这个H19型lincRNA是miR-675的发育性储存库，抑制生长和免疫球蛋白1r

miR-675加工被RNA结合蛋白HuR抑制

由于胎盘中的抑制似乎是一个动态过程，我们假设RNA结合蛋白可能有助于miR-675的调节，因此进行RNA亲和性分析，然后进行质谱分析，以确定结合蛋白H19型miR-675干环区域（见方法）。我们使用部分分化的滋养细胞干（TS）细胞裂解物作为妊娠早期胎盘的细胞培养近似物，因为这些细胞虽然生长旺盛，但不表达miR-675H19型水平(补充图S1b，c). 使用这种方法，我们鉴定了49种选择性结合到H19型在miR-675干环区域(图2a). 值得注意的是，这些蛋白质包括许多与RNA代谢和小RNA调节有关的蛋白质，如Upf1、Zcchc11、Luc7l和HuR。其中，RNA结合蛋白HuR作为调控miR-675加工的候选蛋白，原因有很多：首先，在miR-676中存在一个假定的HuR结合位点H19型miR-675干环（AUUUUA）上游55bp，第二HuR公司随着miR-675的增加，胎盘在发育过程中逐渐下降¹⁹(图2b)第三，已知HuR能够保护mRNA免受内切酶的影响（miRNA加工酶Drosha和Dicer都是RNAse III类内切酶）²⁰最后，击倒HuR公司导致特定的胎盘缺陷²¹。我们还发现HuR公司miR-675沉默的肝脏中的表达高于妊娠晚期胎盘中的表达（数据未显示）。

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图2

HuR公司绑定到全长H19型并抑制miR-675的处理。（a）维恩图显示了通过RNA亲和分析（见方法）鉴定为与H19型在miR-675茎环（茎）区域和控制段，包括H19型阀杆回路上游（5′H19型)和Kcnq1ot1 RNA（Kcnq1 ot1）。（b）已发表的胎盘发育期间转录研究的微阵列数据¹⁹重新分析了HuR公司表达从E8.5到出生（P0）。请注意HuR公司在胎盘发育过程中，miR-675的表达与之相反。数据来自至少两个生物和两个技术复制品。（c）带有HuR抗体的RNA免疫沉淀表明与H19型当miR-675被抑制（E11.5），而当其表达（E19.5）时，在胎盘中表达。随机IgG对照组中RNA的富集显示为18s RNA的归一化。Actb和Gapdh水平分别作为阳性和阴性对照。n=9。（d）带有HuR抗体的RNA免疫沉淀表明与H19型在MEF细胞中。在对18s RNA进行归一化后，再次显示随机IgG对照的RNA富集。p21和Gapdh水平分别作为阳性和阴性对照。n=11。（e，g）miR-675-5p、miR-675-3p或miR-16在MEF细胞中的表达（e）和C2C12电池（g）在用抗HuR的siRNA（si-HuR）或通过qRT-PCR确定的非靶向加扰对照（si-加扰）处理之后。n=4。（f）基因缺乏HuR（HuR）的MEF细胞中miR-675-5p、miR-675-3p或miR-16的表达^-/-). n=5。所有误差条表明s.e.m.p值由Student’st吨-测试。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

我们用HuR抗体进行RNA免疫沉淀，发现它与全长结合H19型在E11.5的胎盘中，当miR-675被抑制且HuR水平较高时，而在E19.5，当miR675表达且HuR含量较低时，则不是这样(图2c). 我们试图确定进行功能研究的细胞培养模型。miR-675在原代MEF细胞中被抑制，尽管其在MEF细胞的表达强劲H19型(补充图S1d)，表明在这些细胞中发生了对加工的抑制；RNA免疫沉淀实验确实证实了HuR与H19型(图2d). 为了评估HuR在抑制miR-675加工中的作用，我们在MEF细胞中进行了siRNA介导的敲除，发现在没有HuR的情况下，miR-675-5p和miR-675-3p的水平分别增加了约2倍和1.5倍(图2e和补充图S2a，b). 在基因缺陷的MEF细胞中观察到类似的效果HuR公司(HuR公司^-/-)其中miR-675-5p和miR-675-3p分别比野生型对照增加约2倍和2.2倍(图2f). 最后，我们消融了HuR公司通过siRNA敲除在成肌细胞系（C2C12）中发现，在没有HuR的情况下，miR-675-5p和miR-675-3p的水平分别增加了2.8倍和3.5倍(图2g和补充图S2c，d). 在所有HuR缺乏的细胞培养模型中，miR-16的水平相对于对照组没有变化，这表明HuR消融的调节作用是miR-675特有的，而不是更广泛的miRNA加工途径。因此，HuR对两种miR-675的加工都有负调控作用。Luc7l公司敲除还导致miR-675水平增加，这表明HuR并不是加工过程中唯一的负调控因子(补充图S2b).

HuR不会阻止Dicer步骤中的miR-675处理，可能会阻止Drosha

接下来，我们试图确定miR-675加工途径中HuR抑制加工的位置。miRNA是从含有较长发夹的RNA开始依次处理的，首先由Drosha在细胞核中从pri-miRNA中产生前miRNA，然后由Dicer在细胞质中产生成熟的miRNA²²。丰富的H19型（pri-miRNA）表明miR-675的加工在Drosha阶段受到抑制。为了进一步研究这一点，我们对胎儿肝脏和胎盘RNA进行了Northern blot实验，发现只有低水平的前miR-675，即Drosha卵裂的产物H19型(图3a、b). 此外，当我们将合成的前miR-675转染到MEF细胞中时，我们观察到成熟miR-675的增加，这种增加不会因HuR的存在或不存在而改变，这表明Dicer的加工不受HuR的影响(图3c). 最后，我们的RNA免疫沉淀实验表明HuR与全长结合H19型核糖核酸(图2c、d). 综上所述，这些数据表明HuR结合了全长H19型RNA并在Drosha步骤抑制miR-675的处理。然而，HuR消融并不能完全处理H19型，表明存在其他机制来保护H19型来自Drosha乳沟，可能包括另一个H19型我们鉴定的RNA结合蛋白。Drosha只定位于细胞核，而H19型已知RNA主要定位于细胞质^1,2因此，很可能HuR（也许还有其他RNA结合蛋白）保护H19型当它被定位于核时，由Drosha进行加工，但核出口提供了另一个级别的保护H19型一个Igf2 mRNA结合蛋白家族与H19型²³因此，这些蛋白质是抑制miR-675加工的额外候选蛋白。确定HuR是否影响核出口H19型，我们从野生型和HuR公司^-/-MEF细胞的细胞核丰度没有变化H19型(图3d，e). 此外，胎盘RNA的分离表明，在该器官中观察到的miR-675表达增加并不是由于细胞核增加H19型水平(图3f-i).

miR-675减缓细胞增殖

尽管miR-675的加工过程受到抑制，但它在进化过程中一直保持不变，这一事实表明miRNA具有功能，并且需要精确调节其剂量。为了检测其功能，我们将miR-675-5p和miR-675-3p拟态瞬时转染到MEF、C2C12、TS和ES细胞系中，发现与干扰对照组相比，miR-675存在时，所有细胞系的增殖率至少降低了50%(图4a-d). TUNEL染色显示，这种效应不是由于细胞凋亡增加所致(补充图S3a)相反，我们注意到细胞周期的负调控因子1卢比miR-675上调，表明细胞周期率可能降低(补充图S3b). 有趣的是，miR-675并不是单一物种导致增殖减少，而是miR-675-5p减缓了ES、TS和MEF细胞的增殖速度，而miR-675-3p减缓了MEF和C2C12细胞的增殖。为了证实这些结果，我们使用了A2lox.cre ES细胞系²⁴创造能够由多西环素诱导表达miR-675-5p（A2lox-5p）、miR-675-3p（A2rox-3p）或扰乱对照（A2lox塞满）的细胞。为了避免加工受到抑制，我们将这些miRNAs放在miR-30发夹上下文中，并观察到添加多西环素后miR-675的任一种选择性上调(补充图S4). 细胞增殖测定证实了ES细胞中瞬时miR-675模拟实验的结果，即A2lox-5p细胞系的增殖因多西环素的添加而减慢，而对A2lox-3p或A2lox扰乱的细胞系没有观察到影响(图4e-g).

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图4

miR-675过表达降低了一些培养细胞系的增殖率。（a、b、c、d）用miR-675-5p（橙色）、miR-675-3p（深蓝色）、两种miR-675物种组合（绿色）、miR-1（粉红色）或打乱对照（浅蓝色）的miRNA模拟物转染细胞系，并在转染后的时间点计算细胞数。该程序在ES中执行（a）、TS（b）、MEF（c）和C2C12（d）细胞。（e、f、g）使用A2lox-core系统（参见方法），建立了ES细胞系，在添加强力霉素后，ES细胞选择性表达miR-675-5p（A2lox-5p）（e），miR-675-3p（A2lox-3p）（f）或非目标加扰控制（A2lox-scrambled）（g）在向生长培养基中添加强力霉素（doxycycline，蓝线）或在没有强力霉素的情况下（doxycline，黑线），计算细胞数。n=4。p值通过双向方差分析和事后Tukey检验确定。（h）用指示的miRNA模拟物处理G401细胞，并在转染72小时后计算细胞数量。n=4。p值由Student’st吨-测试。（i）用miR-675-3p抑制剂或打乱对照处理C2C12细胞。miR-675的表达由分化诱导，分化96小时后细胞计数。n=9。p值由Student’st吨-测试。所有误差条表示标准误差*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

H19型首次通过在G401转移性横纹肌样肿瘤细胞系中过度表达而显示出抑癌特性⁵。我们调查了miR-675，而不是H19型它本身可能是通过在这些细胞中过度表达较小的RNA而导致先前报道的这种效应的原因。事实上，我们观察到当用miR-675-5p治疗时，G401细胞的增殖减少，而不是混乱对照(图4h). 最后，我们利用了这两个事实H19型miR-675在分化的C2C12细胞中表达(补充图S5)进行antagomiR介导的功能丧失实验，发现当miR-675-3p被抑制时，这些细胞的增殖增加(图4i). 综上所述，这些结果表明miR-675是H19型RNA，能够抑制细胞增殖。

删除两者H19型miR-675导致胎盘过度生长

考虑到miR-675的生长限制作用，有趣的是胎盘中miRNA的表达与该器官生长的自然停止相伴随²⁵此外，携带13 kb缺失的小鼠包括H19型、miR-675和10 kb的调控序列上游H19型胎盘（145%WT）的过度生长表型比胚胎（123%WT^26-28然而，这种表型的解释因以下事实而变得复杂：H19型)也会导致链接的免疫球蛋白2基因²⁹.检查以下可能性：H19型RNA本身调节胎盘生长，我们研究了一种替代方法H19型小鼠模型(H19型 ^Δ3)其仅携带3kb的缺失H19型转录单位，包括miR-675³⁰。此删除特别消除了H19型RNA不影响免疫球蛋白2在胎盘中(补充图S6a)⁸.值得注意的是，胎盘携带H19型^Δ3E18.5的等位基因比野生型大32%，而突变胚胎本身仅比野生型高8%，这与之前的结果一致³⁰(图5a和补充图S6c). 胎盘中miR-675的表达与HuR公司胎盘生长自然停止H19型和miR-675(图5b)这意味着miR-675是胎盘大小的负调节因子。

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图5

细胞的表型和转录组H19型^Δ3胎盘暗示miR-675是该组织中的负性生长调节剂。（a）测量纯合的胎盘重量H19型^Δ3杂交并与野生型进行比较，结果显示该基因敲除的过度生长表型在胎盘中比胚胎中更为严重。每个数据点测量的胎盘数量显示在每个条形图的上方。误差条表明s.e.m.p值由Student’st吨-测试**p<0.01，***p<0.001。（b）基于实际数据的表示，显示mir-675（蓝色）和HuR的相关性¹⁹（橙色）胎盘中的表达与该器官的发育重量（黑色）。的重量H19型^Δ3胎盘也有显示（开槽线）。在E13.5，随着miR-675的诱导，HuR表达迅速下降。在大约E15.5时，野生型胎盘停止增加质量，但在H19型^Δ3胎盘²⁵.（c）来自一天E18.5野生型和H19型^Δ3胎盘。基因上调（黑色）和下调（白色）的类别H19型^Δ3显示胎盘。

这个H19型^Δ3胎盘转录组显示miR-675的靶点

与交界区相比，miR-675在胎盘迷路区表达最高(补充图S7a-d); 确定miR-675对H19型^Δ3我们对E18.5迷路区的RNA进行了RNA测序（RNA-Seq）H19型^Δ3胎盘。我们发现，与对照迷宫相比，突变体中有285个基因上调，59个基因下调2倍以上(补充图S7e). 基因本体类别丰富了H19型^Δ3转录组与胎盘的生长和形态发生一致(图5c).H19型此前曾报道调节胎儿肌肉而非胎盘的印记基因网络⁸事实上，我们在H19型^Δ3胎盘。我们发现miR-675的计算预测靶点富集在上调的基因中H19型^Δ3胎盘（p=0.0254）。我们将miR-675-5p和miR-675-3p模拟物共同转染到ES、C2C12和MEF细胞中，并通过qRT-PCR监测对35个预测靶点的影响(图6a–c)其中许多（45%）被miR-675下调。然而，在一个细胞系中似乎是靶基因的基因不一定在另一个细胞中是靶基因。这表明miR-675减缓细胞增殖的靶网络性质复杂，在不同的细胞类型中可能不同。

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图6

识别miR-675靶点。（a、b、c）在C2C12中共同转染miR-675模拟物或干扰对照后，通过qRT-PCR检测预测的miR-675靶点的表达（a），西班牙（b）和MEF（c）细胞。n=3。注意，仅显示了受miR-675转染影响的靶点。（d）miR-675-3p与两个潜在位点结合的示意图免疫球蛋白1r3英尺UTR。碱基突变形成突变体免疫球蛋白1r指示3′UTR。（e）miR-675-3p转染对α雷尼利亚荧光素酶报告子融合到野生型或突变型免疫球蛋白1r3英尺UTR。（f） 免疫球蛋白1r通过qRT-PCR测定野生型和H19型^Δ3胎盘位于E11.5或E18.5。阴影三角形表示胎盘中内源性miR-675的表达。n=4。所有误差条表明s.e.m.p值由Student’st吨-测试。*p＜0.05，***p＜0.001。

动物研究

用于表达研究的小鼠为C57/BL6菌株。这个H19型^Δ3转基因品系先前已被描述³⁰所有实验均根据英国内政部（Home Office，UK）许可证和1986年《动物（科学程序）法案》进行。为了定义发育阶段，受孕日被视为怀孕的第0.5天。

使用Qiazol方法（Qiagen）从动物组织中分离RNA。

A2lox-miR-675细胞系的建立

将含有表达所需的microRNA、miR-30侧翼序列和与限制性位点片段XhoI和EcoRI匹配的悬垂的发夹退火为其相应的互补低聚物(补充表S1)并使用限制性位点悬挑克隆到PSM2载体（Open Biosystems）中。使用含有人工NotI和HindIII限制性位点的引物（ATCAAGCTTCAGGTATAATTGTTGAATGAGGC和AGCGGCGTTCCAATTGAAAAAGTGA）对构建物进行PCR扩增，并克隆到p2lox载体中，然后转染到A2lox.core ES细胞系²⁴转染Cre前一天通过添加强力霉素（0.5μg/ml）诱导产生Cre。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）用2μg p2lox质粒转染细胞，并选择与遗传素（300μg/ml，Melford）稳定整合10天。采集并扩大单个菌落。通过向ES培养基中添加强力霉素（2μg/ml）实现发夹结构的表达。

RNAi敲除

通过Stealth™RNAi寡核苷酸（Invitrogen）在所有细胞类型中实现了RNAi介导的mRNAs敲除HuR公司（目录号mss205313），塞尔维亚人1（目录号mss288826），向上1（目录号mss208598），Zcchc11型（目录号ms279478），第二部分（目录号mss225938），Luc7l公司（目录号mss250251）或非靶向对照（目录号12935-300），最终浓度为50 pmol/ml。将RNAi寡核苷酸转染到使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）获得的细胞系中。48小时后提取RNA。

细胞增殖分析

使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）以24 nM的最终浓度将miR-675-5p、miR-675-3p、has-miR-1或阴性对照#1（Ambion）的Pre-miR™miRNA前体分子转染到所有细胞系中。使用胰蛋白酶（0.05%）采集细胞，然后使用尼康TMS显微镜和血细胞仪（助手）进行计数。

在添加分化培养基（如上所述）诱导分化之前，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将保存在生长培养基（上文所述）中的C2C12细胞转染抗miR-675-3p的antagomiR分子或干扰对照（Invit罗gen），使其最终浓度达到30 nM，转染6小时。细胞在分化培养基中保存2天，然后进行第二轮antagomiR转染。在用胰蛋白酶（0.05%）收获细胞之前，将细胞再保存3天，并使用尼康TMS显微镜和血细胞仪（助手）进行计数。

定量聚合酶链反应

使用来自补充表S2.

使用TaqMan®MicroRNA分析（Applied Biosystems）进行MicroRNA qRT-PCR，并根据制造商指南将其归一化为U6 RNA。对于miRNA水平的绝对定量，将ct值与miRXplore™通用参考（Miltenyi Biotec）的连续稀释和Taqman®MicroRNA扩增产生的标准曲线的ct值进行比较。

用于绝对量化H19型级别，部分H19型使用H19型RT引物（参见补充表格)并克隆到pGEM®T-easy载体（Promega）中。标准曲线由qRT-PCR使用该矢量的稀释系列创建，该稀释系列用于测量绝对值H19型组织样本中的水平。

Northern印迹

为了检测前miR-675探针，PCR扩增自H19型包含质粒DNA，使用包含T7启动子的正向（TGCGGCCCAGGACTGGT）和反向引物（GGATCCTAACGAGGAGCACGCAGGACTGA）。使用[α-³²P] 非屏蔽双绞线。总RNA在15%TBE-尿素变性凝胶（Invitrogen）上分离。将RNA转移到GeneScreen Plus®杂交转移膜（Perkin Elmer）上，并与标记的探针或标记的U6 RNA寡聚物（TTGCGTGTCATCCTTGTGCCAGG）孵育约16小时。将膜暴露于X射线胶片（富士胶片）。

为了检测成熟miR-675，在15%TBE-尿素变性凝胶（Invitrogen）上分离总RNA。将RNA转移至GeneScreen Plus®杂交转移膜（Perkin Elmer）并进行紫外线交联。miR-675-3p（Exiqon）或U6 RNA特异性探针用ATP标记[γ-³²P] 在接触X射线胶片（富士胶片）之前，用薄膜培养约16小时。

mRNA文库制备（RNAseq）

RNAseq文库是使用已经描述过的内部协议创建、测序和绘制的⁴⁴。借助SeqMonk映射序列分析工具分析映射序列读取(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/seqmonk/). 这些数据可从ArrayExpress数据库中获得(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)注册号为E-MTAB-895。

RNA亲和力测定

使用合适的引物（miR-675茎：AATGGAAAAGGGCGAGGTG和CCCAGCTACTCGCTCTACCT，5′H19型：AGACCTGGCAGTGAAGGTA和GCCACTGTCTCAAGGATCC，以及Kcnq1ot1:TGGGTGCCTAATACTGG和CTGCCCCTTCTATTGCAG），分别产生343、363和411 bp的扩增子。请注意，miR-675干片段包括与miR-675stem loop相邻的假定HuR结合位点。PCR产物被克隆到pGEM®T-easy载体（Promega）中，并用ScaI（新英格兰生物实验室）消化，以确定之前的3′端在体外转录。然后使用前面描述的方法分离RNA结合蛋白⁴⁵蛋白质通过质谱鉴定。简而言之，将考马斯染色的凝胶层切除、去污、还原、氨甲酰亚胺甲基化并用10 ng/ml改性胰蛋白酶（Promega）在30°C的25mM碳酸氢铵中消化过夜。通过反相液相色谱法（色谱柱：0.05×100 mm，Vydac C18，5 mm粒径）分离得到的肽混合物，乙腈梯度（30分钟内5–40%）含有0.1%甲酸，流速为150 nL/min。将色谱柱连接到纳米喷雾离子源（Protana Engineering）安装在四极杆TOF质谱仪（Qstar Pulsar i；Applied Biosystems/MDS Sciex）上，以信息相关采集模式运行。

rna免疫沉淀

细胞裂解物由培养的MEF细胞或机械匀浆的整个胎盘在裂解缓冲液（100 mM KCl，5 mM MgCl）中培养产生₂，10 mM Hepes，pH 7，0.5%NP-40，1x完整迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏））。使用4μg抗HuR（3A2，Santa Cruz）或非特异性小鼠IgG（Santa Cru）抗体和先前描述的方法进行RNA免疫沉淀⁴⁶.

荧光素酶检测

使用含有人工XhoI和NotI限制性位点的引物对Igf1r内的miR-675靶位点进行PCR扩增，并克隆到荧光素酶报告基因下游的Psicheck2载体（Promega）中。用含有所需点突变的引物PCR扩增Psicheck2-Igf1r载体，然后通过DpnI消化去除未突变质粒，从而突变miRNA结合位点。将质粒（200μg）与miR-675模拟物（24 nM，Ambion）共同转染到ES细胞中，24小时后使用双球荧光素酶分析（Promega）测定荧光素瘤酶活性。

TUNEL染色

如上所述，用Pre-miR™miRNA前体分子（Ambion）处理细胞，并在收获细胞并将其胞吐到聚赖氨酸涂层载玻片上之前保持48小时。使用DeadEnd™荧光TUNEL系统（Promega）检测凋亡细胞。阳性对照组根据TUNEL染色试剂盒提供的说明，用DNaseI（Roche）处理。细胞核用Vectashield®和DAPI（Vector Laboratories）染色，并在奥林巴斯BX41荧光显微镜上观察。

核质RNA分馏

使用PARIS™试剂盒（Ambion）从MEF细胞中提取细胞核和细胞质RNA。通过在裂解缓冲液（0.32M蔗糖，5mM CaCl）中对胎盘进行机械均质处理，获得分离的胎盘RNA₂，5mM EDTA，3mM MgAc，10mM Tris-HCl pH 8和40U/ml RNAsin（Promega））和过滤。然后将胎盘裂解液在700 g下离心10 min，上清液保留作为细胞质部分用于RNA提取。将细胞核重新悬浮在离心缓冲液中（2 M蔗糖、3mM MgAc和10 mM Tris-HCl pH值8），并覆盖在进一步离心缓冲液的缓冲垫上，然后在26000 g下离心1小时并提取RNA。

我们感谢Dimitris L.Kontoyiannis（亚历山大·弗莱明生物医学科学研究中心）提供HuR公司^-/-MEF细胞。我们还感谢Helene Jammes和Anne Gabory协助收集H19型^Δ3表型数据，Judith Webster用于制备用于质谱分析的样品，Wendy Dean用于组织收集。作者还要感谢克里斯蒂娜·塔巴达（Kristina Tabbada）、安妮·塞贡斯·皮尚（Anne Segonds-Pichon）和西蒙·安德鲁斯（Simon Andrews）分别提供的RNA-seq、统计和生物信息学援助。我们感谢Michelina Iacovino创造了A2lox-core ES细胞系。我们还要感谢蒂姆·霍尔（Tim Hore）、克里斯蒂尔·克鲁格（Christel Krueger）和乔纳森·豪斯利（Jonathan Houseley）对手稿的批判性阅读，以及沃尔夫·雷克（Wolf Reik）、米利亚姆·亨伯格（Myriam Hemberger）、埃琳娜·维戈里托（Elena Vigorito）和乔森·豪。这项工作得到了BBSRC、Wellcome信托、MRC、EU NoE EpiGeneSys、EU BLUEPRINT、NIH/NHLBI（U01HL100407）和剑桥联邦信托的支持。