美国国家科学院院刊。2001年6月5日；98(12): 6865–6870.
促炎细胞因子调节人糖皮质激素受体基因表达与显性基因积累负β亚型：产生糖皮质激素抵抗
分子内分泌学组，信号转导实验室，国家环境健康科学研究所北卡罗来纳州三角研究园卫生研究院，邮编：27709
*现任地址：杜邦炎症疾病研究制药，威尔明顿，DE 19880。
†现住址：杜克大学细胞生物学系北卡罗来纳州达勒姆大学医学中心，邮编：27710。
编辑：Bert W.O'Malley，休斯顿贝勒医学院，德克萨斯州，2001年4月9日批准
摘要
许多细胞类型的炎症反应是协调的由NF-κB和糖皮质激素的相反作用调节受体（GR）。人类糖皮质激素受体（hGR）基因编码两个蛋白质亚型：一种细胞质α型（GRα），结合荷尔蒙，转移到细胞核，调节基因转录，和一种核定位β亚型（GRβ），它不与已知的配体并减弱GRα作用。我们在这里报告身份肿瘤坏死因子（TNF）反应性NF-κB DNA结合位点5′hGR启动子导致GRαmRNA增加1.5倍HeLaS3细胞中GRβmRNA增加2.0倍内源性表达两种GR亚型。然而，TNF-α治疗不成比例地增加了GRβ蛋白亚型超过GRα，使GRβ占主导地位内源性受体亚型。观察到类似的结果用TNF-α或IL-1治疗人CEMC7淋巴细胞。GRβ蛋白表达的增加与糖皮质激素抵抗的发展。
炎症是一种产生组织损伤的多方面免疫反应。促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF）-α和IL-1通过激活转录部分启动这个级联反应因子NF-κB，反过来刺激促炎基因(1–三).相反，皮质类固醇是有效的抗炎药。最近皮质类固醇表明配体结合的糖皮质激素受体（GR）与核定位NF-κB相互作用并改变其促进转录的能力(4). NF-κB之间的拮抗作用GR是相互的，因此NF-κB也可以消除糖皮质激素应答基因的反式激活(5,6).此外，糖皮质激素还可以增加IκB(7,8). 因此，这两个对立的监管体系出现了与炎症反应的控制内在耦合。
糖皮质激素抵抗可引起抗炎皮质类固醇的作用被消融，并且有几种机制建议。例如，长期接触糖皮质激素，存在糖皮质激素的下调mRNA和蛋白质水平的受体（GRα）(9,10). 这个受体的磷酸化状态也会影响敏感性和对糖皮质激素的选择性(11). 细胞类型特异性表达一些GR辅活化剂和/或辅抑制剂也可能有助于糖皮质激素抵抗。
当人类糖皮质激素受体首次被分离和克隆时，描述了两种不同的亚型(12). α亚型结合荷尔蒙，转移到细胞核，并激活激素敏感基因。β亚型未激活已知激素敏感基因(13). 然而，许多研究已经阐明了GRα改变基因表达，很少有人致力于了解GRβ的功能。GRβ不结合典型皮质类固醇或拮抗剂主要位于并且可以减弱配体介导的反式激活GRα的激素敏感基因(13–15). 这个主要的负片GRβ亚型的特性使其成为一个有吸引力的候选解释糖皮质激素抵抗(16–18).
我们在这里报告，一致的NF-κB序列位于之前发布的(19)hGR基因的5′-侧翼序列，其中与淋巴毒素（TNF-β）基因中鉴定的相同(20).根据NF-κB与糖皮质激素信号转导的关系，我们检测了促炎细胞因子如TNF-α的潜在作用和IL-1调节hGR亚型表达。我们发现TNF-αGRβ蛋白的选择性积累和糖皮质激素抵抗状态。
材料和方法
地塞米松（9α-氟-16α-甲基-11β，17α，21-三羟基孕酮-1，4-二烯-3，20-二酮）购自甾体化合物（Wilton，NH）。TNF-α和IL-1购自R&D系统。[14C] 氯霉素（40–60Ci/mmol）来自杜邦/NEN。购买了Biotrans尼龙膜来自ICN。Protran硝化纤维素BA85购自Schleicher&购买Schuell和20×20-cm TLC硅胶60片来自EM分离技术（Gibstown，NJ）。反肽多克隆抗体AShGR和BShGR(14,21)都被用于免疫组化和Western分析。
细胞培养和转染。
如前所述，培养HeLaS3和COS1细胞(10,22).CEMC7细胞在含有100单位/ml青霉素的RPMI-1640中生长，100μg/ml链霉素，补充2 mM谷氨酰胺和10%未来作战系统。培养物保持在37°C的湿润大气中5%一氧化碳2（HeLaS3和COS1）或7%一氧化碳2（CEMC7）。COS1的次级流入单层用DMRIE-C试剂（GIBCO/BRL）转染细胞。
逆转录（RT）-PCR。
TNF-α或载体处理的HeLaS3细胞总RNA为使用TriZol试剂进行隔离（纽约州格兰德岛生命科技公司）。用hGRα和hGRβ引物制备并扩增cDNA前面描述过(13). 扩增的DNA片段在1.75%琼脂糖凝胶上电泳分级。限制hGRα-和hGR扩增RT-PCR产物的酶分析hGRβ特异性引物证实这些片段含有适当的序列。
半定量RT-PCR。
RNA被逆转录，得到的cDNA被扩增为描述。在2个循环中去除5微升PCR反应1.75%琼脂糖凝胶染色间隔和电泳溴化乙锭。溴化乙锭的荧光强度测量密度并绘制成循环函数生成GRα和GRβPCR扩增曲线的数量碎片。GRα和GRβ的放大效率碎片几乎完全相同。
免疫细胞化学。
HeLaS3细胞放置在JMEM的双室玻璃载玻片中补充4%右旋糖酐包被炭处理血清。细胞用TNF-α（1 ng/ml）或载体孵育24小时然后用100 nM地塞米松（DEX）处理1小时。如前所述固定并处理细胞(14,21,23,24). 使用视频图像分析进行图像分析用于Power PC的软件NIH Image 1.56（美国国家研究院健康，马里兰州贝塞斯达）。
Western Blot分析。
用TNF-α或按照说明制备IL-1或载体(25–28).然后用表位纯化的多克隆培养膜抗人生长激素受体α（AShGR）或抗人生长因子受体β（BShGR抗hGR（57号）抗体，稀释度为1:1000。免疫反应性通过增强化学发光（ECL，Amersham法玛西亚）。在同源下调研究中，COS1细胞是如前所述，转染hGRα或hGRβ。18小时转染后，用100 nM DEX或载体处理细胞24 h，制备提取物进行Western blotting。
人生长激素受体mRNA和蛋白的半衰期研究。
通过半定量测定GRα和GRβmRNA的周转放线菌素D处理后GRα和GRβmRNA的RT-PCRHeLaS3细胞。TNF-α治疗后24小时（1 ng/ml），用放线菌素D（1μg/ml）处理细胞。总RNA为在0至9小时的时间点进行隔离。采用西方分析测定受体蛋白半衰期。20小时后用TNF-α（1 ng/ml）处理细胞，用环己酰亚胺（1μM）。全细胞裂解物在不同条件下制备时间点从0到48小时。
荧光素酶分析。
如前所述转染细胞，荧光素酶检测根据制造商的说明进行（分析圣地亚哥发光实验室）。报告荧光素酶活性以相对光单位表示，并计算方差系数一式三份样品。
氯霉素乙酰转移酶（CAT）检测。
用GRE2-TATA-CAT报告质粒转染HeLaS3细胞包含一致糖皮质激素反应的串联重复元素（GRE）(22,29). 转染后，用TNF-α、DEX或载体，并允许孵育24小时。如前所述制备和分析细胞提取物描述(30).
碱性磷酸酶测定。
为了确定TNF-α对内源性糖皮质激素反应基因，碱性磷酸酶活性为用TNF-α（1ng/ml）或溶媒，随后用100 nM地塞米松治疗持续16小时(31).
结果
NF-κB介导的GRα和GRβ表达调控。
NF-κB抑制GRα激活的能力糖皮质激素应答启动子(4,6)通过物理交互核内NF-κB和GRα之间；然而NF-κB介导的GRα和/或GRβ表达变化参与这种对抗是未知的。为了解决这个问题，我们内源性表达两种GR亚型的HeLaS3细胞，加入或不加入细胞因子TNF-α24小时。半定量然后用特异性引物对分离的RNA进行RT-PCRhGRαmRNA、hGRβmRNA和β-肌动蛋白mRNA。代表性放大曲线如图所示（图。).从放大曲线的指数相位，我们测量了GRαmRNA增加1.5倍，略微增加2.0倍TNF-α治疗后GRβmRNA增加。这个小小的变化细胞内GR mRNA水平是该启动子的典型反应给其他代理人(32). 接下来我们评估TNF-α治疗通过免疫细胞化学改变GRα和GRβ蛋白水平。HeLaS3细胞经TNF-α处理24小时使用针对GRα或GRβ。在治疗的最后一小时添加DEX，以促进GRα的核定位及其与构成性核GRβ亚型。如图所示。A类，两种受体亚型对TNF-α的反应增强；然而，GRβ的增加是大于GRα的观察值。这些数据的量化（图。B类)表明GRα染色强度为在对照细胞中为52.6，在TNF-α处理的细胞中为97.1，GRα蛋白增加了1.8倍。相比之下GRβ染色的平均强度在对照细胞为40.8，在TNF-α处理的细胞，GRβ增加4.8倍蛋白质。
细胞因子治疗后GRβ特异性mRNA增加。来自的总RNA分离HeLaS3细胞，并对总计0.5μg的细胞进行RT-PCR使用hGRα-和hGRβ-特异性引物对每个治疗组进行RNA检测。肌动蛋白特异性引物被用作内部对照。
利用异构体特异性对GR异构体进行免疫染色表位纯化的多克隆抗体。(A类)HeLaS3细胞用1 ng/ml TNF-α或载体治疗24小时，然后100 nM地塞米松治疗1小时（TNF）或溶媒（第页）。按照说明固定和处理细胞(14,21,23,24).(B类)荧光染色的图像分析是使用NIH Image 1.56执行。平均峰值强度为计算每种亚型是否接触TNF。
TNF-α对GRα和GRβ蛋白表达的影响通过Western blot分析进一步检查。我们观察到24小时治疗后GRα蛋白水平增加1.5倍TNF-α（1 ng/ml），而GRβ增加了3.5倍。这个GRβ的优先增加具有剂量和时间依赖性。这个测试的最高TNF-α浓度使GRα和GRβ增加4.5倍（图。A类). 最长持续时间TNF-α治疗使GRα增加2倍，GRα提高4.0倍GRβ增加（图。B类). 因此，符合免疫细胞化学分析，两种GR亚型在TNF-α对HeLaS3细胞的治疗作用；然而，GRβ在细胞中积累大于GRα。
细胞因子治疗后GR亚型水平的西方分析。(A类)HeLaS3细胞被增加TNF-α浓度（0.1至100 ng/ml）持续24小时α特异性AShGR和β特异性BShGR抗体用于西方分析。(B类)蛋白质印迹的定量显示了三个单独实验的平均值（SEM）。(C类)用1 ng/ml TNF-α处理HeLaS3细胞0、12、24或48小时。制备并分析全细胞提取物如上所述。(D类)以a形式给出的结果的量化三个实验的平均值（SEM）。
免疫细胞通常是炎症反应的主要介质因此，受糖皮质激素调节。因此，我们评估GRβ的优先增加是否也被诱导淋巴源性细胞中的TNF-α。我们使用了CEMC7细胞已知同时表达GRα和GRβ的淋巴细胞系(33).用AShGR和BShGR特异性抗体进行免疫印迹在用或不用TNF-α处理的CEMC7细胞上（图。A类). 与我们的发现类似在HeLaS3细胞中，CEMC7细胞的TNF-α处理产生GRα增加1.5倍，GRβ增加4.0倍。收件人确定其他NF-κB活化剂是否也优先GRβ增加，我们用IL-1处理HeLaS3和CEMC7细胞(34)并评估GRα和GRβ的表达。如图所示。A类，IL-1治疗产生了适度的1.5倍GRα增加，GRβ诱导增加4.0-5.5倍。因此，GRβ的优先增加由两个因素介导NF-κB的不同激活物，并出现在两种上皮细胞中和淋巴起源。
GRβ优先上调发生在其他细胞类型中其他细胞因子。(A类)HeLaS3细胞和CEMC7细胞未经治疗或用TNF-α（1 ng/ml）或IL-1（10 ng/ml24 h制备全细胞提取物，并用Western使用AShGR和BShGR抗体进行分析。(B类)氦镧S3用TNF-α或载体处理细胞24或48小时。整体制备细胞提取物并用Western blot分析针对两者共同表位的抗人生长激素受体抗体（57号）GRα和GRβ。
因为使用了不同的抗体来评估相对变化在GRα和GRβ的水平上，不可能确定这些细胞中累积GRα和GRβ蛋白的精确比率TNF-α致炎性损伤后。为了解决这个问题，我们评估HeLaS3细胞中GRα和GRβ的相对比值使用或不使用TNF-α治疗24和48小时，然后通过使用一种针对共同表位的抗体进行免疫印迹每个受体亚型。图中的数据。B类表明未经处理的细胞（CON）中GRα与GRβ的比值≈4:1，而用TNF-α（24H-TNF）处理24小时后，比率≈1:1，并且用TNF-α治疗48小时（48H-TNF）后GRα到GRβ为1:2。这些数据最终表明TNF-αHeLa S3细胞治疗导致GRβ变为主要的细胞受体。
NF-κB调节GRα和GRβ的机制表达式。
NF-κB的激活导致两种GR亚型的增加；然而，GRβ的增加幅度大于GRα。阐明GR表达变化的机制，我们首次在人类GR启动子中搜索潜在的NF-κB结合地点。NF-κB共有序列GGGCTTCCC在相对于转录起始位点的−1739和−1730(19).NF-κB结合位点的评估由将其置于胸苷激酶启动子上游，驱动荧光素酶报告子的表达。p65亚基的共表达NF-κB导致荧光素酶活性增加6倍在仅表达pNF-κB-tk-LUC报告子的细胞中测量（图。B类). 这些结果表明GR启动子中发现的NF-κB结合位点可能是功能性的体内表明细胞因子介导GRα和GRβmRNA的增加可能是由于NF-κB诱导GR基因转录增加。
人糖皮质激素中NF-κB共识序列的定位受体启动子。(A类)NF-κB共识的位置与hGR转录起始位点（+1）相关的序列发起人(2). AP-1站点也已指定。NF-κB的序列还显示了该站点。(B类)COS1细胞转染pBR322（MOCK）或NF-κB共识序列与异源胸腺嘧啶核苷激酶启动子驱动a的表达荧光素酶报告子（NF-κB-tk-LUCtk-LUC加上p65或单独使用tk-LUC。荧光素酶分析表明三次转染的平均值。
然而，NF-κB对GR启动子的影响预计会两种异构体的增加相似，尽管我们的数据清楚地表明细胞中GRβmRNA的积累稍多GRβmRNA高于GRαmRNA可能无法解释GRβ。GRβ蛋白的过度增加表明GRα和GRβ表达和分解代谢的其他成分涉及到路径。因此，我们测试了细胞因子治疗不同程度地改变GRα和GRβmRNA的稳定性和/或GRα和GRβ蛋白。如图所示。A类，TNF-α治疗没有对GRα或GRβmRNA稳定性的明显影响。在缺乏GR亚型和TNF-α的存在。同样，TNF-α治疗似乎没有影响GRα和GRβ蛋白的稳定性（图。B类). 有趣的是，GRα蛋白在24小时与先前在转染细胞中的发现一致(11)而GRβ蛋白的半衰期为48小时TNF-α的缺失和存在。一个确定级别的属性GRα是配体依赖性下调，已知其可减少GRα蛋白的半衰期为10小时(11). GRβ的能力进行配体依赖性下调是未知的结合配体。转染GRα和GRβ的能力比较在图中经历配体诱导的下调。C类清晰地表明GRα下调对糖皮质激素（DEX）的反应，而GRβ没有。
肿瘤坏死因子-α后GRα和GRβmRNA及蛋白的半衰期研究治疗和下调受体蛋白以应对糖皮质激素。(A类)HeLaS3细胞被用于用1 ng/ml TNF-α24小时，然后用放线菌素D处理1小时。在不同的时间间隔获得mRNA，并通过RT-PCR使用α-异形或β-异形特异性引物进行。(B类)HeLaS3细胞用1 ng/ml处理24 h然后用环己酰胺处理TNF-α1小时。整个细胞在不同的时间间隔获得提取物，西方分析使用AShGR或BShGR抗体进行。(C类)用hGRα或hGRβ转染COS1细胞。16小时转染后，用100 nM DEX或载体处理细胞（CON）24小时。制备细胞提取物，并测定GR蛋白水平用57号抗体进行Western分析。
NF-κB介导的GRα和GRβ表达调控糖皮质激素抵抗。
GRβ通过抑制GRα的转录活性(15). 据报道两种疾病患者的GRα优先增加全身性和组织特异性糖皮质激素抵抗(18,35–37). 因此，我们接下来评估细胞因子是否介导选择性上调GRβ导致对糖皮质激素。HeLaS3细胞转染有糖皮质激素应答报告质粒。使用产生的DEX进行处理CAT活性的诱导是未处理组的20倍控制单元（图。A类)但是预处理后的细胞CAT活性仅增加4倍TNF-α。我们还分析了TNF-α对GRα介导的作用内源性糖皮质激素反应的激活碱性磷酸酶活性。这种内源性反应是在TNF-α预处理的细胞中也完全消除。直接p65和GRα之间不太可能存在蛋白质相互作用和拮抗作用解释GRα活性的抑制，因为核TNF-α处理的细胞中p65的水平已恢复到控制单元（图。C类). 这些发现表明长期接触细胞因子会产生糖皮质激素抵抗通过涉及细胞内显性阴性GRβ蛋白。与GRα不同，该受体亚型是在存在激素并在细胞中持续存在，尽管给予糖皮质激素。
激素介导的反式激活在用细胞因子。(A类)HeLaS3细胞瞬时转染带有糖皮质激素诱导报告质粒GRE2-TATA-CAT。细胞单独使用载体（CON）、100 nM DEX、1纳克/毫升TNF-α或1纳克/毫克TNF-地塞米松1小时（TNF-α+DEX）。制备细胞提取物并检测CAT活性。(B类)内源性采用相同的处理方法分析碱性磷酸酶活性上述方案。(C类)西方对核能和TNF-α作用0、1和24小时后p65的细胞质水平治疗。
讨论
炎症反应的分子过程被糖皮质激素废除的情况还不太清楚。有证据表明，然而，炎症过程发生的主要信号是由转录因子NF-κB介导。糖皮质激素受体和NF-κB家族成员相互拮抗细胞核区室的反式激活功能(4–6). 或者，NF-κB介导的GRα和/或GRβ水平在这种相互作用中起作用对抗。我们在这里报道了NF-κB的发现consensus-binding元件位于hGR启动子，表明该元件具有功能。我们检查了促炎细胞因子TNF-α是否激活NF-κB对人类细胞系中的GR水平有任何直接影响发现GRβ的增加与GRα的增加不成比例。β亚型水平的选择性增加是两种剂量并且具有时间依赖性，发生在上皮细胞和淋巴细胞中。此外，另一种促炎细胞因子（IL-1β）激活NF-κB，也不成比例地增加GRβ。收件人确定前炎症细胞因子是否激活NF-κB信号会导致GRα和使用GRβ特异性mRNA，半定量RT-PCR。使用TNF-α导致GRβ特异性mRNA略高于GRα特异性mRNA只能部分解释两种受体蛋白亚型之间的差异。细胞因子可以调节mRNA的稳定性，从而导致特定于字母的消息不稳定或特定于β的消息不可靠细胞因子治疗后更稳定；然而，我们的研究没有支持这种可能性，因为两者都没有明显变化当存在TNF-α时，亚型mRNA半衰期。当我们检查每个亚型的蛋白质半衰期，我们再次发现用细胞因子处理时每种亚型的半衰期。有趣的是，受体的β亚型具有更长的蛋白质半衰期大于α亚型，与GRα不同，GRβ是不受配体依赖性同源下调的影响。然而，GRβ蛋白选择性增加的机制还有待确定。
最显著的结果是，用促炎细胞因子导致激素介导的配体对糖皮质激素反应基因的反式激活。内源性和瞬时性表达细胞因子治疗后转染的报告基因被完全抑制当GRβ在细胞中积聚时。虽然我们不能完全统治这种抵抗的一部分是由一种直接的GRα与NF-κB的拮抗作用，很明显核p65具有恢复到分析前的控制水平。以前的研究(13–15)在瞬时转染系统中显示GRβ的作用作为GRα基因反式激活的显性负调控因子。在这些研究要求更高水平的GRβ质粒达到这种主要的负面影响。然而，这是不可能的识别GRα和GRβ的精确细胞比率。我们的新数据表明低水平的GRβ蛋白可以达到先前观察到的显性负功能。最近，Pariante等。(38)也证明了另一种促炎因子细胞因子IL-1α能够适度减弱地塞米松在小鼠L929细胞中的作用。这一观察表明促炎细胞因子也可以影响糖皮质激素介导的功能。虽然他们观察到的一些镇压可能是由于GRα和NF-κB之间的直接物理对抗GRβ的增加不能忽略，因为其作用与糖皮质激素通过上调IκB对NF-κB的晚期作用抑制剂(7,8). 在这种情况下，两个转录家族通过直接互动和增加同源阻遏物的可用性。
慢性炎症是多种疾病状态的结果，如如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和动脉硬化，所有进展都与炎症成分有关(39–41). 皮质类固醇长期用于治疗这些疾病(41–46)以及阿尔茨海默病炎症反应的特征(47–49). 然而，国家类固醇耐药性通常在用糖皮质激素(50–53). 不幸的是，分子机制糖皮质激素抵抗发生的基础是理解力差。
我们的研究确定了一种可能的分子机制糖皮质激素抵抗是由于显性阴性GRβ亚型。长时间接触促炎症物质细胞因子允许稳态水平的大量增加糖皮质激素受体显性负β亚型阻断GRα的作用。β亚型的优先增加人类糖皮质激素受体也出现在疾病状态对糖皮质激素治疗有抵抗力。最近有报道(17,36,54)气道中T细胞GRβ水平升高，外周血单个核细胞和结核菌素诱导的糖皮质激素敏感性哮喘患者的炎症病变。在另一份报告显示，12名患者中有10名患者的GRβ水平较高患有糖皮质激素抵抗性结肠炎(37). 此外，豪克et（等）阿尔。(55)已经证明分离的外周血当用各种超抗原刺激单核细胞时，变得对糖皮质激素不敏感，这种不敏感是被认为是GRβ增加的结果。这些研究强调β亚型在人类疾病状态中的重要性炎症、GRβ和糖皮质激素抵抗。
缩写
| 希腊 | 糖皮质激素受体 |
| hGR公司 | 人糖皮质激素受体 |
| 肿瘤坏死因子 | 肿瘤坏死因子 |
| RT公司 | 反转录 |
| 指数 | 地塞米松 |
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