背景
锡-1,2-二酰基甘油（DAG）是细胞中的第二信使之一，是在G蛋白偶联受体或受体酪氨酸激酶激活磷脂酶C后，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸水解生成的[1——三]. DAG的另一个来源是磷脂酸，通过磷脂酶D水解磷脂酰胆碱而释放。DAG的主要作用机制是通过与一种特殊的识别基序，即所谓的C1结构域的相互作用[4——6] (). C1结构域是长度约为50个氨基酸的锌指结构。它们可以分为两类，一类是对DAG有反应的，另一类是没有反应的。蛋白激酶C（PKC）的C1结构域为DAG反应性C1结构域提供了范例；非典型PKC的C1结构域（zeta和iota）为不响应DAG的所谓“非典型”C1结构域提供了范例。
佛波醇13-醋酸盐与PKC三角洲C1b结构域之间的配合物的结构。A） PKCδC1b结构域结合间隙内佛波醇12,13-二丁酸的相互作用。B） C1b结构域、佛波酯和脂质双层（来自[83]).
经典和新型PKC亚型代表了DAG效应器的第一个公认和研究最广泛的家族[7，8]. PKC是ser/thr特异性蛋白激酶。在结构上，它们由N端抑制调节域和C端催化域组成(). 调节域通过将假底物序列定位在酶的催化位点来发挥作用，阻止其接触底物。调控域包含两个C1结构域（分别为C1a和C1b），在经典PKC中包含一个C2结构域。DAG与C1结构域和Ca的相互作用2+C2结构域使这些结构域在膜上的结合稳定。酶的合成构象变化从催化位点提取假底物，从而激活酶。同时，酶的膜结合会影响其与底物的接近程度，从而有助于提高活性和特异性。最后，构象变化增强了PKC调控和催化结构域之间的铰链区域对钙蛋白酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的访问，导致其断裂[9]. 视情况而定，这种裂解既可以通过PKC的分解下调PKC，也可以提供新的活性，反映出具有不同定位的活性催化结构域以及可能具有自身功能的调控结构域的解放。
含有C1结构域的蛋白质的结构。PS，假底物结构域；TD，跨膜结构域；PH，plekstrin同源结构域；SH2，Src同源2结构域；Rac-GAP、Rac-GTPase激活蛋白结构域；REM、Ras交换基序；鸟嘌呤核苷酸交换因子；CC，卷曲-线圈域；CH，柠檬酸同源结构域；PBD，p21 GTPase结合域
在PKC鉴定之后，其他六个具有同源DAG反应C1结构域的蛋白质家族被鉴定为具有不同的效应域()[10，11]. 蛋白激酶D家族具有一个独特的激酶结构域，与钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶更为相似[12，13]. PKD参与高尔基体功能、增殖、转移和凋亡。嵌合体作为Rac的抑制剂（GAP、GTPase激活蛋白），是候选的肿瘤抑制剂[14]. RasGRP家族成员是Ras的激活因子（GEF、GTP交换因子）[15]T细胞淋巴瘤的致癌性[16]，有助于皮肤致癌过程中的肿瘤进展[17]和参与血管生成[18]. Unc-13家族成员促进囊泡启动[19，20]. DAG激酶磷酸化DAG，终止DAG信号[21]. 最后，MRCK作为参与丝状伪足形成的cdc42的下游效应器，促进肿瘤侵袭[22，23]. DAG的这些其他效应器家族的存在增加了从DAG下游分离出反应亚通路的机会，前提是可以设计出对这些不同效应器家族具有选择性的配体。
C1结构域作为药物靶点的潜力
PKC已经成为一个明确、有效的癌症治疗靶点（参见本卷牛顿的章节，以及[24——28]. 在众多的例子中，PKCβ在弥漫性大B细胞淋巴瘤中过度表达，并与化疗反应的不良预后相关[29，30]. 临床试验正在评估弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗[31]与PKCβ特异性激酶抑制剂恩扎他汀[32]. PKC iota在人非小细胞肺癌中作为癌基因的作用[33]. 金黄葡萄糖是一种临床上用于治疗类风湿关节炎的化合物，已被发现作为PKC iota抑制剂和非小细胞肺癌生长抑制剂[34]目前正在进行临床试验。
针对其C1结构域的策略是对抑制PKC酶活性的更传统方法的补充。针对PKC C1结构域的几种抑制剂已经在临床试验中或即将进行临床试验，这一事实为后一种方法提供了相当大的信心。所有以C1结构域为靶点的第一代化合物都是天然产物，从传统药物中分离出来或从天然产物筛选中鉴定出来。PEP005（ingenol 3-angelate），最初从霸王鞭[35]，正在进行光化性角化病和非黑色素性皮肤癌的临床试验[36]. 通过G.R.Pettit博士的高效海洋天然产物筛选项目鉴定出的Bryostatin 1正在进行多项癌症临床试验[37]. 前列腺素（12-脱氧山梨醇13-醋酸盐），最初从匍匐大戟随后从厚马兰花是与HAART联合治疗以解决HIV-AIDS病毒潜伏期的候选药物[38，39]. 佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA），佛波醇的聚合酯巴豆tiglium，被评估为癌症的分化剂[40].
PKC催化位点抑制剂设计的一个主要困难是人类基因组中500多个激酶中ATP结合位点的高度保守性[41]. 迄今为止，PKC的选择性抑制剂只针对PKCβ开发（这些确实只是半选择性的，因为它们还抑制PKC以外的一些激酶）[42]. 靶向PKC的C1结构域的一个优点是可以介导非靶向效应的C1结构体的数量要少得多。然而，潜在的担忧是C1结构域的高度保守性。多年前，我们能够在线虫、苍蝇和小鼠等多种生物中显示类似的佛波酯结合[43]. 另一方面，一个重要的概念是PKC对配体的识别高度依赖于其所在的细胞环境。促成细胞环境的这种效应的因素包括膜的脂质组成，因为磷脂与C1结构域一起形成配体识别的半衰期，以及细胞内钙水平，调节经典而非新型PKC亚型的膜结合。在在体外结合分析，Lorenzo及其同事[44]例如，证明了12，13-二丁酸佛波酯对PKC-α的相对亲和力与RasGRP1结构体的相对亲和性显著依赖于磷脂组成。同样，我们证明了PMA和bryostatin 1对小鼠3T3细胞PKC亚型α和δ的选择性存在显著差异[45]和小鼠角质形成细胞[46].
C1结构域配体能否实现生物反应亚通路的选择性？早期对佛波醇衍生物生物活性的分析得出的明确答案是，选择性是可以实现的。虽然PMA在小鼠皮肤两阶段致癌模型中作为肿瘤促进剂和皮肤刺激物都是有效的，但一些佛波醇衍生物仅具有刺激性，这使得Hecker得出结论：“炎症和共致癌活性（佛波酯）是不同且独立的参数”[47]. 同样，斯拉格及其同事报告称，甲泽兰是一种具有刺激性的瑞香烷衍生物，只有在使用一种或多种PMA之前，它才能在小鼠皮肤上起到促进作用，从而定义了肿瘤促进的亚阶段[48]和Hennings等人[49]描述了美泽兰与PMA在促进与乳头状瘤相关的鳞状细胞癌方面的功效的显著差异。最引人注目的是，与PMA相比，前列腺素不仅不能诱导增生[50]是PMA诱导皮肤增生、鸟氨酸脱羧酶和水肿的有效抑制剂[51，52]以及促进肿瘤生长[53]. 这些结果明确表明，DAG类似物的反应选择性是可以实现的。剩下的问题将为合理的药物设计提供基础，这些问题包括选择性的程度、选择性靶向所需亚通路的能力以及选择性背后的机制。
生物特异性的总体策略
目标的选择
实现对不同C1结构域配体的不同生物反应的最直接的机制是在7个效应子家族内对C1结构域配体的选择性和/或在单个效应子家族内成员之间的选择性。不仅单个PKC亚型在生物学功能上表现出显著差异，而且一个引人注目的观察结果是，一种PKC亚型态的功能可能与另一种PKC亚型态相反[54]. 例如，在许多系统中，PKCε促进细胞增殖，抑制凋亡，并正在转化[55]. 相应地，在小鼠皮肤中，PKCε过度表达增强了紫外线照射后的肿瘤形成[56]. 相反，PKCδ通常抑制细胞增殖，诱导细胞分化，并促进凋亡[57，58]虽然具体效果取决于细胞系统和凋亡刺激[59]. 同样，在小鼠皮肤两阶段致癌方案中，PKCδ的过度表达抑制肿瘤的促进[60]. 对于结肠，菲尔兹及其同事的优雅研究证明PKCβII表达与癌症形成有关[61]而PKCα作为肿瘤抑制剂[62]. 因此，对PKC亚型选择性抑制剂设计的一种补充策略是设计拮抗亚型的选择性激活剂。对于具有拮抗功能的C1结构域配体，相同的概念适用于不同的效应器家族。DAG激酶通过将DAG转化为磷脂酸，消除DAG途径的生理反应，如PKC的刺激。类似地，抑制Rac的嵌合体被预测为具有肿瘤抑制作用[14].
当然，合理设计选择性配体的一个复杂因素是靶点之间复杂的直接和间接串扰。因此，在C1结构域DAG效应器中，PKC磷酸化PKD[13]和RasGRP，导致其激活[63——66]. PKD和RasGRP的C1结构域的作用显然是驱动定位而不是激活就其本身而言尽管如此，这种定位作用可能对其生物功能至关重要。同样，PKC磷酸化一些DAG激酶亚型。取决于亚型，这种磷酸化可能被激活或抑制[21]. 第二层次的串扰更为间接，其中一个目标诱导的通路向自身或另一个目标上游馈送。例如，EGF受体激活刺激c-Src和PLC-γ，激活RasGRP3，后者激活Rap2B，反过来激活PLC-ε。PLC-ε通过其DAG的形成，可以维持RasGRP3和PKC的激活[67]. 第三个复杂程度是C1域家族成员的关联。例如，DGKξ与RasGRP1关联[68]和PKCα[69]，抑制他们的行动。DGKα与RasGRP1关联[70]DGK公司与RasGRP3合作[71]在这两种情况下都会导致抑制。这些连锁路径的实际结果是，药物设计的最现实方法是半理性的，通过生物反应可以验证潜在的设计概念。
作用动力学差异
从天然产物的经验中得出的一个重要假设是配体的亲脂性可能是一个关键变量。与典型的佛波酯相比，小鼠皮肤对非促性腺激素12-脱氧佛波酯的生物反应存在显著差异，其中短链取代的12-脱氧佛波酯诱导暂时性炎症，而典型的佛波酯诱导持续时间更长的炎症[47]. 人们的注意力集中在侧链的性质上，因为同源的12-脱氧山梨醇衍生物仅在用长的脂肪族侧链取代非促性腺激素衍生物上的短支链方面有所不同，从而产生了有效的肿瘤促进剂[72]. 同样，目前正在临床试验中的PEP005（茚二醇3-天使酸酯）因仅具有短酯侧链而引人注目，而衍生物如茚二醇3-十六烷酸酯也是有效的肿瘤促进剂[73]. 虽然尚未详细研究佛波酯通过皮肤的渗透速率，但在细胞系统中，亲脂性决定了其细胞渗透速率，这一点可以通过使用一系列不同亲脂性的荧光佛波酯衍生物的直接测量得到证明[74]. 亲脂性同样被证明会影响佛波酯诱导细胞反应的结构-活性关系[75].
细胞定位差异
将GFP（绿色荧光蛋白）融合到C1结构域和完整的PKC亚型或其他包含C1结构域的效应器的构建物为测量配体对易位的反应动力学以及易位的亚细胞位置提供了方便的工具[76，77]. 不同的PKC异构体不仅可以转移到不同的细胞部分，而且对于PKCδ，定位模式取决于特定的配体[78]. 具有特殊潜在意义的是一对同源物之间的比较，其中一个同源物是促肿瘤的（12-脱氧山梨醇13-十四酸盐），另一个同源体是促肿瘤抑制剂（12-去氧山梨碱13-苯乙酸盐）。促瘤衍生物导致PKCδ首先移位到质膜，然后再重新分布到内膜和核膜。相反，肿瘤促进抑制剂与内膜和核膜直接相关(). 聚合肿瘤启动子PMA诱导了类似的易位模式，促肿瘤的12-脱氧山梨醇酯也是如此。在随后的研究中，我们发现配体疏水性是PKCδ易位模式和动力学的明确决定因素[79]. 因为PKC的定位将决定它将访问的那些基底，这些不同的定位模式应该适合不同的反应模式。
不同配体导致中国仓鼠卵巢细胞PKCδ的差异性膜移位。表达GFP-PKCδ的细胞在1 uM配体处理后通过共焦显微镜成像。12-脱氧山梨醇13-十四酸盐是一种促进肿瘤生长的佛波醇衍生物，而其更亲水的类似物12-脱氧山梨醇-13-苯乙酸酯是一种肿瘤生长的抑制剂（来自[78]).
上述研究评估了单个过度表达GFP标记的PKC亚型的定位动力学。Gallegos等人提出了一种优雅的互补方法[80]. 这些作者开发了一种选择性PKC底物，该底物在磷酸化时产生FRET信号，并且可以通过融合到适当的靶向序列来定向到特定的亚细胞隔室。使用这些PKC活性的可本地化报告者，他们发现PDBu在不同的细胞位置和不同的时间进程中刺激了总PKC活性。质膜反应最快；线粒体反应最慢。此外，行为模式取决于特定的激活刺激。因此，与PDBu激活PKC相比，UTP对嘌呤能受体刺激的PKC激活在动力学以及不同膜室刺激的时间依赖性比率上表现出显著差异。
使用荧光佛波醇衍生物，可以在同一细胞中比较配体的摄取动力学和含C1结构域效应器的定位动力学和模式[74]. 更多亲水配体在细胞内迅速平衡；更多的疏水配体在长达数小时的时间内缓慢平衡。对于PKCα，定位始终是质膜，与配体主要位于质膜还是内膜无关。因此，结论是除了配体定位之外的其他因素在PKC-α的亚细胞定位偏好中起决定作用。相反，PKCδ始终与配体共定位。出现的一个关键战略概念是，设计具有独特定位模式的C1靶向配体应该能够产生独特的反应模式，选择性地影响包含靶蛋白的C1结构域子集。虽然GFP结构允许亚细胞隔室定位的可视化，但也有可能设计指向亚隔室的配体，例如质膜内的脂筏。同样，此类定位应允许访问该小室中存在的受限基板组。
通过不适当的定位产生对抗
设计C1结构域定向配体的几种在概念上有希望的策略正处于开发的早期阶段。高度亲水的配体至少在理论上具有与C1结构域结合的潜力，但通过在典型配体完成疏水表面的地方引入亲水帽，阻止了C1结构域在膜上的稳定；因此，它们将通过阻止C1结构域效应器在必要底物附近的适当定位来阻止其活动。这种方法的早期测试是通过使用未经取代的佛波醇和英格诺酯的母体醇，即佛波醇与英格诺本身。这两种化合物都不是很有活性。英格诺本身作为配体具有弱活性，与K结合我30μM，并在30μM至1 mM的浓度下诱导佛波酯的几种典型反应[81]. 福尔波确实通过EC抑制PKC5010 mM，但抑制作用似乎独立于其结合活性[82]. 从概念上讲，这两种配体都有缺陷，因为它们缺乏典型配体的酯基。虽然酯羰基在二元配体C1结构域络合物的晶体结构中未与C1结构域相互作用[83]很明显，酯羰基代表一种药效元素，与生理三元结合物中的磷脂头部基团相互作用(84，85]. 第二种方法是使用侧链上被极性官能团取代的佛波酯。Bertolini等人[86]描述了侧链上带有游离羧酸基团的衍生物在非常高的浓度（mM）下抑制PKC活性。极性较弱的配体仍然能够诱导脂质结合。Yamatsugu等人[87]用C12位酯中对苯二甲酰芳环上的全氟烷基和聚醚亲水链取代的二手佛波醇衍生物。这些化合物被证明具有作为PKCα抑制剂的显著效力（约200 nM），并且相对于PKCδ对PKCα具有特异性。然而，具有讽刺意味的是，聚醚亲水链以外的元素似乎主导了化合物的行为，因此它很好地与膜分离。作者得出结论，这些化合物可能具有不同于其预期的作用机制；他们认为，这种结合将配体导向C1结构域，其中聚醚链可以有效地结合金属，从C1结构域中提取锌原子，从而破坏其结构。因此，这将是一个通过特定的灭活功能链来对抗的独特通用策略的示例。
亲水配体设计的基本方法是防止PKC移位到膜，这是一种更广泛策略的专门示例，即将PKC保持在细胞内错误的位置，从而阻止其接触到必要的底物。在前一节中引用了大量的例子，即配体可以通过改变其侧链的疏水性程度来实现对不同膜的定位，从而可以获得类似的结果。尽管这些例子针对的是膜之间定位的差异，但配体直接作用于膜内的亚结构域（如脂筏）或通过蛋白质结合结合的信号复合物的方法也属于同一概念。RasGRP选择性代理可能会提供后一种策略的示例。由于RasGRP需要磷酸化才能在Ras上具有交换活性，因此与RasGRP结合但不与PKC结合的配体可能会将不活跃的RasGRP-转移到膜上，带来其相关的DAG激酶，从而抑制DAG信号传导。
双齿配体的特异性增强
药物设计中的一个长期概念是，将两个相互作用的结合部分组合在一个配体中应产生一个离解常数等于独立结合部分离解常数乘积（K梳子=K一×Kb条). 因此，两个具有μM亲和力的弱结合配体应生成一个具有股骨亲和力的双齿配体，即使两个结合部分之间存在一些干扰，也会留下非常强的亲和力[88]. 在C1结构域包含DAG效应器的情况下，只有PKC和PKD具有孪生C1结构域。嵌合体、RasGRP、Unc13和MRCK家族成员只有一个C1结构域，DAG激酶只有一个参与结合的C1结构域。此外，PKC和PKD亚型之间C1结构域的间距不同。在经典的PKC（α、β、γ）中，15个残基插入两个C1结构域之间；在新型PKC（delta、epsilon、theta和eta）中，数量增加到22–23；对于PKD，两个C1结构域之间有67–76个残基。最后，如下文所述，两个C1结构域的结构-活性关系不同。因此，强有力的预测是，具有适当长度连接子的二聚配体可能对PKC和PKD具有选择性，并且在该组中，仅对C1结构域之间具有相应间距的少数成员具有选择性。可以使用针对两个C1结构域的各自结构-活性要求优化的非对称二聚体来设计进一步的选择性。
几个小组已经设计了可变连接长度的双齿配体，并测定了它们对PKC的活性[89]. 例如，Sridhar等人[90]设计了一系列具有4–20个碳的连接体的苯内酰胺二聚体。10-20个碳的间隔物在低nM范围内产生了类似的最佳结果，但PKC亚型之间没有选择性。Giorgione等人[91]对二聚佛波酯使用了类似的方法。使用仔细的控制来评估两个C1域对增强结合的潜在参与。将PKCβII的分离C1b结构域的活性与完整PKCβⅡ的活性进行比较。同样，与完整PKCδ的结合与C1a或C1b结构域突变为非活性的PKCδ突变体的结合进行了比较。再次，我们获得了有效的配体，但只发现了相当适度（3-4倍）的活性增强，这可能归因于配体的二聚性。迄今为止，对这种适度成功的一个合理解释是，连接物既可以作为间隔物，也可以作为疏水锚，穿透脂质双层。到目前为止的结果表明，这两个角色对于所使用的特定链接器是冲突的。
通过控制穿透深度的特异性
C1结构域在配体结合间隙的结构中高度保守。域外部的残基保存较少，影响了它们与磷脂双层的相互作用(). Cho及其同事的优雅研究表明，不同的C1结构域能够不同程度地插入双层，反映了这种多样性[92——94]. 在利用这些差异的初步研究中，Malloanarashimhan等人[95]设计了一系列具有可变长度的寡（对苯乙炔）酰基结构域的配体。除其他性质外，如果用亲水末端覆盖，此类化合物可以跨越质膜双层，并在相对于双层表面的不同深度或高度呈现DAG-内酯或其他C1结构域结合部分。虽然这些最初的研究只是为了探索这类一般结构的性质，但这些化合物显示出复杂多变的生物活性模式，支持了这一总体策略。
C1域之间的曲面多样性。C1结构域均显示在相同的相对方向上，结合间隙位于前上方。标准化一致憎水性量表来自[119].
C1域的相互作用模式改变
基于X-射线晶体学测定13-醋酸佛波酯与PKCδC1b结构域之间的配合物结构[83]通过分子模型评估了其他类配体与C1结构域的相互作用。该模型表明，结构不同的配体类别——佛波酯、英格诺酯、瑞香烷酯和吲哚内酰胺——使用相同和独特的相互作用组合来驱动它们的结合[96]. 在每种情况下，疏水侧链都从C1结构域伸出，在那里它们可以与磷脂相互作用，但它们的具体取向不同。Bryostatin与其他配体形成对比。该化合物诱导了截然不同的生物学特性，似乎插入到结合间隙中，结构的大部分覆盖在C1结构域上[97]. 因此，它呈现出一个与脂质双层的复杂界面，尽管尚不清楚苔藓抑制素的这种特性在多大程度上导致了它们的异常行为。
DAG-内酯的广泛研究()作为C1结构域的配体将在下文中详细讨论。然而，这里应该注意的是，建模表明DAG和DAG内酯都可以在两个方向中的任何一个方向插入C1结构域的结合间隙，称为锡-1和锡-2，其中与C1结构域的结合相互作用是与C3伯羟基和锡-1或锡-分别为2个羰基[85，98，99](). 取向之间的偏好部分由两个侧链的性质驱动，其中优选引导更疏水的侧链离开C1结构域并进入脂质双层的取向。另一个元素是模板的性质锡-DAG首选1个方向锡-DAG-内酯首选2取向。
佛波酯、苔藓抑制素、DAG和DAG-内酯的结构比较。手性中心以紫色显示。DAG-内酯代表构象受限的DAG类似物（改编自[107]).
DAG-内酯在C1结构域结合间隙中的选择性取向（来自[98]).
影响C1结构域功能的因素
虽然分析C1结构域本身的行为并转移该知识以预测C1结构域所在蛋白质的行为是很方便的，但很明显，C1结构域所处的环境对其行为有重要影响。Irie和同事的广泛研究提供了一个简单的例子[100]. 他们的方法是化学合成各种C1结构域，以表征其结构-活性关系。观察到，将额外的带电残基C末端包含到C1结构域中能够将表观配体结合亲和力提高7.5倍。当然，可能的机制是，结合分析通常不是针对配体和C1结构域的二元络合物，而是针对C1结构域、配体和阴离子脂质的三元络合物。插入双层所需区域外C1结构域上增强的正电荷可能会增加与阴离子脂质的结合，从而有助于三元络合物的表观亲和力。
第二个例子是通过比较单个C1结构域和完整蛋白质的亲和力来提供的。如下文所述，DAG-内酯130C037被发现与PKCδ的C1b结构域具有高亲和力，但与PKC△的C1a结构域或PKCα的C1结构域具有极低亲和力[101]. 相反，这两个完整的PKC亚型对配体的亲和力只有适度（4倍）的差异。
Canagarajah等人对C1结构域和完整蛋白质的行为之间的差异提供了优雅的机械见解[102]. 这些作者测定了β2-奇马林的晶体结构。该蛋白具有C1结构域，该结构域与佛波醇12,13-二丁酯具有高亲和力，而完整蛋白仅在佛波醇酯浓度高得多的完整细胞中易位。X射线结构显示C1结构域的结合裂隙是通过与N末端、SH2结构域、RacGAP结构域以及SH2和C1结构域之间的连接体的接触而掩埋的。导致这些接触的残基突变使蛋白质敏化为佛波酯移位。这意味着β2-嵌合体的生理激活是协同的，DAG与其他一些促进去折叠的因子（磷酸酪氨酸与SH结构域相互作用？）一起作为共同刺激物。
PKC的间接证据支持类似的情况。奥塞亚和迈耶[76]结果表明，含有孪生C1结构域的PKC-γ片段在佛波酯作用下立即移位至质膜。相反，完整的酶显示出延迟的反应，这表明该酶首先需要经历构象变化，从而使C1结构域可以被访问。这种模型与预测一致，即C1结构域的疏水面预计不会暴露于未刺激酶中的溶剂，而是会与酶上的一些互补表面相互作用。与此模型一致，Stahelin等人[103]证明PKC-α的C1a结构域和C2结构域通过两个结构域上的互补电荷相互作用。这些相互作用的破坏增强了膜亲和力和易位动力学。
上述实例是对配体有反应的C1结构域，其中活性在某种程度上被蛋白质中的其他元素掩盖。我们对MRCK的初步理解意味着不同的行为模式。据报道，MRCK对高水平的佛波酯有反应[104]. 我们已经证明，分离的C1结构域对佛波酯具有亲和力，该亲和力明显小于PKCδ的C1b结构域（50倍），但接近PKCα的C1b区域[105]. 这一发现强烈表明，MRCK中的其他元素需要与C1结构域结合，以驱动对佛波酯或在生理条件下对DAG的反应。
DAG内酯作为C1结构域的配体
佛波酯、吲哚内酰胺、聚乙酸酯、大环内酯和环烯醛是C1结构域的有效配体，在刚性模板上以适当的三维构型固定适当的亲水和疏水基团，以便与C1结构域相互作用。不幸的是，这些天然产物复杂的化学性质限制了它们在详细探索结构-活性关系方面的用途。例如，福尔波在结构上有8个不对称中心，而苔藓抑制素有11个不对称中心。C1结构域的内源性配体，锡-相比之下，1,2-二酰基甘油的结构简单得多，只有一个不对称中心，极大地促进了化学反应。另一方面，DAG表现出相当弱的亲和力，部分反映了甘油骨架的灵活性，因此在结合时固定甘油是不利于熵的。
Marquez和Blumberg小组采用的一种方法是探索如果DAG被环化，DAG是否能够提供合适的模板，从而使结构刚性化，以消除这种熵罚。在各种潜在的环化途径中，DAG-内酯结构被证明是成功的[106]. 活性进一步增强，接近佛波酯在体外结合分析是通过对疏水侧链的适当操作实现的[107]，并开发了一种高效的单手性中心立体定向合成方法[108]. 如其他文献所述，使用DAG-内酯模板，对配体结构-活性关系的广泛探索是可能的[98]. 一个强大的策略是将配体的有目的的结构修饰与它们对C1结构域的评估结合起来，C1结构域变异是为了解决假定的相互作用机制，并辅以计算机建模，以深入了解各种组合的能量学。
二恶英酮提供了这种方法的说明[109]. 问题是是否可能在DAG-内酯结构中引入额外的相互作用基团。二恶英酮类代表DAG-内酯结构的桥联亚甲基被氧取代的衍生物。二氧杂蒽酮确实以高亲和力结合到PKCδ的C1b结构域，尽管与相对取代的DAG-内酯相比亲和力没有增强。模型显示，该氧基团可以与PKC三角洲C1b结构域中第27位的保守谷氨酰胺形成新的氢键。与这种相互作用确实对二氧杂蒽酮的相互作用至关重要的情况相一致，谷氨酰胺残基突变为谷氨酸的突变C1b结构域显示出对佛波酯的结合亲和力略有下降，但对二氧杂环蒽酮的结合力严重丧失。如果引入了额外的交互点，为什么结合亲和力没有增强？建模再次提供了洞察力。为了利用这个新的相互作用点，二氧杂蒽酮必须从锡-DAG-内酯倾向于2个方向锡-1方向，基本上抵消了能量的潜在增益。
组合化学是对基于建模见解的特定配体设计的补充，它提供了一种强有力的工具，可以有效地探测疏水结构域的变化对配体生物效应的影响[101，110]. 如上所述，我们已经知道，这种结构方面是C1结构域的有效天然产物配体所观察到的生物结果多样性的主要原因。从96个元素的初始库中，我们确定化合物130C037是一种高选择性配体。它以1.8 nM的亲和力与PKC delta的分离C1b结构域结合，而它与PKC delta的C1a结构域或PKCα的C1结构域的亲和力为μM或较弱。相反，PDBu对这四个C1结构域的亲和力在10倍以内是相似的。对于完整蛋白质，130C037以高亲和力（约4 nM）结合到Ras激活剂RasGRP1和RasGRP3。它与PKCε的亲和力弱8倍，与PKCα的亲和力低80倍。在完整细胞中观察到对膜结合或移位以及Ras下游ERK磷酸化激活的类似选择性。在对最初两个文库进行的研究中，一个明确的发现是，文库成员在各种生物测定中都表现出不同的选择性模式[111]. 虽然尚未证明这些单独的生物终点具有响应特异性的广泛多样性的实际机制，但可信的模型是差异定位，无论是对细胞内的不同膜还是对同一细胞膜内的不同微域，由文库分子上的疏水性“化学邮政编码”引导。组合方法的强大之处在于，它可以有效地生成各种结构，以探测DAG信号网络中交互的多样性，从而产生综合选择性响应。
作为C1结构域配体的吲哚内酰胺和苯内酰胺
已证明可广泛操作的第二类结构是吲哚内酰胺和修饰模板苯并内酰胺的结构（见[112和113]用于审查）。其中一些化合物再次显示出明显的选择性。在单个C1结构域上，与经典PKC的C1结构域或嵌合体、RasGRP或Unc13的C1结构区相比，5-戊烯基吲哚内酰胺-V对新型PKC的C1b结构域表现出显著的选择性[100]. 与经典PKC相比，8-辛基-苯并内酯-V9对新型PKC的移位具有选择性[114]. 与其他PKC活化剂一样，这类化合物作为阿尔茨海默病的潜在治疗剂引起了人们的兴趣，因为它们能够增强PKC刺激后的α-分泌酶活性，导致淀粉样前体蛋白水平降低[115].
总结
C1结构域作为调控基序出现的一致图景是，它们代表驱动反应的单个元素，与靶蛋白内的其他调控元素结合。因此，对于经典PKC亚型，膜上的活性构象通过假底物与膜的离子相互作用、C1结构域与膜分隔配体的稳定以及C1结构域和磷脂的进一步相互作用而稳定，C2结构域通过钙桥和磷脂头部基团相互作用。PKC的磷酸化状态以及可能存在的结合蛋白（如RACKS）也有进一步的作用[116]. 将元素的多样性整合到响应中，使细胞有机会控制7个家族的子集和具有C1域的多个家族成员。
一个叠加的调控水平是由多个C1结构域蛋白质序列定位在同一通路上提供的。PKC磷酸化并激活PKD、RasGRP和一些DAG激酶。同一途径中的多个激活点预测反应的正协同性，生成陡峭的剂量-反应曲线。相反，DAG激酶会消除所有包含C1结构域的蛋白质的反应。
第三级调控是由C1结构域蛋白质提供的，这些蛋白质位于自我反馈的途径中。与磷脂酶Cβ和磷脂酶Cγ偶联的多种受体产生DAG来激活PKC，PKC反过来直接或间接敏化与磷脂酶Cβ和磷酯酶Cγ偶联的各种受体，产生正反馈回路。
在功能水平上，配体C1结构域疏水性的增加起到了两个非决定性的作用。对于PKC，C1结构域既促进与膜的结合，又与膜一起稳定酶的活化构象。在PKD或RasGRP的情况下，C1结构域参与蛋白质的定位，而活化是由磷酸化驱动的独立过程；后一步也是C1域相关的，但由PKC上的C1域驱动。最后，可以区分C1结构域在定位蛋白质自身功能活性方面的作用，如RasGRP的鸟嘌呤核苷酸交换功能，以及C1结构域蛋白质作为适配器的作用，其中C1结构域定位相关功能蛋白质，其中RasGRP和DAG激酶提供了一个例子。
第三个潜在的作用是C1结构域参与蛋白质相互作用，以及配体结合对这些相互作用的可能调节，但这一作用相对较少受到关注[6]. 例如，Wang和Kazanietz[117]描述了奇马林C1结构域和Tmp21-I之间的相互作用，以及Yasuda等人[118]描述了嵌合体C1结构域与DAG激酶γ的相互作用。
由C1结构域之间的同源性驱动的最初观点是，对聚合C1结构域进行表征将揭示C1结构域的一般行为细节。越来越明显的是，这是一种过于简单化的说法，其受体中每个C1结构域的具体行为需要分析。
好消息是，这些相互关联的调控途径和有助于配体反应的多种元素使C1结构域靶向治疗药物摆脱了相对保守的结合间隙所施加的限制。靶点不是结合间隙，而是C1结构域其余部分、特定受体和存在该受体的细胞环境的复杂背景中的C1结构域。另一方面，这种复杂性的必然结果是，对于许多生物学来说，系统的复杂性意味着C1靶向配体的药物开发将趋于半理性而非理性。
同样，非常好的消息是，C1域导向药物潜在的治疗靶点的多样性为将正确的药理解决方案与正确的生物问题匹配提供了大量机会。不太好的消息是，这种方法与制药行业通常的组织结构正交，后者是围绕驱动药物开发的特定治疗条件组织的，而不是围绕影响多种条件的特定途径组织的。因此，毫不奇怪，学术界和政府一直站在C1配体结构先导的前沿。该领域目前的状况非常令人兴奋。
