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方法。作者手稿；PMC 2013年10月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
方法。2012年10月；58(2): 81–87.
2012年7月17日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.meth.2012.07.004
预防性维修识别码：项目经理3493847
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院395242
PMID：22813890

MS2-TRAP（MS2-tagged RNA亲和纯化）：标记RNA以识别相关miRNA

Je-Hyun Yoon先生,Subramanya Srikatan公司、和Myriam Gorospe公司*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

所有类型的细胞转录物，包括编码信使（m）RNAsx和非编码（nc）RNAs，都受到广泛的转录后调控。在引发转录后控制的因素中，微小RNA（miRNA）已成为一类主要的小型调节RNA。由于RNA-RNA相互作用可以通过计算建模，已经开发了几个优秀的程序来预测miRNAs与靶转录物的相互作用。然而，许多这样的预测由于不同的原因没有实现，包括细胞中miRNA的缺失或低丰度表达，竞争因子或构象变化的存在掩盖了microRNA位点，以及目标转录物不存在于预测数据库中的可能性，长ncRNAs也是如此。在这里，我们提供了一种称为MS2-TRAP（标记RNA亲和纯化）的系统方法，用于在细胞环境中识别与靶转录物相关的miRNAs。我们通过基于MS2 RNA发夹标记的lincRNA的表达，识别与长基因间（li）ncRNA相关的microRNA来说明这种方法的使用(lincRNA-p21-MS2)以及识别MS2 RNA发夹的融合蛋白MS2-GST的伴随表达。亲和性下拉包含[MS2-GST的核糖核蛋白（RNP）复合物后/lincRNA-p21-MS2]分离并逆转录（RT）下拉材料中的RNA。随后使用实时定量（q）PCR分析对下拉复合物中存在的microRNA进行评估，从而确定真诚地miRNAs与lincRNA-p21我们描述了该方法的替代设计和应用，并讨论了其在解读转录后基因调控方案中的意义。

1.简介

在转录后水平上，基因表达受两类主要调节分子控制：RNA-结合蛋白（RBP）和非编码RNA[1-三]. RBP影响转录后基因调控的所有方面，包括RNA剪接、成熟、运输、编辑、衰变、稳定、储存和翻译[4-6]. 在ncRNAs中，最受研究的亚类包括microRNAs（miRNAs），通常抑制mRNA的稳定性和翻译[7-9]. RBP和miRNAs与靶RNA的相互作用取决于顺式-RNA中存在的结合元素；其中一些元素是通用的[例如，5'帽或3'聚（A）尾]，但其他元素仅在选择的转录物中发现[例如，内部核糖体进入位点（IRES）、富含AU的元素（are）和特定的miRNA位点][10-12].

计算方法无法准确预测核糖核蛋白（RNP）复合物的形成，尤其是涉及非通用RNP相互作用的RNP复合物顺式-元素。因此，已经设计了许多优雅的实验方法来鉴定RBP-mRNA的相互作用。这些RNP相关性通常使用依赖于抗体和配体亲和力相互作用的分子生物学技术进行研究[13-15].

然而，预测miRNA-mRNA相关性的任务在理论上更容易，因为RNA-RNA相互作用可以建模生物信息学因此，为了预测这些关联，已经开发了许多算法[例如，TargetScan、miRBase、miRanda和PicTar；详情请参阅http://www.exiqon.com/microrna目标预测). 然而，由于这些算法在使用序列守恒、能量学和结构参数方面有所不同，因此它们的预测仅部分重叠。计算预测的进一步局限性源于1）难以研究在内源性miRNA浓度和可用度下结合靶点的能力，因为这取决于mRNA水平和/或与其他miRNA和RBP的竞争，2）内源性靶mRNA折叠成特定构象的可能性，该构象隐藏了miRNA结合位点或以其他方式无法访问miRNA，3）存在报告分析固有的伪影[16]以及4）算法搜索的数据库中缺少完整的转录物集合，如目前尚不清楚的长非编码（lnc）RNA和microRNA。

在这里，我们描述了一种可以绕过这些限制的方法。该方法的基础是将MS2 RNA发夹环添加到感兴趣的目标RNA上，然后将MS2标记的RNA与融合到亲和标记上的蛋白MS2（识别MS2 RNA元素）共同表达，这种方法概括了Keene及其同事开发的“核糖体陷阱”方法的一些特征[14]和。纯化MS2-RNP复合物后，鉴定复合物中存在的miRNAs。为了说明这种方法的有用性，我们标记了鼠标lincRNA-p21并在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中与嵌合蛋白MS2-GST（谷胱甘肽S-转移酶）共同表达。用谷胱甘肽-SH珠亲和纯化后，通过逆转录（RT）和实时定量（q）PCR鉴定RNP复合物中的microRNA。我们讨论了我们的发现以及该方法的变化，该方法可用于识别更大范围的调节性miRNAs、其他短和长ncRNAs以及RBP。

2.方法说明

使用特定的RNA标签（第6节中讨论的其他标签）可以获得一些分离体外表达RNA的方法。最广泛使用的标签之一，MS2，是一个19核苷酸长的病毒（噬菌体）RNA序列，位于MS2复制酶mRNA的核糖体结合位点，折叠成发夹环结构。该发夹环被MS2噬菌体衣壳RNA-结合蛋白MS2（Kd为3-300×109，取决于阀杆回路顺序和MS2 RBP变体[13,17-19]). 将RBP MS2表达为包含肽标签的嵌合蛋白有助于分离[MS2 RNA/MS2蛋白]复合物以及复合物中存在的其他分子。MS2被广泛用于标记转录的RNA在体外和体内用于其他应用程序[20-23]. MS2下拉方法包括三个基本步骤：

2.1. 第1步

涉及两种质粒载体的构建及其与哺乳动物细胞的共转染。第一个质粒表达含有感兴趣的测试RNA的嵌合RNA，随后是几个MS2 RNA发夹（通常是12或24个串联的MS2发夹环）。通常建议在测试RNA的3'端，但在poly（A）尾部之前附加MS2序列，以避免阻碍翻译或可能翻译MS2序列。控制质粒只表达MS2发夹，没有感兴趣的测试RNA。第二质粒表达包含MS2衣壳蛋白和亲和标记的嵌合蛋白。为了减少非特异性结合，表达更多的嵌合RNA比检测嵌合蛋白重要。这里，我们表达了鼠标lincRNA-p21标记有MS2发夹环(lincRNA-p21-MS2)作为感兴趣的RNA(MS2级RNA在对照平行转染中表达），以及嵌合检测蛋白MS2-GST(图1).

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MS2-标记RNA的亲和纯化和检测示意图

本报告中讨论的方法。第1步，质粒pMS2[表达对照MS2级RNA，由串联的24 MS2发夹（红色）组成，pMS2-GST[表达包含MS2 RNA再识别部分（MS2，黑色）的融合蛋白，识别亲和纯化试剂谷胱甘肽-SH（GSH）和核定位信号（NLS）的区域（GST，谷胱甘苷S-转移酶，黄色）]，和pMS2-lincRNA-p21[表达用24个MS2发夹标记的感兴趣的测试RNA（灰色）(lincRNA-p21-MS2)]转染小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）表达编码蛋白和RNA。控制单元(1)转染质粒以表达对照RNA(MS2级RNA）和报告蛋白（MS2-GST），而测试细胞(2)转染质粒以表达感兴趣的实验RNA(lincRNA-p21-MS2RNA）和报告蛋白（MS2-GST）。第2步，在RNP复合物形成后[MS2级细胞中的RNA/MS2-GST（1），以及lincRNA-p21-MS2细胞中的RNA/MS2-GST（2）]，用GSH琼脂糖珠裂解细胞并亲和纯化复合物。第3步从细胞（1）和（2）形成的复合物中分离RNA，并用RT-qPCR反应检测相关的microRNA。使用（2）中相对于（1）的microRNA相对丰度来量化这些microRNA与lincRNA-p21成绩单。

2.2. 第2步

包括在质粒转染后24-48小时采集培养物，然后用缓冲液进行细胞裂解，以保持天然RNP的完整性。然后将细胞裂解物与亲和试剂混合并允许结合，分离并清洗RNP复合物。这里，亲和试剂是附在珠子上的谷胱甘肽-SH（GSH）；GSH珠与融合蛋白（MS2-GST）的GST成分具有高亲和力，可以通过离心有效分离MS2-RNP。然后用DNA酶和蛋白酶处理回收的颗粒，并分离RNA进行进一步分析(图1).

2.3. 步骤3

是为了鉴定存在于纯化的RNP复合物中的miRNA。在表征这些microRNA的不同可能方法中（在第6节)在这里，我们通过逆转录（RT）和实时定量（q）PCR分析进行了靶向筛选。通过基于RT-qPCR的计算预测miRNAs子集检测，确定与小鼠lincRNA-p21特异相关的miRNA。

3.实验结果

我们有兴趣测试鼠标lincRNA-p21与miRNAs相关。我们首先搜索了老鼠是否lincRNA-p21（其序列已知[24])可能是miRNAs的假定靶点。由于当前的microRNA鉴定程序（如TargetScan、miRBase等）不搜索lncRNAs数据库，我们使用预测程序RNA22（IBM）和Segal实验室程序（以色列魏茨曼研究所）来鉴定可能与lincRNA-p21该分析确定了许多假定的miRNA靶位点；其中20个如所示表1.

表1

预测与小鼠相互作用的小鼠miRNA的部分列表lincRNA-p21

miRNAs(左边列）和上的站点lincRNA-p21假定miRNAs相互作用（第一个和最后一个核苷酸，中间的和正确的列）。该列表包括一个阴性对照miRNA（miR702），预计它不会与lincRNA-p21相互作用。

微小RNA开始结束
let7a-1/b/c/i652673
let7a-1/b/c/i565586
让7b621642
让7b10441065
let7c618639
让7d643664
让7d29222943
让7d14621483
让7d20332054
让7d14181439
让7d21842205
让7d14071428
密尔130b10421063
mir14388107
mir206型728748
mir2292113
mir22641662
mir221型20202042
mir320a型94115
mir660型634655
米702--

为了测试lincRNA-p21在细胞环境中是否与一种或几种miRNAs相关，我们制备了质粒plincRNA-p21-MS2（使用从M.Huarte好心获得的试剂[24])，以表达带有lincRNA-p21在3英尺的尽头，有24份MS2发夹。质粒plincRNA-p21-MS2和质粒pMS2-GST（由B.R.Cullen慷慨提供[25])表达含有MS2外壳蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白，使用Lipofectamine 2000共转染到小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。48小时后，对细胞进行裂解，并将裂解产物与谷胱甘肽-SH（GSH）琼脂糖珠混合。在下拉和洗涤后，我们将珠子分为两部分：一部分用于蛋白质分析，另一部分用于分离RNA。对于RNA分析，下拉材料用DNase和蛋白酶消化，RNA用乙醇沉淀以进一步分析。

首先，我们检查了已知分子在lincRNA-p21-MS2下拉。正如预期的那样，下拉在linRNA-p21成绩单本身(图2A)通过目标RNA的RT-qPCR扩增检测到第4.4节). 这个lincRNA-p21-MS2基因下拉后对颗粒中的蛋白质进行Western blot分析显示，该转录物与RNA-binding proteins（RBPs）Ago2和Rck的相互作用丰富，但与RBP-hnRNP C的相互作用不丰富；在所有下拉样本（未显示）中，在背景水平检测到大量的看家蛋白Gapdh，数量相等，表明样本之间的输入是均匀的(图2B).

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MS2复合物的RNA和蛋白质组分检测

在MS2复合物被转染的培养物中取下后，研究了MS2-RNP复合物中的蛋白质和RNA水平图1.（A）相对富集度lincRNA-p21RT-qPCR法检测谷胱甘肽微球中的RNA；如预期，lincRNA-p21相对于转染组（1），RNA在转染组的下拉珠中富集；的级别间隙每个反应中的mRNA用于标准化样本输入。（B）MS2下拉材料中的RBP水平（Ago2、Rck、hnRNP C和MS2-GST）(左边)和裂解物(正确的)Western blot分析检测。

然后，我们试图确定预测目标microRNA的水平。目前有两种基于PCR的miRNA检测方法被广泛使用。一种方法（来自Taqman™）使用基因特异性反义PCR引物进行逆转录，然后使用Taqman™探针进行实时PCR[26]); 该方法仅限于TaqMan™探针可用于的miRNAs。第二种方法来自SBI QuantiMir，基于使用Poly（A）聚合酶合成Poly（A）尾部，然后使用寡核苷酸（dT）适配器进行RT反应。将得到的cDNA与成熟miRNA序列互补的引物以及寡聚（dT）通用引物一起用于PCR扩增反应；这种方法允许简单且相对便宜地筛选基本上每一个miRNA(图3).

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SBI QuantiMir miRNA检测方法

MS2下拉后制备的RNA通过使用酶poly（a）聚合酶在3'端添加poly（a）尾部延伸。适配器杂交后，通过逆转录酶（RT）进行第一链合成，并使用microRNA特异性引物进行实时定量（q）PCR分析(表2)和通用底漆。

使用SBI方法检测几个lincRNA-p21靶miRNAs：let7b、let7c、let7i、miR130和miR221。我们还包括一个非靶点miRNA，miR702。我们的结果表明，在5个预测的靶miRNA中，只有4个miRNA（let7b、let7c、miR130和miR221）在lincRNA-p21-MS2下拉；let7i在下拉列表中没有增加，显示出与非目标miR702的水平相当的水平(图4A)通过比较内源性激素的稳态水平，研究了这些相互作用的生物学后果lincRNA-p21当我们过表达let7b、let7c、let7i或对照siRNA的前体（Pre-）时图4B，只有编码与lincRNA-p21相关的miRNAs的Pre-let7b或Pre-let7 c的过度表达，显著降低了内源性lincRNA-p21而Pre-let7i的过度表达（与lincRNA-p21)不会影响lincRNA-p21综上所述，我们的分析提供了基本证据，证明MS2介导的lincRNA-p21可以帮助识别在lincRNA-p21表达时具有功能作用的相互作用靶miRNAs。

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lincRNA-p21-相关miRNAs

（A）在从MEF转染组制备的下拉材料中（2）lincRNA-p21-MS2和（1）MS2级(图1)，通过RT-qPCR分析测定预测的靶miRNAs let7b、let7c、let7i、miR130、miR221以及非靶miR702的水平，如图3数据表示第（2）组RNA中miRNA水平相对于第（1）组RNA的富集。（B）MEF转染了显示的前miRNAs；48h后，小鼠内源性水平lincRNA-p21对每个转染组[（2）vs（1）]进行评估，标准化为gapdh公司并且以转染组（1）中的值的百分比表示。数据是来自三个独立实验的平均值和S.D；P（P）显示值

4.详细协议

4.1. 步骤1：细胞培养、转染和裂解物制备

  1. 准备1×106小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）每60mm培养皿，在补充有10%（v/v）胎牛血清（Hyclone）和抗生素的DMEM（Invitrogen）中培养。
  2. 共转染2μg质粒pMS2-lincRNA-p21或pMS2，以及1μg pMS2-GST，稀释在150μl OPTIMEM（Invitrogen）中，与5μl脂质体2000（Invit罗gen）混合，稀释150μl OPTIMEM。
  3. 在室温下培养30分钟后，将转染混合物添加到之前用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗两次并补充有OPTIMEM的MEF培养物中。
  4. 在37°C和5%CO中孵育6小时后2培养箱，用PBS清洗MEF两次，并加入含有10%FBS且不含抗生素的DMEM。
  5. 48小时后，在pH 7.5、100 mM KCl、5 mM MgCl、含有20 mM Tris-HCl的300μl裂解缓冲液中，用PBS和溶血剂将细胞洗涤两次2、0.5%NP-40、蛋白酶抑制剂（罗氏）、核糖核酸酶抑制剂（发酵剂）和10 mM DTT在冰上放置10分钟。
  6. 通过刮擦收集细胞裂解物后，在4°C下以10000×g离心裂解物15分钟。
  7. 收集清澈的上清液，并使用Bradford分析法测量蛋白质浓度。
  8. 使用1000μl裂解液（2μg/μl）进行下拉分析。

4.2. 第2步：下拉分析和RNA纯化

  1. 用冰镇PBS洗涤GSH琼脂糖珠（GE Healthcare）两次，然后用等体积的PBS再次悬浮，形成50%的浆液。
  2. 将上清液与50μl GSH琼脂糖珠浆在4°C下培养3小时。
  3. 在4°C下以4500 rpm离心1分钟后，用NT2缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM MgCl）洗涤珠子两次2和0.05%NP-40）。
  4. 将所得微丸与20单位无RNase DNase I在100μl反应体积中在37°C下培养15分钟。
  5. 添加700μl NT2缓冲液，并在4°C下以4500 rpm离心1分钟。
  6. （仅用于RNA分析）在55°C下用0.1%SDS和0.5 mg/ml蛋白酶K培养颗粒15分钟。
  7. 收集在4°C下10000×g离心5分钟的上清液。
  8. 加入500μl无RNase水和500μl酸性苯酚（Ambion），涡流5分钟。
  9. 在10000 g，4°C下离心20分钟，收集上清液。
  10. 将400μl上清液与860μl 100%乙醇、40μl 3M醋酸钠和3μl乙醇蓝混合。
  11. 在-20°C下培养2小时后，在4°C下以10000×g离心20分钟。
  12. 用500μl 70%乙醇洗涤所得RNA颗粒，并在4°C下以10000×g离心10分钟。
  13. 干燥RNA颗粒并在10μl无RNase水中重新悬浮。

4.3. 步骤3：检测miRNAs

  1. 将来自MS2下拉列表的5μl RNA与2μl 5×Poly（A）缓冲液、1μl 25 mM MnCl混合21.5μl 5 mM ATP和0.5μl Poly（A）聚合酶（System Biosciences QuantiMir试剂盒）。
  2. 在37°C下培养30分钟
  3. 添加0.5μl Oligo dT适配器（QuantiMir试剂盒）
  4. 在60°C下培养5分钟。
  5. 在室温下冷却2分钟
  6. 添加4μl 5×RT缓冲液、2μl dNTP混合物、1.5μl 0.1 M DTT、1.5μl无RNase水和1μl逆转录酶（QuantiMir试剂盒）。
  7. 在42°C下培养60分钟，在95°C下加热10分钟。
  8. 将2.5μl cDNA与2.5μl miRNA特异性引物[2.5μM(表2)]通用底漆（QuantiMir Kit提供10μM）和SYBR绿色主混合料。

    表2

    用于qPCR扩增的引物

    表中包括用于检测本报告中测试的微小RNA的引物，以及用于扩增的正向（F）和反向（R）引物lincRNA-p21RNA和gapdh公司mRNA。

    底漆顺序
    让7bTGAGGTAGTAGGTGTGTGGTT公司
    让7c-1TGAGGTAGTAGGTGTATGGTT公司
    让7iTGAGGTAGTAGTGTGTGTGCTGTT公司
    miR130a基因GCTCTTTTCACATTGTGCTACT公司
    221英里ACCTGGCATATAGTAGATTCTGT公司
    米702TGCCCACCTTTACCCCCTC公司
    6号机组TGGCCCCTGCGCAAGGATG
    lincRNA-p21 FCCTGTCCACTCGCTTC公司
    licnRNA-p21受体GGAACTGGACGGAATGTC公司
    GAPDH F公司GGGAAATTCAACGGCACAGT公司
    间隙AGATGGTGATGCTCCC公司
  9. 通过PCR（应用生物系统7300仪器）进行定量。

4.4. MS2下拉框中蛋白质和RNA的验证

  1. 用pMS2构建物转染MEF 48小时后，在RIPA缓冲液中制备全细胞裂解物[10 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1%（v/v）Nonide P-40，1 mM EDTA，0.1%（w/v）SDS和1 mM DTT]。
  2. 下拉后，将SDS样品缓冲液添加到一半珠子中，以进行蛋白质印迹分析。
  3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，将样品转移到PVDF膜（Invitrogen iBlot Stack）上，并用识别Ago2（Abcam）、hnRNP C1/C2、Rck或GST（Santa Cruz Biotechnology）的一级抗体探测膜。
  4. 使用HRP-结合二级抗体检测一级抗体信号（GE Healthcare），并使用化学发光检测（Pierce）。
  5. 对于RNA分析，用DNase处理另一半珠子（如上所述）。
  6. 使用基因特异性引物CCTGTCCACTCGCTTC和GGAACGAGATGTC进行RT和qPCR(表2)和在Applied Biosystems 7300仪器中的SYBR绿色母料混合物（Kapa Biosystems）。

4.5. miRNAs对lincRNA-p21丰度影响的验证

  1. 如上所述，在用脂质体2000转染MEF后，用脂质体200010 nM最终浓度转染对照（Ctrl）siRNA（UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT）、Pre-let-7b、Pre-let-7c或Pre-let-9i（Ambion）。
  2. 48小时后，用PBS清洗细胞两次，添加1 ml Trizol（Invitrogen）和200μl氯仿。
  3. 涡流3分钟，10000×离心样品克在4°C下保持20分钟，并将上清液与100%乙醇和3M醋酸钠混合，如上所述。
  4. 使用0.5μg RNA进行RT，然后使用特定引物进行qPCR(表2)和SYBR绿色主混合（Kapa Biosystems）和应用生物系统7300仪器。

5.故障排除

无法检测嵌合体中的浓缩RNA-MS2与…相比MS2级单独地

通常，通过添加表达标记嵌合RNA的质粒（本例中为plincRNA-p21-MS2）相对于表达嵌合检测蛋白的质粒（此例中为pMS2-GST）的摩尔过量量来解决此问题。这种修饰减少了细胞RNA与MS2-GST融合蛋白的非特异性结合。为了满足每个细胞系统的特定需求，可能需要在转染后额外调整质粒数量和收集次数。

低特异性

这个问题的常见解决方案是将与GST珠的孵育时间降低到6小时以下，和/或减少所使用的珠或裂解物的量。

无法验证microRNA的影响

如果发现与MS2-tagged RNA相关的miRNAs无法使用报告构建物进行验证，建议降低报告靶RNA的浓度。

MS2标签定位不足

根据方法的应用，将MS2标签放在lincRNA的3'端可能不够，可能会干扰RBP的结合。如果是这种情况，MS2标签可以插入标记RNA的5'段。应注意避免通过此策略引入翻译起始位点。同样重要的是要记住，在3'位置标记可能不会产生与在5'位置标记相同的相互作用分子。

残留DNA的背景扩增

在某些情况下，样本中残留的质粒DNA可能会产生背景扩增。为了测试这是否是一个问题，作者必须始终包括RT-minus PCR扩增反应（这将专门检测污染质粒DNA）。为了消除这个问题，研究人员可以使用无RNase的DNA酶进行更长时间的培养，可以提高反应中DNA酶的浓度，并可以进行顺序的DNA酶消化。

用PCR鉴定siRNA

由于我们使用PCR引物来扩增小RNA，同样的引物对也可能扩增较长的靶RNA。尽管这可能不是miRNA的问题（因为存在错配），但对于siRNA，引物序列是完全互补的，因此可能导致不必要的扩增。尽管如此，还是有可能区分扩增的小RNA产物和长RNA产物。

6.本方法的适用性

6.1. RNA标签

除了本报告中使用的标签MS2之外，其他天然RNA标签可以添加到感兴趣的RNA中，包括由噬菌体蛋白λN识别的boxB序列；还开发了人工RNA标记，包括D8 Sephadex RNA基序（由Sephadex识别）和S1 Streptavidin RNA基序[27]. 这些标签具有不同的优点和局限性，可以根据分子应用、所需检测类型、所研究的细胞类型和其他考虑因素进行选择。

6.2. 相关RNA的检测

除了测试相关的miRNA外，选择“先验”，因为它们是通过计算预测的（如本报告和[28-31])，可以使用许多其他检测方法。可以使用microRNA微阵列分析进行更全面的搜索，以识别相关的microRNA，这是快速、可靠和相对低成本的。然而，最系统的方法是通过所有相关RNA的深度测序（RNAseq）来全面识别相关的microRNA，以及所有小RNA（piRNA、tiRNA、snoRNA、siRNA等）。显然，如果RNAseq分析包括长RNA，这种方法也可以识别相互作用的mRNA、rRNA和其他lncRNA，尽管目前长RNA之间的关联还没有很好的特征。

6.3. 与限制性商业惯例的互动

如果RBP与标记RNA的相互作用稳定，核糖核蛋白免疫沉淀（RIP）分析[32]非常适合分析相关的限制性商业惯例。如果RBP-RNA相互作用是暂时的，RIP分析可能不够[33,34]和RNP复合物的交联（使用最近在[35])可能需要在下拉之前。天然或交联的、与标记RNA相互作用的RBP的系统识别可以通过放大下拉分析和执行各种蛋白质组方法来进行[例如，通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）或串联质谱（MS）]。

6.4. 标记RNA的定位

如果有兴趣跟踪标记RNA的亚细胞定位，嵌合检测蛋白（MS2-GST）可以替代荧光嵌合蛋白（例如MS2-GFP或MS2-YFP[36-38])可以在酵母和哺乳动物细胞的细胞质中追踪到。亚细胞定位可以用活体显微镜研究；如果有必要研究荧光RNP与需要免疫荧光检测的细胞蛋白（如[39]).

7.结束语

随着我们对转录后基因调控的理解不断加深，我们也意识到这一过程的复杂性和多样性。RNA-结合因子对这种丰富的调控起着至关重要的作用，因此人们对阐明其特性和对基因表达的影响越来越感兴趣。这里描述的方法称为MS2-TRAP（MS2-tagged RNA亲和纯化），允许在完整细胞的背景下分析与RNA相关的因素。虽然这里研究的测试RNA是一种lncRNA和与其相关的miRNAs，但其他RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用也可以用类似的方法进行研究。除了用于表征RNP的运输和定位之外，MS2-TRAP还可用于检测带有生化读数的RNA复合物，该读数系统地评估RNP的组成，即与感兴趣的RNA相互作用的蛋白质和RNA。鉴于RNA作用领域不断扩大，我们预计MS2-TRAP的使用将在未来几年迅速增长。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院院内老化研究计划的全面支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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