析等多种方法证明了诱导凋亡细胞死亡。我们还发现，联合使用吉西他滨抑制MACC1可显著抑制Ras/ERK信号通路的活性。这是通过研究Ras/ERK途径的几个下游靶点确定的，包括Bcl-2、caspase-3和caspase-9。研究还发现，MACC1-siRNA处理显著降低了Gab2的表达，Gab2是支架适配器Gab家族的成员，也包含Gab1和Gab3(27). 大多数Gab蛋白-受体相互作用是通过Grb2间接介导的，并且仅证明Gab1和c-Met之间存在直接募集(28). 先前的研究表明Gab-Shp2复合物作为Ras/ERK信号通路激活的“放大器”(29–30). 因此，我们认为Gab家族可能参与了MACC1介导的Ras/ERK信号通路激活过程，但明确的机制需要进一步研究。
在本研究中，我们提供证据表明，胰腺癌患者血清中可检测到MACC1过度表达，并与肿瘤转移相关。因此，血清MACC1的表达对胰腺癌的诊断有价值。然而，我们研究中使用的样本量较小，应进行调查，以在更大的患者队列中确认我们的发现。MACC1也可能通过调节Ras/ERK信号通路在化疗耐药中发挥重要作用。总之，MACC1可能被证明是吉西他滨治疗的新靶点；然而，目前尚需进行深入研究，以充分探讨肿瘤转移和化疗耐药的分子机制。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金资助（编号81172158、81001094、81071960、3090145和81100549）。
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