美国国家科学院院刊。2012年6月5日；109(23): 8983–8988.
脯氨酸和谷氨酰胺代谢的重新编程有助于癌基因转录因子c-MYC调节的增殖和代谢反应
,a、，1 ,b条 ,一 ,c、，d日 ,e（电子） ,f、，d中，1和a、，1
刘伟（音译）
一国家癌症研究所基础研究实验室代谢和癌症易感性科，马里兰州弗雷德里克，21702；
安妮·勒
b条约翰霍普金斯大学医学院病理学系，马里兰州巴尔的摩，21205；
查德·汉考克
一国家癌症研究所基础研究实验室代谢和癌症易感性科，马里兰州弗雷德里克，21702；
安德鲁·莱恩
以下部门c（c）医学和如果化学，监管环境分析代谢组学和
d日肯塔基州路易斯维尔大学詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心，40202；和
池V.Dang
e（电子）宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心，艾布拉姆森家族癌症研究所，宾夕法尼亚州费城，19104
特蕾莎·W·M·范
以下部门c（c）医学和如果化学，监管环境分析代谢组学和
d日肯塔基州路易斯维尔大学詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心，40202；和
詹姆斯·M·彭
一国家癌症研究所基础研究实验室代谢和癌症易感性科，马里兰州弗雷德里克，21702；
一国家癌症研究所基础研究实验室代谢和癌症易感性科，马里兰州弗雷德里克，21702；
b条约翰霍普金斯大学医学院病理学系，马里兰州巴尔的摩，21205；
以下部门c（c）医学和如果化学，监管环境分析代谢组学和
d日肯塔基州路易斯维尔大学詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心，40202；和
e（电子）宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所艾布拉姆逊癌症中心，宾夕法尼亚州费城，19104
Matt Vander Heiden编辑，马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院，编辑委员会于2012年4月23日接受（2012年2月24日收到审查）
作者贡献：W.L.、A.L.、C.H.、A.N.L.、C.V.D.、T.W.-M.F.和J.M.P.设计的研究；W.L.、A.L.、C.H.、A.N.L.和T.W.-M.F.进行了研究；W.L.、C.H.、A.N.L.、C.V.D.、T.W.-M.F.和J.M.P.分析数据；W.L.、A.N.L.、T.W.-M.F.和J.M.P.撰写了论文。
- 补充资料
支持信息
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电话：078AF1D5-751D-4337-A37C-07B242993B5D
摘要
除了糖酵解，致癌转录因子c-MYC（MYC）通过上调谷氨酰胺酶（GLS）刺激谷氨酰胺分解代谢，促进癌细胞的生长和增殖。谷氨酰胺通过GLS转化为谷氨酸，作为重要的能源进入三羧酸循环。不太被认可的是，谷氨酸也可以通过Δ转化为脯氨酸1-吡咯烷-5-羧酸盐（P5C），反之亦然。这项研究表明，一些MYC诱导的细胞效应是由于MYC调节脯氨酸代谢所致。脯氨酸氧化酶，也称为脯氨酸脱氢酶（POX/PRODH），是脯氨酸分解代谢的第一种酶，是一种抑制增殖和诱导凋亡的线粒体肿瘤抑制剂。MiR-23b*介导人肾肿瘤中POX/PRODH的下调。MiR-23b*与MiR-23b来自同一转录本；后者抑制GLS的翻译。使用MYC诱导的人类Burkitt淋巴瘤模型P493和PC3人类前列腺癌细胞，我们发现MYC主要通过上调miR-23b*抑制POX/PRODH表达。POX/PRODH敲除部分逆转了无MYC时的生长抑制，表明抑制POX/PODH在MYC介导的细胞效应中的重要性。有趣的是，MYC不仅抑制POX/PRODH，而且显著增加了谷氨酰胺合成脯氨酸的酶，包括P5C合成酶和P5C还原酶1。使用13C、，15N-谷氨酰胺作为示踪剂。MYC提供的谷氨酰胺和脯氨酸之间的代谢联系强调了肿瘤代谢的复杂性。对谷氨酰胺和脯氨酸代谢之间关系的进一步研究应能加深对肿瘤代谢的理解，同时有助于开发新的治疗策略。
关键词：氨基酸、氧化还原信号、活性氧物种、miRNA、代谢性肿瘤抑制剂
生长中的肿瘤改变其代谢特征，以满足细胞生长和增殖增加的生物能量和生物合成需求(1–三). 许多致癌基因和抑癌基因与肿瘤代谢调节有关(4,5). 脯氨酸氧化酶，也称为脯氨酸脱氢酶（POX/PRODH），是一种线粒体内膜酶，参与脯氨酸分解代谢的第一步，已被确定为少数线粒体肿瘤抑制剂之一(6–10). 编码POX/PRODH的基因也称为PRODH公司在筛选研究中最初被鉴定为p53诱导基因(8). 在这里，我们将这种酶称为POX/PRODH，基因称为PRODH公司经过深入研究，人们认识到脯氨酸代谢在人类肿瘤中的重要作用。我们实验室的早期工作已经证明了POX/PRODH在细胞毒药物和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）及其配体诱导的细胞凋亡中的重要作用(6,10). POX/PRODH在癌细胞中的高表达足以启动凋亡，因为它能够产生活性氧物种（ROS）(6,7). 除了诱导凋亡细胞死亡外，POX/PRODH还负调控各种癌细胞的生长，导致细胞周期在G2-M检查点，并在小鼠异种移植模型中抑制肿瘤形成(7,9). 随后，与正常组织相比，在多种人类肿瘤组织中观察到POX/PRODH的缺失或减少(9,11)miR-23b*被发现是调节肾肿瘤中POX/PRODH下调的机制之一(11).
这个MYC公司癌基因在人类癌症中经常失调。它编码转录因子c-MYC（本文称为MYC），将细胞代谢改变与致癌联系起来。除了已知的调节葡萄糖代谢的功能外(12)最近有文献证明，MYC可诱导线粒体谷氨酰胺酶（GLS）的表达以刺激谷氨酰胺分解代谢(13,14). 这些发现再次强调了谷氨酰胺分解代谢在癌细胞代谢中的重要性。除了用于合成蛋白质、核苷酸和脂质外(15,16)，谷氨酰胺通过GLS转化为谷氨酸。谷氨酸不仅是谷胱甘肽的重要组成部分，而且是转化为α-酮戊二酸（α-KG）后通过补体输入三羧酸（TCA）循环的重要能量来源。不太被认可的是，谷氨酸也可以通过Δ转化为脯氨酸1-P5C合成酶（P5CS）和P5C还原酶（PYCR）依次催化吡咯烷-5-羧酸盐（P5C）(). 相反，脯氨酸可以通过POX/PRODH和P5C脱氢酶（P5CDH）依次催化的脯氨酸分解代谢转化为谷氨酸。脯氨酸衍生的谷氨酸可进一步转化为α-KG，或通过谷氨酰胺合成酶（GS）用于生成谷氨酰胺。因此，我们想知道致癌MYC是否会影响脯氨酸代谢，特别是通过肿瘤抑制因子POX/PRODH调节脯氨酸分解代谢。在本研究中，我们研究了MYC对脯氨酸分解代谢和谷氨酰胺合成脯氨酸的影响，特别是对POX/PODH表达的影响及其调控机制。进一步确定POX/PRODH对MYC介导的肿瘤细胞行为的贡献。
MYC强烈抑制POX/PRODH蛋白的表达。(A类)脯氨酸和谷氨酰胺相互转化方案。谷氨酰胺酶；谷氨酰胺合成酶；谷氨酸-γ-半醛；α-KG，α-酮戊二酸；P5C，Δ1-吡咯啉-5-羧酸盐；P5CDH、P5C脱氢酶；P5CS、P5C合成酶；POX/PRODH、脯氨酸氧化酶/脱氢酶；PYCR1、P5C还原酶1；TCA循环、三羧酸循环。(B类和D上部)使用GAPDH作为负荷控制，对经或未经四环素（T）处理的P493细胞中POX/PRODH和MYC进行蛋白质印迹。(B类和D下部)密度分析显示MYC和POX/PRODH的带密度比与负载控制。所示数据代表三个独立实验之一。(C类和E类)使用GAPDH作为内部对照，通过实时RT-PCR测量POX/PRODH mRNA水平。计算未经四环素治疗组的相对折叠数。结果为平均值±SEM，n个= 3.P（P）数值通过单因素方差分析获得*P（P）<0.05和**P（P）与0小时对照组相比<0.001。
结果
MYC强烈抑制POX/PRODH蛋白的表达。
为了研究MYC是否在调节人类癌症中POX/PRODH的表达中发挥作用，我们使用了携带四环素可再表达的人类Burkitt淋巴瘤模型P493细胞MYC公司构造。在缺乏四环素的情况下，异位MYC是在类似于人类Burkitt淋巴瘤的致瘤状态下诱导的。我们分析了MYC引起的POX/PRODH蛋白和mRNA表达的变化。如所示，POX/PRODH蛋白以时间依赖性的方式增加，当P493细胞被四环素处理24小时和120小时时，分别达到约3.8倍和7.5倍。当通过去除四环素恢复MYC表达时，POX/PRODH蛋白显著减少(). 然而，直到四环素治疗后72小时（约1.7倍），POX/PRODH mRNA才显示出任何明显的增加，即使在120小时，它也只增加了约4.7倍(). 因此，与POX/PRODH蛋白水平的变化相比，POX/PRODH mRNA水平的变化被延迟并稳定在较低的水平。
由于在人类前列腺癌中也发现MYC的过度表达，我们测试了MYC对PC3人类前列腺癌细胞中POX/PRODH的表达是否具有相同的影响。短干扰RNA（siRNA）敲低PC3细胞中的MYC，导致POX/PRODH表达受到抑制，其模式与P493细胞相似(图S1A类). 当MYC降低85%时，POX/PRODH蛋白表达增加了约4.2倍，而POX/PORDH mRNA水平仅增加了约1.6倍(图S1A类和B类).
POX/PRODH抑制对MYC介导的癌细胞增殖和生存至关重要。
如上所述，POX/PRODH已被确定为一种肿瘤抑制因子，其在多种肿瘤中的表达受到抑制；在异种移植小鼠模型中，通过产生ROS诱导凋亡并抑制肿瘤生长。MYC对POX/PRODH的抑制是否与MYC诱导的增殖和细胞存活有关成为一个有趣的问题。我们通过siRNA敲低了四环素抑制MYC的P493细胞中POX/PRODH的表达。Western blot证实POX/PRODH基因敲除(). 在在四环素治疗的不同时间点，POX/PRODH siRNA持续降低ROS的生成，尽管四环素对MYC的抑制降低了第4天ROS的积累（-Tet+siNeg vs.+Tet+siNeg，如)这可能反映了不同MYC调节基因在不同阶段对ROS生成的不同影响(17–19). 相应地，通过流式细胞术进行的细胞凋亡测定显示，siRNA敲低POX/PRODH降低了MYC抑制时发生的凋亡和死亡细胞的百分比(). 相反，活细胞的数量表明，POX/PRODH siRNA可以显著挽救30～40%的生长率下降，在第2天和第4天分别为46%和82%，这是由于四环素抑制MYC所致(). 这些结果表明，POX/PRODH抑制参与MYC介导的癌细胞增殖和生存。
抑制POX/PRODH对MYC介导的P493细胞中的癌细胞增殖和存活是必要的。首先用抗POX/PRODH（siPOX）或阴性对照siRNA（siNeg）的siRNA转染P493细胞24 h，然后用四环素（Tet）处理2或4 d(A类)Western blot证实POX/PRODH基因敲除。(B类)通过二氯荧光素（DCF）分析进行ROS生成。(C类)四环素治疗4d后，通过Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色监测细胞凋亡。结果代表了两个单独的实验，一式三份。右下角的数字显示了Annexin V阳性细胞的百分比，用平均值±SEM表示(D类)用台盼蓝排斥法测定相对活细胞数。结果显示为平均值±SEM(n个= 3). 全部P（P）值由学生获得t吨测试。
为了将上述结论从四环素对照细胞延伸到过度表达MYC的癌细胞，我们对PC3前列腺癌细胞进行了相同的检测。我们首先用Western blots通过其各自的siRNAs证实了MYC和POX/PRODH的表达降低(图S2A类). 如所示图S2B类siRNA对MYC的敲除首先导致第3天ROS生成减少，然后在第6天略有增加。当使用POX/PRODH siRNA降低MYC siRNA导致的POX/PODH表达增加时，ROS的生成在这两个时间点都降低。MYC siRNA对MYC的减少在第3天和第6天分别降低了细胞生长53.0%和68.6%，POX/PRODH siRNA可恢复19.5%和71.6%(图S2C类). 凋亡分析表明，MYC siRNA使凋亡细胞的百分比增加了三倍，POX/PRODH敲除使凋亡细胞百分比降低了～40%(图S2D类).
POX/PRODH通过电子传递链复合体III产生ROS的机制，以及POX/PORDH产生的ROS对MYC抑制导致的生长减少的贡献，见SI结果和讨论和所示图S3。
MYC在转录水平间接抑制POX/PRODH的表达。
如上所述，MYC降低了POX/PRODH mRNA的表达，尽管它与抑制POX/PORDH蛋白水平不可相比。为了进一步证实其对POX/PRODH转录的调节，我们测试了MYC对PRODH公司通过转染产品启动子/荧光素酶报告子结构包含PRODH公司启动子区(10). 如所示，MYC的击倒导致了PRODH公司启动子活性，表明MYC在转录水平调节POX/PRODH。然而，目前尚不清楚MYC是否通过直接与PRODH公司启动子区域。分析PRODH公司启动子核苷酸序列显示一个典型的MYC结合位点5′-CACGTG-3′（E-box）和一个非经典的结合位点（5′-ACGGT-3′）分别位于-2808到-2813 bp和-637到-642 bp产品启动子区。调查MYC是否直接与PRODH公司基因，我们使用细胞周期素依赖性激酶4（CDK4）对P493细胞进行染色质免疫沉淀（ChIP）检测，据报道MYC上调了CDK4(20)，作为阳性对照。这些都不是PRODH公司含有典型或非典型MYC结合位点的启动子区域显示出显著的PCR扩增()证明MYC不会直接与PRODH公司POX/PRODH mRNA表达降低可能通过其他转录因子介导。该结果与MYC调节的POX/PRODH mRNA水平的延迟变化一致，如。
MYC在转录水平间接抑制POX/PRODH的表达。(A类)PC3细胞与荧光素酶报告子共转染PRODH公司-含有LucPRODH公司启动子和siMYC或siNeg，使用pRL-null肾小球荧光素酶报告子作为标准化转染效率的内部控制。PRODH公司用双荧光素酶试剂盒测定启动子荧光素素酶活性。所示数据为平均值±SEM(n个= 3).P（P）值由学生获得t吨测试。(B类)染色质免疫沉淀法产品用或不用四环素处理的P493细胞中的启动子。用抗MYC抗体或无抗体作对照，免疫沉淀可溶性染色质。一部分超声染色质被用作DNA输入控制。MYC的一个已知靶基因，细胞周期依赖性激酶4（CDK4），被用作阳性对照。用含有典型或非典型MYC结合序列（E-box）的PRODH和CDK4基因区域的特异性引物，通过PCR分析免疫沉淀物。
MYC主要通过增加miR-23b*抑制POX/PRODH蛋白表达。
上述数据表明，POX/PRODH蛋白（而非mRNA）对P493和PC3细胞中MYC水平的改变有强烈的反应。因此，我们在转录后水平上寻求MYC对POX/PRODH的调节作用。早期研究表明，MYC抑制P493和PC3细胞中miR-23b的表达(14). 我们先前发表的研究表明，miR-23b*介导肾癌中POX/PRODH蛋白的丢失(11). 由于miR-23b和miR-23b*来自同一转录物，我们首先确定MYC对miR-23b2*的影响，然后测试MYC抑制POX/PODH是否与其对P493细胞中miR-23b*的影响有关。在，实时PCR分析显示，miR-23b*水平随着MYC表达的减少而降低，然后在MYC再诱导时增加，其方式与在PC3前列腺癌细胞也显示出MYC与miR-23b*水平之间的相同关系，即siRNA敲除MYC导致miR-23b*表达降低(图S4A类). 这些结果与MYC报告的miR-23b减少不同。MYC调控的同胞miRNA的非平行表达暗示MYC可能会对miRNA的加工产生不同的影响，包括其稳定和降解。SI结果和讨论和图S5提供初步数据，表明MYC通过上调Agonaute 2蛋白（Ago 2）部分调节miR-23b*和miR-23b的差异表达，Ago 2是miRNAs稳定性和降解的关键因素。
MYC主要通过增加miR-23b*抑制POX/PRODH蛋白表达。(A类和B类)通过实时RT-PCR监测使用或不使用四环素（T）处理的P493细胞中miR-23b*的表达。U6被用作内部控制。结果一式三份，并在两个独立实验中重复。数据显示为平均值±SEM。P（P）数值通过单因素方差分析获得**P（P）与0小时对照组相比<0.001A类. (C类)用miR-23b*antagomir（Anti-23b*）转染P493细胞以抑制miR-23b*的表达，并用干扰RNA作为阴性对照（Neg RNA）。(D类)当向培养基中添加四环素以抑制MYC表达时，用模拟miR-23b*转染P493细胞以增强miR-23b*的表达。(C类和D上部)Western blot检测POX/PRODH蛋白。(C类和D下部)通过密度分析对POX/PRODH蛋白相对于负荷控制的标准化。所示数据代表三个独立实验之一。
为了评估MYC对POX/PRODH的抑制是否与miR-23b*的增加有关，我们用抗miR-23b*的antagomirs转染P493细胞，以抑制在缺乏四环素的情况下MYC过度表达诱导的miR-23b2*的高表达。如所示miR-23b*被拮抗剂抑制后，POX/PRODH蛋白水平增加了1.5倍。此外，我们在四环素MYC抑制下用模拟miR-23b*转染P493细胞。转染后通过实时PCR证实异位miR-23b*的高水平表达。正如预期的那样，模拟miR-23b*导致POX/PRODH蛋白显著降低(). 然而，POX/PRODH的减少仍然与未经四环素治疗的情况不可比较，这表明MYC可以通过miRNA以外的途径抑制POX/PORDH的表达，如上述转录水平的间接调节。
我们通过将含有miR-23b*结合位点的POX/PRODH mRNA 3′UTR序列转染荧光素酶报告子，进一步证实了MYC通过miR-23b*在PC3细胞中抑制POX/PODH，该序列被指定为pPOX 3′UTR*结合位点(11). pMIR-Report，使用不含POX/PRODH mRNA 3′UTR的原始报告者作为对照。阴性siRNAs（siNeg）或MYC siRNA（siMYC）共同转染到PC3细胞。如所示图S4B类siRNAs敲除MYC后，pPOX 3′UTR的荧光素酶活性显著增加，表明siMYC降低了miR-23b*。正如预期的那样，在不敲除MYC的情况下，由于miR-23b*与POX/PRODH mRNA 3′UTR的高水平结合，因此pPOX 3′UTR-的荧光素酶活性远低于原始pMIR-报告，从而抑制了荧光素酶的表达。
MYC显著增加谷氨酰胺中脯氨酸的生物合成。
MYC已被证明能增强GLS表达和谷氨酰胺分解代谢(13,14). 因为谷氨酰胺和脯氨酸是相互转化的()，我们通过研究P493细胞中谷氨酰胺-脯氨酸代谢途径的酶来研究MYC对谷氨酰胺和脯氨酸代谢的调节。如所示，MYC在从谷氨酰胺到脯氨酸的途径中显著增加GLS、P5CS和PYCR1的表达，并在从脯氨酸到谷氨酰胺的途径中降低POX/PRODH、P5CDH和GS的表达。PC3人前列腺癌细胞在MYC与谷氨酰胺和脯氨酸代谢之间表现出相同的相关性。MYC siRNA减少MYC导致POX/PODH、P5CDH和GS增加，GLS、P5CS和PYCR1减少(). 然后我们测量了P493 MYC-On和MYC-Off细胞中脯氨酸的细胞内水平。正如预期的那样，MYC显著增加了细胞内脯氨酸水平().
MYC显著增加谷氨酰胺中脯氨酸的生物合成(A类)用四环素处理不同时间的P493细胞脯氨酸和谷氨酰胺分解代谢途径中酶的蛋白质印迹。(B类)用抗MYC（siMYC）或阴性对照siRNA（siNeg）的siRNA转染PC3细胞。用Western blots分析脯氨酸和谷氨酰胺代谢途径中的酶。实验得到了类似的结果。(C类)MYC-On和MYC-Off细胞中的细胞内脯氨酸水平。(D类)[U中的预期标记模式-13C、，15N] -谷氨酰胺（Gln）和预先存在的未标记Gln通过谷氨酸（Glu）与脯氨酸（Pro）的不同同位素和TCA循环的中间产物结合。[13C类5,15N个2]-Gln可以通过谷氨酰胺酶（GLS）分解代谢产生13C类5,15N-谷氨酸（Glu）（m+6），可直接转化为13C类5,15N-Pro（m+6）通过或者，13C类5,15N-谷氨酸可以转化为α-酮戊二酸（α-KG），并通过TCA循环代谢。α-KG与Glu的反向反应使15N重新并入Glu（例如，生产15N个1-谷氨酸）通过转氨酶（TA）和/或谷氨酸脱氢酶（GDH）活性。所示的碳轨迹说明了13TCA循环三圈后的C命运。●,12C或14N；红色圆圈，13C在第一圈；绿色圆圈，13第二圈C；粉红色圆圈，13第三圈C；蓝色圆圈和N，15N；氨基酸；单头和双头实心箭头：分别为单不可逆和可逆反应；虚线箭头，多步反应；氨基酸；CS，柠檬酸合成酶；PDH，丙酮酸脱氢酶。(E类和F类)GC-MS分析[13C、，15N] -在MYC开启和关闭的情况下，Gln对P493细胞中柠檬酸盐和脯氨酸合成的贡献。所有GC-MS数据都经过了天然丰度同位素贡献校正，并标准化为细胞颗粒湿重。每个值是重复样本的平均值。整个实验重复了三次。
为了直接证实由MYC诱导的谷氨酰胺产生脯氨酸，我们通过气相色谱-质谱（GC-MS）、傅里叶变换-离子回旋共振质谱（FT-ICR-MS）和核磁共振（NMR）跟踪谷氨酰胺向脯氨酸的转化，并使用[U-13C、，15N] -谷氨酰胺（Gln）作为P493细胞中的示踪剂。谷氨酰胺被标记在所有五个碳原子和两个氮原子上，并被并入新合成的脯氨酸中。显示了[U的预期标签模式-13C、，15N] -Gln，包括TCA循环的中间产物和通过谷氨酸（Glu）的脯氨酸（Pro）。如详细描述(21)，MYC通过TCA循环诱导谷氨酰胺氧化，因此MYC增加了源自谷氨酰胺的TCA循环的所有中间产物，包括α-KG、琥珀酸、富马酸、苹果酸和柠檬酸。为了确认之前的结果13C、，15MYC-On和MYC-Off的P493细胞中N-Gln对柠檬酸的贡献如所示.生产13C类5-Gln示踪剂中的柠檬酸盐（m+5）可以用α-KG的还原羧基化来解释，这需要像最近在其他细胞中报道的那样，在乌头糖和异柠檬酸脱氢酶（IDH）催化下，柠檬酸盐转化为α-KG的反应发生逆转(22–25). 然而，如前所述，这一过程不太可能是P493细胞在常压氧下的主要途径(21). 这一发现也与最近的报告相一致，该报告显示谷氨酰胺依赖性还原羧基化在缺氧或TCA循环缺乏的细胞中最为普遍(23–25).
显示了以下成分的GC-MS分析13C、，15无论是否经过四环素处理，N-Gln对脯氨酸合成的贡献。m+1到m+6表示中子质量从1到5的增量增加13C和零或一15N并入脯氨酸。因此，m+6标记的脯氨酸物种(13C类5,15N-Pro）是来自13C类5,15N个2-Gln分解代谢，而其余标记物种可通过TCA循环、转氨作用（TA）和/或谷氨酸脱氢酶（GDH）活性的代谢紊乱从亲本谷氨酰胺示踪剂中获得(). 随着四环素的退出，MYC的表达增加，脯氨酸的m+1到m+6同位素水平显著且持续增加，尽管脯氨酸的各种标记同位素的浓度比并不恒定。MYC-On和MYC-Off之间脯氨酸等位异构体的非恒定比率可能是由于以下原因造成的。如上所述，除了m+6之外的各种标记的脯氨酸物种可以通过TCA循环、转氨作用和/或GDH活性从各种碳和氮加扰过程中衍生出来，如转了三圈之后。通过TCA循环检测到脯氨酸中碳的扰动与不同扰动标记模式（例如，m+2和m+4同位素）标记柠檬酸盐的生成一致). 柠檬酸盐的m+2和m+4同位素分别是克雷布斯循环三圈和一圈的产物()，而m+5(13C类5-柠檬酸盐）和m+6(13C类6-柠檬酸盐）可由丙酮酸羧化和TCA环非依赖性ATP柠檬酸裂解酶加苹果酸酶反应序列产生，如Le等人(21). MYC抑制可能对这些过程有不同的影响。此外，Pro丰富的m+5同位素意味着15N由14N作为所有五种碳都应标记，因为其前体的丰度很高13C类5-谷氨酸(21). 中的FT-ICR-MS分析图S6显示了Glu、天冬氨酸（Asp）和脯氨酸同位素的分数分布。与脯氨酸一致，13C和15谷氨酸和天冬氨酸的N同位素分布受MYC表达的差异调节。
此外图S7显示了广泛的13MYC诱导的谷氨酰胺脯氨酸中的C富集，进一步证实了GC-MS数据。这些发现与介导谷氨酸合成脯氨酸的酶的显著增加相一致。因此，MYC不仅刺激谷氨酰胺向谷氨酸的转化，而且还通过脯氨酸生物合成酶显著促进谷氨酸向脯氨酸的后续转化。
讨论
脯氨酸作为唯一的蛋白质生成次级氨基酸，由其自身的酶家族代谢，这些酶对各种应激反应并参与氧化还原调节和代谢信号传递。最近的研究表明，脯氨酸是一种“应激底物”，脯氨酸代谢可能是一个潜在的抗肿瘤靶点。POX/PRODH是脯氨酸分解代谢的第一种酶，由基因毒性（p53）诱导(8)炎症（PPARγ及其配体）(10)和营养应激（葡萄糖缺乏）(26). POX/PRODH催化的脯氨酸分解代谢产生电子以产生ROS并引发多种下游效应，包括细胞周期阻滞和细胞凋亡的启动。从这个意义上讲，POX/PRODH作为一种代谢性肿瘤抑制剂发挥作用，其在肿瘤中的低表达或缺失以及通过其异位表达抑制小鼠异种移植瘤模型中的肿瘤形成都支持这一点。在这项工作中，我们发现致癌转录因子MYC抑制POX/PRODH的表达，从而抑制其抑癌功能。当MYC受到抑制时，POX/PRODH的增加会诱导ROS生成和凋亡，导致细胞增殖和生长下降。这些结果表明，MYC诱导的POX/PRODH抑制有助于MYC介导的细胞行为改变，包括增殖和代谢重编程，而这反过来又有助于肿瘤的发生和进展。
来自不同来源的转化细胞通常会上调葡萄糖和谷氨酰胺的消耗，作为代谢能量的来源和大分子生物合成的前体(13,27). 这个MYC公司癌基因在许多人类癌症中起着关键作用，被认为是细胞代谢和增殖的主要调节因子。它不仅促进葡萄糖摄取和诱导有氧糖酵解，而且还促进谷氨酰胺摄取和刺激谷氨酰胺分解代谢。如上所述，谷氨酰胺代谢与蛋白质、核苷酸和脂质的生物合成、氧化还原平衡和能量代谢有关。然而，Wise等人的报告表明，MYC刺激的谷氨酰胺摄取很少用于大分子合成(13). MYC-诱导的谷氨酰胺分解代谢是线粒体代谢的重新编程，以维持细胞活力和TCA循环的恢复(13). Le et al(21)Wang等人(28)已经强调了由转化细胞和活化T细胞中的MYC控制的代谢重编程。后者表明，MYC驱动的谷氨酰胺分解代谢与多种生物合成途径耦合，尤其是鸟氨酸和多胺生物合成(28). 有趣的是，我们目前的研究表明，MYC显著增加了谷氨酰胺衍生脯氨酸的生物合成。然而，这种生物合成途径如何适应MYC驱动的代谢重编程？
20世纪70年代，Windmueller和Spaeth观察到谷氨酰胺和脯氨酸代谢之间的生理关系(29). 在快速增殖的大鼠小肠组织中，谷氨酰胺是一种重要的底物，其利用率几乎是葡萄糖的三分之二。有趣的是，脯氨酸是谷氨酰胺的重要定量产物。同样，在培养的L-M细胞中，Stoner和Merchant显示出游离脯氨酸的净增加伴随着谷氨酰胺的利用(30). 在肿瘤微环境中，受MYC和HIF-1不同影响的区域之间或肿瘤和基质细胞之间存在代谢共栖性(三,31–33). 谷氨酰胺转化为脯氨酸的增加所带来的代谢优势尚不清楚，但将一种非必需氨基酸转化为另一种用于蛋白质合成的氨基酸似乎不太可能。前面描述的脯氨酸合成和磷酸戊糖途径之间的代谢连锁为理解MYC上调脯氨酸合成途径提供了一个有吸引力的模型(34–36).
总之，我们展示了MYC对POX/PRODH的抑制，并证明了这种重新编程对细胞增殖和生存的影响，这使得POX/PODH成为癌症治疗的潜在靶点。肿瘤抑制因子POX/PRODH在人类癌症中表达降低的调节机制部分是由MYC通过miRNA转录后介导的。MYC提供的谷氨酰胺和脯氨酸之间的代谢联系强调了肿瘤代谢的复杂性，这是一个值得进一步研究的领域。
材料和方法
细胞和细胞培养。
将MYC诱导的人类Burkitt淋巴瘤模型P493细胞和PC3人类前列腺癌细胞保存在含有10%（vol/vol）FBS的RPMI培养基1640中。
其他方法。
实时RT-PCR分析、小RNA转染、Western blot、荧光素酶分析、活性氧测定、凋亡测定、染色质免疫沉淀测定、细胞内脯氨酸水平测定、谷氨酸和谷胱甘肽测定、GC-MS、FT-ICR-MS和NMR研究方法的详细说明[13C、，15N] -支持信息中提供了谷氨酰胺对脯氨酸生物合成的贡献。
致谢
我们感谢朱自强博士的富有洞察力的评论，感谢朱自强·朱博士、朱丽叶·谭和拉迪卡·伯拉博士的出色技术援助。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）校内研究计划的支持；国家癌症研究所；癌症研究中心；国家科学基金会刺激竞争性研究实验项目（EPSCoR）EPS-0447479；NIH从国家研究资源中心1R01CA118434-01A2（给T.W.-M.F.）、3R01CA18434-02S1（给T.W.-M.F）和R21CA133688（给A.N.L.）拨款P20RR018733；和布朗基金会。
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