[U的代谢-¹³C] 人脑肿瘤中的葡萄糖在体内

摘要

引言

能量代谢的重新编程被认为是恶性转化的标志[1]. 这个概念起源于20世纪20年代，当时Warburg证明，相对于正常组织，肿瘤在有氧的情况下表现出过度的糖酵解和乳酸生成（“Warburge效应”）[2,三]. 这一观察结果导致了一个在过去80年的大部分时间里主导癌症代谢研究的模型：恶性转化将葡萄糖代谢从线粒体中有效的能量生成途径转移到糖酵解作为主要能量来源[4]. Warburg的工作预示了用葡萄糖类似物监测肿瘤葡萄糖摄取的临床实践，2-¹⁸氟-2-脱氧葡萄糖(¹⁸FDG）和正电子发射断层成像（PET）。这种手术利用了肿瘤比周围组织更快地运输葡萄糖的能力。驱动肿瘤中葡萄糖代谢增强的机制，以及这种代谢现象在细胞水平上的益处，都是复杂的，尚未完全理解。癌细胞株中葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶的表达受癌基因和低氧诱导因子-1（HIF-1）的驱动，可能体内[5–7]. 在少数肿瘤中，明显损害氧化代谢的突变也可能在肿瘤生长过程中刺激糖酵解[8–11]. 此外，来自实验模型的证据表明，过量的葡萄糖代谢实际上通过维持必需的糖酵解中间产物和其他效应分子的池来实现卓越的细胞生长[5,12–15].

然而，尽管¹⁸FDG-PET作为肿瘤糖酵解的替代物[16]除葡萄糖摄取外，无法从这些扫描中收集到任何信息，因此很难设计合理的治疗策略来干扰肿瘤能量的形成。在¹⁸对于FDG-PET类肿瘤，尚不清楚葡萄糖是否仅代谢为丙酮酸和乳酸，或者葡萄糖碳是否在TCA循环中被氧化。葡萄糖碳进入循环也会提供肿瘤生长所需的大分子前体（例如柠檬酸盐、琥珀酰辅酶A、非必需氨基酸、核苷酸、脂肪酸）[17–19]. 稳定同位素示踪剂，如¹³富含C的葡萄糖是探测新陈代谢的有用工具体内，因为¹³葡萄糖下游代谢产物中的C，通过¹³C核磁共振（NMR）波谱提供了有关感兴趣组织中新陈代谢的丰富信息。由于这些示踪剂没有放射性，因此可以安全地将其注入人体患者体内，以大量丰富信息代谢物。虽然实时采集¹³活患者的C谱可能有用[20]，有限的空间分辨率和部分体积效应体内 ¹³核磁共振谱学限制了其在癌症中的实用性。或者，从注入¹³可以分析C-葡萄糖体外[21,22]. 在治疗过程中计划手术切除原发肿瘤时，这种方法是可行的。

恶性胶质瘤迫切需要新的治疗方法，这是因为尽管进行了积极的多模式治疗，但肿瘤的快速进展和致命性。胶质母细胞瘤（GBM）和脑转移显示¹⁸PET对FDG的摄取，通常超过正常皮层的高葡萄糖摄取率，并且通过以下方式显示出细胞内代谢物池的显著扰动¹核磁共振波谱（MRS）[23–25]. 这些发现表明，代谢重编程有助于GBM的生长，可能是一个有用的治疗靶点。在当前的研究中，我们优化了-¹³C] 产生高质量质子解耦的葡萄糖输注协议¹³从九个原发性高级胶质瘤和两个转移性脑肿瘤中提取的代谢物的C NMR谱。在每个肿瘤中，葡萄糖在TCA循环中被氧化，并被用于生产大分子前体，反映出复杂的代谢表型，包括但不限于葡萄糖转化为乳酸。TCA循环中使用的乙酰辅酶A的很大一部分并非来源于血载葡萄糖，这表明除葡萄糖外，其他底物也能在脑肿瘤生长期间提供能量。

材料和方法

结果

人GBM中的糖酵解、甘氨酸合成和葡萄糖氧化

[美]-¹³C] 在三名GBM患者（患者1-3，见支持信息图S1). 典型病例（患者3）如所示图1.一个含囊性和实性成分的钆增强右颞顶肿块(图1a)显示出对¹⁸肿瘤边缘的FDG(图1b).¹³在输注过程中，血浆中的C-葡萄糖浓度逐渐增加，在肿瘤取样时最高可达25%(图1c). 质谱分析显示，基本上所有的血糖在所有六个位置都是未标记或标记的，只有一小部分（研究中所有患者的3±2%）含有1到5个¹³C原子。因此，基本上所有进入肿瘤的标记葡萄糖都是[U-¹³C] 葡萄糖。尽管血糖浓度相对较低，¹³C–¹³在许多肿瘤代谢物中检测到C自旋耦合(图1d). 联轴器反射相邻¹³[U代谢产生的C核-¹³C] 葡萄糖。¹³C–¹³在乳酸和丙氨酸中观察到C偶联，这与糖酵解细胞中葡萄糖代谢为丙酮酸的高速率一致。¹³C–¹³甘氨酸中也检测到C偶联，甘氨酸是核苷酸和蛋白质合成的中间产物，最近被确定为一些肿瘤细胞中葡萄糖碳的重要去向[29,30]. 乳酸碳2（lactate carbon 2，LAC2）中的信号显示了一个大的双峰，反映了所有三个乳酸碳的标记。LAC2多聚体还包含小的2–3和1–2双聚体，这表明并非肿瘤中的所有乳酸都被均匀标记。这些模式产生于葡萄糖碳进入TCA循环，然后代谢为丙酮酸（丙酮酸循环）和乳酸[31].

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图1

GBM患者输注[U后的肿瘤葡萄糖代谢-¹³C] 4克/小时的葡萄糖

（a）术前T1加权钆后冠状位图像显示右侧颞顶环巨大肿块，伴有中央囊性成分（X）和周围水肿。（b） ¹⁸FDG-PET扫描显示摄取¹⁸沿肿瘤边缘和囊肿下方的FDG（箭头所示）。预期高皮质率¹⁸左半球可见白质摄取减少的FDG信号。变钝了¹⁸肿瘤上方右半球的FDG信号可能是肿瘤相关水肿的结果。肿瘤样本的组织学分析显示，近100%为恶性细胞。（c）百分比¹³200分钟输注[U后血浆葡萄糖（Glc）中的C富集-¹³C] 葡萄糖浓度为4g/hr。浓缩是指血浆葡萄糖均匀标记的分数¹³C.在最后35分钟内收集肿瘤样本（蓝色条）。质子解耦¹³C核磁共振波谱（d）与中箭头对应的肿瘤样本（b）; 和（e）囊肿液。在许多突出的共振中出现多重波是由于¹³C–¹³C联轴器。论文中所有光谱的赋值：（1）乳酸C2；（2） 谷氨酸C2；（3） 谷氨酰胺C2；（4） 天冬氨酸C2；（5） 丙氨酸C2；（6） 牛磺酸C1；（7） 甘氨酸C2；（8） N-乙酰天冬氨酸C3；（9） GABA C4；（10） 肌酸C2；（11） 天冬氨酸C3；（12） 牛磺酸C2；（13） GABA C2；（14） 谷氨酸C4；（15） 谷氨酰胺C4；（16） 谷氨酸C3；（17） 谷氨酰胺C3；（18） γ-氨基丁酸C3；（19） N-乙酰天冬氨酸C6；（20） ，乳酸C3；（21）丙氨酸C3。插图从左到右为乳酸C2；甘氨酸C2；谷氨酸C4；谷氨酸和谷氨酰胺C3。缩写：S、 单线；D、 双重（例如D12，双重产生于¹³碳1和2中的C）；Q、 四重奏。

出乎意料的是，在每个GBM中分析的所有碳中都标记了谷氨酸和谷氨酰胺。谷氨酸和谷酰胺碳4中的4-5倍来自[1,2-¹³C] [U产生的乙酰辅酶A-¹³C] 葡萄糖，证明葡萄糖通过丙酮酸脱氢酶（PDH）代谢为乙酰辅酶A。谷氨酸碳2和谷氨酸碳3的标记与TCA循环的周转一致。谷氨酸和谷氨酰胺在每个碳原子上的标记模式相似，表明谷氨酸通过谷氨酰胺合成酶（GS）转化为谷氨酰胺。然而，由于一些多重态的分辨率较差，尤其是谷氨酸碳4中的双重态，因此不可能进行完整的定量同位素分析(图1d). 这些GBM中观察到的代谢活动的定性总结见图2.

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图2

人脑肿瘤糖代谢研究综述体内

填充符号为¹³C、 开放符号是¹²C.数字表示代谢物中的碳位置，由¹³这项研究中的C NMR，并包括在内，以帮助解释光谱。TCA循环第一圈以外的标记可以从¹³柠檬酸盐/异柠檬酸盐的C分布；有其他详细信息[47]. 在多个肿瘤中观察到图中所示的每条通路。整个代谢网络包括葡萄糖通过糖酵解代谢为乳酸，以及通过涉及部分TCA循环和/或磷酸戊糖途径的更复杂的代谢途径（数据未显示）。所有11例肿瘤中均可见丙酮酸脱氢酶（PDH）、柠檬酸合成酶（CS）、TCA循环的完全转换、回补以及葡萄糖合成谷氨酸和谷氨酰胺。从头开始在星形细胞瘤、转移性乳腺肿瘤和8例胶质母细胞瘤中的7例中，甘氨酸合成明显。GS，谷氨酰胺合成酶。

由于囊肿是GBM的常见特征，我们还分析了该患者囊肿中的液体。与正常血浆水平（1-2 mM）相比，它含有丰富的乳酸（15.7 mM），并且¹³C核磁共振谱以乳酸信号为主(图1e). 虽然乳酸囊肿中存在小的多胞菌，但与肿瘤乳酸不同，这些多胞菌与大的单胞菌相比显得矮小。质谱分析显示，囊肿中乳酸含量不到5%¹³C.因此，单峰是自然发生的¹³C（占所有碳的1.1%），而不是从¹³C-葡萄糖和新的葡萄糖衍生乳酸进入囊肿的速度不够快，无法标记这一大池中的高比例。与血浆一样，囊肿液也含有丰富的谷氨酰胺（0.7 mM）和极少的谷氨酸。缺乏¹³C–¹³谷氨酰胺中的C多重态(图1e)结果显示，在输注过程中，肿瘤衍生的谷氨酰胺没有分泌到囊肿中。

用GBM中的葡萄糖和其他燃料生产乙酰辅酶A

接下来，我们通过注入初始剂量为8g[U-¹³C] 葡萄糖超过10分钟，然后持续输注8克/小时。一名III级星形细胞瘤患者（患者4，图3)五名未经治疗的GBM患者¹⁸使用该方案研究了FDG阳性肿块（5-9名患者）。正如预期的那样，患者的¹³C标记血糖，最终浓缩倍数增加2–3倍（通常超过50%），肿瘤取样前血浆中长期高浓缩(图S1). 在所有病例中，肿瘤标本均在输液至少100分钟后采集(图S1). 在四名血糖正常的患者中，最终血浆浓度为49-65%，在一名类固醇诱导的高血糖患者（患者5）中，血浆浓度为32%(表1). 在整个过程中，其他循环营养素的标记都很少。少量统一标记的乳酸（占血浆乳酸总量的9±5%）和谷氨酰胺，以及两个额外的质量单位¹³在这些输液结束时，通过质谱法检测到C（占血浆谷氨酰胺总量的4±3%）。

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图3

一例WHO III级星形细胞瘤患者输注[U-¹³C] 8克/小时的葡萄糖

（a）术前T1加权钆后轴位图像显示右侧颞叶结节状强化。（b）从切除标本制备的组织切片的苏木精和伊红染色。细胞性：约80%的肿瘤细胞核和约20%的非肿瘤细胞细胞核（神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和内皮细胞）。（c）血浆葡萄糖（Glc）富集的时间过程。这位患者接受了8克[U-¹³C] 葡萄糖，然后输注8g/hr。在150到200分钟（蓝色条）之间取出肿瘤组织样本，并在采集最后一个肿瘤样本后，即最后一个血浆样本前30分钟停止输注。（d）质子解耦¹³肿瘤组织的核磁共振波谱。缩写：T、 由于谷氨酸或谷氨酰胺在碳2、3和4中富集而形成三重态。作业和其他缩写与图1.

表1

11例人脑肿瘤同位素分析总结

两种类型的[U输液-¹³C] 使用葡萄糖：1-3号患者静脉滴注4g/hr，4-11号患者静脉推注8g/hr。患者3没有进行同位素分析，因为谷氨酸多聚体的分辨率较差。然而，八名输注Bolus+8 g/hr方案的患者的光谱质量足以进行非稳态（NSS）和稳态（SS）建模。计算接受这种输液的五名GBM患者的代谢参数的平均值和标准差。无补是指相对于柠檬酸合成酶活性的无补流量。Fc3，含有乙酰辅酶A的分数¹³两个碳中的C（[1,2-¹³C] 乙酰辅酶A）。

病人	肿瘤类型	输液方案	葡萄糖m+6 （血浆）	NSS Fc3公司	不锈钢Fc3	无补体
1	胶质母细胞瘤	4克/小时	0.23	0.05
2	胶质母细胞瘤	4克/小时	0.24	0.07
三	胶质母细胞瘤	4克/小时	0.25	-
5	胶质母细胞瘤	Bolus+8克/小时	0.32	0.09	0.06	1.63
6	胶质母细胞瘤	Bolus+8克/小时	0.58	0.09	0.08	1.80
7	胶质母细胞瘤	Bolus+8克/小时	0.57	0.13	0.08	0.94
8	胶质母细胞瘤	Bolus+8克/小时	0.61	0.19	0.17	0.94
9	胶质母细胞瘤	Bolus+8克/小时	0.56	0.25	0.19	0.94
		平均值	0.53	0.15	0.11	1.25
		标准偏差	0.12	0.07	0.06	0.43
4	III级星形细胞瘤	Bolus+8克/小时	0.57	0.20	0.21	0.84
10	转移性乳房	Bolus+8克/小时	0.65	0.25	0.22	0.58
11	转移性肺	Bolus+8克/小时	0.49	0.11	0.05	1.81

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较高的输注速率提高了核磁共振波谱中的信噪比，如III级星形细胞瘤患者（患者4，图3d). 即使在血糖浓度最低的高血糖患者中¹³C多重波（患者5，图4e).¹³C–¹³在所有肿瘤中的乳酸和丙氨酸中观察到C偶联，在两种输注方案中的8名GBM患者中有7名患者的甘氨酸中也观察到了C偶联。LAC2中可见双倍体，证实所有这些肿瘤中都存在丙酮酸循环。谷氨酸和谷氨酰胺的4-5倍证实PDH在所有肿瘤中都是活性的。在所有肿瘤中也观察到GLU4和GLN4处的双重性。这种多重性表明TCA循环的完全转换，因为只有当乙酰辅酶A和草酰乙酸在¹³C.GLU2、GLU3和GLU4多峰中的所有信号都得到了很好的解析，能够以高置信度整合峰面积，因此可以对谷氨酸同位素进行完整分析，以确定与葡萄糖代谢核心途径相关的富集度和相对通量[32]. 因为我们无法确定肿瘤内是否建立了代谢稳态，所以我们应用了稳态（SS）和非稳态（NSS）模型(表1). 我们首先确定乙酰辅酶A池（Fc3）中的分数富集。在这两种模型中，乙酰辅酶a的显著百分比标记为[1,2-¹³C] 肿瘤中的乙酰辅酶A（NSS模型中为15±7%，SS模型中为11±6%）。乙酰辅酶A富集与血浆葡萄糖富集呈正相关(图5). 然而，令人惊讶的是，在分析的每一个肿瘤中¹³乙酰辅酶A中的C富集度远低于血浆中的葡萄糖富集度(表1). 然后对两个接受4g/hr输注的肿瘤进行非稳态分析。尽管这些肿瘤含有[1,2]-¹³C] 乙酰辅酶A（acetyl-CoA）中测得的分数富集度远低于血糖富集度(表1). 这些数据表明，在这些肿瘤中，除葡萄糖外，其他营养素被代谢为乙酰辅酶a，然后在TCA循环中被显著氧化。

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图4

GBM患者输注[U后的肿瘤葡萄糖代谢-¹³C] 8克/小时的葡萄糖

a、，术前T1加权钆后矢状位图像显示左颞叶病变增强。b、， ¹⁸FDG-PET扫描显示摄取¹⁸T1增强对应区域的FDG。c、，肿瘤样本的代表性苏木精和伊红染色切片（200倍放大）显示GBM的特征。样本中几乎100%的活细胞为肿瘤细胞。日期：，百分比¹³血浆葡萄糖（Glc）中的C富集。该患者接受了8g丸，然后每小时8g输注[U-¹³C] -葡萄糖。请注意，该患者患有类固醇诱导的高血糖，这导致血糖最终浓度相对较低。蓝色条对应于肿瘤样本的去除。e、，质子解耦¹³从肿瘤中提取的代谢物的C核磁共振波谱。作业和缩写与图1.

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图5

血糖浓度与[1,2含量的相关性-¹³C] 肿瘤TCA循环中的乙酰辅酶A

¹³通过质谱法测定每个患者在肿瘤取样时间附近的血糖中的C富集。该值与Fc3的值（即进入TCA循环的乙酰辅酶A的分数¹³在两个碳上都标记有C，[1,2-¹³C] 乙酰辅酶a）通过非稳态分析从每个肿瘤光谱中测定。请注意，在每个患者中，¹³血浆葡萄糖中C的富集度远远超过Fc3。蓝色符号来自两名胶质母细胞瘤患者，使用每小时4克的[U-¹³C] -葡萄糖（Fc3无法根据根据本方案输注的第三名患者的频谱计算）。黑色符号来自五名胶质母细胞瘤患者，使用8克的[U-¹³C] -葡萄糖，然后每小时输液8克。红色符号为WHO III级星形细胞瘤患者，绿色符号为两名脑转移患者。

脑转移瘤中的葡萄糖氧化

综上所述，这些在高级胶质瘤中的观察结果表明，葡萄糖碳分配到多种生物能量和生物合成途径中。目前尚不清楚这些特性是这些侵袭性原发性脑肿瘤独有的，还是更广泛地描述生长在脑微环境中的肿瘤的特征。为了解决这个问题，我们研究了另外两名全身性癌症患者（乳腺癌和非小细胞肺癌原发患者），他们已经发展为脑部的孤立性转移。这个¹³乳腺转移瘤的核磁共振谱(图6)和肺转移(图7)共享了GBM中观察到的许多功能，包括¹³C–¹³乳酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺中的C多重态。乳腺转移瘤也从葡萄糖中产生甘氨酸(图6d，多路#7）。这两种肿瘤在GLU4中都有显著的4-5倍，反映了PDH通量。稳态模型再次揭示了乙酰辅酶A的显著回补和富集，这远远低于血糖(表1). 尽管仅限于2名患者，但这些病例代表了两种不同的癌症亚型，与原发性脑肿瘤的代谢相似性引人注目。

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图6

转移性乳腺癌患者的肿瘤葡萄糖代谢

包括术前成像（a）T1加权钆后冠状位图像显示一个大的、孤立的右侧小脑肿块和（b） ¹⁸FDG-PET扫描显示摄取¹⁸质量内的FDG。（c）从切除标本制备的组织切片的苏木精和伊红染色。免疫过氧化物酶染色显示，乳腺癌细胞中的乳腺珠蛋白和BRST-2（未显示）表达与乳腺起源一致。这个肿瘤对HER-2型雌激素和孕激素受体表达阴性。肿瘤细胞数>99%。（d）质子解耦¹³肿瘤的核磁共振波谱。作业和缩写与图1.

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图7

转移性非小细胞肺癌患者的肿瘤葡萄糖代谢

（a）术前影像学包括T1加权钆后轴位影像，显示右侧枕部巨大肿块。（b）从切除标本制备的切片的苏木精和伊红染色。免疫过氧化物酶染色显示肿瘤细胞（未显示）中甲状腺转录因子-1（TTF-1）的表达，与肺部来源一致。肿瘤细胞数约为95%。（c）质子解耦¹³肿瘤的核磁共振波谱。作业和缩写与图1.

讨论

这项工作有三个进步。首先，我们使用¹³C-葡萄糖检测人脑胶质瘤和脑转移瘤的代谢就地这为这些肿瘤中的葡萄糖代谢提供了一个新的生物学相关观点，这与之前仅依赖于在葡萄糖过量和其他非生理条件下培养的癌细胞株的代谢研究相比，向前迈出了重要一步。其次，葡萄糖和其他燃料在这些肿瘤的TCA循环中被氧化，这表明除了Warburg效应外，能量生产还涉及许多途径。第三，11个肿瘤的代谢非常相似，这表明这是脑部肿瘤侵袭性生长的共同特征，而不是特定突变或组织学类型的影响。

¹³富含C的葡萄糖和检测¹³核磁共振富含C的产物已应用于早期使用大鼠C6胶质瘤模型进行的肿瘤代谢研究。这种恶性肿瘤是通过暴露于N，N’-亚硝基-甲基脲诱导大鼠发生的，肿瘤细胞可以培养体外或重新植入新宿主，产生与多形性胶质母细胞瘤形态相似的肿瘤[33]. 在某些方面，C6模型的结果与当前报告一致。例如，Bouzier及其同事发现¹³C6胶质瘤高氯酸提取物中谷氨酸、谷氨酰胺、GABA和天冬氨酸的C富集-¹³C] 葡萄糖[34]. 尽管本报告中未提及¹³C光谱显示¹³C–¹³谷氨酸中的C自旋偶联，与预期的完全一样，如果进入TCA循环的乙酰辅酶a的重要部分来自[1-¹³C] 葡萄糖，正如这里报道的人类肿瘤。然而，其他报告也使用[1-¹³C] 相同C6模型中的葡萄糖，得出了相反的结论[35]. 即使在长时间输注后，正常大脑中也很容易检测到谷氨酸碳3和4的富集，但肿瘤中没有。因此，该报告中对葡萄糖代谢的数学分析基于TCA循环中的氧化可以忽略不计的假设。

这个¹³葡萄糖中的C标记模式，[U-¹³C] 葡萄糖被选为替代品，因为其目的是实现丙酮酸池的最大富集，以增加通过PDH检测通量的可能性。这种标记模式消除了与产生单标记乙酰辅酶A的标记模式相关的歧义，如[1-¹³C] 葡萄糖或[1,6-¹³C] 葡萄糖，因为在谷氨酸中产生的单峰态很难与自然丰度区分开来¹³如果TCA循环的周转缓慢，则为C。尽管[1，2-¹³C] 葡萄糖最好用于检测氧化戊糖磷酸分流的活性，只有[1,2产生的丙酮酸的一半-¹³C] 葡萄糖含有¹³C.此外，从实际角度来看，[U-¹³C] 葡萄糖相对便宜，大大提高了人体稳态输液实验的负担能力。我们专注于¹³C核磁共振波谱由于信息编码在自旋-自旋耦合中，因此它是分析单个样品复杂代谢途径的最强大的技术。至关重要的是¹³C使我们能够分析代谢途径的相对活性，而不是简单地测量代谢物丰度。

因为¹³C NMR很低，选择输液参数对获得最高质量的光谱至关重要。使用药丸和8g[U的输液速度-¹³C] 葡萄糖/hr可重复产生卓越的信噪比和良好的分辨率¹³C–¹³C倍数，让我们可以应用中间代谢的数学模型。虽然在不持续输液的情况下静脉推注可以获得信息丰富的核磁共振波谱[22]，在这些条件下没有建立代谢稳态。

全身输液¹³富含C的葡萄糖为肝脏和骨骼肌等其他器官提供葡萄糖，这些器官原则上可以生成¹³富含C的谷氨酰胺可以通过循环转移到肿瘤。然而，这不太可能，因为我们只检测到非常少量的¹³这些患者血浆中的C-谷氨酰胺。此外，研究人员开发了“化学活组织检查”方法来精确探测肝谷氨酰胺和谷氨酸的标记模式，因为人类肝脏通常不会输出大量这些氨基酸[36]. 我们还考虑了以下可能性：¹³C-标记的谷氨酸和/或谷氨酰胺在周围的大脑中合成，然后转移到肿瘤，夸大了肿瘤氧化葡萄糖并产生这些中间产物的能力。事实上，早期的一项研究使用微透析来证明人脑释放合成的谷氨酰胺从头开始从¹³C标记的营养物质进入间隙[37]. 未发布¹³该研究中检测到C-谷氨酸。然而，我们研究中的肿瘤光谱检查不支持一个模型，其中¹³肿瘤中检测到的C谷氨酸/谷氨酰胺来源于相邻组织产生的细胞外谷氨酰胺。如果¹³C-谷氨酰胺从间质空间进入肿瘤，然后转化为谷氨酸，谷氨酰胺的富集分数将超过谷氨酸的富集分数。但我们观察到相反的情况，如谷氨酸和谷氨酰胺多聚体的差异所示图1这里是单线态与自然丰度的比值¹³从C到加倍从头开始谷氨酰胺的合成比谷氨酸高得多。这表明谷氨酰胺的富集分数较低，模式表明¹³C在到达谷氨酰胺之前经过谷氨酸池，而不是相反。这与从头开始肿瘤内由葡萄糖合成谷氨酸和谷氨酰胺。

消耗的所有肿瘤[U-¹³C] 葡萄糖大量分泌¹³C–¹³许多代谢物中的C偶联。通过PDH和TCA循环的葡萄糖代谢在原发性和转移性肿瘤中都很活跃。因此，这些肿瘤保留了在TCA循环中高效捕获能量的酶机制。这个具体的结论完全依赖于对¹³C核磁共振谱，不需要任何假设或数学建模。这些发现与传统的新陈代谢观念相矛盾¹⁸FDG-PET阳性肿瘤：肿瘤葡萄糖处理主要由最终产物乳酸和丙氨酸的产生所控制。虽然在所有肿瘤中都观察到这两种代谢产物，但它们的形成表明这些人类肿瘤就地同时使用氧化和非氧化代谢[17,38]. 这些数据加强了最近对Warburg工作的重新审查，该工作强调了肿瘤代谢的复杂性，并且缺乏证据表明大多数肿瘤中存在呼吸抑制，甚至Warburg's早期实验中研究的肿瘤也是如此[39]. 肿瘤中PDH活性的观察尤其重要，因为最近的治疗努力调节GBM代谢体内使用了旨在刺激而非抑制PDH的药物[40].

出乎意料的是，我们发现血源性葡萄糖在肿瘤TCA循环中只提供了少数乙酰辅酶a。这一发现与正常大脑形成对比，正常大脑中95%的氧化代谢由葡萄糖提供[41]. 应根据以下两个假设来解释结果¹³C核磁共振分析。首先，我们假设血载葡萄糖的部分富集与肿瘤可用的葡萄糖富集相匹配。这似乎是合理的，因为肿瘤往往比大脑周围的¹⁸FDG-PET摄取，因为在30分钟内获得的肿瘤标本的核磁共振波谱几乎没有变化（数据未显示）。其次，数学分析要求肿瘤样本在葡萄糖代谢方面是均匀的。尽管所有肿瘤碎片都含有少量非恶性细胞¹³通过术前规划和成像、切除过程中碎片的立体定向定位以及每个样本的大体和组织学检查，仔细选择C NMR，以确保肿瘤细胞尽可能高（见材料和方法），并确保¹³C NMR谱反映了真诚地肿瘤组织。因此，在本分析支持的较低分辨率水平（150–400 mg肿瘤碎片）下，采取了一切可能的预防措施，以最大限度地提高样品的均匀性。考虑到这些假设，数据表明，除了血载葡萄糖外，肿瘤还会氧化其他底物。这些替代燃料（可能包括糖原、脂肪酸、氨基酸或有机酸）的代谢可能是人类GBM的合适治疗靶点，因为它们在大脑其他部位的利用预计最低。另一种可能性是，人类和动物胶质瘤中的细胞质脂质滴为线粒体中乙酰辅酶a的生成提供了动态底物库[42]. 未来的输液¹³C标记的替代营养素类似物将测试这些可能性。

除了在产生能量方面的作用外，葡萄糖还有助于生物合成。葡萄糖中的碳被用来供应蛋白质和核酸合成所需的大分子前体谷氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸。谷氨酰胺的生产在GBM中尤为明显¹³谷氨酰胺中的C核磁共振信号超过了相应谷氨酸碳中的信号(图1d和图4e). 甘氨酸是由糖酵解中间体3-磷酸甘油酯生成的，它为丝氨酸和甘氨酸提供碳。我们最近使用体内 ¹H MRS鉴定细胞内甘氨酸含量高的人类GBM亚群[43]. 由于丝氨酸/甘氨酸生物合成途径中的一种酶磷酸甘油酸脱氢酶在人类乳腺癌中通常过度表达，因此检测乳腺转移中的甘氨酸具有特殊的意义，该酶在这些肿瘤的一个子集的基因组水平上被扩增，在人类乳腺癌异种移植模型中对肿瘤生长至关重要[29]. 因此检测甘氨酸合成体内可能产生与肿瘤生长相关的重要信息。

代谢反映了肿瘤生物学的许多临床重要方面，包括增殖状态、对化疗和放疗的反应，以及特定致癌基因的可能影响。因此，令人惊讶的是，11种独立肿瘤的代谢活动如此一致。需要进一步研究以确定单个致癌突变是否与特定代谢特征相关，这些代谢特征可用于预测预后或个体化治疗。例如，异柠檬酸脱氢酶亚型1和2的突变在低度恶性胶质瘤中常见，并影响中间代谢，包括本研究分析的一些途径[44–46]. 将此方法推广到研究低度胶质瘤，以及研究除葡萄糖外其他营养物质的代谢，应该没有重大障碍。

结论

总之，这些研究表明，输注[U-¹³C] 在接受高级别胶质瘤和脑转移瘤手术切除的患者中，葡萄糖可以很容易地整合到标准手术室程序中。一种简单的方案，使用8g丸，然后每小时8g U输注-¹³C] 葡萄糖产生了高稳态血糖浓度和良好的信噪比¹³从肿瘤中提取的代谢产物的C光谱。在所有研究的11种肿瘤中，通过PDH的流量和TCA循环的周转都很活跃，这表明线粒体中的氧化是葡萄糖碳的重要去向。葡萄糖还用于生产非必需氨基酸谷氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸。¹³核磁共振同位素分析表明，肿瘤在TCA循环中氧化了血载葡萄糖以外的替代底物。

补充材料

致谢

缩写

参考文献