miR-34–一种microRNA替代疗法即将进入临床

摘要

简介

近年来，基因组和蛋白质组方法产生的结果改变了我们对癌症的看法。癌症是一种以前被认为仅表现为几个基因改变的疾病，事实上，它的基因非常复杂。肿瘤细胞通常含有一系列突变基因，每个肿瘤块可以包含数百个具有不同癌症基因型的癌细胞(Jones等人，2008年;Parsons等人，2008年;Gerlinger等人，2012年). 因此，癌症治疗方法正在转变，以适应这些新发现，并设计更有效和更安全的治疗方法。传统疗法，仍然是主流的治疗方式，由于化疗耐药，经常被认为毒性太大或不够。这些治疗之后或被截获已知癌基因的靶向治疗所取代。以越来越快的速度，这些靶向治疗不仅仅是基于组织类型，而是基于遗传癌症特征。因此，那些最初针对特定肿瘤类型开发的肿瘤也可以在另一种具有相同潜在突变但组织学无关的癌症类型中发挥作用(韦尔奇和摩尔，2007年). 然而，许多靶向治疗单独是不够有效的，必须联合使用。这证实了癌症是各种遗传和表观遗传变化的产物，需要干扰多种致癌途径才能成功干预。

miRNAs是一类非编码RNA，其作用机制与我们目前认为癌症是一种通路疾病的观点一致，因此其在治疗上的应用受到了广泛关注。miRNAs通过调节数十到数百个基因的表达并同时控制多个细胞通路，起到基因组的主调节器的作用。某些miRNA在癌细胞中经常失调，因此下游的途径也会失调。因此，细胞原癌基因可以逃避miRNA介导的抑制，从而获得独立于原癌基因本身突变的功能增益(Johnson等人，2005年). 少量的miRNAs在广泛的癌症类型中表现出功能丧失，表明它们在调节肿瘤抑制中起着核心作用。其中包括让-7、miR-34和miR-200，它们在植物与人类之间进化上都是保守的，可能控制着细胞增殖和分化过程中的基本程序。通过miRNA替换纠正这些缺陷会激活抗增殖和促凋亡途径，并导致癌细胞死亡(Bader等人，2010年;Wiggins等人，2010年). 一个明显符合miRNA替换条件的患者是肿瘤中miRNA水平低于正常组织的患者。然而，越来越多的证据表明，miRNA表达水平正常的癌细胞也容易受到miRNA治疗(Wiggins等人，2010年). 对这一观察结果的一个合理解释是阈值现象——很可能是由其他基因突变诱导的致癌途径受到内源性miRNA的控制，尽管没有充分抵消。增加miRNA的表达可能会增强其拮抗功能，使其超过肿瘤抑制的阈值。

主肿瘤抑制物miR-34

药物开发商面临的挑战之一是选择正确的目标。这也适用于miRNA。癌症组织中有许多miRNAs被解除调控；然而，其中只有少数能够在癌细胞中诱导强大的表型，甚至更少的能够有效地用于治疗。因此，与其他癌症基因类似，miRNAs可能发挥不同的作用，其中只有一个子集起到癌症进展的“驱动因素”的作用。此外，其他一些miRNAs与肿瘤抑制和致癌功能相关，或在肿瘤学以外的疾病中发挥作用，这使得它们作为癌症治疗药物的实际应用难以预测(Valastyan等人，2009年;刘等人，2010).

肿瘤抑制作用明确的miRNA是miR-34。人类miR-34由三个家族成员组成：miR-34a、miR-34b和miR-34c。成熟的miR-34a序列由22个核苷酸组成，与miR-34b和miR-34c分别具有86%的同源性（19/22 nt）和82%的同源度（18/22 nt）。miR-34b和miR-34c的长度均为23个核苷酸，同源性为83%（19/23 nt）。所有三个家族成员之间的相同残基跨越整个miRNA序列，并包括“种子区”中的残基，该区域由8个核苷酸组成，位于邻近5′末端的位置2-9，用于指导目标mRNA的选择。由于这种同源性，miR-34家族成员控制着一组类似的靶基因，并且似乎具有功能冗余(He等人，2007年). 在正常人体组织中，miR-34a是主要的家族成员(Hsu等人，2008年). 相反，除肺、卵巢、睾丸和气管外，大多数组织中内源性miR-34b/c水平较低(Hsu等人，2008年). miR-34a基因位于染色体1p36.22上，miR-34b和miR-34c由编码在染色体11q23.1上的多顺反子转录物表达。这两个基因位点都位于与癌症中经常改变的基因组脆弱位点相关的区域(Calin等人，2004年). miR-34启动子的超甲基化是导致内源性miR-34家族成员水平降低的另一种机制(Lodygin等人，2008年;Lujambio等人，2008年;Vogt等人，2011年). 因此，遗传和表观遗传机制导致miR-34a表达缺失，这种缺失已在广泛的实体和血液恶性肿瘤中发现，包括肺癌(Bommer等人，2007年;Lodygin等人，2008年;Gallardo等人，2009年;Wiggins等人，2010年)，前列腺(Fujita等人，2008年;Lodygin等人，2008年)，胸部(Lodygin等人，2008年;Vogt等人，2011年)，胰腺(Chang等人，2007年;Lodygin等人，2008年;Vogt等人，2011年)，冒号(Tazawa等人，2007年;Lodygin等人，2008年;Vogt等人，2011年)，肾脏(Lodygin等人，2008年;Vogt等人，2011年)，肝脏(Li等人，2009年;Tryndyak等人，2009年)，膀胱(Lodygin等人，2008年)，皮肤(Lodygin等人，2008年)，食道(Chen等人，2011年)，大脑(Welch等人，2007年;科尔等人，2008年;Wei等人，2008年;Feinberg-Gorenshtein等人，2009年)，宫颈(Wang等人，2009年;Li等人，2010年)，卵巢(Kuo等人，2009年;科尼等人，2010年;Vogt等人，2011年)，尿路上皮(Vogt等人，2011年)和淋巴系统(Mraz等人，2009年;Chim等人，2010年;Craig等人，2011年). 与这种广泛的异常表达谱一致，重新引入miR-34a的模拟物可以抑制多种癌细胞类型，并表明miR-34a在癌细胞之间共同的致瘤过程的核心发挥作用。miR-34a的这种抗癌活性已在肺癌细胞类型中得到证实(Bommer等人，2007年;He等人，2007年;Raver-Shapira等人，2007年;Tarasov等人，2007年;Sun等人，2008年;Wiggins等人，2010年)，肝脏(Li等人，2009年)，胰腺(Lodygin等人，2008年;Ji等人，2009年)，冒号(Chang等人，2007年;He等人，2007年;Tazawa等人，2007年;Lize等人，2009年)，大脑(Welch等人，2007年;科尔等人，2008年;Wei等人，2008年;Luan等人，2010年;Li等人，2011年)，皮肤(Yan等人，2009年;Greenberg等人，2011年)，前列腺(Lodygin等人，2008年;Liu等人，2011年)，骨骼(Tarasov等人，2007年;Yan等人，2012年)，卵巢(科尼等人，2010年)还有淋巴瘤和白血病(Asslaber等人，2010年;Craig等人，2011年).

miR-34抑瘤的分子机制

miR-34a是如何工作的？对miR-34a诱导的表型的研究开始勾勒出一幅图，在这幅图中，miR-34a-发挥着肿瘤抑制的主导作用(图​图11). miR-34a可以通过调节各种细胞途径中的基因来对抗许多不同的致癌过程(表​表11). 这些基因中的大多数编码众所周知的原癌蛋白，这些原癌蛋白本身就是有吸引力的药物靶点。miR-34a表型可能只受少数选择性靶点的抑制。事实上，一些miR-34a调节的转录物在miR-34a-依赖性肿瘤抑制过程中直接受到牵连(Craig等人，2011年). 然而，没有人能够完全重述miR-34a表型，这表明miR-34b功能依赖于多个靶点，甚至可能是大多数靶点。miR-34a对任何靶向基因产物的诱导变化都是中等的，对于大多数蛋白质来说，这种变化小于1.23倍(Kaller等人，2011年). 然而，广泛靶基因的集体抑制可能会对细胞表型产生重大影响(Selbach等人，2008年). 有趣的是，miR-34a靶点在蛋白水平下调也会影响mRNA水平，这表明miR-34a同时影响蛋白质合成和mRNA丰度(Kaller等人，2011年).

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图1

miR-34对抗癌症进程.

miR-34a的主要功能是控制细胞增殖、细胞周期和衰老。在癌细胞中，miR-34a的异位表达降低了细胞倍增率(Lodygin等人，2008年;Wiggins等人，2010年)导致G1/G2被捕(He等人，2007年;Lodygin等人，2008年)并将细胞转化为大而扁平的小体，对衰老相关的β-半乳糖苷酶呈阳性染色(He等人，2007年;Tazawa等人，2007年;Lodygin等人，2008年). miR-34a在各种形式的衰老过程中上调，包括静止、复制性衰老、H₂O（运行）₂-诱导的早衰和癌基因诱导的衰老(Christoffersen等人，2009年;Maes等人，2009年). 与这些表型一致的是miR-34a过度表达细胞中生成的转录组和蛋白质组图谱。这些结果表明，差异表达的基因主要在细胞周期的调节中发挥作用(Bommer等人，2007年;Chang等人，2007年;He等人，2007年). 下调的基因富集了那些含有假定的miR-34a结合位点的基因，这表明几种相互作用是直接的。经实验验证与miR-34a相互作用的转录物包括细胞周期蛋白D1和E2，以及细胞周期蛋白依赖性激酶4和6。此外，miR-34a直接抑制一系列驱动细胞增殖的信号分子，并在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）途径中发挥作用。这些是有丝分裂原活化蛋白激酶激酶1（MEK1，MAP2K1）、R-Ras（RRAS）、血小板衍生生长因子受体（PDGFRA）和肝细胞生长因子受体。

miR-34a在细胞周期控制中的功能由调节凋亡的功能补充。所有miR-34家族成员均由p53转录诱导，是执行p53分子程序的重要效应分子(Bommer等人，2007年;Chang等人，2007年;He等人，2007年;Raver-Shapira等人，2007年;Tarasov等人，2007年). miR-34a抑制BCL2和survivin；然而，miR-34a的促凋亡功能可能与其他机制有关(Bommer等人，2007年;沈等，2012). 事实上，miR-34a可以通过靶向SIRT1（沉默信息调节器1）（一种NAD依赖的去乙酰化酶，使TP53（肿瘤蛋白53）失活）和YY1（阴阳1）（与p53结合并促进p53泛素化和降解的蛋白），在正反馈中刺激内源性p53活性(Sui等人，2004年;Yamakuchi等人，2008年;Chen等人，2010年). 因此，miR-34a似乎利用上游信号维持其自身的表达水平并激活p53专门调控的肿瘤抑制通路。然而，在miR-34a诱导的肿瘤抑制中对p53的需求仍然未知。新的证据表明内源性p53不是miR-34a肿瘤抑制的先决条件——miR-34a转录可以独立于p53发生，而miR-34b能够抑制缺乏内源性p35的癌细胞(Christoffersen等人，2009年;Wiggins等人，2010年).

miR-34a的一个重要方面是其抑制肿瘤干细胞的能力。癌症干细胞，也称为肿瘤起始细胞，是指一小部分具有自我更新能力并产生相同子细胞的癌症细胞(Reya等人，2001年). 因此，肿瘤干细胞充当肿瘤的“种子”，增强了在动物体内形成肿瘤、转移和抵抗传统癌症治疗的倾向。因此，化疗耐药和复发可能是由于这些肿瘤起始细胞的存在，为了患者的成功转归，这些细胞应该被清除。例如，与大部分前列腺肿瘤细胞相比，miR-34a在表达CD44或CD133表位的前列腺癌干细胞中以及在侧群中富集的干细胞中的水平较低(Liu等人，2011年). miR-34a的过表达，无论是通过瞬时转染还是通过逆转录病毒进行稳定的基因组整合，都会干扰软琼脂中球体的形成和致瘤性体内(Liu等人，2011年). 这两种能力都与前列腺癌干细胞的存在有关。miR-34a还抑制胰腺癌和髓母细胞瘤的肿瘤起始细胞的增殖特性(Ji等人，2009年;de Antonellis等人，2011年). 因此，内源性miR-34a的相对量随着细胞从正常细胞转变为癌细胞和癌干细胞样细胞而成比例下降。这种进展似乎在功能上与肿瘤生存能力有关，并被miR-34替代物所消除。

miR-34a丰度的调节对多能性有直接影响的观点得到了观察结果的支持，这些观察结果表明miR-34a参与了体细胞重编程(Choi等人，2011年). miR-34a通过直接抑制包括NANOG、SOX2和MYCN在内的多能性基因来防止细胞重编程(Choi等人，2011年). 同样，抑制前列腺癌干细胞的能力与miR-34a依赖性CD44抑制有关，这可能进一步明确其对癌症干细胞的特异性作用(Liu等人，2011年). 因此，这些多能性基因的抑制为miR-34a调控干细胞和分化的功能提供了分子解释。

miR-34a的其他功能是抑制转移和化疗耐药。两者都可能是miR-34a诱导癌干细胞消除的结果，但也可能是非肿瘤细胞中miR-34a调节的独立结果。Wnt信号通路密切参与从上皮状态到间充质状态（EMT）的转变和转移。它在多个层面上受miR-34依赖性调控。miR-34a和miR-34b/c直接抑制WNT1和WNT3以及LRP6的翻译，LRP6是与Wnt配体结合的Frizzled的共同受体(Kim等人，2011年). miR-34家族成员还抑制作为Wnt下游主要转录介质的LEF1和β-catenin（CTNNB1）。因此，miR-34干扰Wnt信号转导的表型，如Wnt诱导的轴复制阻断爪蟾结直肠癌细胞的发育、组织无创活性的降低和TCF/LEF靶基因的抑制(Kim等人，2011年). 有趣的是，TCF/LEF转录诱导的几个基因是CCND1、MYC和CD44，它们也被miR-34a独立抑制。miRNA还下调其他与Wnt信号通路（MET、AXL、MTA2；He等人，2007年;Kaller等人，2011年). 这证实了miRNAs的调控机制涉及给定通路中的多个成分以及其他几个成分的概念。

影响多种细胞途径的能力也可能表明miR-34a可以与传统的细胞毒疗法协同作用。这两类药物的作用模式可能有足够的区别，以便联合用药提供额外的益处。这已经在前列腺、胰腺、结肠、膀胱、胃和大脑的癌细胞模型中进行了实验测试。如所示表​表22miR-34a减轻了对紫杉醇和铂类药物的耐药性以及对其他几种药物的耐药性。目前尚不清楚这种组合对正常组织的影响。miR-34a发挥其化学增敏作用的机制尚不明确，需要进一步研究；然而，从这些细胞模型获得的初步数据可能表明，未来miR-34a治疗药物的用途可以大大扩展。

miR-34在肿瘤动物模型中的药理学研究

细胞模型中确定的miR-34a的生物活性表明它也可以抑制肿瘤生长体内虽然对动物体内miR-34a活性的彻底评估主要取决于体内输送系统，有几个例子说明了它的治疗潜力(表​表3三). 实现miRNA表达的常用方法体内基于功能类似于传统基因治疗的载体系统(Esquela-Kerscher等人，2008年;Kumar等人，2008年;Kota等人，2009年;邱等，2011). 这些药物可以在移植前用于异种移植物，也可以通过静脉注射作为纳米颗粒全身应用。另一种方法是纳米颗粒的形式，其中含有约19–23-nt双链miRNA模拟物，可以通过尾静脉注射给药(Chen等人，2010年;Wiggins等人，2010年). 在此，我们将进一步详细讨论系统交付模式的示例。

全身给药的一个例子是静脉给药miR-34a在用GC4单链抗体片段（scFv；Chen等人，2010年). 抗体部分有助于肿瘤靶向人类胶质瘤球形细胞以及小鼠B16黑色素瘤细胞。为了测试其疗效，对B16F10黑色素瘤异种移植诱导的肺转移小鼠连续两天（0.3 mg/kg）给予该制剂。第一次治疗后11天，通过转移病灶的发光成像评估，肿瘤负担减轻了约50%。在另一项实验中，miR-34a活性通过miR-34a-诱导的细胞凋亡增加和肺转移中survivin蛋白水平的下调得到证实。

Pramanik等人（2011年）研究miR-34a在皮下和原位胰腺MiaPaca-2异种移植中的治疗潜力。使用含有miR-34a编码载体的100nm基于脂质的纳米颗粒系统递送miR-34a。患有确诊肿瘤的动物每周治疗三次，连续治疗三周，肿瘤生长通过卡尺测量或超声波测定。数据显示，用miR-34a治疗的小鼠肿瘤明显较小，并显示坏死和凋亡迹象。原位肿瘤也显示Ki67水平降低。此外，miR-34a治疗的动物皮下肿瘤组织中SIRT1蛋白以及CD44和ALDH mRNA水平降低。

使用中性脂肪乳剂（NLE）进行了一系列实验，该中性脂肪乳化剂在纳米范围内形成颗粒，净电荷接近于零。在皮下H460和A549非小细胞肺癌异种移植物中产生了miR-34a/NLE制剂治疗效用的概念证明(Wiggins等人，2010年). 携带可触及H460肿瘤的小鼠在9天内每3天通过尾静脉注射接受3 mg/kg的剂量。A549催产动物每隔一天服用1 mg/kg，共15天。与对照组相比，miR-34a治疗组的肿瘤生长分别受到78%和62%的抑制。两种异种移植物均表现出凋亡增加和增殖减少。抗肿瘤作用伴随着miR-34a模拟物在肿瘤组织中的积累以及MET、CDK4和BCL2蛋白水平的下调(Wiggins等人，2010年).

基于组成活性KRAS突变G12D的肺癌基因工程小鼠模型也获得了类似的结果(Trang等人，2011年). 在激活KRAS-G12D突变体和原位肺肿瘤发生10周后，每隔一天系统地引入与NLE偶联的miR-34a模拟物，共注射8次，每次注射浓度为1 mg/kg。在牺牲时，小鼠服用含有爬阴性对照寡核苷酸显示肺部广泛弥漫性增生和腺瘤。相比之下，在miR-34a治疗的动物中观察到的病变很少且明显较小。其余肿瘤面积仅为对照组肿瘤总面积的40%。该结果与肺组织中miR-34a水平显著升高、Ki67表达降低和TUNEL阳性细胞增加相关。

在前列腺癌模型中，在NLE中复合miR-34a的疗效通过Liu等人（2011）将肿瘤细胞外科植入雄性NOD/SCID小鼠的背侧前列腺，生成原位PC-3肿瘤，并允许其生长3周。然后，每隔一天对小鼠进行一次尾静脉注射，每次给药剂量为1 mg/kg。第五次给药后，处死小鼠以测定肿瘤重量。肿瘤的重量是对照动物的一半(Liu等人，2011年). 使用类似的实验装置来评估原位LAPC9肿瘤异种移植物中miR-34a的活性。在这些动物中，对原发肿瘤的影响仅为中等（20%肿瘤抑制）。然而，miR-34a研究组的动物从显著提高的生存率中受益匪浅，这很可能是因为LAPC9向肺和其他器官的转移显著减少(Liu等人，2011年).

在从低度恶性肿瘤向高度恶性肿瘤过渡期间，弥漫性大B细胞淋巴瘤经常表现出MYC功能增强和miR-34a同时丢失。将miR-34a模拟物再导入培养的淋巴瘤细胞，证明其抑制淋巴瘤细胞的效果优于针对MYC或FOXP1的siRNAs，后者是这类癌症的另一个关键癌基因。这表明miR-34a替代物是该模型的首选治疗方式(Craig等人，2011年). 为了在实验上探索这一点，每隔一天给皮下移植有U2932淋巴瘤的小鼠静脉注射NLE/miR-34a制剂。每个剂量相当于1 mg/kg，在13天内重复8次。卡尺测量表明，miR-34a能够减少76%的肿瘤生长，这也反映在肿瘤重量上。因此，数据表明miR-34a的治疗作用不仅限于实体瘤类型，还可以应用于血液系统恶性肿瘤(Craig等人，2012年).

以NLE为特征的研究是使用双链miR-34a模拟物进行的，其中活性链与内源性miRNA相同。因此，不太可能出现非特异性的靶外效应，因为该模拟物预计会抑制同样受天然对应物调控的同一组基因。然而，miRNAs的多效性引起了人们对miR-34a在正常组织中诱导毒性的担忧。诱导miRNA调节的途径来驱使癌细胞的消除也可能对正常细胞有害。然而，与这一观点不一致的是，miR-34a的瞬时转染在一系列非癌细胞中没有明显效果(Wiggins等人，2010年). 同样，评估miR-34a制剂治疗效果的动物研究未能检测到与miR-34a相关的不良副作用。这些观察基于小鼠的总体行为、体重、器官形态的病理检查以及表明肝、肾和肌肉损伤的血液化学(Chen等人，2010年;Wiggins等人，2010年;Pramanik等人，2011年;Craig等人，2012年). 此外，根据免疫活性小鼠的血清细胞因子水平评估，配方miR-34a模拟物并未诱导非特异性免疫反应(Chen等人，2010年;Wiggins等人，2010年). 从大多数组织中检索到的内源性miR-34a的平均水平约为50000拷贝/ng RNA(Hsu等人，2008年). 假设总RNA含量为10-20 pg/细胞，这相当于大约500-1000拷贝/细胞。因此，正常组织中内源性miR-34a的丰度表明，受外源性miR-34影响的通路已经被内源性miRNA激活或失活。治疗性增加miRNA水平可能不会充分改变靶基因的水平，从而影响这些通路的方向和正常细胞活动。然而，支持这一假设的实验证据缺失。

miR-34疗法的发展进展

以miR-34a为基础的癌症治疗从长椅过渡到床边取决于临床相关输送系统的可用性。许多用于在动物身上建立概念验证的技术都是有希望的候选技术，但还不够先进，无法证明支持临床试验所需的健壮性、可扩展制造和质量控制。

为了加快临床进程，Mirna Therapeutics筛选了多个现有的递送系统，这些系统正在临床前开发中，或者已经与其他寡核苷酸疗法一起进入临床测试。该评估包括以下方面的评估：（i）在适当的小鼠癌症模型中的疗效，（ii）miRNA的生物分布，以及（iii）初步安全性。将疗效、生物分布和安全性最佳结合的交付技术是NOV340技术（SMARTICLES^®华盛顿州波瑟尔市Marina Biotech；Mirna Therapeutics Inc.，2011年)，一种可电离的脂质体，形成直径约120nm的颗粒。脂质体含有两性脂质，在低pH下为阳离子，在中性和高pH下为中性或阴离子。脂质和miRNA模拟物在酸性条件下混合，以促进有效的miRNA封装和脂质体形成。在pH值为7–7.5的生物流体中，纳米颗粒具有轻微的阴离子特性，可防止与内皮细胞膜和其他组织中的负电荷发生不必要的相互作用。由于肿瘤区域的pH值往往较低，NOV340颗粒可能在这些区域变成阳离子，并粘附到肿瘤细胞上。

在肝细胞癌原位模型中测试了NOV340/miR-34a配方的药理学。之所以选择肝癌模型，是因为（i）大多数肝癌都存在可被miR-34a（癌症体细胞突变目录）拮抗的途径突变，（ii）miR-34a抑制培养的人肝癌细胞(Li等人，2009年)以及（iii）将NOV340脂质体高效输送至肝脏。数据表明，对携带现有肿瘤的小鼠进行治疗可导致肿瘤显著退化并延长生存期(Daige等人，2011年;Bader等人，2012年). 肝脏组织学检查显示，一些小鼠似乎没有肿瘤。这与给药NOV340颗粒的小鼠形成鲜明对比，NOV340颗粒负载爬控件。根据正常器官形态、血液化学和血清细胞因子水平，NOV340/miR-34a治疗的动物缺乏显著的药物相关副作用。

总之，数据证明了临床相关的NOV340/miR-34制剂在肝细胞癌模型中的治疗效用。Mirna Therapeutics已经启动了一个临床前开发项目，以支持cGMP材料的制造和IND验证研究的开展。该公司预计将于2013年启动miR-34的临床试验，这可能是首批进入临床的miRNA模拟物之一。

结束语

miRNA的替代提供了一个新的治疗概念。它的目的是恢复药物开发人员基本上无法实现的功能丧失。此外，它建立在与人类疾病相关的多个细胞路径的调控之上，这似乎是成功癌症治疗的必要条件。在动物身上产生的数据表明，miRNA模拟物的药理传递有效抑制肿瘤生长，正常组织耐受性良好。这为miR-34的临床治疗扫清了道路。现在的重点是高等物种和人类的安全。

利益冲突声明

作者是Mirna Therapeutics的员工，声明与本文讨论的主题或材料相关的潜在利益冲突。

致谢

参考文献