侵袭性三阴性乳腺癌的表型可塑性证据：一种新的模型系统对人类生物学进行了综述

体外DKAT细胞系反映原发性肿瘤的特征

从患者的恶性胸腔积液中分离出的细胞迅速适应组织培养条件。分离48小时后（第1代），DKAT细胞开始在培养基中增殖，增殖时间约为24小时（数据未显示）。DKAT细胞系已连续培养70代以上。对25个中期DKAT细胞（第3代）进行光谱核型分析，另外9个细胞进行G显带和核型分析(图2). 模式染色体数为56。除了29个具有超二倍体染色体数目的细胞外，还有3个细胞具有低倍体染色体数目（104–109条染色体），2个细胞具有117或127条染色体。在主要的超二倍体细胞中，鉴定出两个克隆，一个干系和一个边线1。主干线和边线1之间的唯一区别是边线上有一个双分钟（dmin）。由于它的体积很小，无法确定这两分钟的起源。边线2是近四倍体，代表干系加倍，细胞中有一些随机染色体丢失和一些非克隆畸变，边线3是2个细胞的复合核型，染色体数目最多。

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图2

DKAT细胞系核型。

图中显示了来自边线1的有丝分裂DKAT细胞。答：。SKY显示染色体的中期细胞显示颜色。B。同一中期细胞的反转和对比增强DAPI图像。C、。以光谱分类颜色显示的具有染色体的相同中期细胞。D。SKY显示的同一中期细胞的光谱核型显示颜色。

侵袭性三阴性乳腺癌常含有TP53型和PIK3CA公司基因[2],[17],[18].第5–9外显子的测序TP53型DKAT细胞中的基因在第8外显子273密码子处发现了一个单点突变（CGT>CAT）。这是先前在MDA-MB-468乳腺癌细胞系中描述的错义突变，据报道对p53功能有害[19],[20].在乳腺肿瘤中，PIK3CA公司已发现外显子9和20经常发生突变[21].排序PIK3CA公司DKAT基因组DNA的外显子9和20在这两个外显子的编码区内未发现突变。

采用多种技术检测DKAT细胞与三阴性乳腺癌相关的蛋白的基线表达和侵袭性表型，包括EMT标记物、祖细胞样细胞标记物和PI3K/AKT通路激活标记物。基线DKAT表达数据摘要见表2免疫组织化学分析显示，DKAT细胞没有ER/PR染色，但EGFR和荧光染色阳性就地杂交显示的二倍体拷贝数HER2型，与三阴性原发性人类肿瘤一致（数据未显示）。免疫荧光和免疫印迹显示，DKAT细胞表达其他与基底乳腺上皮细胞一致的标记物，包括CK5和CK17、p63和E-cadherin，这些标记物定位于细胞膜和细胞质中(图3A). DKAT细胞也表达管腔上皮细胞标记物CK18，尽管所有其他受试细胞系也表达CK18，包括间充质MDA-MB-231细胞系[22],[23]Western blot分析表明，DKAT细胞表达高水平的丝氨酸473磷酸化Akt，这是三阴性乳腺癌的常见特征(图3B)[24]虽然我们没有观察到PIK3CA外显子9或20的突变，但473号Ser的Akt磷酸化可能是由于DKAT细胞系中PTEN水平相对较低所致(图3B). 细胞表面标志物CD44和CD24的FACS分析显示，DKAT细胞系具有高百分比的CD44细胞⁺/CD24型^−/低据报道，在致瘤性和干细胞样细胞活性方面表现丰富[25],[26]最近与经历EMT的细胞有关[10],[27](图3C). 综上所述，这些观察结果表明，DKAT细胞表现出基底和管腔上皮标记物的基线表达，AKT-丝氨酸473的磷酸化，以及祖细胞样标记物的表达。

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图3

DKAT细胞表达基底上皮细胞标记物。答：。

DKAT、永生化HMEC、MCF-7和MDA-MB-231细胞中CK5、CK17、p63和CK18的免疫荧光。B类.HMEC、MCF-7、MDA-MB-231和MEGM中生长的DKAT细胞的总细胞裂解物的蛋白质印迹。C、。CD44和CD24染色的DKAT-MEGM、MCF-7和MDA-MB-231细胞的FACS分析。D。使用公布的数据集，通过无监督分层聚类分析DKAT、MDA-MB-231和HMEC Affymetrix HG-U133 2+阵列的结果[28]细胞系按乳腺癌亚型标记；类灯具（蓝色）；基底样（红色）；间充质样（绿色）；未知子类型（黑色）。显示的是包含基础特异基因表达的选定基因簇的扩展视图。完整的基因簇如下所示图S1.

为了评估DKAT细胞与已发表乳腺癌亚型的关系，我们对DKAT转录表达进行了无监督的分级聚类。将我们的实验数据与之前发表的乳腺癌细胞系分析进行比较[28]，我们发现DKAT基因表达谱与许多基础型细胞系聚集在一起(图3D,图S1). DKAT细胞与SUM-149细胞最为紧密地聚集在一起，但也与184B5、MCF-10A和HMEC细胞聚集在一起。对照MDA-MB-231和HMEC转录物的平行分析显示，与先前发布的微阵列数据高度相关（分别为r=0.70和r=0.84），验证了结合这两个数据集的有效性。

可逆EMT/MET的证据在体外

DKAT细胞来源于一种表现出不同表型的乳腺癌，但尚不清楚这种表型多样性是1）原发肿瘤内特定亚群细胞的生长或进化的结果，还是2）肿瘤细胞内固有的表型可塑性的结果。我们通过改变培养条件和测试在体外紧急/气象。

蛋白质印迹分析表明，在基线时，在哺乳动物上皮生长培养基（MEGM）中生长的DKAT细胞表达E-钙粘蛋白和低水平的波形蛋白(图3B). 免疫荧光研究表明，MEGM中培养的DKAT细胞对上皮标记物CK5、CK18和E-cadherin呈阳性染色，这些标记物在细胞膜和细胞质中都存在。间充质标志物波形蛋白染色较弱且分散(图4A).

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图4

形态学和表型变化的证据与在体外EMT公司。

答：。在MEGM（上部）或SCGM中培养14天（下部）的DKAT细胞的相位对比或免疫荧光图像。使用20倍物镜（比例尺=40µm）获取相位对比图像。IF图像是用40倍物镜采集的，比例尺=20µm。同时对细胞进行波形蛋白（绿色）和E-cadherin（红色）或CK18（绿色）及CK5（红色）染色。B。在MEGM或SCGM中培养2小时的DKAT细胞的E-cadherin免疫荧光图像。C、。在MEGM或SCGM中培养1小时、24小时或14天的DKAT细胞的总细胞裂解物通过western blot分析波形蛋白、E-cadherin和肌动蛋白。D。划痕伤口愈合试验，比较MEGM或SCGM（14天）和MDA-MB-231细胞中生长的DKAT细胞。在划伤时（T=0）和12小时后用5倍物镜拍摄图像（上面板）。比例尺=200µm。结果（下面板）表示为ImageJ软件测量的12小时时闭合划痕区域的百分比，平均每个样品12处划痕。E.公司。用western blot分析MEGM或SCGM培养14天的克隆性DKAT细胞株的总细胞裂解物中的波形蛋白、E-cadherin和肌动蛋白。F、。用western blot分析在MEGM、SCGM或SCGM中培养10代并传回MEGM 5代的DKAT细胞传代匹配培养物的总细胞裂解物的上皮和间充质标记。G。在SCGM或MEGM中培养14天的亚克隆DKAT-SCGM细胞的免疫荧光（IF）图像。同时对细胞进行波形蛋白（绿色）和E-cadherin（红色）染色，并用40倍物镜采集图像。H。通过western blot分析在正常培养基中培养或切换到MEGM或SCGM培养14天的所示细胞系的总细胞裂解液中的波形蛋白、E-cadherin和肌动蛋白表达。N=正常，M=MEGM，S=SCGM。

诱导在体外EMT、DKAT细胞从无血清MEGM转变为含有胰岛素、bFGF和5%FBS的基质细胞生长培养基（SCGM）。与在MEGM中生长的上皮表型相反，在SCGM中生长14天的DKAT细胞以波形蛋白阳性和E-钙粘蛋白阴性为主，尽管有一小部分细胞保留了上皮染色模式(图4A). 此外，我们观察到上皮标志物CK5和CK18显著降低，这与细胞角蛋白中间丝表达向波形蛋白表达的转变一致[29](图4A). 虽然CK5被一致下调，但CK18在一些细胞中仍以低水平表达。引人注目的是，在SCGM中培养2小时内，DKAT细胞发生了形态变化，出现了更多的纺锤形和较少的鹅卵石样外观(图4B).

为了评估转换为SCGM后不同时间点E-cadherin和vimentin的表达，在SCGM中培养DKAT细胞，并在1小时、24小时或14天后收集蛋白裂解物。SCGM中培养的DKAT细胞在1小时内波形蛋白表达增加了100倍，E-cadherin的表达在第14天时显著下降(图4C). 虽然我们在SCGM治疗后通过western blot没有观察到E-cadherin蛋白的快速下调，但免疫荧光显示，SCGM治疗2小时内，E-cadherin主要定位在细胞质中，远离细胞膜(图4B).

接下来，我们使用划痕/伤口愈合试验测试SCGM中生长的DKAT细胞是否显示出迁移增加。与MEGM中的DKAT细胞相比，SCGM中生长14天的DKAT电池迁移更快地填充划痕区域，12小时时DKAT-SCGM细胞几乎100%闭合，而DKAT-MEGM细胞则60%闭合(图4D). 这种增加的迁移行为进一步支持了在SCGM中生长的DKAT细胞的间充质表型。

SCGM中的长期培养可能导致已经处于间充质状态的细胞的选择，而不是诱导EMT。为了进一步研究这种可能性，我们在MEGM中对来自单个DKAT细胞的克隆群体进行亚培养。我们观察到，当在SCGM中培养时，MEGM中具有低波形蛋白和高E-cadherin水平的克隆群体经历了相同的波形蛋白上调和E-cadherin下调，其动力学与DKAT细胞的大量群体相似(图4E).

测试DKAT细胞承受在体外MET，我们取在SCGM中培养了10代并表现出间充质表型的DKAT细胞，并将其转换回在MEGM培养基中生长。在返回MEGM五代后，DKAT细胞显示波形蛋白表达显著下降，E-cadherin增加(图4F)与原始上皮表型的逆转一致。Western blotting也显示SCGM中间充质标志物N-cadherin的表达显著增加，14天后上皮标志物CK17和claudin-1的水平降低。返回MEGM五代后，N-cadherin表达显著降低，CK17和claudin-1恢复到其原始表达水平(图4F).

我们还测试了来源于具有间充质表型的单个DKAT-SCGM细胞的克隆群体的耐受性在体外遇见。在MEGM中培养14天后，E-cadherin和vimentin的免疫荧光显示，该克隆细胞系包含两种主要不同表型的细胞(图4G). 一个群体的外观为形态上的鹅卵石，膜E-钙粘蛋白染色阳性，波形蛋白染色阴性。第二个群体表现出更多的纺锤形形态，呈E-钙粘蛋白阴性和波形蛋白阳性。综上所述，这些观察结果提供了证据，证明DKAT细胞在改变培养条件后，会发生与EMT和MET一致的表型和形态变化。

为了确定DKAT细胞系的特性是否独特，或者在MEGM或SCGM中培养任何乳腺癌细胞系是否会导致类似的表型转变，我们在MEGM和SCGM中培育了多种乳腺细胞系。根据基因表达谱，MDA-MB-231乳腺癌细胞分为基底B细胞和间充质细胞[28],[30],[31]并且经常用于研究乳腺癌转移。这些细胞通常在含有5-10%FBS的培养基中培养，因此我们在MEGM中培养该细胞系并寻找MET的证据。MEGM治疗14天后，western blotting显示E-cadherin或vimentin蛋白表达水平没有变化，表明MET没有发生(图4H).

相反，MCF-7、SUM-149和SUM-190乳腺癌细胞通常生长在含有5-10%FBS的培养基中，并表达上皮标记物。在SCGM中培养这三种细胞系14天后，我们没有发现EMT的证据(图4H). 此外，在MEGM中培养这两种细胞株对E-钙粘蛋白或波形蛋白的表达没有影响。最后，我们还测试了在SCGM中培养14天的hTERT永生化人类乳腺上皮细胞（HMEC）的效果。虽然在SCGM中培养这些细胞确实导致E-钙粘蛋白减少，波形蛋白略有增加(图4H)，非转化细胞在血清中不增殖，并在14天的时间过程中被阻止[32]（未显示数据）。这些实验表明，DKAT细胞系在所测试的乳腺癌模型中是独一无二的，因为它能够基于细胞生长的培养基在上皮或间充质表型之间进行可逆转换。

比较MEGM和SCGM培养14天的DKAT细胞的mRNA表达。正如预期的那样，在SCGM培养基中生长的DKAT细胞显示出上皮特异性基因表达显著下降，包括调节粘附和细胞间连接的基因。还观察到与间充质表型和细胞转化相关的基因显著增加。差异表达基因的部分列表见表3。值得注意的是KRT6C公司（CK6；131.8倍），韩元5（CK5；37.0倍），TP63型（第63页；26.2倍），KRT17型（CK17；7.8倍），14韩元（CK14；3.0倍），以及第1类（第1条；2.9倍）和TGFA公司（TGF-α；2.3倍），TGFBI公司（TGF-β诱导；2.6倍），液氧（赖氨酰氧化酶；2.9倍），ALDH1A3型（ALDH-1a3；3.6倍），CDH2公司（N-钙粘蛋白；5.6倍），以及FGF2组（FGF2；6.0倍）。如所示图4F如上所述，对经历EMT/MET的DKAT细胞的蛋白裂解酶进行claudin-1、细胞角蛋白17和N-钙粘蛋白的western blotting，证实了微阵列数据的结果。

Zeb1调节DKAT细胞的可塑性

EMT过程中涉及大量转录因子，包括蜗牛、bHLH和Zeb家族的成员，所有这些都被报道能够抑制E-cadherin并在各种细胞类型中诱导EMT[33]为了进一步研究DKAT细胞系上皮可塑性的机制，我们观察了DKAT模型中三种转录因子的表达。Western印迹显示，在生长于MEBM和SCBM的DKAT细胞中，Snail1和Twist蛋白的表达没有显著差异。然而，与DKAT-MEGM细胞相比，DKAT-SCGM细胞中的Zeb1显著增加(图5A). Zeb1是一种锌指转录因子，直接与E-cadherin启动子结合并抑制其转录[34]为了确定Zeb1的过度表达是否足以诱导与EMT一致的表型变化，我们在上皮性DKAT-MEGM细胞中组成性表达Zeb1。Zeb1的组成性过表达导致向间充质表型转变，表现为E-Cadherin和Claudin-1的表达减少，波形蛋白增加(图5B). 值得注意的是，当DKAT细胞从MEGM转换为SCGM时，使用两种不同的慢病毒shRNA序列稳定敲低Zeb1阻止了迁移的增加(图5C). 总之，这些数据表明Zeb1在DKAT模型中诱导EMT和增加间充质DKAT细胞迁移能力方面都很重要。

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图5

Zeb1调节DKAT EMT/MET。答：。

从DKAT-MEGM或DKAT-SCGM细胞制备总细胞裂解物，并进行EMT标记物的western blot分析。B。从稳定转染有控制载体（V）或含有Zeb1转录物（Zeb1）的载体的DKAT-MEGM细胞制备总细胞裂解物，并进行EMT标记物的western blot分析。C、。划痕伤口愈合试验，比较MEGM或SCGM中培养的DKAT细胞，稳定表达非靶向shRNA序列或两个Zeb1靶向序列中的一个。结果表示为ImageJ软件测量的16小时时闭合划痕区域的百分比，平均每个样品12处划痕。

DKAT细胞具有高度致癌性体内塑性

为了测试DKAT细胞系的致瘤潜能，10⁴, 10^三, 10²或将MEGM中生长的10个细胞注射到免疫低下小鼠的乳腺脂肪垫中。可触及的肿瘤在2-4周内出现，大多数动物在注射后13周被杀死，肿瘤直径为15 mm。我们观察到，8/8只小鼠在10倍剂量下发生肿瘤⁴, 10^三和10²细胞/注射。重要的是，仅注射10个细胞时，2/8的小鼠就形成了肿瘤，这表明DKAT细胞系具有显著的致瘤性。

与人类原发癌相似，DKAT异种移植瘤表现出一系列形态学模式和免疫组织化学染色。在未使用Matrigel移植的DKAT异种移植物中观察到三种重复出现的形态学模式。图案I：无致密纤维基质的渗透生长(图6Ai） ●●●●。DKAT细胞形成肿瘤细胞的索状和柱状结构，浸润周围脂肪，CK5染色阳性。模式II：致密纤维基质渗透生长(图6Aii）。DKAT细胞形成由致密结缔组织包围的细胞巢和索。值得注意的是，在宿主乳腺导管内观察到DKAT细胞，表明DKAT细胞有能力通过基底膜侵入。模式III：导管内和Pagetoid扩散(图6Aiii）。一个异种移植物无法触及，但在暴露宿主脂肪垫时可见。移植体平放在沿导管树扩散的脂肪垫中，但没有形成三维肿块。整个肿块显示出异常的不规则分支模式，这种模式经常出现在小鼠乳腺上皮内瘤样病变的外生长中。在某些区域，肿瘤细胞以小巢的形式浸润在小鼠的肌上皮和管腔细胞之间（Pagetoid扩散）。在其他地区，人类癌细胞明显侵入基质，与小鼠乳腺细胞没有任何可识别的联系。周围生长的所有区域都有密集的炎性浸润。DKAT细胞CK5染色，但没有波形蛋白染色。

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图6

DKAT异种移植物的H&E和IHC模式的比较。

答：。IHC显示H&E（i和ii）或CK5染色（iii），说明在未使用Matrigel移植的DKAT异种移植物中观察到的三种重复出现的形态学模式。B。IHC显示用Matrigel移植的DKAT异种移植物的H&E、CK8/18、CK5和SMA染色。左栏显示移植的中心，右栏显示肿瘤的前缘。

Matrigel的加入显著影响了DKAT异种移植物肿瘤的形态学和染色模式。用Matrigel移植的DKAT异种移植物形成巢穴和细胞索，CK5和SMA染色(图6B)提示肌上皮细胞的形成。外周细胞浸润周围组织和封闭的上皮细胞巢，CK8/18阳性，SMA阴性。肿瘤中心的DKAT细胞(图6B（左柱）细胞核较大，染色质开放，细胞质更丰富。SMA和CK5的IHC显示由双染色细胞包围的未染色细胞簇。相反，肿瘤边缘的浸润细胞(图6B（右栏）。

对DKAT异种移植瘤进行三色免疫荧光染色（人类特异性p53、CK14和核逆转录染色），以证实观察到的肌上皮标记物的表达是由于DKAT肿瘤细胞的异质性，而不是肿瘤微环境中宿主细胞的浸润。肿瘤中含有不同CK14表达水平的人p53阳性细胞，这表明CK14阳性的基底/肌上皮细胞和管腔更大的CK14弱/阴性细胞都是人DKAT肿瘤细胞(图7A和7B). 也有DAPI阳性细胞没有人类p53染色，可能代表混合的小鼠细胞。然而，这些细胞CK14阴性，证实了肿瘤中的基底细胞和肌上皮分化来自植入的DKAT肿瘤细胞，而不是小鼠成纤维细胞或其他宿主细胞。综上所述，这些结果表明DKAT细胞体内具有侵袭性，表现出表型可塑性。

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图7

DKAT异种移植物的基底/肌上皮分化。答：。

DAPI（蓝色）核反染染色显示DKAT异种移植瘤，CK14（绿色）显示肿瘤细胞的基底/肌上皮分化，人类特异性p53（红色）证实CK14阳性细胞和更管腔的CK14弱/阴性细胞均为人类DKAT肿瘤细胞。DAPI通道中的100微米比例尺适用于所有四个图像。B。第二只小鼠的DKAT肿瘤在高倍镜下显示出一个腺体结构模糊的区域，CK14阳性的基底细胞/肌上皮细胞（箭头所示）略长，围绕CK14弱/阴性细胞，这些细胞围绕在形态不良的腺腔（星点）周围。DAPI通道中显示25微米标尺。

其他细胞系

原代人类乳腺上皮细胞（HMECs）（Lonza）用hTERT（HMEC-hTERT）永生化，并在补充的MEGM中维持。如前所述，MDA-MB-231和MCF-7细胞（弗吉尼亚州马纳萨斯市美国型培养物收集中心[ATCC]）保存在补充的αMEM（加利福尼亚州卡尔斯巴德市英维特罗根）中[43]SUM-190细胞（ATCC）保存在添加10%FBS的RPMI中。

细胞遗传学分析

如前所述，进行了光谱核型分析（SKY）[44]根据国际人类细胞遗传学命名系统对核型异常进行分类。

免疫组织化学

将人类福尔马林固定、石蜡包埋的初级乳腺活检、胸壁复发和骨转移样品切片，厚度为4µm，并对α-平滑肌肌动蛋白（1A4，Sigma）、波形蛋白（3B4 Boehringer Mannheim Roche，Hvidovre，丹麦）、CK5（OVTM，DAKO，Glostrup，丹麦）和广泛角蛋白（MNF116，DAKO）进行染色。用链霉亲和素-生物素（DAKO 5004）观察抗体。

TP53型和PIK3CA公司排序

基因外显子5-9的序列测定TP53型基因和外显子9和20PIK3CA公司使用先前发布的引物和程序[IARC TP53突变数据库，http://www-p53.iarc.fr/p53sequencing.html和[45]]对从第20代DKAT细胞中分离的基因组DNA进行检测。在正反义序列中测试突变，并通过第二个独立基因组DNA制备的重复测序进行确认。

免疫荧光

细胞在甲醇中固定20分钟或在4%多聚甲醛中冰上固定30分钟。细胞被阻断30分钟，在4°C下与一级抗体和二级抗体孵育过夜，在RT下孵育1小时，并用DAPI进行反染色。图像是在蔡司Axio Observer A1荧光显微镜（德国哥廷根卡尔蔡司）上采集的，该显微镜具有40倍或63倍物镜。主要抗体来自1）Santa Cruz Biotechnology Inc.（加州圣克鲁斯）：CK5（sc-66856）、CK14（sc-53253）、CK18（sc-28264）、CK17（sc-101931）、E-cadherin（sc-7870）、EGFR（sc-120）、ERalpha（sc-8005）、p63（sc-56188）和vimentin（sc-5565）2）BD biosciences（加州圣何塞）：vimentin3）Thermo Fisher Scientific Inc.（加利福尼亚州弗里蒙特）：PR（MS-298）4）Abcam（马萨诸塞州剑桥）：平滑肌肌动蛋白（ab15734）和5）Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）：claudin-1（37-4900）、claudin-4（32-9400）、ZO-1（40-2300）、clodin（40-4700）、山羊抗鼠Alexa-fluro 488（A21222）和山羊抗兔Alexa-flou 597（A11070）二级抗体。

西方印迹法

抗体为p53（DO-1，Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA）；PTEN、Akt-pSer473、Akt-1、Akt-2、Akt-3（分别为9552、4051和4058、2967、2964、3788，Cell Signaling，丹弗斯，马萨诸塞州）；claudin-1、claudin-4、cloudin、ZO-1（分别为37–4900、32–9400、40–4700和40–2300；Invitrogen，Carlsbad，CA）、snai-1（安东尼奥·加西亚-德埃雷罗斯赠送）。通过用β-肌动蛋白抗体（I19，Santa Cruz Biotechnology，Inc.）复制膜来提供负荷控制。使用柯达图像工作站2000 MM拍摄图像，并使用柯达1D图像分析软件（伊士曼柯达，罗切斯特，明尼苏达州）进行量化。

FACS分析

用细胞分离缓冲液（Invitrogen）收集细胞，并与APC结合的CD44和PE结合的CD24抗体孵育（BD Biosciences，加州圣何塞）。使用FACSCaliber流式细胞仪收集了5万例事件，并使用CellQuest软件（BD Immunocytometry Systems）分析CD44/CD24的表达。

差异基因表达研究

使用Qiagen RNeasy迷你试剂盒和可选的DNA步骤（Quiagen，Valencia，CA）收集mRNA，并通过电泳确认RNA完整性。cRNA合成和cRNA阵列杂交探针生成是根据Affymetrix™（加利福尼亚州圣克拉拉市Affymetix™）提供的标准化协议进行的。使用Affymetrix HG-U133 Plus2.0基因芯片进行转录分析。严格遵守Affymetrix的标准化协议，对样品进行标记和杂交。在进一步分析之前，对基因芯片结果进行质量评估。将HMEC、DKAT和MDA-MB-231三种细胞系的技术复制品的中位数表达值（n=3）与从出版商网站下载的已发布乳腺癌细胞系表达数据进行比较[28]探针集ID用于合并这两个数据集（16383个特征）。通过平均探针集ID值总结重复的基因符号。这些数据以阵列和基因为中心，并进行过滤，以排除观测值标准偏差小于1.5的基因。其余473个特征使用质心连锁和皮尔逊相关作为相似性度量进行聚类（聚类版本3.0）。数据已根据MIAME指南提交给NCBI GEO。

迁移分析

5×10⁵将DKAT或MDA-MB-231细胞置于6孔板中，培养至融合。然后用移液管尖端划伤细胞单层，冲洗并定期拍照，直到划痕完全闭合。使用ImageJ软件测量划痕的面积[46]，并且结果表示为在所指示的时间点由单元填充的原始划痕区域的百分比。

体外塑性

EMT：DKAT细胞从MEGM转换为SCGM（Lonza）；DKAT对照细胞留在MEGM中。SCGM培养时间长达10代，对照组DKAT细胞在MEGM中维持并并行传代。MET：在SCGM中传代10次后，部分DKAT细胞切换回MEGM。对照细胞包括1）在MEGM中持续生长的原始DKAT细胞和2）在SCGM中维持的DKAT细胞。所有细胞和对照细胞平行传代，成像并以相似的汇合点采集。

克隆细胞系的产生

用胰蛋白酶将MEGM中的DKAT细胞消化成单细胞悬浮液，并在96孔板中每孔一个细胞进行平板，目视检查微孔的形成情况。22天后，用细胞分离缓冲液（Invitrogen）从含有菌落的微孔中取出细胞，然后依次在24孔板、6孔板、T25烧瓶和T75烧瓶中生长。体外如前所述诱发EMT。

Zeb1表达式

使用以下引物通过PCR从MDA-MB-231细胞中扩增出全长Zeb1转录物：正向5′-CAA GCG AGA GGA TCA TGG CG-3′和反向5′-TTC CTT CTA GAA AAA CGA TTA GGC-3′将所得产物克隆到pLXSN的XhoI和BamHI位点。通过将产生的构建物或pLXSN空载体对照转染到GP293细胞中，生成逆转录病毒颗粒。然后转导DKAT-MEGM细胞，并用0.5 mg/ml G418（Invitrogen）筛选表达细胞。

Zeb1 shRNA

靶向Zeb1的任务shRNA结构体和非靶向对照结构体是从Sigma购买的，慢病毒是根据制造商的说明生产的。将MEGM中的DKAT细胞转导并用0.5µg/ml嘌呤霉素筛选，然后将所得细胞在MEGM（对照）或SCGM中培养以诱导EMT。转移到SCGM后至少14天进行划痕分析。

异种移植实验

通过限制稀释，对MEGM中生长的DKAT细胞进行异种移植生长测试；10⁴, 10^三, 10²或将10个细胞重新悬浮在50µl的1）1∶1/v:v PBS:Matrigel™或2）PBS单独溶液中，并注射到NOD的右侧和左侧未清理的#4乳腺脂肪垫中。CB17-PrkdcSCID/J小鼠。杜克大学和加州大学戴维斯分校（UCD）进行了四个独立实验（每个实验八个重复）。使用基质凝胶对NOD CB17-Prkdc SCID/J小鼠（Jackson Labs）进行DKAT异种移植，并按照杜克大学动物护理和使用委员会批准的方案（方案编号A328-08-12）进行。每周通过卡尺测量肿瘤体积来评估肿瘤生长。当肿瘤直径达到1.5厘米或150天后处死小鼠。切除肿瘤，在4°C的4%多聚甲醛中固定过夜，切片和染色，并在UCD接受中心病理检查。根据UCD机构动物护理和使用委员会批准的方案（方案编号13217），在裸鼠和NOD CB17-Prkdc SCID/J小鼠（Jackson Labs）中进行不含基质凝胶的DKAT异种移植。所有的努力都是为了减少痛苦。

异种免疫荧光染色

使用标准方案进行三色（p53、角蛋白14、核反染）免疫荧光染色。简单地说，将新鲜冷冻石蜡包埋的4微米切片安装在带正电荷的载玻片上，用二甲苯脱蜡，并用无水乙醇清洗。内源性过氧化物酶被淬灭，组织在抗原回收之前被重新水化（柠檬酸盐，pH=6.0，95°C下2分钟）。用无血清块（DAKO X090）封闭组织15分钟，然后在4°C下与一级抗体、1∶500抗p53山羊多克隆（Santa Cruz FL-393-G）、1∶200抗角蛋白14兔多克隆（Thermo Scientific RB-9020-P1）在PBS中与卵清蛋白孵育过夜。在室温下用PBS洗涤5分钟两次后，首先在室温下PBS中用1∶500驴抗兔结合Alexa Flour 488（Invitrogen A21206）培养30分钟。在PBS中再次洗涤5分钟两次后，将组织在PBS中与罗丹明偶联的1∶500兔抗山羊（Millipore AP106R）中室温孵育30分钟，然后在PBS中洗涤两次5分钟，并使用DAPI Vectashield（Vector Labs）盖上，用透明指甲油密封并成像。图像是在配备FITC、DAPI和罗丹明带通滤波器的蔡司Axiophot荧光显微镜上采集的。使用冷却CCD蔡司彩色AxioCam和软件获得图像。图像叠加是在Photoshop（Adobe）中生成的。