临床癌症研究。作者手稿；PMC 2012年9月28日发布。
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c-Src和c-Met在介导头颈癌对c-Src-抑制的耐药性中的独特相互作用
,1 ,1 ,1 ,1,2和1,三，*
Banibrata Sen公司
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心胸颈部肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
彭少华
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心胸颈部肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
巴比塔·赛加尔
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心胸颈部肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
米歇尔·威廉姆斯
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心胸颈部肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心病理学系，德克萨斯州休斯顿
费耶·约翰逊
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心胸颈部肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
三德克萨斯大学休斯顿生物医学研究生院
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心胸颈部肿瘤医学系，德克萨斯州休斯顿
2得克萨斯州休斯顿得克萨斯大学MD安德森癌症中心病理学系
三德克萨斯大学休斯顿生物医学研究生院
*通讯地址：德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号德州大学安德森癌症中心432单元胸科/头颈肿瘤医学系，邮编77030-4009；电话：713-792-6363；传真：713-792-1220；gro.nosrednadm@snhojmf - 补充资料
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摘要
目的
癌细胞中的c-Src抑制可导致肿瘤细胞的侵袭性消失，但对细胞凋亡的影响是可变的。c-Src下游促进生存的途径没有很好的特征。因为既能减少侵袭又能诱导显著凋亡的癌症治疗是理想的，所以我们试图描述抗c-Src抑制的机制。
实验设计
在一组口腔癌细胞系中，c-Src被抑制，随后的存活率和信号传导被测量。使用免疫沉淀和体外激酶分析评估c-Src和c-Met之间的相互作用。测定细胞毒性并计算Chou-Talalay组合指数。使用口腔癌原位模型评估c-Met和c-Src抑制剂的效果。
结果
c-Src的抑制在敏感细胞系中导致c-Met抑制，但在耐药细胞系中没有。分离的c-Met在敏感细胞和抗性细胞中都是c-Src底物，但在完整的抗性细胞中c-Src和c-Met没有相互作用。为了研究这种机制的生物学后果，我们证明了c-Src和c-Met抑制剂的联合具有协同细胞毒性、增强凋亡和减小肿瘤大小。
结论
持续的c-Met活化可以介导对c-Src抑制的抵抗。这些数据表明，敏感细胞和耐药细胞中c-Met和c-Src信号的差异分别是由于促进或抑制相互作用的不同因素所致，而不是由于c-Src或c-Met的内在结构变化。c-Src和c-Met抑制的协同细胞毒性作用可能对头颈癌的治疗很重要。
关键词：c-Src、c-Met、头颈癌
介绍
所有上皮性肿瘤在临床实践中都面临着巨大的挑战，但头颈部肿瘤的解剖结构使其特别难以治疗。美国每年约有45000例新的头颈癌确诊病例，估计全球发病率为500000(1). 然而，发病率和存活率统计数据只是故事的一半；癌症和治疗导致的解剖和生理扭曲对重要功能（如饮食、说话和听力）有着深刻的影响，面部表情的扭曲导致幸存者的社会隔离。尽管新的方法改善了晚期头颈部鳞癌患者的局部控制，但局部和远处复发仍然很常见，几乎总是致命的。因此，迫切需要改进这些肿瘤患者的系统治疗，以提高治愈率并降低发病率。
最成功的靶向分子治疗方法是抑制癌基因靶点，尤其是酪氨酸激酶。HNSCC中一个潜在的癌基因靶点是非受体酪氨酸激酶（SFKs）的c-Src家族(2,三). c-Src的异常激活已在许多上皮性肿瘤中得到证实，包括HNSCC。c-Src调节控制多种生物过程的多种信号级联，其在癌细胞中的抑制可导致凤尾鱼非依赖性生长、增殖、存活、侵袭、迁移、转移和肿瘤血管减少(2). 然而，在上皮性癌中，一些研究人员观察到，尽管c-Src抑制可减少迁移和侵袭，但对增殖或凋亡几乎没有影响(4–6). 在12个结肠癌细胞系中的10个中，完全抑制c-Src活性并不影响细胞增殖，尽管它确实抑制了粘附和迁移(7). 同样，胰腺癌细胞中的c-Src抑制对细胞周期进程没有影响，但完全抑制了迁移和血管生成(8). 我们证明，c-Src抑制导致所有HNSCC细胞株的侵袭和迁移普遍而深刻地减少，但仅在9个HNSCC肿瘤细胞株中的4个产生细胞毒性(9,10). 显然，c-Src可以独立地介导不同的生物过程。这可以通过c-Src在其多个下游底物上的差异效应来实现。
虽然介导c-Src迁移效应的分子机制已经被很好地描述(11)而那些介导增殖和存活的基因则没有很好的定义。c-Src可以通过与生长因子受体以及ERK1/2、JAK/STAT和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）途径的相互作用调节其对增殖和生存的影响。c-Src可能通过3种不同的机制激活PI3K通路：AKT的直接相互作用和磷酸化(12,13); PI3K的相互作用和激活(14,15); PTEN活性的逆转(16).
由于局部侵袭是HNSCC发病率和死亡率的关键决定因素，因此减少局部侵袭并诱导显著癌细胞毒性的系统治疗将是理想的。鉴于c-Src抑制已经导致侵袭性显著降低，我们在本研究中试图了解c-Src-抑制对癌细胞存活影响的机制。我们研究了几种已知与c-Src相互作用的信号通路，发现了c-Src-抑制的生物效应与受体酪氨酸激酶c-Met的下游信号效应之间的相关性。已知c-Met在c-Src上游和下游发出信号。它介导肺癌对表皮生长因子受体（EGFR）抑制的抵抗(17,18)胃癌细胞系中的c-Src抑制(19). 在HNSCC细胞系和肿瘤中观察到c-Met通过其配体肝细胞生长因子（HGF）激活(20,21); 这种激活刺激HNSCC细胞的迁移和侵袭，并抑制其凋亡(20,22–25). 我们假设c-Src抑制后持续的c-Met激活介导了对凋亡和细胞周期阻滞的抵抗。
材料和方法
材料
Western blot分析中使用的抗体包括c-Met（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）；pSFK（Y416）、pSTAT3（Y705）、pPDK1（S241）、pan AKT、pAKT（S473）和pMet（Y1234/1235和Y1349）（Cell Signaling Technology，Beverly，MA）；HGF和pMet（Y1365）（马萨诸塞州坎布里奇Abcam）、pMet（Y1003）（马里兰州贝德福德BD Bioscience）和β-actin（密苏里州圣路易斯Sigma Chemical）。对于免疫沉淀研究，从Calbiochem（加州La Jolla）获得琼脂糖结合c-Src抗体，从Santa Cruz Biotechnology获得琼脂酶结合c-Met抗体。Dasatinib购自德克萨斯大学MD Anderson癌症中心药房，制成10 mM二甲基亚砜（DMSO）储备溶液。PHA665752和PF02341066（克里唑替尼）由辉瑞制药公司（新伦敦，CT）提供，并在二甲基亚砜中制备为10 mM储备溶液。人HGF Quantikine ELISA购自研发系统（明尼阿波利斯，明尼苏达州）。
细胞培养
人类HNSCC细胞系取自Jeffrey Myers博士（得克萨斯州休斯顿MD Anderson癌症中心），并按前述方法进行维护(10). 对提交给约翰·霍普金斯大学片段分析核心设施（马里兰州巴尔的摩）的细胞DNA进行短串联重复序列分析。通过将PowerPlex 1.2平台（威斯康星州麦迪逊市Promega）生成的等位基因短串联重复序列模式与美国类型培养物收集库数据库进行交叉比较，验证所有细胞系。细胞从经鉴定的库存中解冻后不超过6个月在培养基中传递。
MTT分析
如其他地方所述，通过MTT试验评估细胞毒性(9). 对于每个实验条件，至少处理4口井。使用Chou-Talalay方程计算细胞毒性效应和组合指数，其中考虑了效力（IC50)剂量效应曲线的形状(26–28)，使用CalcuSyn软件（密苏里州弗格森市Biosoft）。
细胞周期和凋亡检测
对于细胞周期分析，细胞被采集、固定并用碘化丙啶染色，如前所述(29). 使用ModFit软件（澳大利亚新南威尔士州图拉穆拉市Verity软件公司）通过荧光激活细胞分选分析（FACS）（FACScan；加利福尼亚州圣何塞市Becton Dickinson）在细胞荧光仪上分析DNA含量。为了分析细胞凋亡，按照制造商的方案（APO-BRDU试剂盒；加利福尼亚州圣地亚哥Phoenix Flow Systems公司）固定细胞并进行末端脱氧核苷酸转移酶生物素-dUTP镍标记（TUNEL）染色，如前所述(29).
siRNA转染
收集、清洗和悬浮细胞（106细胞/100 mL）的Nucleofector-V溶液（Amaxa，Gaithersburg，MD）中，并加入siRNA（200 pmol/100 mL）。将细胞电穿孔（U-31 Nucleofector程序，Amaxa），然后立即用预加热的500μL Dulbecco改良基本培养基稀释，并将其镀在6孔板上。16h后改变培养基。所有c-Src和c-Met siRNA预先设计为4组独立序列（siGENOME SMARTpool，Dharmacon Inc.，Lafayette，CO）。对照组包括转染非靶向（加扰）siRNA的细胞和模拟转染细胞（即无siRNA）。
免疫沉淀和蛋白质印迹分析
如前所述进行蛋白质印迹分析和免疫沉淀(9,29). 简单地说，细胞在冰上进行裂解，裂解产物在4°C下以15000 rpm离心5分钟。对于免疫沉淀，使用蛋白A和G Sepharose珠（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）预处理等量的蛋白细胞裂解物上清液（500 mg）。预先分离的裂解液与5μg琼脂糖结合的c-Met或c-Src一级抗体孵育过夜。用免疫复合物洗涤缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl[pH7.5]，100 mmol/LNaCl，1%Triton X-100，1 mmol/LEGTA，1 mmol/L EDTA，1%甘油，20μg/mL亮氨酸蛋白酶，10μg/mL抑肽酶，1 mm醇/L苯甲基磺酰氟，1 mmol/L钒酸钠）洗涤含有琼脂糖珠的免疫沉淀物4次用1×样品缓冲液煮沸5 min。免疫沉淀和Western blot均用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将等量的蛋白分块溶解，转移到硝化纤维素膜上，用一抗进行免疫印迹，并用辣根过氧化物酶结合二级抗体（加州Hercules Bio-Rad实验室）和ECL试剂（新泽西州皮斯卡塔韦Amersham Biosciences）进行检测。
体外激酶测定
体外如前所述进行激酶分析(29). 简言之，在细胞进行裂解之前，将Tu167和Osc-19细胞与100 nM达沙替尼、DMSO（载体对照）或2μM PHA665752孵育7小时，并如前一段所述对c-Met或c-Src进行免疫沉淀。将免疫复合物洗涤并重新悬浮在含有15 microCi[γ32P] ATP。在激酶测定过程中，将100nM达沙替尼或2μM PHA6665752添加到各自的样品中。用样品缓冲液在室温下30分钟后终止反应，并用8%SDS-PAGE分离煮沸的免疫复合物。放射自显影术检测放射性标记蛋白。当c-Src和c-Met一起分析时，两者都是独立的免疫沉淀，然后在激酶分析中结合免疫沉淀部分。
原位裸鼠模型
所有的动物程序都是按照机构动物护理和使用委员会的政策进行的。如前所述，将Osc-19-LN5-Rluc细胞粘膜下注射到裸鼠舌头中(30). 将发生肿瘤的小鼠随机分为四个治疗组：单独使用载体（对照组）、单独使用克雷唑替尼[PF02341066（20 mg/kg/天）]、单独使用达沙替尼（20 mg/kg天）或达沙替尼加克雷唑替尼；所有药物均经口灌胃给药。如前所述，在第1天、第5天和第9天使用卡尺和体内生物发光成像直接测量肿瘤体积(30). 第10天处死小鼠，解剖肿瘤。对小鼠进行区域和远处转移检查。将舌肿瘤均质化并进行Western blotting。
结果
口腔鳞癌细胞系对SFK抑制有不同的敏感性
我们使用来自口腔的11个独立、经鉴定的HNSCC细胞系组成的小组来测量SFK抑制对细胞毒性、增殖和存活的影响。所有细胞系均与SFK抑制剂达沙替尼孵育，并通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）测定细胞毒性。中值抑制浓度（IC50)对于45 nM到>5μM的细胞系(). 我们还测定了SFK抑制对达沙替尼敏感性不同的7个细胞系的细胞周期进展和凋亡的影响(). 达沙替尼不影响耐药细胞系（IC）的增殖或存活50值>100 nM），但影响了3个敏感系中的2个的质量。
SFK抑制对HNSCC细胞凋亡和细胞周期的影响细胞用载体对照或100 nM达沙替尼处理24 h，并用TUNEL染色进行分析(A类)或用碘化丙啶染色并通过FACS分析(B类). 凋亡细胞或细胞在每个细胞周期阶段的比例以占总数的百分比表示。横杆，SD*P（P）与车辆控制相比，<0.05（B，对S相的影响）。
表1
集成电路50Dasatinib在HNSCC细胞系中的数值
| 细胞系 | 来源 | 集成电路50（毫微米） | 解释 |
|---|
| 图167 | 口腔、口底 | 45 ± 8 | 敏感 |
| TR146型 | 口腔 | 67 ± 2 | 敏感 |
| PCI-24型 | 口腔、舌头 | 53 ± 14 | 敏感 |
| PCI-13型 | 口腔 | 96 ± 15 | 敏感 |
| HN5型 | 口腔、舌头 | 140 ± 79 | 中级 |
| UMSCC47公司 | 口腔、舌头 | 160 ± 34 | 中级 |
| UMSCC2公司 | 口腔、牙槽嵴 | 180 ± 37 | 中级 |
| UMSCC15A公司 | 口腔 | 186 ± 15 | 中级 |
| OSC19系统 | 口腔 | 312 ± 36 | 抗性 |
| LN686型 | 口腔、舌头 | 324 ± 101 | 抗性 |
| 图167R2 | 口腔、口腔底部 | 803 ± 189 | 抗性 |
| 图167R1 | 口腔、口底 | >1000 | 抗性 |
| 图138 | 口腔 | >5000 | 抗性 |
长时间接触SFK抑制导致获得性耐药性
为了研究在等基因环境下对SFK抑制的耐受性，将敏感细胞株Tu167与达沙替尼的浓度增加进行培养。最终，两种细胞系（Tu167R1和Tu167R2）能够在300nM的达沙替尼中生长，其生长时间与亲本细胞系的生长时间相似。这两种细胞系的IC都明显较高50值大于Tul67()暴露于达沙替尼后，未发生细胞周期阻滞或凋亡().
抑制SFK导致对SFK抑制敏感的HNSCC细胞中c-Met抑制
为了确定SFK耐药的机制，我们研究了上皮性恶性肿瘤中与SFK协同或下游的信号通路。我们观察到SFK抑制导致敏感细胞系中c-Met的抑制()但不适用于抗性品系(). 此外，当接触达沙替尼时，发生凋亡的细胞株（Tu167、PCI-13）中的PI3K通路（AKT或PDK1）受到抑制()而pERK1/2测定的对有丝分裂原活化蛋白激酶途径的影响是可变的（数据未显示）。令人惊讶的是，我们还观察到，即使在Tu167R2中达沙替尼（200 nM）浓度升高时，c-Met和AKT也不受抑制，而达沙替尼可抑制该等基因耐药细胞系中的SFK(). 达沙替尼即使在较高浓度（200 nM）下也不能抑制Tu167R1中的SFK，这表明靶细胞（即SFK）对药物的直接耐药性是这些细胞对达沙替尼细胞毒作用不敏感的机制(图S1). 因此，我们没有进一步研究Tu167R1中的c-Src和c-Met相互作用。
SFK抑制或缺失对敏感和耐药HNSCC细胞株c-Met和AKT磷酸化的影响9个HNSCC细胞系与100 nM达沙替尼孵育(A、 B、C类)用于指定的时间(A类)或持续7小时(B、 C、D)并通过Western blotting进行分析。(C类)通过密度测定法分析9株HNSCC细胞系活化Met（pMet Y1234/1235）的蛋白质印迹，并将其归一化为β-肌动蛋白和对照（即载体处理）。（E）用c-Src特异性siRNA或干扰siRNA转染HNSCC细胞，或模拟转染，转染72 h后通过Western blotting分析信号分子。
c-Src的特异性抑制导致敏感HNSCC细胞中c-Met的抑制
为了确定c-Met的抑制是由于SFK的抑制还是达沙替尼的非靶向效应，使用小干扰RNA（siRNA）特异性地消除c-Src。在敏感细胞中，c-Src敲除导致c-Met受到实质性抑制，而在耐药细胞中，c-Src缺失不影响c-Met的激活(). 与达沙替尼的结果类似，特异性c-Src敲除导致敏感细胞中AKT的抑制，而不是耐药细胞中的AKT。
c-Src或c-Met的基线表达或激活不能预测对SFK抑制剂的生物反应
我们假设，基础水平较高的活化c-Src或c-Met细胞系更有可能对SFK抑制敏感。我们检测了这些蛋白在8个HNSCC系中的基本表达和激活(图S2)之前已经描述过的()并没有发现这种相关性。
c-Met是敏感和耐药细胞系中的c-Src底物
为了确定c-Met是否是直接的c-Src底物，我们培养了来自耐药（Osc-19）和敏感（Tu167）细胞系的分离c-Met和c-Src-或两者，并通过在体外激酶分析。正如预期的那样，达沙替尼和c-Met抑制剂PHA665752分别特异性地抑制了c-Src和c-Met激酶活性(，1-6车道）。在这两种细胞系中，c-Src的抑制导致磷酸化c-Met的表达降低(，通道7 vs.8），但c-Met的抑制并不影响磷酸化c-Src的表达(，车道7与9）。此外，在PHA665752和c-Src的存在下，c-Met被磷酸化，证实c-Met是一种直接的c-Src底物(，通道9），并作为c-Src激酶的下游信号分子。
c-Met和c-Src作为分离蛋白在完整细胞中的相互作用(A、 B类)从2个HNSCC细胞系中免疫沉淀（IP）c-Src或c-Met，并与2.5μM PHA6665752（P）或100nM达沙替尼（D）或其组合（D/P）一起孵育，如图所示，通过在体外激酶分析。(C类)从与100 nM达沙替尼或载体对照培养7 h的HNSCC细胞中免疫沉淀c-Src和c-Met。免疫复合物通过11%SDS-PAGE溶解，并用c-Src或c-Met抗体印迹。
c-Src和c-Met相互作用在HNSCC细胞系中不同
虽然在体外激酶分析表明，c-Met在敏感和耐药细胞系中都是c-Src底物，c-Src敲低或抑制降低了一些HNSCC细胞系中的c-Met活化，但其他细胞系则没有。这些数据表明，c-Src或c-Met分子没有内在变化，但在敏感和耐药的完整细胞中，c-Src和c-Met之间的相互作用不同。为了研究这种可能性，我们从敏感和耐药细胞中免疫沉淀c-Met或c-Src(). 在Tu167细胞中，c-Src和c-Met的免疫沉淀证明了c-Src-和c-Met-之间的相互作用。在耐药细胞中没有这种相互作用。
SFK对c-Met的抑制作用不是通过配体释放介导的
我们研究了HGF的释放是否介导SFK对c-Met活化的影响。在一组对达沙替尼具有不同敏感性的6个HNSCC细胞系（Tu167、Tu167R2、PCI13、Osc19、Tu138和TR146）中，我们没有通过ELISA检测到HGF分泌到对照细胞或达沙替尼特处理细胞的细胞培养基中（培养48小时）。同样，达沙替尼治疗后，这些细胞株中HGF的细胞水平没有改变(). 外源性HGF导致c-Met在4个不同位点活化(). 在敏感细胞中，达沙替尼在有无外源性HGF的情况下抑制Y1234/1235（激活环）、Y1365（形态/运动）和Y1349（Gab1结合）的磷酸化，但不影响Y1003（泛素化）。所有细胞株均表达衔接蛋白Gab1。
抑制HGF和EGFR对c-Met活化的影响(A类)将HNSCC细胞血清饥饿，然后与50 ng/ml HGF（5分钟）和/或100 nM达沙替尼（7小时）孵育，如图所示，并通过Western blotting分析信号分子。(B类)将HNSCC细胞与1μM埃洛替尼、100 nM达沙替尼、载体对照或这两种药物的组合培养7小时，然后通过Western blotting进行分析。
EGFR促进耐药细胞株中c-Met的活化
之前的报告已经证明EGFR和c-Met之间存在相互干扰。为了确定EGFR是否有助于HNSCC中c-Met的激活，将细胞与EGFR抑制剂厄洛替尼、达沙替尼或两者的联合培养(). 在所有测试的细胞系中，EGFR抑制确实导致c-Met失活，而SFK激活没有影响。厄洛替尼和达沙替尼联合使用对c-Met活化产生协同作用，并显著降低耐药细胞系中AKT活化。同样，我们以前的工作证明达沙替尼和厄洛替尼在体外对HNSCC细胞具有加性作用(9).
SFK和c-Met抑制剂在体内外对HNSCC细胞活力具有协同作用
鉴于c-Met在对SFK抑制有抵抗力的细胞系中不受抑制，我们假设持续的c-Met激活可能介导这种抵抗。为了验证这一点，用达沙替尼、PHA665752或其组合培养对SFK抑制具有不同敏感性的7株HNSCC细胞株，并用MTT法测定细胞毒性。我们还计算了药物组合的组合指数(). 组合指数值小于1表示协同作用；等于1的值表示累加效应；值大于1表示对抗。具有代表性的细胞毒性数据如所示.
SFK和c-Met联合抑制导致协同细胞毒性和信号传导效应体外和体内图138(A类)和Osc19(B类)用PHA665752单独处理细胞、达沙替尼单独处理细胞或两种药物按指定剂量以固定比例联合处理细胞72小时。活细胞数量通过MTT分析（外径，光密度）确定，并表示为折叠对照（单独载体）。(C类)用100 nM达沙替尼、2μM PHA665752或联合用药处理Tu138细胞24 h，并用FACS分析进行TUNEL染色分析。(D类)用100 nM达沙替尼和/或2.5μM PHA665752处理HNSCC细胞7小时，并用所示抗体进行免疫印迹分析。（E） 携带原位舌肿瘤（转染荧光素酶的Osc19细胞）的小鼠分别用克里唑替尼、达沙替尼或两种药物联合治疗，并测量肿瘤大小。P（P）第7天，联合用药的数值分别为0.002（与对照组相比）、0.03（与达沙替尼相比）和0.01（与克雷佐替尼相比）。P（P）联合用药10天时的数值分别为0.007（与对照组相比）、0.02（与达沙替尼相比）和0.05（与克雷佐替尼比较）。(*P（P）≤0.05（相对于车辆控制）。
表2
达沙替尼和PHA665752作为单药和联合用药的中位效应
| 细胞系 | 单一代理，IC50 | 组合，IC50 | 组合指数模拟 | 解释 |
|---|
|
|---|
| 达沙替尼（nM） | PHA665752（微米） | 达萨替尼（nM） | PHA665752（微米） | F类一= 0.5 | |
|---|
| 图167 | 45 ± 7.7 | 6.8 ± 2.1 | 20 ± 6.6 | 1.6 ± 0.53 | 0.68 ± 0.15 | 协同效应 |
| TR146型 | 67 ± 2.3 | 2.6 ± 1.0 | 27 ± 13 | 0.53 ± 0.27 | 0.60 ± 0.22 | 协同效应 |
| UMSCC14a公司 | 186 ± 15 | 1.9 ± 0.7 | 28 ± 18 | 0.57 ± 0.37 | 0.44 ± 0.26 | 协同效应 |
| 奥斯克19 | 312 ± 36 | 8.7 ± 4.9 | 107 ± 39 | 1.1 ± 0.39 | 0.47 ± 0.12 | 协同效应 |
| 图167R2 | 803 ± 189 | 22 ± 1.4 | 268 ± 86 | 1.1 ± 0.34 | 0.38 ± 0.09 | 协同效应 |
| 图167R1 | >1000 | 6.5 ± 2.2 | 316 ± 129 | 1.3 ± 0.50 | 0.41 ± 0.13 | 协同效应 |
| 图138 | >5000 | 2.1 ± 0.3 | 148 ± 19 | 1.5 ± 0.02 | 0.72 ± 0.07 | 协同效应 |
没有一种细胞株表现出对PHA-665752的极端敏感性，这种敏感性出现在c-Met（IC）扩增的细胞中50<100毫微米）(31). 然而，7条线路中有3条线路显示IC50小于或接近2.5μM的值，在这个浓度下我们观察到c-Met的显著抑制(图S3); 浓度为1μM时，c-Met的抑制作用不完全（未公布数据）。正如假设的那样，c-Met和SFK抑制在达沙替尼耐药细胞系中是协同作用的。与细胞毒性数据一致，这一发现表明，联合用药导致的细胞凋亡明显多于单独用药(). 令人惊讶的是，该组合在达沙替尼敏感（Tu167，TR146）和中间（UMSCC14a）细胞系中也具有协同作用，这表明抑制SFK抑制后剩余的c-Met活化足以增强细胞毒性().
正如预期的那样，PHA665752抑制了HNSCC细胞株中的c-Met，达沙替尼抑制了c-Src(). 我们还检测了这些抑制剂对激活的ErbB3的影响，因为ErbB3s可以在EGFR抑制剂耐药的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系中介导c-Met的作用(17). 然而，我们没有发现c-Met或SFK抑制对激活的ErbB3有任何一致的影响。在大多数这些细胞系中，这种结合导致通过PI3K途径（PDK1或AKT）的信号减少。
与我们的体外数据一致，我们还观察到c-Src和c-Met的联合抑制降低了体内肿瘤的大小(,S4系列). 在体内研究中，由于PHA665752的口服生物利用度较差，我们使用了克里唑替尼。单用药物对肿瘤大小没有显著影响。肿瘤的免疫印迹证实药物影响了靶点(图S5). 与对照组（7/28，25%）或单一药物[达沙替尼（8/27，30%）或克雷唑替尼（4/21，19%）]相比，联合用药（检查的20个淋巴结中有3个淋巴结含有肿瘤，15%）治疗的小鼠淋巴结转移减少的趋势无统计学意义。有淋巴结转移的小鼠数量在42-56%之间。
我们之前观察到，c-Src抑制导致普遍抑制侵袭和迁移，而不依赖于其对凋亡的影响(10). PHA665752和达沙替尼均抑制入侵和迁移；联合用药比单一用药更有效(图S6). 这种作用与两种药物对细胞毒性的作用无关。
HNSCC细胞株中c-Src和c-Met的特异性缺失
为了确定达沙替尼和PHA665752增强的细胞毒性作用是否分别是由于药物对c-Src和c-Met的特异性作用，我们用siRNA特异性地敲除c-Src-和c-Met-，并用MTT法测量存活细胞(,第7部分). 在Osc-19和Tu167细胞中，c-Src缺失单独导致细胞数量减少约25%，c-Met缺失单独造成细胞数量减少大约15%(P（P）<0.05 vs.对照组或加扰siRNA）。与药理学数据一致()结果表明，这种组合比任何一种单一的siRNA都更有效，Tu167和Osc-19的细胞数分别减少了36%和54%(P（P）与对照组、加扰组、c-Src组或c-Met组相比，<0.05）。正如我们之前观察到的(29)，与达沙替尼抑制SFK相比，c-Src敲除的细胞毒性明显降低，可能是因为以下三个因素：达沙替尼可抑制所有SFK（不仅仅是c-Src），达沙替宁是一种比siRNA更有效的c-Src抑制剂，达沙替尼可能具有导致其细胞毒性的非靶向效应(32).
c-Met耗竭增强c-Src耗竭的细胞毒性Tu167和Osc19细胞转染c-Src特异性siRNA（KD，敲除）、c-Met特异性siRNA或非特异性（加扰）对照。通过MTT分析估计转染96小时后活细胞的数量，并表示为折叠对照（模拟转染）。横杆，SD*P（P）与车辆控制相比≤0.05。
讨论
在这项研究中，我们试图确定导致c-Src抑制下游细胞毒性的途径，并证明持续的c-Met激活介导c-Src抑制后的细胞存活。我们观察到c-Src抑制对c-Met活性的影响与其对细胞凋亡的影响之间的相关性。虽然从敏感细胞和耐药细胞分离出的c-Met和c-Src表现相似，但在完整的敏感和耐药细胞系中，c-Met与c-Src之间的相互作用不同。这意味着在敏感细胞中有促进c-Src/c-Met相互作用的因素，和/或在耐药细胞中有抑制这种相互作用的因子；这将在我们未来的研究中得到检验。我们推测这些因素是可以影响c-Src或c-Met定位和/或蛋白-蛋白结合和相互作用的衔接蛋白。我们研究了这种相互作用的生物学后果，发现SFK抑制剂达沙替尼和c-Met抑制剂PHA-665752具有协同的细胞毒性和促凋亡作用，并且c-Src和c-Met-siRNA的结合增强了细胞毒性。c-Met单独抑制（通过siRNA或PHA665752）对细胞毒性有统计学意义，但影响很小，表明c-Src独立于c-Met介导其部分作用。这些数据共同支持了c-Src和c-Met合作维持敏感HNSCC细胞存活的模型。在耐药细胞系中，尽管c-Src和c-Met被完全抑制，但仍必须存在可使细胞存活的替代途径(图S8).
我们没想到对c-Src抑制的抗性只有一种机制。这种情况类似于癌症对靶向药物和细胞毒性化疗药物的耐药性，这是由多种机制介导的(33). 例如，肺癌对EGFR抑制剂的耐药性可以通过EGFR（T790M）的额外突变、c-Met的扩增来介导(17)，激活胰岛素生长因子受体(34)和其他未定义的机制。相应地，用一种无偏见的方法来鉴定酪氨酸磷酸化在c-Src激活后发生显著变化的蛋白质，鉴定出136个酪氨酸磷酸化度增加的蛋白质，包括c-Met(35). 这些数据得到了以下发现的支持：表达c-Met的胃细胞系对SFK抑制诱导的细胞凋亡具有耐药性(19). 我们还证明，持续c-Src抑制后STAT3的重新激活可能有助于抵抗c-Src-抑制(29). 然而，尽管可能存在替代机制，但c-Met和c-Src抑制剂的组合在所有测试的细胞系中都是协同作用的，这表明这是未来临床研究的合理组合。
c-Met和c-Src之间的交叉反应已在其他上皮性肿瘤中得到证实，并且经常涉及她的家族成员。膀胱癌细胞株的血清饥饿导致释放可激活EGFR的生长因子，随后以c-Src依赖的方式激活c-Met。这一过程并不依赖于配体介导的c-Met活化，而是通过c-Src激活c-Met(36). 同样，c-Met可以被人肝癌细胞系中的EGFR激活(37)，间变性甲状腺癌细胞(38)和肺癌(39)，但未研究c-Src在这些系统中的作用。在另一项研究中，SFK的药物抑制导致五分之四的结肠癌细胞株磷酸化c-Met水平降低，但其机制尚未明确(40).
c-Src和c-Met之间的信号可以是双向的。在乳腺癌细胞系中，HGF激活c-Met导致c-Src和c-Met相互作用，随后激活c-Src。c-Src的激酶活性是HGF诱导的细胞运动和凤尾鱼非依赖性生长所必需的(41). 然而，在我们的研究中，c-Met的抑制并不影响完整细胞中c-Src的激活，并且达沙替尼对HGF没有影响。同样，c-Src不是直接的c-Met底物。这些差异可能是由于细胞类型的差异（HNSCC与乳腺）或用于操纵c-Met活化的不同方法（即配体刺激与激酶抑制）。此外，在一些癌细胞系中，c-Met单独抑制可导致细胞毒性和AKT抑制(42)和HNSCC体内(21)，但在我们的HNSCC中在体外，未观察到这一点。
在肺癌细胞系中，c-Met可以介导对EGFR抑制的耐药性。当具有激活EGFR突变的非小细胞肺癌细胞系与EGFR抑制剂吉非替尼浓度增加一起孵育时，产生的吉非替宁耐药非小细胞癌细胞在暴露于吉非替尼后扩增了c-Met和ErbB3和AKT的持续激活。尽管这些细胞对吉非替尼和PHA665752都有耐药性，但两者的结合导致生长抑制和AKT和ErbB3磷酸化的抑制。我们还观察到达沙替尼和PHA665752联合使用对ErbB3磷酸化的抑制，但在6个受试细胞系中只有1个（Tu138）。c-Src抑制对HNSCC细胞中活化的EGFR没有观察到影响(9). EGFR抑制确实导致耐药细胞株中c-Met抑制。在NSCLC细胞系中，c-Met激活ErbB3并不依赖于c-Src(17). 同样，在乳腺癌细胞系中，c-Met激活可以介导EGFR抵抗，但其机制与非小细胞肺癌不同。在乳腺癌细胞中，c-Met激活通过c-Src依赖机制导致EGFR激酶诱导的EGFR磷酸化。因此，尽管存在EGFR激酶抑制剂，EGFR仍然可以被磷酸化并促进细胞生长(43). 有趣的是，EGFR信号的参与可以介导NSCLC细胞对c-Met抑制的抵抗在体外进一步证明了肺癌中这两种途径之间的密切联系(44).
任何使用药物的研究都受到药物特异性的限制。尽管PHA-665752确实大幅降低了IC50对于达沙替尼，它将该值带入了一个范围，我们认为在5个达沙替尼可耐受细胞系（Osc-19和UMSCC14a）中只有2个细胞具有SFK特异性（<100 nM），这表明这些细胞系中的耐药性可能由包括JAK-STAT信号轴的其他信号通路“驱动”(29). 然而，结合c-Src和c-Met siRNA观察到的细胞毒性增强确实证明了这两种特定途径可以协同促进细胞存活。在我们使用的浓度下，PHA665752抑制c-Met、Ron、Flk-1和c-Abl(42)达沙替尼抑制c-Abl、PDGFR、Btk、EphA2等(32,45,46).
总之，本研究为HNSCC细胞中c-Src和c-Met的相互作用提供了新的见解。在对SFK抑制敏感的细胞中，c-Met是c-Src底物，两种蛋白相互作用。即使分离的c-Met是c-Src底物，这种相互作用在耐药细胞系中也没有发生。这是首次研究证明c-Met激活仅在癌细胞亚群中介导对SFK抑制的耐药性的潜在机制。SFK和c-Met抑制的协同作用可能对HNSCC的治疗具有重要的临床意义。
翻译相关性
尽管侵袭在许多癌症的病理生理学中很重要，但局部侵袭在头颈癌中至关重要，它是发病率和死亡率的决定因素，因为它与局部控制较差和生存率降低有关。同时诱导显著凋亡和减少侵袭的癌症治疗将是头颈癌的理想治疗方法。由于c-Src的抑制导致侵袭力大大降低，对生存和增殖只有中等影响，我们试图确定导致c-Src-下游细胞毒性的途径。这里我们证明持续的c-Met激活在c-Src抑制后介导细胞存活。我们研究了这种相互作用的生物学重要性，发现c-Src和c-Met的抑制是协同作用的。鉴于c-Src和c-Met抑制剂都在临床上使用，我们的研究与人类癌症治疗直接相关。
致谢
这项工作得到了头颈部SPORE（P50 CA097007）和癌症患者及其家属的慷慨捐赠的支持。FACS由国家癌症研究所拨款CA 16672资助。
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