乳腺癌风险相关SNP调节染色质对FOXA1的亲和力并改变基因表达

摘要

疾病风险相关SNP（raSNP）主要映射到非编码区域¹美国国家人类基因组研究所（NHGRI）GWAS目录中70%以上的风险关联缺乏单倍型区内外显子的变异，从而避免了编码序列的中断².“顺反义体”被定义为在特定处理下对给定细胞类型进行全基因组评估的转录因子的一整套结合位点。同样，“表观基因组”是指对特定细胞类型和治疗具有相同表观基因组标记的整套元素。通过ChIP-seq获得的顺反子和表观基因组确定了调控元件和新转录物在整个基因组编码区和非编码区的位置^三–8重要的是，这表明池和表观基因组是细胞类型特异性的^4,5,9,10例如，与其他细胞类型相比，先驱因子FOXA1（也称为HNF3A）和转录因子ESR1（雌激素受体α；也称为ERα）的顺反子在乳腺癌（BCa）细胞中具有独特的分布^4,11–13类似地，在不同细胞类型的调节元件中发现的特定组蛋白修饰的表观基因组，如组蛋白H3（H3K4me1或me2）上赖氨酸4的单或二甲基化，表明功能调节元件也具有谱系特异性^4,5.顺反子和表观基因组之间的相互作用将BCa发育中这两个关键因子的转录活性引导到特定区域，从而驱动正确的基因表达谱^11,12,14重要的是，FOXA1在增强子处的差异募集驱动细胞类型特异性转录程序⁴由于顺位体和表观基因组是细胞身份的来源，我们使用一种新的综合功能基因组学方法研究了BCa-raSNPs与BCa-顺位体和表观基因组之间的功能关系。

风险SNP富集

我们首先从NHGRI提供的GWAS目录中收集了BCa的raSNP坐标¹⁵其中，只有四分之一被定位到编码外显子，二十五个定位到内含子，一个定位到FOXA1位点，三个定位到ESR1位点(图1a). 然而，GWAS基因分型微阵列中评估的SNP数量提供了较低的基因组覆盖率；任何给定平台覆盖的所有注释SNP（dbSNP构建135）不到10%¹⁶因此，统计上，raSNP更可能与因果变量处于连锁不平衡（LD），而不是因果本身¹⁷因此，我们使用HapMap项目数据为每个BCa-raSNP确定了强LD（ldSNP）中所有SNP的列表(补充表1). 我们使用了非常严格的LD阈值LOD>2和D'>0.99。通过这种插补方法，我们将raSNP的覆盖范围扩展到更全面的假定功能性ldSNP列表，定义了raSNP/ldSNP簇(图1b). 我们将与特定疾病或性状（在本例中为BCa）相关的所有raSNP/ldSNP簇的综合集合称为其相关变异集（AVS）。BCa AVS由44个raSNP和1315个ldSNP组成(补充表1). raSNP/ldSNP簇的全基因组分布让人想起许多转录因子（如FOXA1和ESR1）的招募情况，因为它们主要映射到内含子和基因间区域^4,11,12,14考虑到ldSNP，映射到编码外显子的raSNP/ldSNP簇数从1个增加到5个，映射到FOXA1和ESR1结合位点的簇数分别从1个增至16个和3个增至19个(图1c). 通过一种新的计算方法计算了这些映射结果的重要性；变量集扩展（VSE）。VSE是一种基于置换测试的方法，它基于随机变量集生成零分布，同时考虑到BCa AVS的异构LD结构(图1d–g; 方法部分提供了详细描述）。这是辛多夫和同事工作的延伸¹⁸.VSE显示BCa AVS不富含基因(图1d–e)但对FOXA1和ESR1顺反子有很强的富集作用(图1f–g).

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图1

BCa-AVS富含FOXA1和ESR1的顺反池。(一)乳腺癌（BCa）raSNPs。二进制矩阵编码映射到基因组注释的raSNP。映射计数显示每个注释的raSNP数。(b条)SNP rs704010的单倍型区块。raSNP/ldSNP簇中包含的SNP以红色突出显示。底部一行数字表示每个raSNP/ld SNP簇的ldSNP数量。(c)BCa-raSNP/ldSNP簇。二进制矩阵编码带有至少一个SNP映射到基因组注释的簇。映射计数显示每个注释的簇数。(d–g)直方图和方框图显示了每个注释的映射计数的零分布。空值基于1000个匹配随机变量集（MRVS）。钻石显示了BCa集群的映射计数。红色菱形突出显示映射符合零以外的基因组注释（P<0.001）

我们扩展了VSE分析，将BCa细胞中16种不同转录因子的共72个顺反子和8种不同组蛋白修饰的27个表观基因组包括在内。在BCa细胞系MCF7、T47D和ZR75中进行评估。样品的主要处理是雌二醇（E2），其目的是刺激ESR1。睫状体和表观基因组要么由我们的实验室产生，要么从文献和核受体睫状体项目中获得。分析中仅使用了顺反子和表观基因组的显著峰（P<10e⁻⁵)^4,19只有满足严格的Bonferroni显著性校正阈值的浓缩分数才被报告（103次测试；P<10^−3.3).

在评估的24个不同的BCa表观基因组和外显子和内含子注释中，只有H3K4me1（未处理和处理）显示富集(图2a-c和补充表2和3)，一种组蛋白修饰，与调节元件相关，主要是增强子。在72个不同的BCa池中，只有FOXA1（三个样品，未处理和处理）和ESR1（一个样品，处理）转录因子显示富集(图2d，e和补充表4和5). H3K4me1的富集与FOXA1和ESR1无关。从H3K4me1元件中减去FOXA1和ESR1结合位点后，雌激素治疗下的表观基因组仍然显著（P=10^−3.532,补充表6). 使用r时，FOXA1、ESR1和H3K4me1仍然显著²作为LD而非D'的度量，以及r阈值的LOD²=0.8或更大(补充表7、8和9). BCa细胞中这六个富集的池和表观基因组跨越70%（31/44）的BCa-raSNP/ldSNP簇(图2a-e，深色热图行）。当在随后的VSE运行中使用基于DNase可访问性的空分布时，这六个富集事件中的五个也通过BCa AVS显著富集(补充表10和11).

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图2

BCa-AVS的富集具有因子、细胞型和癌型特异性。(a–f)乳腺癌AVS的变异集富集（VSE）图。每个面板中的方框图显示了标准化的零分布。钻石显示相应的VSE分数。彩色钻石突出显示了基因组注释的映射结果，这些注释满足Bonferroni校正的显著性阈值（P＜10^−3.3). P值基于1000个MRVS的零分布。二进制矩阵编码raSNP/ldSNP簇，其中至少有一个SNP映射到基因组注释。以深灰色突出显示的行显示了基因组注释的统计显著丰富性。(一)核心基因注释。(b条)BCa细胞中未经处理的表观基因组。(c)在BCa细胞中处理表观基因组。(d日)BCa细胞中未经处理的池。(e（电子）)BCa细胞中经处理的池。(（f）)对照细胞系的睫状体和表观基因组。(克)前列腺癌AVS与FOXA1池的VSE图。(小时)骨密度AVS对ESR1池的VSE图。(我)结直肠癌AVS对H3K4me1表观基因组的VSE图。

对BCa细胞中所有池和表观基因组的BCa-AVS的VSE分析表明，FOXA1、ESR1池和H3K4me1表观基因组富集具有高度的因子特异性(图2a-e). 然而，由于并非所有FOXA1或ESR1顺反子都显示出显著的VSE评分，因此不能完全放弃研究中分析的其他转录因子的富集。核受体Cistrome项目数据集具有高度异质性；MCF7细胞中FOXA1结合位点的数量在数量级上有所不同，这取决于来源实验室。考虑到我们将44个raSNP与成千上万个结合位点交叉，结合位点数量减少了10倍，大大降低了我们检测富集的能力。

BCa-AVS对FOXA1、ESR1和H3K4me1的富集也是癌症和细胞类型特异性的。我们使用前列腺癌（PCa）、骨密度（BMD）和结直肠癌（CRC）的AVS分别控制FOXA1、ESR1和H3K4me1的富集(补充表12,13和14). 前列腺癌的发展依赖于FOXA1，骨密度受雌激素信号的影响，结直肠癌AVS富含肿瘤样本中的H3K4me1表观基因组²⁰这些AVS均未在乳腺癌细胞的靶池或表观基因组中富集，表明BCa-AVS对这些池和表观基因组的富集是癌症类型特异性的(图2g–i、和补充表15、16和17).

相反，检测乳腺癌AVS在前列腺、骨和结肠细胞系（LNCaP、VCaP、人类转移癌组织、U2OS和Caco-2）中的富集情况。在这些细胞系中评估的纤毛和表观基因组的因子和修饰，包括FOXA1、ESR2、AR和H3K4me1，没有显示BCa-AVS的富集，表明BCa-AVS的富集是细胞类型特异性的(图2f和补充表18).

FOXA1调制

获得这些结果后，我们测试了BCa-raSNP/ldSNP簇破坏FOXA1向染色质正常募集的能力。我们将碱基对改变结合基序识别的机制称为亲和力调制。使用一种新的计算方法，即基因组内复制（IGR），我们能够准确预测SNP的亲和性调制。该方法描述了给定转录因子对SNP的参考和变异等位基因的亲和力，同时解释了其上下文序列。转录因子对长度为K（K-mer）的特定DNA序列的亲和力可以通过对该转录因子的全基因组ChIP-seq数据集中的结合数据进行平均来获得。我们将此测量称为该K-mer的亲和力模型。如果经典结合基序被变异等位基因改变，结合因子可以通过移动几个碱基或反转其方向来找到更高的亲和力配置。IGR通过在感兴趣的SNP周围的K-mers的滑动窗口上计算亲和力模型来解释位移效应(图3a). 通过这个过程，用于增加K值的亲和模型集合被放置在一个晶格结构中，该晶格结构连接相隔一个碱基对的K单体。构建了两个格子，每个格子对应一个变异等位基因(图3b). 然后根据其信噪比过滤每个格中的亲和模型（方法部分提供了详细描述）。格中剩余亲和模型的最大值用于计算IGR得分和p值(图3c). 根据SNP的基因组背景，最大值之间的比较代表了每个等位基因的最高亲和力。对于同一组256 K-mer，亲和力模型得分与位置加权矩阵（PWM）得分几乎没有相关性(图3d). 针对给定转录因子推导的模型在实验室和细胞系中是一致的(图3e–f). 由于染色质景观是转录因子和DNA之间相互作用的已知障碍，我们将K-mer搜索限制在有利于结合的染色质区域²¹当K-mer实例没有根据有利的染色质景观进行筛选时，高度排序的K-mer的亲和力被低估(图3g).

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图3

基因内复制方法。(一)亲和力模型是在参考（C，蓝色）和变异等位基因（T，红色）的感兴趣SNP周围的K-mers滑动窗口上计算的。(b条)连通K-mer亲和模型的晶格结构。(c)对应于8-mers的晶格行。每个编号为1到8的单元格对应于一个亲和力模型。每个细胞右侧的顶部数字表示每个8 mer的基因组匹配数。底部数字表示所有8-mer匹配的平均绑定信号。灰色数字表示由于匹配数量不足而丢弃晶格中的单元格。彩色线条显示了以每个8-mer匹配为中心的400 bp窗口上的平均结合曲线。黑线显示了加扰的8-mer序列的平均结合曲线。(d日)基因内复制（IGR）一组256个8-mers的MCF7细胞中FOXA1的亲和力得分，与基于相同256个8 mers组的叉头（FKH）基序的位置加权矩阵（PWM）得分相对照。(e（电子）)比较两个独立实验室获得的MCF7细胞FOXA1的IGR评分。(（f）)比较MCF7 BCa细胞和LNCaP PCa细胞中FOXA1的IGR评分。(克)使用或不使用H3K4me2可及性过滤器获得的MCF7细胞FOXA1 IGR评分的比较。

FOXA1的招募取决于对叉头（FKH）基序的识别(图4a). 我们通过生成30个10-mers的集合来探索FKH基序的亲和景观；FKH基序中十个位置的每一个可能变化对应一个(图4b–d). PWM有助于识别转录因子结合位点，但其分数与结合亲和力相关性较差(图4b，d–e). IGR方法可以准确预测30个10-mers的亲和力调节特性(图4c–e). 此外，转录因子和DNA之间的物理联系不能被单独考虑基序的每个碱基的PWM完全捕获。基序一侧的变化可以加剧或补偿另一侧的变化。我们将这种现象称为基序之间的相互作用效应。如果忽略上下文序列，这些影响可能非常显著，甚至可以逆转等位基因的亲和力调节特性(补充图1).

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图4

BCa-raSNP rs4784227通过改变叉头（FKH）基序来调节FOXA1亲和力。(一)FKH图案的序列标志。(b、 c（c）)FKH基序位置加权矩阵（PWM）和FOXA1基因组内复制（IGR）分数针对FKH基序的每个单个碱基变异。将值归一化为标准FKH基序（红线）的各自得分。灰色区域显示PWM得分的范围。(d日)FKH部位得分最高的每个变体的MCF7中的FOXA1 ChIP-qPCR。每次测量基于三个重复。通过ChIP-qPCR检测的每个位置的FKH变体以颜色和粗体突出显示b条和c. (e（电子）)MCF7中FOXA1 IGR评分和FOXA1 ChIP-Seq剖面之间比较的散点图和回归。插图显示了FKH PWM分数和ChIP-Seq配置文件之间的比较。(（f）)SNP rs6983267和rs4784227的IGR配置文件。彩色数字：实例之间的平均绑定。黑色：IGR获得的p值的-log10。灰色：基因组中K-mer实例的数量。

SNP rs4784227与BCa相关，预计会破坏一个未确定转录因子的结合²²它也是一个直接映射到FOXA1结合位点的raSNP(图1a). 该raSNP位于FOXA1识别的FKH基序的第八位(图4a). 该SNP的上下文序列不同于典型的FKH基序；FKH基序的PWM预测，与参考C等位基因相比，变异T风险等位基因rs4784227的亲和力增加了9%（6.24 T等位基因vs.5.734 C等位，图4b). 考虑到基序位置之间的相互作用效应，IGR方法预测与参考C等位基因相比，变异T等位基因的亲和力增加了63%（倍数变化1.63，P<10e⁻¹⁰,图4f和补充图1). 以前的报告显示，结肠癌细胞中风险相关rs6983267单核苷酸多态性的等位基因特异性TCF4募集²³⁻²⁵.IGR验证了TCF4的rs6983267亲和力调制（折叠变化=1.59，P<10⁻¹⁰,图4f). TCF4评估的BCa-raSNP rs4784227和FOXA1评估的结肠癌raSNP rs6983267的IGR评分之间的比较表明，亲和力预测是因子特异性的（倍数变化~1；P>0.05，图4f).

在探测单个raSNP后，我们将IGR方法应用于所有raSNP/ldSNP簇，发现BCa-AVS富含FOXA1的亲和调节SNP(补充表19). 在BCa AVS中的44个raSNP/ldSNP簇中，33个包含映射到BCa细胞中FOXA1池蛋白或H3K4me2表观基因组的SNP。这些簇包含可以创建或销毁FOXA1结合位点的区域；这些是本分析中考虑的唯一集群⁴对于每个簇，我们计算了FOXA1或H3K4me2区域中所有SNP的IGR得分，并计算了每个簇中亲和力调节SNP的数量。然后，我们使用VSE方法为随机化簇集中的亲和力调制变体的数量生成一个零分布。亲和力调节的显著性阈值基于Bonferroni校正，该校正考虑了所有排列的所有测试（P＜10e⁻⁶). 在映射到FOXA1或H3K4me2区域的33个簇中，有24个簇（73%）包含亲合力调制SNP（P=0.009，图5a). 这意味着一半以上与乳腺癌相关的SNP调节了FOXA1的亲和力。对四种乳腺癌细胞系（MCF7、BT474、T47D和ZR75-1）中被预测破坏FOXA1结合的SNP进行基因分型，在至少一种细胞系中鉴定出13个SNP（包括rs4784227变异体）杂合。77%（10/13）的预测SNP表明，FOXA1的等位基因特异性结合偏好是由体内等位基因特异性ChIP分析(图5b). 这种综合方法验证了IGR识别亲和调制SNP的能力。

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图5

BCa-AVS富含亲和调节SNP。(一)FOXA1亲和力调节raSNP/ldSNP簇在BCa-raSNPs中具有定位到FOXA1或H3K4me2位点的SNPs的所有簇中的百分比。直方图显示了超过1000个MRVS的该百分比的零分布。(b条)在BCa细胞系中发现的13个杂合SNP的等位基因特异性ChIP-qPCR结果。年轴表示每个SNP的变异和参考等位基因之间FOXA1结合水平的对数转换倍变化。红色表示显示IGR预测的FOXA1具有显著且一致的等位基因特异性结合偏好的SNP。

TOX3（TOX3）破坏，破坏

为了证明体内通过VSE和IGR方法鉴定的破坏性SNP可以促进BCa的发育，我们关注的是MCF7 BCa细胞中的BCa-raSNP rs4784227杂合子。杂合性使我们能够在自然基因组背景下确定变异体的等位基因特异性功能。SNP rs4784227与FOXA1结合位点内的FKH基序直接重叠，该结合位点位于距离基因18 kb的调控元件（标记为H3K4me2）中TOX3（TOX3）基因（也称为TNRC9公司和复合年增长率9;图6a、b). IGR方法预测，与参考C等位基因相比，变异T等位基因将有利于FOXA1结合(图4f和补充图1). 因此，等位基因特异性定向ChIP分析体内确认FOXA1优先招募为T风险等位基因(图6b). 这与H3K4me2的变化无关，H3K4me2是有利于FOXA1结合的表观遗传标记，因为MCF7 BCa细胞中rs4784227的T和C等位基因之间的H3K4 me2水平相等⁴(图6a). 虽然FOXA1通常促进基因表达，但与Groucho/TLE蛋白共同结合染色质会导致局部染色质浓缩和转录抑制²⁶与C等位基因相比，与FOXA1结合增加相关的rs4784227的风险变异T等位基因也显著受Groucho/TLE的结合(图6c). 此外，与C等位基因相比，H3K9Ac（活性增强子的染色质特征）在T等位基因处的富集程度显著降低⁷(图6d).

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图6

BCa-raSNP rs4784227通过FOXA1亲和性调制干扰增强子功能。(a–d)在rs4784227处进行H3K4me2组蛋白修饰（增强子）、FOXA1和TLE结合以及H3K9Ac（活性增强子）的ChIP-qPCR。C等位基因是参考基因，T等位基因则是风险变体。(e、 （f）)3C测序结果显示了增强子处杂合SNP（rs4784227）和TOX3（TOX3）内含子（rs2193094）。(克)中两个等位基因的RNA和DNA水平之间的比率TOX3（TOX3）内含子。误差线，SEM来自三个重复测量。

使用BglII或MspI限制酶进行的染色质构象捕获分析（3C）表明，rs4784227区域与TOX3（TOX3）基因(图6e、f). 因此，TOX3（TOX3）是含有rs4784227的调控区的基因靶点。为了评估rs4784227等位基因对TOX3（TOX3）基因表达，我们在TOX3（TOX3）在MCF7细胞中。对3C产物进行测序表明，rs4784227的参考C等位基因和变异T等位基因分别与rs2193094的T和G等位基因有物理联系(图6e、f和补充图2). 等位基因特异性表达分析表明，与G等位基因相比，rs2193094的T等位基因优先表达，表明变异T等位蛋白在rs4784227处具有抑制作用(图6g). 这与之前的结果一致在体外荧光素酶报告分析²².

MCF7细胞的RNA-Seq数据显示了6个基因(TOX3、CHD9、RBL2、AKTIP、RPGRIP1L和FTO)在以rs4784227 SNP为中心的~3.5 Mb基因组窗口中表达(补充图3). 除了第一个内含子中的rs2193094 SNP外TOX3（TOX3），我们在瑞士法郎9和自由贸易组织（分别为rs35925303和rs11646260）。而rs2193094的变异G等位基因与TOX3（TOX3）与参考T等位基因相比，rs35925303的变异和参考等位基因的RNA水平没有显著差异(瑞士法郎9)或rs11646260(自由贸易组织)单核苷酸多态性(图7a). 此外，我们对11个ESR1+和FOXA1+乳腺癌细胞系中的rs4784227单核苷酸多态性进行了基因分型，并提取了其表达数据TOX3（TOX3）来自Neve乳腺癌细胞系数据库¹只有一个细胞系T47D是rs4784227的T等位基因纯合子。相应地，T47D的TOX3（TOX3）将所有杂合（N=3）细胞系与纯合的rs4784227的C等位基因（N=7）细胞系进行比较，我们观察到rs4784277的T等位基因与TOX3（TOX3）（单侧p=0.046，图7b). 该关联与之前的一项研究一致，该研究确定了rs3803662 SNP与TOX3（TOX3）1401例欧洲血统乳腺癌患者的基因表达²⁷在欧洲血统个体中，rs3803662 SNP与rs4784227 SNP在显著LD中（r2=0.864，D'=1，HapMap CEU）(补充表20). 事实上，rs4784227的T等位基因只与rs3803662的A等位基因分离，这也与TOX3基因表达减少有关，支持我们的结论，即rs4784277的功能性T等位蛋白与TOX3（TOX3）此外，我们还包括了其余五个基因(CHD9、RBL2、AKTIP、RPGRIP1L和FTO)在e-QTL分析中以rs4784227为中心的~3.5 Mb窗口中表达(图7b和补充图3). rs4784227单核苷酸多态性与这些基因的表达没有显著相关性。总的来说，这表明等位基因特异性表达对于TOX3（TOX3）依赖于rs4784227单核苷酸多态性。

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图7

BCa-raSNP rs4784227通过干扰细胞增殖TOX3（TOX3）基因表达。(一)每个SNP的DNA和RNA水平的变异和参考等位基因之间的比率（rs2193094TOX3（TOX3）; rs35925303英寸瑞士法郎9; rs11646260英寸自由贸易组织). (b条)基于细胞系的SNP rs4784227的e-QTL结果和基因表达水平TOX3（TOX3）（rs4784227:T47D，T/T；HCC1428，C/T；MCF7，C/T，MDA-MB-415，C/T。UACC-812，C/C。(c)ZR75-1细胞中的TOX3沉默。(d日)2天后计数的细胞数TOX3（TOX3）沉默。N.S.，不显著；*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.001。误差线，SEM来自三个重复测量。

为了评估TOX3在乳腺癌细胞中的作用，我们在沉默后进行了细胞增殖试验TOX3（TOX3）我们使用了ZR75-1乳腺癌细胞系，因为它的高表达水平TOX3（TOX3）.沉默TOX3（TOX3）与对照治疗（抗荧光素酶siRNA）相比，ZR75-1乳腺癌细胞的细胞增殖显著增加，表明TOX3在乳腺癌细胞中起抑癌作用(图7c、d).

讨论

BCa-raSNP的潜在机制尚不清楚。与大多数其他复杂性状一样，这些raSNP映射到基因组的非编码区域²在这里，我们证明BCa-raSNP富含FOXA1和ESR1转录因子结合位点以及H3K4me1组蛋白修饰。此外，我们发现这种富集是因子特异性的、细胞类型特异性的和癌症类型特异性的。支持GWAS raSNPs调控机制的证据正在稳步增长^28–31在转录起始位点100 bp内具有差异等位基因占有率的杂合位点已被证明与差异基因表达密切相关，并可富集GWAS SNP³²FOXA1先驱因子的结合是染色质开放和核小体定位的中心，有利于转录因子募集^{4,11,12,33,34}此外，FOXA1对ESR1阳性BCa细胞中雌激素刺激反应的转录程序的建立至关重要^{4,11,12,33,35,36}.

在难以捉摸的BCa-raSNP中，rs4784227是研究最多的。16q12.1位点，包含rs4784227和TOX3（TOX3）在欧洲、亚洲和非洲血统人群中，该基因通过GWAS与乳腺癌相关^37–4016q12.1基因座的精细定位显示，rs4784227是欧洲和亚洲人群中关联性最强的SNP^22,41.体外实验表明，风险等位基因T降低荧光素酶活性并改变DNA蛋白结合模式，表明rs4784227具有调节作用²²在功能上，TOX3属于染色质结构修饰蛋白的HMG-box家族⁴²主要表达于上皮细胞，靶向抗凋亡和促凋亡转录物，防止细胞死亡⁴³此外，它刺激雌激素反应元件（ERE）依赖性转录程序⁴³.从统计角度来看，TOX3（TOX3）在复发为骨的乳腺癌中有差异表达⁴⁴基因中包含的SNP与BRCA1或BRCA2的突变相互作用，增加乳腺癌风险⁴⁵在这里，我们显示rs4784227的风险等位基因T使TOX3（TOX3）基因表达。这种减少是由于rs4784227所在增强子对FOXA1的亲和力增加。FOXA1结合与TLE阻遏物的招募有关，这会降低增强子的强度（H3K9Ac减少）。由染色质环介导TOX3（TOX3）启动子，减弱的rs4784227增强子下调基因的转录输出(图8). 癌症风险相关SNP的这种作用机制，即远端增强子处转录因子结合的中断和随后的基因表达变化，如结直肠癌中的报道，似乎是风险相关SNPs的一种常见作用机制^23–25.

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图8

的示意图TOX3（TOX3）位点和16号染色体同源物之间和内部的物理相互作用。

与疾病相关的单核苷酸多态性的数量与功能性特征的单核苷酸多样性的数量（rs6983267、rs4784227和rs1859962）之间存在显著差异^46,47因此，无法推断任何特定疾病的遗传风险促进的一般机制。这里，我们表明，对于BCa，大多数风险相关SNP调节FOXA1结合。首先，它们与FOXA1结合位点中包含的SNP处于完全连锁不平衡状态。其次，这些关联的SNP能够显著改变FOXA1的招募。FOXA1等先锋因子和ESR1等谱系特异性因子是建立细胞身份的转录程序的基础⁴因此，我们已经证明，大多数能够破坏正常乳腺细胞特性的SNP调节FOXA1先锋因子的结合。

是时候转向GWAS后人类遗传学阶段了⁴⁸Freedman等人提出了一套用于GWAS后癌症风险位点功能表征的原则⁴⁶但在实现这一转变之前，仍有一个主要障碍需要克服。GWAS raSNP的数量庞大且不断增长，每个raSNP都有数百或数千个ldSNP。此外，由于大多数ldSNP位于调控区域，每个ldSNP都有一系列潜在的基因靶点。这种分支泥沼使得对所有GWAS结果进行详尽的函数表征是不可行的。需要一种机制来优先考虑这一点，而不是假定的因果SNPs的丰度。本研究中开发和应用的方法提供了这种机制(补充图4). 首先，他们确定最有希望的转录因子、组蛋白修饰或其他基因组注释（VSE）。其次，他们在数千个ldSNP中确定候选SNP，用于实验性后续研究（IGR）。功能基因组数据的整合将使GWAS后风险位点的特征化得到牵引和推进。

URL。NHGRI GWAS目录，www.genome.gov/gwastudies网站; 核受体Cistrome项目，肉苁蓉.dfci.harvard.edu/NR_cistrome/.

联机方法

实验程序

补充材料

致谢

脚注

工具书类