跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
生物化学杂志。2012年5月18日；287(21): 17530–17545.
2012年4月2日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。123.559638南非兰特
预防性维修识别码：下午3366846
PMID：22474287

氯硝柳胺的结构活性分析揭示了细胞质pH在控制雷帕霉素复合物1（mTORC1）信号的哺乳动物靶点中的潜在作用*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

布鲁诺·D·丰塞卡,‡§,1 格雷厄姆·H·迪林,‡,2 迈克尔·毕迪诺斯蒂,§,三 库什·达拉,‡ 汤米·阿兰,§ 阿鲁纳·D·巴尔吉,‡ 罗伯托·福雷斯蒂埃里, 马特·诺德维尔, 查尔斯·拉贾杜赖,§ 辛西娅·古纳拉特南,‡ 安德鲁·R·T,‖ 弗兰克·邓,‡ 雷蒙德·安徒生, 约翰·奥洛夫斯基,** Masayuki Numata公司,‡ 纳胡姆·索嫩贝尔格,§和米歇尔·罗贝奇‡,4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

背景：mTORC1在人类疾病中失调，人们对开发mTORC抑制剂感兴趣。氯硝柳胺抑制mTORC1信号传导，但其作用方式尚不清楚。

结果：氯硝柳胺从溶酶体中挤出质子，从而降低细胞质pH值并抑制mTORC1信号传导。

结论：细胞质酸化抑制mTORC1信号传导。

意义：我们的发现可能有助于基于氯硝柳胺的抗癌治疗剂的设计。

关键词：酸中毒、溶酶体、mTOR复合物（mTORC）、器官pH平衡、S6激酶、细胞质pH平衡、氯硝柳胺

摘要

雷帕霉素复合物1（mTORC1）信号传导的哺乳动物靶点在癌症中经常失调。因此，抑制mTORC1被认为是治疗mTORC活性升高的肿瘤的一种有希望的策略。我们最近确定氯硝柳胺（一种食品和药物管理局批准的抗蠕虫药）是mTORC1信号的抑制剂。在本研究中，我们探讨了氯硝柳胺抑制mTORC1信号传导的可能机制。我们测试了氯硝柳胺是否干扰mTORC1上游的信号级联、mTOR的催化活性或mTORC1-组装。我们发现氯硝柳胺不损害PI3K/Akt信号传导，也不抑制mTORC1激酶活性。我们还发现氯硝柳胺不会干扰mTORC1的组装。先前对蠕虫的研究表明，氯硝柳胺会破坏寄生虫的pH稳态。这促使我们研究氯硝柳胺是否影响癌细胞的pH平衡。在乳腺癌细胞和无细胞系统中的实验表明，氯硝柳胺在细胞和在体外在细胞中，氯硝柳胺将质子（沿浓度梯度）从溶酶体释放到胞浆，有效降低了细胞质pH值。值得注意的是，对五种氯硝柳酰胺类似物的分析表明，氯硝酰胺的结构特征对抑制mTORC1也至关重要。此外，通过氯硝柳胺以外的方法降低细胞质pH值(例如用丙酸或碳酸氢盐提取液孵育）概括了氯硝柳胺对mTORC1信号传导的抑制作用，支持了细胞质pH值在控制mTORCl中的可能作用。我们的数据说明了涉及细胞质pH调节的mTORC1信号化学抑制的潜在机制。

关键词：酸中毒、溶酶体、mTOR复合物（mTORC）、器官pH平衡、S6激酶、细胞质pH平衡、氯硝柳胺

引言

雷帕霉素的哺乳动物靶点（mTOR）5是一种Ser/Thr蛋白激酶，存在于两种蛋白质复合物中，分别称为mTORC1和mTORC2，各自控制不同的细胞功能。mTORC2磷酸化PKB/Akt、血清和糖皮质激素调节激酶1（SGK1）和PKCα以调节细胞存活和细胞骨架组织(1——7)而mTORC1磷酸化S6K1和4E-BP1以控制细胞生长和增殖(8,9). S6K1和4E-BP1是研究得最好的mTORC1靶点，但新的证据表明，mTORC2磷酸化许多其他蛋白质(10——12).

mTORC1由不同的信号级联调节，其中许多由肿瘤抑制因子和人类癌症中突变的原癌基因组成。已知在mTORC1上游起作用的肿瘤抑制因子包括PTEN、TSC1/TSC2、LKB1/STK11、NF1和NF2(13——19). 缺乏TSC1、TSC2、PTEN、LKB1或NF1的小鼠胚胎成纤维细胞显示mTORC1信号升高(14,16,19,20). mTORC1也受到一些原癌基因的正向调节，例如PI3K、PKB/Akt和EGF受体(21,22). 根据COSMIC（癌症体细胞突变目录）人类癌症数据库的报告，mTOR本身在多种人类癌症中发生突变(23). 值得注意的是，其中一些突变导致mTORC1过度激活和细胞周期加速(24). 因此，mTORC1被认为是肿瘤治疗的一个有吸引力的靶点，目前对mTORC的药物抑制剂的开发有着很高的兴趣。

mTORC1被天然产物雷帕霉素（西罗莫司）变构抑制，雷帕霉素与mTOR中的FKBP12-雷帕霉素结合域相互作用(25,26). 此前已有研究表明，雷帕霉素可以在含磷缓冲液中消除猛禽与mTOR的结合(27,28). 猛禽被认为是一种支架蛋白，可以使底物接近mTOR，从而实现高效磷酸化(29——31). 雷帕霉素从猛禽体内分离mTOR的能力可以解释雷帕霉素对S6K1和4E-BP1磷酸化的抑制作用，但雷帕霉素干扰mTORC1功能的确切机制尚未完全阐明。

雷帕霉素具有不良的药代动力学特性(32). 这一认识促进了雷帕霉素替代品的开发，该替代品具有改进的药理特性，可用于癌症治疗。这些努力最终导致了雷帕霉素类似物替米罗莫司（细胞周期抑制剂-779（CCI-779））、依维莫司（RAD-001）和利达福勒莫斯（AP23573；也称为MK-8669）的开发，生物利用度略有提高(33). 前两种药物已被批准用于治疗晚期肾细胞癌，目前正在对各种实体肿瘤和造血系统恶性肿瘤进行临床试验(34,35). AP23573目前正在进行晚期软组织和骨肉瘤、子宫内膜癌和造血恶性肿瘤的临床试验(36).

雷帕霉素抑制由mTORC1介导的许多但不是全部信号事件。例如，雷帕霉素对各种细胞类型的急性治疗很容易消除S6K1在Thr的磷酸化389和4E-BP165但对Thr的磷酸化几乎没有影响37/46在4E-BP1中(37)而mTORC2活性对急性雷帕霉素治疗不敏感。然而，mTORC2对某些细胞类型的慢性雷帕霉素治疗敏感(38). 近年来，人们对寻找替代mTOR抑制剂的兴趣越来越高，这种抑制剂直接靶向mTOR的催化活性，从而能够阻断雷帕霉素敏感和不敏感的mTOR功能(39,40). 五项独立研究(41——45)报道了不同的ATP-竞争性抑制剂（Torin1、Ku-0063794、WAY-600、WYE-687、WYE-354、AZD8055和PP242）的开发，它们能有效抑制所有mTOR功能。其他组(46,47)开发了ATP-竞争性抑制剂（PI-103和NVP-BEZ235），以mTOR和PI3K的催化活性为目标。上述所有化合物与雷帕霉素和雷帕霉素类似物的不同之处在于，它们直接靶向mTOR的催化活性，从而抑制mTORC1和mTORC2。

我们最近发现氯硝柳胺是一种结构独特的mTORC1信号抑制剂(48)在筛选自噬调节剂的背景下，mTORC1抑制的分解代谢细胞过程(49). 氯硝柳胺快速有效地诱导自噬标记物EGFP-LC3的积累，同时抑制4E-BP1和S6K1的磷酸化(48)mTORC1激活最广泛使用的读数。然而，氯硝柳胺不能抑制mTORC2(48)这表明它并不直接抑制mTOR激酶活性，而是削弱mTORC1的信号传导。

氯硝柳胺是自1960年以来批准用于人类治疗各种绦虫感染的口服水杨酸苯胺衍生物(50). 氯硝柳胺是根据寄生虫感染动物模型中的活性开发的，但不知道其作用靶点，其作用机制尚不明确(51). 据信，氯硝柳胺具有抗寄生虫活性，这是因为它能够破坏寄生虫的pH稳态(52). 在本研究中，我们研究了氯硝柳胺抑制mTORC1信号传导的机制。

我们的数据表明氯硝柳胺并不直接抑制mTORC1或其他激酶的催化活性在体外相反，氯硝柳胺通过引起质子通过质膜向内流动，并在细胞内细胞器（如溶酶体）的膜上消散质子梯度，从而诱导细胞质酸化。值得注意的是，我们观察到，对细胞质酸化至关重要的氯硝柳胺的化学特征也需要用于抑制mTORC1信号，这表明细胞质pH值在控制mTORC 1信号中发挥作用。与这一想法一致，通过氯硝柳胺以外的其他方法调节细胞质酸化，对mTORC1信号产生类似的抑制作用。

细胞质pH如何调节mTORC1活性？还需要进一步的实验来全面描述支持酸中毒介导的mTORC1抑制的确切信号事件。然而，有趣的是，我们的数据表明，PI3K/Akt/TSC2/Rheb信号级联（mTORC1的主要调控轴）在这种情况下是完全不必要的。

实验程序

化学制品

数字图书馆-二硫苏糖醇（目录号DTT001.5）购自BioShop Canada，Inc.5-(N个-乙基-N个-异丙基氨氯（EIPA）（目录号A3085）和1,1-二甲基双胍盐酸盐（二甲双胍）（目录编号D5035）购自Sigma。PD184352（目录号P-8499）购自LC Laboratories。CGP57380型（目录号CA60801-314）购自VWR。托林1（1-[4-[4-（1-氧丙基）-1-哌嗪基]-3-（三氟甲基）苯基]-9-（3-喹啉基）-苯[小时]-1,6-萘吡啶-2（1H（H）)-一个）（目录号4247）和PP242（2-[4-氨基-1-（1-甲基乙基）-1H（H）-吡唑啉[3,4-d日]嘧啶-3-基]-1H（H）-吲哚-5-醇）（目录号4257）购自Tocris Bioscience。雷帕霉素（目录号553211）从Calbiochem获得，氯硝柳胺（目录号N3510）从Sigma-Aldrich获得。氯硝柳胺类似物1是通过碳二亚胺介导的2-氯-4-硝基苯胺和3-氯苯甲酸之间的酰胺偶联制备的。氯硝柳胺类似物2是通过碳二亚胺介导的2-氯-4-硝基苯胺和3-氯-5-甲氧基苯甲酸之间的酰胺偶联，然后通过BBr裂解甲基醚制备的三氯硝柳胺类似物3是使用甲基化剂硫酸二甲酯和K通过氯硝柳酰胺甲基化制备的2一氧化碳三氯硝柳胺类似物4是由2-乙酰氧基-5-氯苯甲酰氯和2-氯苯胺偶联，然后水解O（运行）-乙酰基（K）2一氧化碳三氯硝柳胺类似物5通过甲基化O（运行）-乙酰氯硝柳胺，以前是由氯硝柳酰胺和醋酸酐反应，使用甲基化剂硫酸二甲酯和K合成的2一氧化碳三然后水解O（运行）-乙酰基（K）2一氧化碳三使用硅胶超纯硅胶（230–400目）通过柱色谱纯化所有类似物，并通过1H和13核磁共振波谱和高分辨率电喷雾质谱。

质粒

Dunlop之前已经描述了本研究中使用的pRK7空载体和pRK7-FLAG-Rheb Q64L载体等。(53).

哺乳动物细胞培养

BT-4T4、Hs578T和TSC2+/+/第53页−/−和TSC2−/−/第53页−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）在添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS）、100单位/ml青霉素G和100μG/ml硫酸链霉素的Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）中培养，37°C，5%（v/v）CO2加湿培养箱。TSC2型+/+/第53页−/−和TSC2−/−/第53页−/−MEF是David Kwiatkowski博士（马萨诸塞州波士顿）的一份礼物。MDA-MB-468细胞保存在Leibovitz的L-15培养基中，添加10%（v/v）FBS、100单位/ml青霉素G和100μG/ml硫酸链霉素，在37°C的CO中2-免费培养箱。MCF-7细胞保存在完整的罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基中，补充10%（v/v）FBS、100单位/ml青霉素G和100μG/ml硫酸链霉素，37°C，5%（v/v）CO2加湿培养箱。在相同的无血清培养基中进行血清剥夺。碳酸氢盐/CO2通过在无碳酸氢盐的RPMI 1640培养基（Wisent Inc.，目录号350-010-CL）中培养MCF-7细胞，补充10%（v/v）FBS、100单位/ml青霉素G和100μG/ml硫酸链霉素，并在无碳酸盐的DMEM中培养MEF，进行停药实验（Wisent Inc.，目录编号219−010-XK）添加10%（v/v）FBS、100单位/ml青霉素G和100μG/ml硫酸链霉素2-免费培养箱，适用于图中图例所示的时间段。通过在无碳酸氢盐的RPMI 1640完全培养基（如上所述）中培养MCF-7细胞，在CO中用HCl调节至37°C时所需的pH值，从而进行调节细胞外pH值的实验2-免费培养箱。MEF在无碳酸氢盐的完整DMEM（如上所述）中在相同的温度和CO下培养2-自由条件。在使用50 m的实验中米丙酸，培养基的NaCl浓度降低到60 m米以保持等渗性。

细胞裂解和免疫印迹

通过在以下提取缓冲液中刮取细胞：20 m米三氯化氢，pH 7.5，150 m米氯化钠，1米米EDTA，1米米EGTA，1%（v/v）Triton®声波风廓线仪X-100，2.5 m米焦磷酸钠，1 m米添加新鲜1米的β-甘油磷酸米纳三VO（旁白）4，1米米二硫苏糖醇和1×完整蛋白酶抑制剂混合物（罗氏应用科学，目录号11697498001）。在21000×克在4°C下保持10分钟。使用不同的裂解缓冲液对完整的mTORC1复合物进行免疫纯化（参见“体外试验mTORC1激酶分析”）。通过在含有0.1%亚甲基双丙烯酰胺（w/v）的10%（w/v）丙烯酰胺凝胶上溶解裂解物样品，然后用所示抗血清进行Western印迹，分析磷酸化和总蛋白水平。抗磷Thr37/464E-BP1（目录号2855），抗磷-Thr389第70页S6K1系列（目录号9234），抗磷-Ser371第70页S6K1系列（目录号9208），抗磷-Thr421/序号424第70页S6K1系列（目录号9204），抗磷-Thr172AMPK（目录号2531），抗磷-Thr308PKB/Akt（目录号2965），抗磷-Ser473PKB/Akt（目录号9721），抗磷-Thr202/提尔204p44/42 ERK1/ERK2（目录号9106）、抗4E-BP1（目录号9644）、抗AMPKα（目录号2532）、抗p44/42ERK1/ERG2（目录编号9107）、抗PKB/Akt（目录号4691）和抗mTOR（目录号2983）抗体购自Cell Signaling Technology。抗-S6K C-18（目录号SC-230）购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.。抗捕捉器（目录号09−217）抗体购自Millipore。抗磷Ser209eIF4E（目录号NB100-79938）和抗eIF4E（目录号610270）分别从Novus Biologicals和BD Transduction Laboratories获得。通过增强化学发光监测磷酸化和总蛋白水平。

活性/增殖3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-四唑溴化物测定

将MCF-7细胞以每孔8000个细胞的速度接种在96周的微孔板中并繁殖18小时。然后用雷帕霉素、氯硝柳胺或类似物处理细胞。48小时后使用所述的3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-四氮唑溴化物试验（Sigma，目录号M2128）测量细胞存活率/增殖(54).

大肠杆菌内膜泡pH值的测定

倒置内膜囊泡（IMVs）由大肠杆菌描述的菌株KM9(55). 在25°C的瓦里安·卡里·Eclipse荧光光谱仪上进行荧光测量。IMV（40μg）在50 m内稀释至150μl米Tris-SO公司4，pH值7.9，25米米K（K）2SO公司4，10米米硫酸镁4，0.2 mg/ml BSA，置于石英试管中。NADH（1米米)添加以在IMV内生成酸性pH值。使用pH敏感染料9-氨基-6-氯-2-甲氧基克里丁（4μ米)激发和发射波长分别为409（20-nm狭缝宽度）和474nm（10-nm狭缝宽）。氯硝柳胺、氯硝柳酰胺类似物或羰基氰化物挑战pH梯度的稳定性第页-1μ时的氯苯腙米.

EGFP-LC3自噬试验

将稳定表达EGFP-LC3的MCF-7细胞接种在PerkinElmer Life Sciences View 96 well微特板中，每孔20000个细胞。播种18小时后，将雷帕霉素、氯硝柳胺和类似物添加到每个孔中，达到图中图例所示的最终浓度。将平板在37°C下培养4小时。然后除去培养基，并用含有500ng/ml Hoechst 33342的3%（v/v）多聚甲醛在室温下固定细胞15分钟。用含1m的PBS清洗固定细胞一次米氯化镁2和0.1米米氯化钙2然后在4°C的相同介质中保存，直到板准备好进行分析。在Cellomics中读取盘子TM（TM）阵列扫描V钛自动荧光成像仪。在Hoechst和GFP（XF-100过滤器）通道中使用20倍物镜拍摄细胞。使用隔室分析算法识别细胞核，应用细胞质掩模，并量化固定在250像素强度单位的GFP通道中的GFP斑点。GFP通道中的荧光强度在细胞质掩模内以10个平均像素强度单位进行门控，以选择表达极低水平EGFP-LC3的细胞。点状EGFP-LC3的总像素强度作为“圆形光斑总强度通道”获得

细胞质pH值的测定

MCF-7细胞在涂有0.01%（v/v）poly的玻璃盖玻片上增殖-我-在测量细胞内pH值之前，将赖氨酸在完整培养基中培养48小时。然后，通过在室温下将细胞在缓冲盐水（120 m）中培养10分钟，将细胞加载pH敏感染料2′，7′-双（2-羧乙基）-5（6）-羧基荧光素（BCECF）乙酰甲酯米氯化钠，5米米KCl，1米米氯化镁2，2米米氯化钙2，5米米葡萄糖，20米米HEPES，pH 7.4），含2μ米BCECF乙酰甲酯。用盐水冲洗后，将附着有细胞的盖玻片安装在充满盐水的温控记录室上，放置在显微镜上，然后在34°C下用盐水以2 ml/min的速度超冲洗，以进行剩余的实验。在指定的时间，10μ米将氯硝柳胺或相同浓度的类似物1或2添加到灌流液中，并随时间监测细胞质pH值的变化。在一些实验中，用高[K+]中等（50米米KCl，75米米氯化钠，1米米氯化镁2，2米米氯化钙2，5米米葡萄糖，20米米HEPES，pH 7.4）添加10μ米氯硝柳胺。在另一个实验中，用100 n米雷帕霉素10分钟，然后用等渗NH进行短暂治疗4氯盐（50 m米全日空航空公司4氯，70米米氯化胆碱，5米米KCl，1米米氯化镁2，2米米氯化钙2，5米米葡萄糖，20米米HEPES，pH 7.4）。测量pH值我，BCECF染料在452和488 nm处交替激发，并使用荧光比成像系统（Atto Bioscience，Rockville，MD）测量515 nm处的发射强度。背景校正的BCECF发射强度比转换为pH值我使用高K值+/尼日尔金技术(56,57).

宽场荧光显微镜的溶酶体可视化

MCF-7细胞接种于5×105细胞在6孔板中，置于2 ml完整培养基中（添加10%（v/v）FBS、100单位/ml青霉素G和100μG/ml硫酸链霉素的RPMI 1640培养基）。细胞在37°C和5%（v/v）CO下繁殖2持续48小时，直到它们达到约70–80%的汇合点，此时将LysoTracker Red（DND-99）（分子探针，Invitrogen，目录号L7528）直接添加到最终浓度为100 n的培养基中米细胞与染料孵育1h，然后用含有0.1%（v/v）DMSO，10μ米氯硝柳胺，10μ米类似物，或100 n米雷帕霉素。细胞与药物在37°C和5%（v/v）CO下孵育2小时2，并在蔡司显微镜下观察LysoTracker染色。使用AxioCam HR相机采集图像，并使用Axiovert 4.8版软件进行分析。

体外mTORC1激酶检测

如前所述进行mTORC1激酶检测(58). 简单地说，MCF-7细胞在含有40 m的裂解缓冲液中的冰上裂解30 min米HEPES，pH 7.5，0.3%（w/v）CHAPS，120 m米氯化钠，1米米EDTA，10米米焦磷酸钠和10 m米β-甘油磷酸。通过10000×离心对裂解液进行预分离克使用猛禽抗体（Millipore，目录号09-217）从MCF-7细胞裂解液中免疫沉淀mTORC1复合物10分钟。免疫复合物用裂解缓冲液（如上所述）洗涤两次，然后用含有0.4的裂解缓冲液洗涤一次米NaCl和两个额外的带有激酶缓冲液的洗涤液（25 m米HEPES，pH 7.4，50 m米KCl，10米米氯化镁2). 重组4E-BP1之前是从GST融合中分离出来的，用作最终浓度为7.5 ng/μl的mTORC1底物。在含有250μl的激酶缓冲液中，在20μl反应体积内对固定化免疫复合物进行激酶反应米ATP。如有指示，在开始以指示浓度进行激酶分析之前，将免疫复合物与激酶缓冲液中的化学品孵育10分钟。激酶反应中含有相同浓度的抑制剂。反应在30°C下进行20分钟，并通过添加5×SDS-PAGE样品缓冲液停止。

特异性激酶面板

国家蛋白激酶谱分析中心（邓迪大学）使用[33P] ATP过滤器结合分析(59).

结果

氯硝柳胺独立于Akt、ERK和AMPK抑制mTORC1信号

我们之前已经证明氯硝柳胺(图1A类)通过未知机制抑制mTORC1信号(48). 氯硝柳胺降低Thr处4E-BP1的磷酸化37/46，序列号65和Thr70，它破坏eIF4F复合物的组装并消除p70的磷酸化S6K1系列在Thr389(48). 在本研究中，我们系统地评估了氯硝柳胺抑制mTORC1信号传导的几种潜在机制。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0231209520001.jpg

氯硝柳胺抑制mTORC1信号传导。 A类氯硝柳胺的结构。B类，MCF-7细胞在完全培养基中繁殖24小时，此时用10μ米氯硝柳胺在完全培养基中培养1、2或4小时。使用所示抗体通过免疫印迹分析细胞裂解产物。T-MOTIF公司、转向主题；T形回路theonine环；H（H），疏水；期限，终点站。

首先，我们检测了氯硝柳胺是否干扰了上游信号级联的激活，而上游信号级联通常参与对血清的mTORC1激活。我们首先测试氯硝柳胺在MCF-7细胞中阻断PKB/Akt信号的能力，这些细胞是根据S6K1蛋白水平升高而选择的(补充图1A) (60——62). MCF-7细胞暴露于10μ米氯硝柳胺降低血清刺激的p70磷酸化S6K1系列在几个地点，包括Thr389（疏水基序内），Ser371（在转弯图案内）和Thr421/序号424（靠近C终点站）(图1B类). 1小时后抑制作用明显，与氯硝柳胺孵育4小时后基本完全。

相比之下，暴露于氯硝柳胺增强了Thr时血清诱导的PKB/Akt磷酸化308（由3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）和473（由mTORC2催化）(图1B类)可能是由于连接S6K1和IRS-1的负反馈回路失活(63——65). Thr的磷酸化450（取决于mTORC2）在血清刺激或氯硝柳胺治疗后无变化(图1B类). 氯硝柳胺抑制mTORC1信号转导，同时增加mTORC2信号转导的观察排除了氯硝柳酰胺抑制mTOR1信号转导是由于阻断PKB/Akt信号通路所致的可能性。

MEK/ERK信号通路先前也与某些细胞类型中mTORC1的激活有关(66,67). 为了确定氯硝柳胺是否通过抑制MEK/ERK而损害mTORC1激活，我们使用抗Thr的磷酸特异性抗体监测了氯硝柳酰胺处理的MCF-7细胞中的MEK活性202/提尔204ERK1/ERK2上。PD184352能有效阻断ERK磷酸化，而氯硝柳胺没有(补充图1B). MAPK相互作用激酶Mnk1和Mnk2分别被ERK和p38丝裂原活化蛋白激酶α和β激活(68,69)和磷酸化Ser209在eIF4E上(70——72)，翻译启动机制的核心组件(73). 药物对Mnk1和Mnk2活性的抑制作用CGP57380型血清中eIF4E磷酸化显著降低209在MCF-7细胞中(补充图1C). 相反，氯硝柳胺在有效抑制mTORC1信号的浓度下使用时，并不影响Mnk催化活性(补充图1C). 这些数据表明，氯硝柳胺不会通过干扰MEK/ERK/Mnk信号来抑制mTORC1。

AMPK是电池中能量可用性的传感器。在ATP生成减少或消耗增加导致能量不足的情况下，AMPK被激活并抑制mTORC1以限制消耗高水平ATP的细胞过程，如蛋白质合成(74). AMPK在Thr上的磷酸化172LKB1显著提高AMPK的催化活性(75)广泛用作AMPK酶活性的读数。为了测试氯硝柳胺是否通过模拟能量应激抑制mTORC1信号，将MCF-7细胞与10μ米氯硝柳胺，100 n米雷帕霉素，或20米米二甲双胍；后者可以增加AMP和AMPK活性的细胞溶质水平(76). 二甲双胍增加Thr172磷酸化，但雷帕霉素和氯硝柳胺没有(补充图1D). 因此，氯硝柳胺不会通过激活AMPK来抑制mTORC1信号。

氯硝柳胺不影响mTOR与猛禽的结合或mTORC1的体外催化活性

因为氯硝柳胺似乎不抑制mTORC1上游的主要控制途径，我们接下来检查它是否直接干扰mTORC2组装。之前已经证明雷帕霉素在含磷缓冲液中破坏mTOR与猛禽的结合(27,28)通过一种特征不佳的机制。为了确定氯硝柳胺是否同样影响mTOR受体结合，用雷帕霉素或氯硝柳酰胺处理的细胞获得的裂解物进行猛禽抗体免疫沉淀，并用Western blot检测免疫沉淀中的猛禽和mTOR。急性雷帕霉素治疗导致mTOR与猛禽分离(补充图2A，上部面板)与早期研究一致(27,28). 相比之下，氯硝柳胺并没有引起猛禽mTOR的任何可测量的分离(补充图2A，上部面板). 裂解物的免疫印迹证实，根据在Thr处S6K1缺乏磷酸化来判断，用两种药物处理的细胞中mTORC1信号被抑制389/412(补充图2A，下部面板). 因此，氯硝柳胺不会通过破坏mTOR-受体结合来损害mTORC1信号。

为了确定氯硝柳胺是否直接抑制mTORC1的催化活性，用不同浓度的氯硝柳酰胺预孵育猛禽免疫沉淀物。然后将细菌表达的重组4E-BP1添加到存在ATP的免疫沉淀中。4E-BP1的磷酸化通过使用针对Thr的磷酸特异性抗体的蛋白质印迹来监测第37页，共46页氯硝柳胺对mTORC1活性无明显影响在体外在任何测试浓度下，Torin1、PP242和雷帕霉素-FKBP12复合物都能有效抑制mTORC1激酶活性(补充图2B). 猛禽免疫沉淀物的免疫印迹证实在所有反应中存在等量的猛禽和mTOR(补充图2B). 综上所述，这些数据表明氯硝柳胺抑制mTORC1信号传导，但不直接阻断mTORC1-激酶活性，也不破坏mTOR-受体关联。

另外对氯硝柳胺进行了测试在体外针对95种蛋白激酶，在1或10μ米(补充表1). 这些浓度可有效抑制细胞内mTORC1信号传导，表明氯硝柳胺的作用机制可能不是直接抑制激酶。

氯硝柳胺具有原核活性

氯硝柳胺是一种用于治疗寄生虫感染的水杨酸苯胺衍生物。氯硝柳胺的作用机制尚不清楚，但其抗寄生虫特性被认为是由于该药物能够通过生物膜运输质子（以下称为原核吞噬活性），从而破坏寄生虫的pH稳态(52). 接下来，我们使用无细胞系统检查氯硝柳胺是否显示原核活性。IMV由大肠杆菌缺乏功能性F的应变0/F类1ATP酶可以通过其电子传输链建立质子梯度(55). 事实上，通过pH敏感染料9-氨基-6-氯-2-甲氧基克里丁的荧光降低来测量，向IMV中添加NADH会导致IMV管腔快速酸化(图2C类). 随后用氯硝柳胺或特征良好的原菌羰基氰化物挑战pH梯度第页-氯苯腙。1μ米，均为羰基氰化物第页-氯苯腙和氯硝柳胺迅速消散了pH梯度，表明氯硝柳酰胺是一种有效的原生质体。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0231209520002.jpg

氯硝柳胺类似物的原核活性及其对mTORC1信号传导的影响。 A类，模型显示氯硝柳胺的中性和阴离子形式，以及使阴离子形式的负电荷离域以保持其疏水性的结构特征。B类氯硝柳胺类似物1-5的结构。C类和D类原核细胞活性测定。NADH（1米米)在IMV中指定的时间添加箭头以产生pH梯度。一分钟后，在1μ米使用9-氨基-6-氯-2-甲氧基克里丁监测pH值的变化(美国汽车制造商协会)荧光。E类和F类用指定浓度的氯硝柳胺或30 n米雷帕霉素(拉帕牌手表)在含有10%（v/v）FBS的完全培养基中培养4h。用指示的抗体检测细胞裂解物。美国。，吸光度单位；CCCP公司，羰基氰化物第页-氯苯腙。

氯硝柳胺类似于特征明确的原核细胞S13(77——79). 基于S13模型(80)，赋予氯硝柳胺原卟啉活性的结构基团是具有pK（K）一在生理pH值范围内，以及许多有助于使分子阴离子形式的负电荷离域以保持其疏水性和膜结合的化学特征，如吸电子NO2参与分子内氢键的部分和NH基团(图2A类). 为了通过实验验证这些预测，我们合成并测试了五种类似物(图2B类). 模拟物1缺乏OH基团，因此没有可分离质子，缺乏原核活性(图2C类). OH基团位于中间位置以防止氢键与NH基团结合的模拟物2也缺乏原核活性(图2C类).O（运行）-缺少可解离质子的Me类似物3也完全不活跃，而缺少强吸电子硝基的Me模拟物4使可解离的质子不那么酸性(图2D类). 最后，模拟5带有N个-甲基取代基不能形成维持氯硝柳胺阴离子形式疏水性所需的分子内氢键，也完全没有质子引发活性在体外(图2D类). 这些结果与Terada完全一致(78)原虫活动模型。

抑制mTORC1信号也需要原核活性所需的氯硝柳胺的结构特征

在确定了原核细胞活性所需的结构特征后，我们接下来评估了每个类似物在MCF-7细胞中减少mTORC1信号的能力(图2,E类和F类). 在1μ米氯硝柳胺在该浓度下能有效抑制mTORC1信号传导。在所有测试浓度下，类似物1、3和5均完全不活跃。模拟物2的可解离质子位于中间位置，模拟物4缺乏硝基，仅在高浓度下表现出活性。因此，氯硝柳胺对原核细胞活性的结构要求与mTORC1抑制所需的结构要求非常相似。每种氯硝柳胺类似物还测试了其调节自噬和抑制细胞增殖的能力。值得注意的是，抑制mTORC1信号传导所需的氯硝柳胺的化学特征对于调节自噬和抑制增殖也至关重要(补充图3、A和B)与mTORC1在自噬和细胞增殖中的既定作用一致(8,49).

氯硝柳胺诱导细胞质酸化

众所周知，即使细胞在生理pH值的培养基中维持，原核菌也会在质膜内负电位的驱动下诱导细胞质酸化，迫使质子向内流动(81). 因此，我们使用pH敏感染料BCECF检测氯硝柳胺是否能诱导细胞质酸化。将细胞从碳酸氢盐缓冲生长培养基切换到pH测量方案中使用的HEPES缓冲溶液，导致细胞质pH值从实验开始时的7.4±0.09缓慢下降到7.04±0.03的新静息pH值(图3A类)与碳酸氢盐依赖的酸挤压机制的存在相一致，该机制有助于维持MCF-7细胞内稳定的细胞内pH值。添加10μ米氯硝柳胺导致胞质溶胶迅速酸化，达到6.61±0.05的新稳定状态(图3A类). 氯硝柳胺引起的酸化持续了2小时，这是有记录以来最长的时间（数据未显示）。相比之下，暴露于10μ米模拟物1或2对细胞质pH值没有显著影响(图3A类).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0231209520003.jpg

氯硝柳胺引起快速细胞质酸化。将装有BCECF的MCF-7细胞与HEPES缓冲盐水混合，在实验过程中测量细胞质pH值。每条轨迹显示了从三个独立实验中获得的平均细胞内pH值，每个实验至少包括30个细胞。A类，MCF-7细胞与含有0.2%二甲基亚砜（载体）的生理盐水混合，10μ米氯硝柳胺，10μ米模拟1或10μ米模拟2，时间由箭头所示。B类，将MCF-7细胞与等渗HEPES缓冲盐水（含50 m米KCl表示“50米米K（K）+”酒吧氯硝柳胺（10μ米)然后在“药物”酒吧在最后3分钟，用HEPES缓冲盐水冲洗KCl。C类，将MCF-7细胞与含有10μ米氯硝柳胺在箭头和50米米KCl溶液的时间由50米米K（K）+ 酒吧然后在HEPES缓冲盐水中进行冲洗。D类，将MCF-7细胞与含有0.2%（v/v）DMSO，1μ米FCCP，或1μ米TFA9在箭头所示。E类MCF-7细胞在完全培养基中培养至接近汇合处，此时细胞在DMSO（载体）、雷帕霉素的存在下切换至新鲜完全培养基(拉帕)（100牛顿米)或不同浓度的TFA9和FCCP 2 h。然后对细胞进行裂解，并用所示抗血清对裂解产物进行mTORC1激活分析。F类，将MCF-7细胞与100 n米雷帕霉素的使用时间毒品吧取下药物后，将细胞暴露于含50 m的盐水中米全日空航空公司4Cl表示“全日空航空公司4氯”酒吧然后在HEPES缓冲盐水溶液中冲洗。

可以通过在含有高[K的等渗培养基中孵育细胞来降低膜电位+]. 存在高[K+]（50米米)氯硝柳胺降低细胞质pH值的能力显著降低(图3B类)当细胞被转移回含有钠的生理盐水条件下时，它迅速重建+(图3B类). 类似地，转移到高[K+]添加氯硝柳胺后，部分逆转了细胞质酸化(图3C类)这表明氯硝柳胺持续的细胞溶质酸化需要持续的膜电位。然而，去极化并没有完全消除氯硝柳胺诱导细胞溶质酸化的能力(图3C类)表明细胞内储存的质子释放也可能是氯硝柳胺依赖性细胞质酸化的一个促成因素。我们探索了细胞内质子储存对胞浆酸化的贡献，详情如下。

氯硝柳胺胞质酸化所需结构特征的观察(图3A类)与抑制mTORC1信号所需的相似(图2E类)提出氯硝柳胺通过诱导胞浆酸化抑制mTORC1信号传导的可能性。为了测试这种可能性，我们询问在结构上与氯硝柳胺不同的原核菌是否也能抑制mTORC1。用特征良好的原核菌羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）和酪朊蛋白A9（TFA9）培养细胞，如预期的那样迅速降低MCF-7细胞的细胞质pH值(图3D类). 有趣的是，FCCP和TFA9都能有效降低p70S6K1系列低微摩尔浓度下的磷酸化(图3E类). 三种结构不同的化学物质导致细胞内酸化并抑制mTORC1，这一观察强烈证明，原核细胞活性是导致这些效应的机制，而不是对其他无关靶点的结构特异性效应。

迄今为止获得的数据与氯硝柳胺抑制mTORC1信号传导导致的细胞质酸化相一致，也与细胞质酸化是mTORC抑制的结果的可能性相一致。为了区分这些可能性，用雷帕霉素培养MCF-7细胞，用BCECF追踪细胞质pH值。雷帕霉素对细胞质pH值无影响(图3F类). 细胞质pH值对弱碱氨（50 m）敏感米全日空航空公司4Cl），表明细胞对细胞外pH值的变化保持反应。尽管雷帕霉素对调节细胞pH值无效，但在10分钟内有效地消除了mTORC1信号（数据未显示）。这些数据表明氯硝柳胺降低细胞质pH值的能力不是mTORC1抑制的结果。相反，我们关于FCCP和TFA9的数据表明，事实可能恰恰相反；即。原核生物介导的细胞质酸化导致mTORC1抑制。

氯硝柳胺消除溶酶体-细胞质pH梯度

氯硝柳胺和其他原核菌不仅作用于质膜，也作用于细胞内膜，将质子从酸性细胞器释放到胞浆中。事实上，某些原核细胞在跨内膜扩散质子梯度方面比跨质膜更有效；羰基氰化物就是这样第页-酵母中的氯苯腙(82). 接下来，我们询问细胞内质子储存是否有助于氯硝柳胺介导的细胞质酸化。

溶酶体是细胞中酸性最强的细胞器，pH值在4.5到4.7之间(83)，是潜在的细胞内质子源，并且考虑到mTORC1定位于溶酶体表面(84)如此吸引人。为了验证溶酶体是否有助于氯硝柳胺依赖性细胞质酸化，用溶酶体高选择性的嗜酸荧光染料LysoTracker Red监测MCF-7细胞溶酶体pH值(85). 载体处理的细胞显示出大小不等的明亮荧光点状结构(图4A类,DMSO面板). MCF-7细胞暴露于氯硝柳胺后，点状荧光显著降低，表明该药物在溶酶体膜上消散质子梯度(图4A类,氯硝柳胺板). 有趣的是，点状染色的减少伴随着弥散细胞质荧光的增加，这与我们的观察一致，即氯硝柳胺会导致细胞质酸化。正如预期的那样，氯硝柳胺类似物1、2、3和5对点状LysoTracker荧光没有明显影响，这与它们缺乏原核蛋白活性一致(图4A类). 氯硝柳胺类似物4引起弥散细胞质溶菌酶跟踪器荧光的轻微但可检测到的增加(图4A类)和mTORC1信号的部分抑制(图2F类和​和44B类). 浓度较高时为30μ米，类似物4显示出更清晰的扩散细胞质荧光和强烈的mTORC1抑制(补充图4).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0231209520004.jpg

氯硝柳胺将质子从溶酶体释放到细胞质。将MCF-7细胞在完全培养基中培养48 h。然后将LysoTracker染料以最终浓度100 n添加到细胞中米细胞与LysoTracker孵育1h，然后用含有DMSO，10μ米氯硝柳胺或等摩尔量的每种类似物持续2h。通过宽场荧光显微镜观察LysoTracker染色(A类)，然后对细胞进行裂解和p70分析S6K1系列磷酸化(B类).比例尺，100μm。

溶酶体碱化不影响mTORC1信号传导

在定稿时，Zoncu进行了一项优雅的研究等。(86)证明了液泡质子ATP酶（v-ATP酶），即负责保持溶酶体腔酸性的质子泵，在mTORC1激活中起着重要作用。用v-ATP酶抑制剂（如康那霉素A或水杨酰亚胺A）处理HEK293T细胞可抑制S6K1的氨基酸依赖性磷酸化(86). v-ATP酶在溶酶体酸化和mTORC1激活中起关键作用，这一事实提出了一种有趣的可能性，即氯硝柳胺对mTORCl的抑制作用源于该药物提高溶酶体pH值的能力，用不同浓度的巴非霉素A处理MCF-7细胞1，一种与刀豆霉素a密切相关的有效v-ATP酶抑制剂(87)用LysoTracker染料监测溶酶体pH值。亚微摩尔浓度（0.3μ米)巴非霉素A1完全废除点状LysoTracker染色(图5A类). 然而，这种浓度的巴非霉素A1对p70的影响很小S6K1系列磷酸化(图5B类). 这一结果与溶酶体pH值在控制mTORC1信号传导中的作用相矛盾。更高（10μ米)巴非霉素A的浓度1有效减少mTORC1信号(图5B类)与报告一致，抑制mTORC1需要类似浓度的康那霉素A(86). 有趣的是，我们观察到暴露于高浓度巴非霉素A的细胞1与用亚摩尔浓度的巴非霉素A处理的细胞相比，显示更强的弥漫性细胞质染色1(图5A类). 此外，不同浓度的巴非霉素A对mTORC1的抑制程度1与细胞质酸化相关(图5,比较A和B类).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0231209520005.jpg

溶酶体pH值不调节mTORC1信号传导。将MCF-7细胞在完全培养基中培养48 h。然后将LysoTracker染料以最终浓度100 n添加到细胞中米细胞与LysoTracker孵育1h，然后用含有DMSO，10μ米氯硝柳胺或指定浓度的巴非霉素A12小时后，用宽视野荧光显微镜观察LysoTracker染色(A类)，然后对细胞进行裂解和p70分析S6K1系列磷酸化(B类).比例尺，100微米。

细胞质酸化导致mTORC1信号传导抑制

我们小组以前的一项研究表明，将细胞暴露在酸性外部pH值下会导致细胞质酸化并抑制mTORC1信号传导（参考文献。88; 另请参见图6). 然而，外部和细胞质酸性pH值对mTORC1抑制的相对贡献没有被研究。氯硝柳胺和其他原虫在维持生理外界pH值的细胞中诱导细胞质酸化并抑制mTORC1信号传导的观察结果表明，后者可能就足够了。接下来，我们试图在不改变细胞外pH的情况下使用丙酸诱导细胞质酸化，丙酸是一种短链脂肪酸，可以以中性形式通过膜扩散，并在质子解离时被困在细胞内，从而导致细胞内酸化(89). 将MCF-7细胞暴露于含有丙酸盐的细胞培养基（pH 7.3）中1或4小时，并将p70磷酸化S6K1系列在Thr389被监控。抑制p70S6K1系列磷酸化在1小时内观察到，并持续至少4小时(图7A类)表明降低细胞质pH值足以削弱mTORC1信号传导。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0231209520006.jpg

细胞外酸化抑制mTORC1信号传导。MCF-7细胞在完全培养基中培养48小时，此时将细胞转移到只缺少碳酸氢钠（调整到所示的pH值）的完全培养基，在37°C的CO中培养30分钟2-自由条件。使用所示抗血清分析裂解产物的mTORC1激活。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0231209520007.jpg

细胞质酸化抑制mTORC1信号传导。 A类，MCF-7细胞在完全培养基中增殖至接近汇合处，然后用10μ米氯硝柳胺；50米米丙酸，pH值7.3；和/或25μ米在含有10%（v/v）FBS的完整培养基中进行1或4小时的EIPA（详见“实验程序”）。用抗磷酸化和总p70的抗血清通过免疫印迹分析细胞裂解物的mTORC1活化S6K1系列.B类，MCF-7细胞在完全培养基（含有碳酸氢钠）中繁殖至接近汇合，然后在存在或不存在浓度增加的EIPA（25、50和100μ米). 细胞在裂解前用EIPA培养1小时。用所示抗血清分析裂解产物的mTORC1和mTORC2活化。C类，细胞与100 n孵育米雷帕霉素或10μ米氯硝柳胺在含有或不含碳酸氢钠的完全培养基中培养1小时，并分析mTORC1和mTORC2的活化情况。D类MCF-7细胞在完全培养基（含碳酸氢钠）中培养48小时，直至接近汇合处，然后在25μ米EIPA和/或碳酸氢钠1小时。使用所示抗血清分析裂解产物的mTORC1激活。

NHE1是一种完整的质膜蛋白，通过挤压积聚在细胞质中的质子，在维持细胞内pH稳态方面起着重要作用(90). 接下来，我们询问抑制NHE1是否同样减少了mTORC1信号。NHE1抑制剂EIPA本身并没有降低p70S6K1系列孵育1h后磷酸化。相比之下，长时间（4小时）接触EIPA对p70的抑制作用很小S6K1系列磷酸化(图7A类). 丙酸盐和EIPA的结合有效地降低了p70S6K1系列4h磷酸化(图7A类).

类似地，将细胞切换到无碳酸氢盐介质和大气CO导致的细胞质酸化2导致p70降低S6K1系列30分钟内磷酸化(图7B类). 添加EIPA进一步降低p70S6K1系列无碳酸氢盐/CO时的磷酸化2(图7B类). 重要的是，mTORC2的活化不受碳酸氢盐/CO的影响2或EIPA暴露，表明pH调节的抑制作用仅限于mTORC1信号(图7B类). 氯硝柳胺与碳酸氢盐/CO联用2戒断对mTORC1信号的抑制作用强于单独治疗(图7C类)而氯硝柳胺、EIPA和碳酸氢盐/CO的三重组合2退出进一步抑制了mTORC1信号(图7D类). 综上所述，这些数据支持细胞质pH值在控制mTORC1信号传导中的直接作用。

TSC2和Rheb不参与氯硝柳胺或pH对mTORC1信号的调节

结节性硬化复合体（TSC）由GTPase激活蛋白TSC2和支架蛋白TSC1组成，在控制mTORC1对生长因子和其他环境信号的反应中发挥重要作用(91,92). TSC调节小G蛋白Rheb的GTP负荷(93)，进而通过一个不完全理解的机制激活mTORC1。我们试图研究氯硝柳胺是否通过TSC降低mTORC1信号。缺乏血清的TSC2敲除MEF显示出高基础mTORC1激活（参考文献。94; 另请参见图8A类). 氯硝柳胺有效地阻断了野生型和TSC2敲除MEF中基础和血清诱导的mTORC1激活（参考文献。48; 另请参见图8A类)证明氯硝柳胺独立于TSC抑制mTORC1信号。我们还验证了氯硝柳胺是否通过调节Rheb GTP负荷来抑制mTORC1活性。为了解决这一点，我们利用了Rheb上的Q64L突变，使其组成性GTP结合，因此具有组成性活性。如果氯硝柳胺通过调节GTP结合的Rheb的水平来抑制mTORC1信号传导，那么Rheb Q64L的过表达应该阻断氯硝柳胺对mTORC1的影响。如预期，Rheb Q64L增强了p70S6K1系列缺血清MCF-7细胞的磷酸化(图8B类). 氯硝柳胺保留其在Rheb Q64L过度表达细胞中阻断mTORC1激活的能力。因此，无论Rheb的GTP负载状态如何，该药物都能阻断mTORC1信号(图8B类). 这些数据与TSC2-null MEF获得的数据一致，表明氯硝柳胺独立于TSC2抑制mTORC1信号(图8A类).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为zbc0231209520008.jpg

氯硝柳胺和细胞外pH值独立于TSC2和Rheb调节mTORC1信号。 A类、TSC2+/+/第53页−/−和TSC2−/−/第53页−/−将MEF接种在完整的培养基中，并允许其繁殖24小时，然后将细胞饥饿血清20小时米氯硝柳胺或100n米雷帕霉素用于血清饥饿的最后3h。在血清饥饿/药物治疗后，用10%（v/v）的血清刺激细胞30分钟，然后按照“实验程序”进行裂解。分析裂解产物的mTORC1激活和TSC2水平。还检测了裂解液中的β-肌动蛋白作为负荷控制。B类，将MCF-7细胞接种在完全培养基中，并允许其繁殖24小时，此时用2μg pRK7 FLAG Rheb Q64L或相应的pRK7空载体转染细胞(电动汽车。). 转染后，将细胞再培养24小时，以允许Rheb Q64L表达，然后将细胞饥饿血清20小时米氯硝柳胺或100n米雷帕霉素用于血清饥饿的最后3h。然后用10%（v/v）血清刺激细胞30分钟，然后对其进行裂解，并对裂解产物进行mTORC1激活分析。C类、TSC2+/+/第53页−/−和TSC2−/−/第53页−/−MEF在完全培养基中播种并繁殖至接近汇合处，此时用无碳酸氢盐培养基（调整至不同pH值）替换生长培养基，并添加10%（v/v）血清（细胞在CO中用无碳酸酯培养基培养1h2-自由条件）。然后对细胞进行裂解，并用所示抗血清对裂解产物进行mTORC1激活分析。D类，氯硝柳胺介导的细胞质酸化和mTORC1抑制的潜在模型示意图。

由于TSC2对氯硝柳胺介导的mTORC1抑制作用是不必要的，我们想知道TSC2是否对酸中毒的mTORC抑制作用也是不必要的。如所示图8C类将细胞外培养液酸化至pH值6，可抑制野生型和TSC2-null MEF的mTORC1信号，这与我们的上述数据一致，表明氯硝柳胺可独立于TSC2抑制mTORCl信号。

讨论

近年来，针对mTOR催化活性的新型mTORC1抑制剂（在结构上与雷帕霉素不同）的开发引起了极大兴趣(41——43)其中一些可能具有治疗价值(95). 鉴定具有治疗潜力的mTORC1信号抑制剂的另一种方法是筛选已经批准用于人类的药物。这是一个有吸引力的策略，因为它大大减少了药物开发的时间和成本，因为药代动力学和安全性特征已经建立(96,97). 在本研究中，我们发现抗寄生虫药物氯硝柳胺在低至1μ米。氯硝柳胺是用来消灭肠道内腔中的寄生虫的，并不是用来通过肠道吸收的。然而，在大鼠标准口服剂量为5 mg/kg后，一小部分被吸收，导致1.08μ米血清浓度(98)，在抑制mTORC1的范围内。

氯硝柳胺对mTORC1有选择性抑制作用，其他实验表明氯硝柳酰胺不影响MEK/ERK或LKB1/AMPK信号传导。氯硝柳胺不抑制mTORC1或95其他蛋白激酶在体外表明它必须间接抑制mTORC1，不像最近开发的活性位点mTOR抑制剂。氯硝柳胺的化学性质检查表明，它具有原核菌的独特特征，包括一个弱酸性OH基团，可以在生理pH范围内可逆地结合质子，一个用于膜溶解度的庞大疏水部分，和吸电子部分，使阴离子形式的原藻体的负电荷离域，使其与膜保持联系(78,79). 这些特性使这些化学物质能够嵌入质膜和细胞内膜，并进行快速的质子结合和释放循环，从而降低跨膜质子梯度。我们验证了氯硝柳胺确实能够快速消散质子梯度穿过从大肠杆菌.

我们在氯硝柳胺和五种类似物中观察到，原核细胞活性和mTORC1信号传导抑制之间存在紧密的相关性，从而提出mTORCl抑制实际上是由原核细胞活动引起的可能性。TFA9和FCCP在结构上与氯硝柳胺不同，但具有良好的原核菌特征，也能快速有效地抑制mTORC1，这有力地支持了这一观点。

原核菌能够抑制线粒体中电子传递和氧化磷酸化之间的耦合，从而抑制ATP合成(99). 然而，mTORC1的抑制不是ATP耗竭的结果，因为氯硝柳胺不能降低细胞ATP水平(48)也没有激活AMPK。质子孔也被认为可以通过质膜运输质子(77)并且通过主要由跨过质膜的电化学质子梯度驱动的机制引起净向内质子运动。与FCCP和TFA9一样，氯硝柳胺确实导致快速可逆的细胞质酸化，酸化的pH值高达0.5–1单位。我们试图通过使用广泛用于诱导细胞质酸化的弱酸丙酸来确定细胞质酸化是否足以抑制mTORC1。丙酸暂时抑制mTORC1信号传导，支持我们的模型，即细胞质pH值调节mTORC1。然而，该实验的一个警告是，丙酸盐也可以通过与G蛋白偶联受体GPR41和-43结合以及激活细胞内信号级联而发挥信号分子的作用，这些信号级联可能独立于pH值影响mTORC1(100). 然而，丙酸对mTORC1的抑制作用通过与NHE1抑制剂EIPA共同孵育而增强，该抑制剂可减少质子从细胞中挤出，这一观察结果表明，细胞质酸化可能与氯硝柳胺的作用机制有关。此外，我们最近发现细胞外介质酸化，导致细胞内快速酸化(88)，抑制mTORC1信号。在该研究中，酸性细胞外pH值是否直接控制mTORC1或作为细胞质酸化的结果未进行检查(88)，但这里的实验表明，细胞内酸化足以抑制mTORC1信号。

原核细胞可以通过酸性细胞内小泡消散质子梯度(例如溶酶体（pH 4.7）、晚期内体（pH 5.5）或早期内体（pH6.3））。溶酶体在控制mTORC1信号传导中起着关键作用：mTORC2已被证明定位于溶酶体(84)，溶酶体定位本身已被证明可以协调mTORC1的激活(101)v-ATP酶在氨基酸激活mTORC1中起主要作用(86). 因此，我们检测了溶酶体pH值是否也在mTORC1调节中发挥作用。我们的数据表明，尽管v-ATP酶对mTORC1的激活起关键作用，溶酶体的pH值并不调节mTORCl信号传导，这与Zoncu的发现一致等。(86).

总之，本研究表明，细胞质酸化可发生在生理和病理条件下(83)，抑制mTORC1信号。我们提出的氯硝柳胺介导的mTORC1抑制机制描述如下图8D类尽管还需要更多的工作来阐明质子在胞质溶胶中的积累如何沉默mTORC1信号传导，但到目前为止，我们已经表明TSC和Rheb对于mTORC1通过pH调节是可有可无的。本研究揭示了一种涉及细胞质酸化的mTORC1信号传导的重要化学抑制新模式。

补充材料

补充数据：

致谢

我们感谢Hilary McLauchlan博士和英国邓迪大学（苏格兰）信号转导治疗部成员进行体外蛋白激酶检测选择性筛选，感谢Thibault Mayor博士、John Church博士、Maritza Jaramillo博士和。希拉里·安德森（Hilary Anderson）对这份手稿进行了有益的讨论和批判性阅读。

*这项工作得到了加拿大乳腺癌基金会（给M.R.）和加拿大癌症协会（给N.S.）的部分资助。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文包含补充图1-4和表1.

5使用的缩写如下：

mTOR公司
雷帕霉素的哺乳动物靶点
4E-BP1型
eIF4E结合蛋白1
AMPK公司
一磷酸腺苷活化蛋白激酶
BCECF公司
2′，7′-双（2-羧乙基）-5（6）-羧基荧光素
EGFP-LC3
增强型绿色荧光蛋白-轻链3融合蛋白
催化裂化装置
羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙
FKBP12型
FK506结合蛋白12
MCF-7型
MI癌症基金会7号线
MEF公司
小鼠胚胎成纤维细胞
Mnk公司
MAPK相互作用激酶或MAPK信号整合激酶
mTORC公司
mTOR复合体
PKB/Akt公司
蛋白激酶B/急性转化逆转录病毒AKT8在啮齿动物T细胞淋巴瘤中的表达
法国试验标准
神经纤维蛋白
PTEN公司
10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物
猛禽
mTOR的调节相关蛋白
S6K1系列
核糖体蛋白S6激酶1
TFA9型
酪蛋白A9
TSC公司
结节性硬化综合征
欧洲投资保护局
5-(N个-乙基-N个-异丙基氨氯）
国际货币基金组织
倒置内膜囊泡
v-ATP酶
液泡质子ATP酶。

参考文献

1Facchinetti V.、Ouyang W.、Wei H.、Soto N.、Lazorchak A.、Gould C.、Lowry C.、Newton A.C.、Mao Y.、Miao R.Q.、Sessa W.C.、Qin J.、Zhang P.、Su B.、Jacinto E.（2008）雷帕霉素复合物2的哺乳动物靶点控制Akt和蛋白激酶C的折叠和稳定性.EMBO J。 27, 1932–1943[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
2García-Martínez J.M.，Alessi D.R.（2008）mTOR复合物2（mTORC2）控制血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶1（SGK1）的疏水基序磷酸化和活化.生物化学。J。 416, 375–385 [公共医学][谷歌学者]
3Sarbassov D.D.、Guertin D.A.、Ali S.M.、Sabatini D.M.（2005）rictor-mTOR复合物对Akt/PKB的磷酸化及调控.科学类 307, 1098–1101 [公共医学][谷歌学者]
4Hresko R.C.、Mueckler M.（2005）mTOR·RICTOR是3T3-L1脂肪细胞中Akt/蛋白激酶B的Ser473激酶.生物学杂志。化学。 280, 40406–40416 [公共医学][谷歌学者]
5Ikenoue T.、Inoki K.、Yang Q.、Zhou X.、Guan K.L.（2008）TORC2在PKC和Akt-turn基序磷酸化、成熟和信号传递中的基本功能.EMBO J。 271919年至1931年[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Guertin D.A.、Stevens D.M.、Thoreen C.C.、Burds A.A.、Kalaany N.Y.、Moffat J.、Brown M.、Fitzgerald K.J.、Sabatini D.M.（2006）在小鼠中对mTORC成分猛禽、rictor或mLST8的消融表明，mTORC2是向Akt-FOXO和PKCα发出信号所必需的，而不是S6K1.开发单元 11, 859–871 [公共医学][谷歌学者]
7Yan L.、Mieulet V.、Lamb R.F.（2008）mTORC2是SGK1的疏水基序激酶.生物化学。J。 416，e19–21[公共医学][谷歌学者]
8Dowling R.J.、Topisirovic I.、Alain T.、Bidinosti M.、Fonseca B.D.、Petroulakis E.、Wang X.、Larsson O.、Selvaraj A.、Liu Y.、Kozma S.C.、Thomas G.、Sonenberg N.（2010）mTORC1介导细胞增殖，但不是细胞生长，由4E-BP控制.科学类 328, 1172–1176[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9Burnett P.E.、Barrow R.K.、Cohen N.A.、Snyder S.H.、Sabatini D.M.（1998）翻译调节因子p70 S6激酶和4E-BP1的RAFT1磷酸化.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 95, 1432–1437[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10Yu Y.，Yoon S.O.，Poulogiannis G.，Yang Q.，Ma X.M.，Villn J.，Kubica N.，Hoffman G.R.，Cantley L.C.，Gygi S.P.，Blenis J.（2011）磷蛋白组学分析确定Grb10是负调节胰岛素信号的mTORC1底物.科学类 332, 1322–1326[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Hsu P.P.、Kang S.A.、Rameseder J.、Zhang Y.、Ottina K.A.、Lim D.、Peterson T.R.、Choi Y.、Gray N.S.、Yaffe M.B.、Marto J.A.、Sabatini D.M.（2011）mTOR调节的磷酸蛋白质组揭示了mTORC1介导的生长因子信号传导抑制机制.科学类 332, 1317–1322[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Yea S.S.，Fruman D.A.（2011年）细胞信号。新的mTOR目标是引起Grb的关注.科学类 332, 1270–1271 [公共医学][谷歌学者]
13Neshat M.S.、Mellinghoff I.K.、Tran C.、Stiles B.、Thomas G.、Petersen R.、Frost P.、Gibbons J.、Wu H.、Sawyers C.L.（2001）PTEN缺乏肿瘤对FRAP/mTOR抑制的敏感性增强.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 98, 10314–10319[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Kwiatkowski D.J.、Zhang H.、Bandura J.L.、Heiberger K.M.、Glogauer M.、el-Hashemite N.、Onda H.（2002）TSC1小鼠模型揭示了肝血管瘤的性别依赖性致死性，以及TSC1阴性细胞中p70S6激酶活性的上调.嗯，分子遗传学。 11, 525–534 [公共医学][谷歌学者]
15Kenerson H.L.、Aicher L.D.、True L.D.和Yeung R.S.（2002）雷帕霉素通路激活的哺乳动物靶点在结节性硬化症复杂肾肿瘤发病中的作用.癌症研究。 62, 5645–5650 [公共医学][谷歌学者]
16Onda H.、Crino P.B.、Zhang H.、Murphey R.D.、Rastelli L.、Gould Rothberg B.E.、Kwiatkowski D.J.（2002）Tsc2缺失的小鼠神经上皮细胞是人类结节巨细胞的模型，并显示mTOR通路的激活.分子细胞。神经科学。 21, 561–574 [公共医学][谷歌学者]
17Corradetti M.N.、Inoki K.、Bardeesy N.、DePinho R.A.、Guan K.L.（2004）LKB1对TSC通路的调节：结节性硬化综合征与Peutz-Jeghers综合征之间分子联系的证据.基因发育。 18，1533年至1538年[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Shaw R.J.、Bardeesy N.、Manning B.D.、Lopez L.、Kosmatka M.、DePinho R.A.、Cantley L.C.（2004）LKB1抑癌基因负调控mTOR信号.癌细胞 6, 91–99 [公共医学][谷歌学者]
19Johannessen C.M.、Reczek E.E.、James M.F.、Brems H.、Legius E.、Cichowski K.（2005）NF1肿瘤抑制因子对TSC2和mTOR的调节至关重要.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 102, 8573–8578[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Huang X.、Wullschleger S.、Shpiro N.、McGuire V.A.、Sakamoto K.、Woods Y.L.、McBurnie W.、Fleming S.、Alessi D.R.（2008）LKB1-AMPK通路在抑制PTEN缺乏小鼠肿瘤发生中的重要作用.生物化学。J。 412, 211–221 [公共医学][谷歌学者]
21SekulićA.、Hudson C.C.、Homme J.L.、Yin P.、Otterness D.M.、Karnitz L.M.、Abraham R.T.（2000）有丝分裂原刺激和转化细胞中磷酸肌醇3-激酶-AKT信号通路与哺乳动物雷帕霉素靶点之间的直接联系.癌症研究。 60, 3504–3513 [公共医学][谷歌学者]
22Fan Q.W.、Cheng C.、Knight Z.A.、Haas-Kogan D.、Stokoe D.、James C.D.、McCormick F.、Shokat K.M.、Weiss W.A.（2009）胶质瘤中EGFR通过PKC独立于Akt向mTOR信号.科学。信号。 2，ra4。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23福布斯S.A.、巴姆拉G.、班福德S.、道森E.、科克C.、克莱门茨J.、孟席斯A.、提格J.W.、未来P.A.、斯特拉顿M.R.（2008）癌症体细胞突变目录（COSMIC）.货币。Protoc公司。嗯，遗传学。 第10章，10.11单元[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
24Sato T.、Nakashima A.、Guo L.、Coffman K.、Tamanoi F.（2010）在人类癌症中发现了赋予mTOR组成型激活的单一氨基酸变化.癌基因 29，2746–2752[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Choi J.、Chen J.、Schreiber S.L.、Clardy J.（1996）与人FRAP结合域相互作用的FKBP12-雷帕霉素复合物的结构.科学类 273, 239–242 [公共医学][谷歌学者]
26Liang J.、Choi J.和Clardy J.（1999）2.2Å分辨率下FKBP12-雷帕霉素-FRB三元配合物的精细结构.《水晶学报》。D生物结晶仪。 55, 736–744 [公共医学][谷歌学者]
27Kim D.H.、Sarbassov D.D.、Ali S.M.、King J.E.、Latek R.、Erdjument-Bromage H.、Tempst P.、Sabatini D.M.（2002）mTOR与猛禽相互作用，形成对营养敏感的复合物，向细胞生长机器发出信号.单元格 110, 163–175 [公共医学][谷歌学者]
28Sarbassov D.D.、Ali S.M.、Kim D.H.、Guertin D.A.、Latek R.、Erdjument-Bromage H.、Tempst P.、Sabatini D.M.（2004）Rictor是mTOR的一种新的结合伙伴，它定义了一种雷帕霉素不敏感和雷帕霉素依赖的通路，该通路调节细胞骨架.货币。生物。 14, 1296–1302 [公共医学][谷歌学者]
29Hara K.、Maruki Y.、Long X.、Yoshino K.、Oshiro N.、Hidayat S.、Tokunaga C.、Avruch J.、Yonezawa K.（2002）猛禽是雷帕霉素（TOR）靶点的结合伙伴，介导TOR作用.单元格 110, 177–189 [公共医学][谷歌学者]
30Schalm S.S.、Blenis J.（2002）mTOR信号传导所需的保守基序的鉴定.货币。生物。 12, 632–639 [公共医学][谷歌学者]
31Schalm S.S.、Fingar D.C.、Sabatini D.M.、Blenis J.（2003）TOS基序介导的猛禽结合调节4E-BP1多位点磷酸化和功能.货币。生物。 13, 797–806 [公共医学][谷歌学者]
32Yatscoff R.W.（1996）雷帕霉素的药代动力学.移植。程序。 28, 970–973 [公共医学][谷歌学者]
33Hartford C.M.、Ratain M.J.（2007）雷帕霉素：旧的东西，新的东西，有时借来，现在更新.临床。药理学。疗法。 82, 381–388 [公共医学][谷歌学者]
34Gibbons J.J.、Abraham R.T.、Yu K.（2009）雷帕霉素的哺乳动物靶点：雷帕霉素发现揭示了对正常和癌细胞生长重要的信号通路.塞明。昂科尔。 36,补充3，S3–S17[公共医学][谷歌学者]
35霍顿P.J.（2010）埃弗罗利莫斯.临床。癌症研究。 16, 1368–1372[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
36Rizzieri D.A.、Feldman E.、Dipersio J.F.、Gabrail N.、Stock W.、Strair R.、Rivera V.M.、Albitar M.，Bedrosian C.L.、Giles F.J.（2008）雷帕霉素抑制剂的哺乳动物新靶点去氟莫司（AP23573，MK-8669）在复发或难治性血液系统恶性肿瘤患者中的2期临床试验.临床。癌症研究。 14，2756–2762[公共医学][谷歌学者]
37Gingras A.C.、Raught B.、Gygi S.P.、Niedzwiecka A.、Miron M.、Burley S.K.、Polakiewicz R.D.、Wyslouch-Ceeszynska A.、Aebersold R.、Sonenberg N.（2001）翻译抑制剂4E-BP1的分级磷酸化.基因发育。 15, 2852–2864[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Sarbassov D.D.、Ali S.M.、Sengupta S.、Sheen J.H.、Hsu P.、Bagley A.F.、Markhard A.L.、Sabatini D.M.（2006）长期雷帕霉素治疗抑制mTORC2组装和Akt/PKB.分子电池 22, 159–168 [公共医学][谷歌学者]
39Guertin D.A.、Sabatini D.M.（2009年）mTOR抑制的药理学.科学。信号。 2，第24页。[公共医学][谷歌学者]
40Dowling R.J.、Topisirovic I.、Fonseca B.D.、Sonenberg N.（2010）剖析mTOR的作用：来自mTOR抑制剂的教训.生物化学。生物物理学。学报 1804, 433–439 [公共医学][谷歌学者]
41Yu K.、Toral-Barza L.、Shi C.、Zhang W.G.、Lucas J.、Shor B.、Kim J.、Verheijen J.、Curran K.、Malwitz D.J.、Cole D.C.、Ellingboe J.、Ayral-Kaloustian S.、Mansour T.、Gibbons J.、Abraham R.T.，Nowak P.、Zask A.（2009）雷帕霉素哺乳动物靶点的新型ATP竞争性和选择性抑制剂的生物化学、细胞和体内活性.癌症研究。 69, 6232–6240 [公共医学][谷歌学者]
42García-Martínez J.M.、Moran J.、Clarke R.G.、Gray a.、Cosulich S.C.、Chresta C.、Alessi D.R.（2009）Ku-0063794是哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）的特异性抑制剂.生物化学。J。 421, 29–42[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Thoreen C.C.、Kang S.A.、Chang J.W.、Liu Q.、Zhang J.、Gao Y.、Reichling L.J.、Sim T.、Sabatini D.M.、Gray N.S.（2009）雷帕霉素抑制剂的ATP竞争哺乳动物靶点揭示了mTORC1的雷帕霉素耐药功能.生物学杂志。化学。 284, 8023–8032[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
44Feldman M.E.、Apsel B.、Uotila A.、Loewith R.、Knight Z.A.、Ruggro D.、Shokat K.M.（2009）mTOR靶向雷帕霉素活性抑制剂对mTORC1和mTORC2的耐药输出.《公共科学图书馆·生物学》。 7，e38。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45Chresta C.M.、Davies B.R.、Hickson I.、Harding T.、Cosulich S.、Critchlow S.E.、Vincent J.P.、Ellston R.、Jones D.、Sini P.、James D.、Howard Z.、Dudley P.、Hughes G.、Smith L.、Maguire S.、Hummersone M.、Malagu、Menear K.、Jenkins R.、Jacobsen M.，Smith G.、Guichard S.、Pass M.（2010）AZD8055是雷帕霉素激酶抑制剂的一种有效、选择性和口服生物可利用的ATP竞争哺乳动物靶点在体外和体内抗肿瘤活性.癌症研究。 70, 288–298 [公共医学][谷歌学者]
46Fan Q.W.、Knight Z.A.、Goldenberg D.、Yu W.、Mostov K.E.、Stokoe D.、Shokat K.M.、Weiss W.A.（2006）双重PI3激酶/mTOR抑制剂显示对胶质瘤的紧急疗效.癌细胞 9, 341–349[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
47Maira S.M.、Stauffer F.、Brueggen J.、Furet P.、Schnell C.、Fritsch C.、Brachmann S.、Chène P.、De Pover A.、Schoemaker K.、Fabbro D.、Gabriel D.、Simonen M.、Murphy L.、Finan P.、Sellers W.、GarcíA-EcheverríA C.（2008）新型口服双磷脂酰肌醇3-激酶/哺乳动物靶点雷帕霉素抑制剂NVP-BEZ235的鉴定与表征体内抗肿瘤活性.摩尔癌症治疗。 7, 1851–1863 [公共医学][谷歌学者]
48Balgi A.D.、Fonseca B.D.、Donohue E.、Tsang T.C.、Lajoie P.、Proud C.G.、Nabi I.R.、Roberge M.（2009）自噬化学调节剂的筛选揭示了mTORC1信号传导的新型治疗抑制剂.公共科学图书馆一号 4，e7124。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
49Díaz-Troya S.、Pérez-Pérez M.E.、Florencio F.J.、Crespo J.L.（2008）TOR在酵母对植物和哺乳动物自噬调控中的作用.自噬 4, 851–865 [公共医学][谷歌学者]
50Anand N.（1997）抗寄生虫药物的设计与合成方法第240页，阿姆斯特丹爱思唯尔[谷歌学者]
51Imming P.、Sinning C.、Meyer A.（2006年）药物及其靶点和药物靶点的性质和数量.Nat.Rev.药物发现。 5, 821–834 [公共医学][谷歌学者]
52Fairweather I.，Boray J.C.（1999）时尚：功效、行动、抵抗力及其管理.兽医。J。 158, 81–112 [公共医学][谷歌学者]
53Dunlop E.A.、Dodd K.M.、Seymour L.A.、Tee A.R.（2009）雷帕霉素复合物1介导的真核启动因子4E-结合蛋白1磷酸化的哺乳动物靶点需要多种蛋白质相互作用才能进行底物识别.单元格。信号。 21, 1073–1084 [公共医学][谷歌学者]
54Curman D.、Cinel B.、Williams D.E.、Rundle N.、Block W.D.、Goodarzi A.A.、Hutchins J.R.、Clarke P.、Zhou B.B.、Lees-Miller S.P.、Andersen R.J.、Roberge M.（2001）G的抑制作用2海绵体生物碱脱溴胸腺嘧啶核苷对DNA损伤检查点和蛋白激酶Chk1和Chk2的影响.生物学杂志。化学。 276, 17914–17919 [公共医学][谷歌学者]
55Dallal K.，Duong F.（2009）SecY络合物形成一种能够进行离子识别的通道.EMBO代表。 10, 762–768[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
56Baxter K.A.，Church J.（1996）培养胎鼠海马神经元酸挤压机制的表征.《生理学杂志》。 493, 457–470[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
57Smith M.A.、Ashford M.L.（1998）模式转换表征大鼠皮层融合神经末梢记录的大电导钾通道的活动.《生理学杂志》。 513, 733–747[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
58Sancak Y.、Thoreen C.C.、Peterson T.R.、Lindquist R.A.、Kang S.A.、Spooner E.、Carr S.A.和Sabatini D.M.（2007）PRAS40是mTORC1蛋白激酶的胰岛素调节抑制剂.分子电池 25, 903–915 [公共医学][谷歌学者]
59Bain J.、Plater L.、Elliott M.、Shpiro N.、Hastie C.J.、McLauchlan H.、Klevernic I.、Arthur J.S.、Alessi D.R.、Cohen P.（2007）蛋白激酶抑制剂的选择性：进一步更新.生物化学。J。 408, 297–315[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
60Bärlund M.、Monni O.、Kononen J.、Cornelison R.、Torhorst J.、Sauter G.、Kallioniemi O.P.、Kalioniemi A.（2000）乳腺癌中17q23的多个基因扩增和过度表达.癌症研究。 60，5340–5344[公共医学][谷歌学者]
61Karni R.、de Stanchina E.、Lowe S.W.、Sinha R.、Mu D.、Krainer A.R.（2007年）编码剪接因子SF2/ASF的基因是原癌基因.自然结构。分子生物学。 14, 185–193[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
62Wu G.J.、Sinclair C.S.、Paape J.、Ingle J.N.、Roche P.C.、James C.D.、Couch F.J.（2000）乳腺癌17q23扩增涉及PAT1、RAD51C、PS6K和SIGMA1B基因.癌症研究。 60, 5371–5375 [公共医学][谷歌学者]
63Harrington L.S.、Findlay G.M.、Gray A.、Tolkacheva T.、Wigfield S.、Rebholz H.、Barnett J.、Leslie N.R.、Cheng S.、Shepherd P.R.，Gout I.、Downes C.P.、Lamb R.F.（2004）TSC1–2肿瘤抑制因子通过调节IRS蛋白控制胰岛素-PI3K信号.《细胞生物学杂志》。 166, 213–223[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
64Shah O.J.、Wang Z.、Hunter T.（2004）TSC/Rheb/mTOR/S6K盒的不当激活导致IRS1/2耗竭、胰岛素抵抗和细胞存活缺陷.货币。生物。 14, 1650–1656 [公共医学][谷歌学者]
65Um S.H.、Frigerio F.、Watanabe M.、Picard F.、Joaquin M.、Sticker M.、Fumagalli S.、Allegrini P.R.、Kozma S.C.、Auwerx J.、Thomas G.（2004）不含S6K1可以防止年龄和饮食诱导的肥胖，同时提高胰岛素敏感性.自然 431, 200–205 [公共医学][谷歌学者]
66马磊，陈振，埃尔德朱门特·布隆格·H，邓普斯特·P，潘多尔菲·P·P（2005）TSC2磷酸化和功能失活与结节性硬化和癌症发病机制的关系.单元格 121，179–193[公共医学][谷歌学者]
67Fonseca B.D.、Alain T.、Finestone L.K.、Huang B.P.、Rolfe M.、Jiang T.，Yao Z.、Hernandez G.、Bennett C.F.、Proud C.G.（2011）丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶激酶（MEK）、细胞外信号调控激酶（ERK）和p90（RSK）在佛波酯控制mTORC1蛋白信号传导中的拟议作用的药理学和遗传学评估.生物学杂志。化学。 286, 27111–27122[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
68Fukunaga R.、Hunter T.（1997）一种新的MAP激酶激活的蛋白激酶MNK1，通过新的表达筛选方法分离鉴定蛋白激酶底物.EMBO J。 16, 1921–1933[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
69Waskiewicz A.J.、Flynn A.、Proud C.G.、Cooper J.A.（1997）有丝分裂原激活的蛋白激酶激活丝氨酸/苏氨酸激酶Mnk1和Mnk2.EMBO J。 16, 1909–1920[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
70Waskiewicz A.J.、Johnson J.C.、Penn B.、Mahalingam M.、Kimball S.R.、Cooper J.A.（1999）蛋白激酶Mnk1对cap-binding蛋白真核翻译起始因子4E的磷酸化作用体内.分子细胞。生物。 19, 1871–1880[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
71Pyronnet S.、Imataka H.、Gingras A.C.、Fukunaga R.、Hunter T.、Sonenberg N.（1999）人类真核翻译起始因子4G（eIF4G）招募mnk1磷酸化eIF4E.EMBO J。 18, 270–279[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
72Ueda T.、Watanabe-Fukunaga R.、Fukuyama H.、Nagata S.和Fukunaga R.（2004）Mnk2和Mnk1对真核细胞起始因子4E的组成和诱导磷酸化至关重要，但对细胞生长或发育则不重要.分子细胞。生物。 24, 6539–6549[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
73Sonenberg N.（2008）eIF4E，信使核糖核酸帽结合蛋白：从基础发现到转化研究.生物化学。细胞生物学。 86，178–183[公共医学][谷歌学者]
74斯坦伯格·G·R（2009）AMP活化蛋白激酶在运动中调节脂肪酸代谢中的作用.申请。生理学。螺母。Metab公司。 34, 315–322 [公共医学][谷歌学者]
75哈代·D·G（2004）AMP激活的蛋白激酶途径——上游和下游的新参与者.细胞科学杂志。 117, 5479–5487 [公共医学][谷歌学者]
76张磊、何华、巴尔斯基J.A.（2007）二甲双胍和邻苯二甲酸通过增加胞浆AMP浓度激活心脏AMP活化蛋白激酶.美国生理学杂志。心脏循环。生理学。 293，H457–H466[公共医学][谷歌学者]
77McLaughlin S.G.、Dilger J.P.（1980）弱酸对质子跨膜传输的影响.生理学。版次。 60, 825–863 [公共医学][谷歌学者]
78Terada H.（1990）氧化磷酸化解偶联物.环境。健康展望。 87, 213–218[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
79Wang G.J.、Richardson S.R.、Thayer S.A.（1995年）细胞内酸化不是培养海马神经元谷氨酸诱发死亡的先决条件.神经科学。莱特。 186, 139–144 [公共医学][谷歌学者]
80Shih T.M.、Smith R.D.、Toro L.、Goldin A.L.（1998）离子通道的高级表达和检测爪蟾卵母细胞.方法酶制剂。 293, 529–556 [公共医学][谷歌学者]
81Grinstein S.、Cohen S.（1987）细胞质[Ca2+]淋巴细胞的细胞内pH值。膜电位和体积活化钠的作用+/H（H）+交换.生理学杂志。 89, 185–213[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
82Beauvoit B.、Rigoulet M.、Raffard G.、Canioni P.、Guérin B.（1991）细胞隔室的差异敏感性酿酒酵母发酵和呼吸能量供应下的原核细胞解偶联.生物化学 30, 11212–11220 [公共医学][谷歌学者]
83Casey J.R.、Grinstein S.、Orlowski J.（2010）细胞内pH值的传感器和调节器.自然修订版分子细胞生物学。 11，50–61[公共医学][谷歌学者]
84Sancak Y.、Bar-Peled L.、Zoncu R.、Markhard A.L.、Nada S.、Sabatini D.M.（2010）Ragulator-Rag复合物将mTORC1靶向溶酶体表面，是氨基酸激活其所必需的.单元格 141，290–303[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
85Han J.，Burgess K.（2010）细胞内pH值的荧光指示剂.化学。版次。 110, 2709–2728 [公共医学][谷歌学者]
86Zoncu R.、Bar-Peled L.、Efeyan A.、Wang S.、Sancak Y.、Sabatini D.M.（2011）mTORC1通过需要液泡H的内-外机制感应溶酶体氨基酸+-ATP酶.科学类 334, 678–683[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
87Dröse S.，Altendorf K.（1997）作为V-ATP酶和P-ATP酶抑制剂的Bafilmycins和concanamycins.实验生物学杂志。 200, 1–8 [公共医学][谷歌学者]
88Balgi A.D.、Diering G.H.、Donohue E.、Lam K.K.、Fonseca B.D.、Zimmerman C.、Numata M.、Roberge M.（2011）pH对mTORC1信号的调节.公共科学图书馆一号 6第21549页。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
89Sandoval A.、Triviños F.、Sanhueza A.、Carretta D.、Hidalgo M.A.、Hancke J.L.、Burgos R.A.（2007）丙酸诱导pH值我牛中性粒细胞钙通量、ERK1/2、p38和PKC的变化.兽医。免疫学。免疫病理学。 115，286–298[公共医学][谷歌学者]
90Brett C.L.、Donowitz M.、Rao R.（2005）真核生物钠/质子交换器的进化起源.美国生理学杂志。细胞生理学。 288，C223–C239[公共医学][谷歌学者]
91Li Y.，Corradetti M.N.，Inoki K.，Guan K.L.（2004）TSC2：填补mTOR信号通路中的间隙.生物化学趋势。科学。 29, 32–38 [公共医学][谷歌学者]
92潘丹、董杰、张瑜、高霞（2004）结节性硬化综合征：来自果蝇属对人类疾病.趋势细胞生物学。 14, 78–85 [公共医学][谷歌学者]
93Becker M.L.、Remsen E.E.、Pan D.、Wooley K.L.（2004）肽衍生壳交联纳米粒。1.合成与表征.生物魔术。化学。 15, 699–709 [公共医学][谷歌学者]
94Zhang H.、Cicchetti G.、Onda H.、Koon H.B.、Asrican K.、Bajraszewski N.、Vazquez F.、Carpenter C.L.、Kwiatkowski D.J.（2003）Tsc1/Tsc2的缺失通过PDGFR的下调激活mTOR并中断PI3K-Akt信号.临床杂志。投资。 112, 1223–1233[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
95Zhang Y.J.，Duan Y.，Zheng X.F.（2011年）靶向mTOR激酶结构域：第二代mTOR抑制剂.药物研发。今天 16, 325–331[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
96Chong C.R.，Sullivan D.J.，Jr.（2007）旧药物的新用途.自然 448, 645–646 [公共医学][谷歌学者]
97O'Connor K.A.、Roth B.L.（2005）发现旧药物的新把戏：公共部门药物发现的有效途径.Nat.Rev.药物发现。 4, 1005–1014 [公共医学][谷歌学者]
98Chang Y.-W.，Yeh T.-K.，Lin K.-T.，Chen W.-C.，Yao H.-T.，Lan S.-J.，Wu Y.-S.，Xieh H.-P.，Cheng C.-M.，Chen-C.-T.（2006）抗SARS-CoV药物氯硝柳胺及其类似物在大鼠体内的药代动力学.食品药物分析杂志。 14, 329–333[谷歌学者]
99Curnock A.P.、Thomson T.A.、Westwood R.、Kuo E.A.、Williamson R.A.、Yea C.M.、Ruuthb E.（2001）免疫调节化合物HR325对刺激Jurkat细胞腺苷3′，5′-环磷酸合成的抑制作用.生物化学。药理学。 61, 227–235 [公共医学][谷歌学者]
100Brown A.J.、Goldsworthy S.M.、Barnes A.A.、Eilert M.、Tchaang L.、Daniels D.、Muir A.I.、Wigglesworth M.J.、Kinghorn I.、Fraser N.J.，Pike N.B.、Strum J.C.、Steplewski K.M.、Murdock P.R.、Holder J.C.，Marshall F.H.、Szekeres P.G.、Wilson S.、Ignar D.M.、Foord S.、Wise A.、Dowell S.J.（2003）孤儿G蛋白偶联受体GPR41和GPR43被丙酸和其他短链羧酸激活.生物学杂志。化学。 278，11312–11319[公共医学][谷歌学者]
101Korolchuk V.I.、Saiki S.、Lichtenberg M.、Siddiqi F.H.、Roberts E.A.、Imarisio S.、Jahreiss L.、Sarkar S.、Futter M.、Menzies F.M.、O'Kane C.J.、Deretic V.、Rubinsztein D.C.（2011）溶酶体定位协调细胞营养反应.自然细胞生物学。 13, 453–460[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会