功能基因组学揭示丝氨酸合成在PHGDH扩增的乳腺癌中至关重要

摘要

作为确定肿瘤发生所需代谢基因的起点，我们将代谢途径图与KEGG数据库进行了交叉引用，以汇编2752个基因的综合列表，这些基因编码所有已知的人类代谢酶和转运体(补充表1). 对公共肿瘤基因组数据进行分析，根据以下三个特性对基因进行评分：（i）肿瘤中的表达高于正常组织，（ii）侵袭性乳腺癌中的高表达，或（iii）与干细胞状态的相关性(图1a). 在这三个类别中的两个以及每个类别中排名靠前的基因中进行评分，以确定一组高优先级的133个代谢酶和转运蛋白基因(补充表2). 我们组装了靶向这些基因的慢病毒shRNA载体（每个基因平均5个shRNAs），并用它们生成了两个表达shRNA-慢病毒的文库，其中一个文库包含235个不同的shRNA（靶向转运体和控制基因）和516个不同的shRNAs（靶向代谢酶和控制基因(4).

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图1

体内联合筛查策略概述，确定PHGDH对肿瘤发生至关重要

一，维恩图概述了荟萃分析。b条，实验设计大纲。c（c），日志₂单个肿瘤（X轴）中实验性（蓝色）或中性shRNA（红色）shRNA丰度的倍数变化，而平均为11个肿瘤（Y轴）。d日，体内基因评分。e（电子）、表达靶向PHGDH（PHGDH_1、PHGDH_2和PHGDH_3）或对照（GFP）的shRNAs的MCF10DCIS.com细胞的肿瘤平均重量以及PHGDH或RPS6的蛋白表达（S6）。误差线为SEM（n=4）。星号表示概率值（p）<0.05。ND=未完成。

为了确定可能对肿瘤发生至关重要的基因，对这些文库进行了shRNAs筛选，以筛选在小鼠乳腺肿瘤形成过程中耗尽的shRNA。人类MCF10DCIS。COM单元格(5)之所以被选为筛选对象，是因为在所检测的几种乳腺癌细胞系中，这些细胞在注射最少数量的细胞后能够形成肿瘤。150万MCF10DCIS。COM细胞感染每个文库，使每个细胞携带一个病毒整合物，并将每只shRNA约500–1000个细胞（总计10万–100万个细胞）注射到每只动物的两个部位的小鼠乳腺脂肪垫中(补充讨论). 28天后采集原位肿瘤，并使用大规模并行DNA测序来确定肿瘤和最初注射细胞基因组DNA中每个shRNA的丰度(图1b). shRNA丰度在重复性肿瘤中相关性良好(图1c)对每个文库中的5或12个肿瘤进行分析，以确定在肿瘤形成过程中显著缺失的shRNAs。16个基因被指定在屏幕上点击，至少75%的shRNAs靶向这些基因得分(图1d和补充表3).

一些先前被证明在癌症中起重要作用的基因被发现为hits，包括线粒体ATP转运蛋白VDAC1；乳酸转运体SLC16A3；以及核苷酸合成基因GMPS和CTPS。命中列表还包括参与控制氧化应激（SOD2、GLS2、SEPHS1）、磷酸戊糖途径（TALDO1）糖酵解（GAPDH、TPI1）以及脯氨酸（PYCR1）和丝氨酸（PHGDH）生物合成途径的基因。在培养的MCF10DCIS.com细胞而非肿瘤异种移植物中进行的一项类似的混合筛选显示，在体外筛选中得分的20个基因中，10个也在体内筛选中得分(补充图2a,补充表3和补充讨论). 有趣的是，AK2编码从ATP和AMP生成ADP的腺苷酸激酶，是体外生长所必需的，而不是体内生长(补充图2b).

对于五个命中基因（PHGDH、GMPS、SLC16A3、PYCR1和VDAC1），测试了两个评分shRNAs对肿瘤形成的影响。每一种shRNAs都抑制MCF10DCIS.com细胞中其靶点的表达，并降低肿瘤形成能力。(图1e,补充图2c). 出于以下讨论的原因，PHGDH特别感兴趣，而在体内筛选还降低了PHGDH蛋白的表达，两种不同敲除效率的shRNAs抑制肿瘤生长的能力与其抑制PHGDH表达的能力一致(图1e). 此外，来自培养中证实PHGDH水平降低的细胞的肿瘤，在免疫组化中(补充图3a)和免疫印迹分析(补充图3b)PHGDH染色或与对照肿瘤相似的水平，表明肿瘤发生选择了失去shRNA-介导的PHGDH抑制的细胞。

为了对后续研究的基因进行优先排序，我们查阅了一份最近关于癌症基因组拷贝数变化的分析(6). 事实上，PHGDH存在于乳腺癌和黑色素瘤中常见的1p染色体区域(图2a)以及其他几种癌症类型（未显示）。总的来说，18%的患者源性乳腺癌细胞系和6%的原发肿瘤在PHGDH中有扩增。在检查的数据集中，其他命中基因均不在局部和重复拷贝数增加的基因组区域。

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图2

癌症中PHGDH的基因组扩增及其与侵袭性乳腺癌标记物的相关性

一，黑素瘤（左侧，n=111）和乳腺癌（BC，右侧，n=243）样本的PHGDH附近拷贝数（CN）数据。彩色条表示CN损失（蓝色）或增加（红色）的程度。样本由CN在PHGDH公司轨迹（虚线）。CN数据左侧的图显示了放大显著性（−log₁₀（q值），~0.60是放大的显著性阈值）。b条，所示BC组的代表性PHGDH基因表达数据。晶须表示91^标准和9^第个百分位数。c（c）表中报告了所示BC亚群中PHGDH染色“弱”、“中等”或“强”的人类BC样本数量。图像中显示的代表性染色强度。星号表示ER-阳性与ER-阴性分类比较p<0.0001（Fisher精确检验）。d–f日，PHGDH蛋白水平显示为（d）PHGDH扩增与非扩增（注释为“+”或“−”），（e）PHGDH-非扩增、过表达和（f）MCF10A衍生细胞系。PHGDH免疫印迹下的值是PHGDH水平相对于肌动蛋白对照、MCF10A和MCF7的归一化免疫荧光定量（LI-COR）。

我们对侵袭性乳腺癌相关基因的荟萃分析得到了先前一项研究的证实，该研究发现，ER阴性、基底型、与5年生存率低相关的乳腺癌中PHGDH mRNA水平升高(7). 我们在不同的基因表达数据集中证实了这些关联(图2b)另外还发现，与正常乳腺组织相比，ER-阴性乳腺癌中PHGDH升高(图2b). 在我们筛选出的所有热门基因中，PHGDH在ER阴性乳腺癌中的表达最显著(补充图4). 此外，通过对82例人类乳腺肿瘤样本进行PHGDH免疫组化分析，我们发现PHGDH蛋白水平与ER阴性状态显著相关(图2c). 总的来说，与ER阳性乳腺肿瘤相比，约68%和约70%的ER阴性乳腺肿瘤的PHGDH在mRNA和蛋白质水平上分别升高(图2b、2c和补充方法). ER阴性乳腺癌约占所有乳腺癌病例的20-25%，但在确诊后5年内，高达所有乳腺癌死亡病例的50%(8)强调了为这类乳腺癌确定其他药物靶点的重要性。

在一组乳腺癌细胞系中，与未进行PHGDH扩增的非转化MCF10A和ER-阳性MCF7细胞系相比，四个具有PHGDH放大的细胞系的PHGDH蛋白表达高8–12倍(图2d). 除了基因拷贝数增加之外，还必须存在其他机制来促进PHGDH表达，因为PHGDH蛋白水平在两个缺乏PHGDH扩增的ER阴性细胞系（MT3，Hs578T）中也升高(图2e). 这与发现相一致，即在ER-阴性乳腺癌中，PHGDH表达在mRNA和蛋白质水平上上调的比例高于在DNA水平上表现出扩增的比例。有趣的是，PHGDH在MCF10DCIS中的表达也增加了4倍。中使用的COM单元格体内筛选两个无致瘤性或低致瘤性的亲本品系（MCF-10A；MCF10AT）(9) (图2f).

PHGDH编码3-磷酸甘油脱氢酶，这是三步丝氨酸生物合成途径中糖酵解的第一个分支酶(10) (图3a). PHGDH使用NAD作为辅因子将糖酵解中间体3-磷酸甘油酯氧化为磷酸氢丙酮酸(11,12)途径中的后续酶通过转氨作用（PSAT1）和磷酸酯水解（PSPH）反应转化为丝氨酸(10) (图3a). 丝氨酸对于合成蛋白质和细胞增殖所需的其他生物分子至关重要，包括核苷酸、磷脂酰-氨基酸和鞘氨醇(补充图1). 经典研究表明，通过酶分析测定，大鼠肿瘤裂解物中丝氨酸生物合成活性升高(10,13)表明PSPH是肝脏中该途径的速率限制酶(14). 有趣的是，我们发现许多有望促进丝氨酸生物合成或参与丝氨酸后续代谢以进行生物合成的基因在ER阴性乳腺癌中升高(补充图5)证明PHGDH升高是在更广泛的通路上调的背景下发生的。

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图3

PHGDH表达升高的细胞株增加了丝氨酸生物合成途径的活性，并且对PHGDH抑制敏感

一丝氨酸生物合成途径（SBP）。b–d段，SBP生产丝氨酸(b条)显示乳腺细胞系(c（c）)用siRNA抑制PHGDH后，以及(d日)表达具有相关免疫印迹的PHGDH或PSPH cDNA的MCF-10A细胞。e–f，针对表达对照shRNA（GFP）或针对PHGDH（PHGDH_1和PHGDH_2）的shRNA的指示细胞系的指示蛋白质（e）的免疫印迹。七天后用shRNA构建物转导的细胞的相对增殖（f）。克，显示第7天MDA-MB-468细胞形态的图像(（f）).小时首次肿瘤触诊后（第0天），在喂食多西环素（Dox，2mg/kg，绿线，n=5）或正常（蓝线，n=4）饮食的小鼠中，表达多西环素可诱导控制shRNA（GFP）或抗PHGDH shRNA（shPHGDH_2）的MDA-MB-468细胞的肿瘤生长。体外细胞的PHGDH或RPS6（S6）免疫印迹显示。星号表示与对照组相比p<0.05。代谢物测量（n=4）和肿瘤大小的误差线表示SEM，细胞数的误差线则表示SD（n=3）。

为了了解PHGDH表达增加的代谢后果，我们使用代谢物分析和丝氨酸合成途径流量分析来检测有或无PHGDH扩增的乳腺癌细胞。我们发现，与未扩增PHGDH的细胞（MDA-MB-231、MCF7和MCFC10A）相比，具有PHGDH扩增的细胞（BT-20、MDA-MB-468、HCC70）通过丝氨酸合成途径的流量增加(图3b和补充图6a). PHGDH升高且通路流量高的细胞能够在缺乏丝氨酸的培养基中进行强有力的增殖，而在PHGDH水平低的细胞中，丝氨酸的缺失导致增殖显著减弱甚至停止(补充图6b).

PHGDH是PHGDH升高细胞丝氨酸途径流量增加所必需的，因为RNAi介导的PHGDH抑制显著降低了MDA-MB-468和BT-20细胞的流量(图3c). 相反，在过度表达PHGDH的MCF-10A人乳腺细胞中，丝氨酸途径流量增加到与MDA-MB-468、BT-20和HCC70细胞相似的水平(图3d). 此外，过度表达PHGDH的MCF-10A细胞在缺乏丝氨酸的情况下增殖增加，表明PHGDH过度表达足以驱动通过该途径的流量(补充图6c). 有趣的是，PSPH（被认为是肝脏中的速率限制性丝氨酸生物合成酶）的过度表达并没有增加MCF-10A细胞的通路流量(图3d). PSPH在肝脏中是限速的，而PHGDH在MCF10A细胞中是限量的，这一观察结果可以通过以下观察结果得到证实：肝脏中的丝氨酸水平（2 mM）远高于丝氨酸（500µM）抑制PSPH反馈的浓度，但在培养的细胞系中含量较低（~100µM，PSPH应为活性的浓度14。这些数据表明，PHGDH是控制癌细胞丝氨酸生物合成途径流量的关键酶。

接下来，我们询问PHGDH表达增加的细胞是否需要它来促进细胞增殖和存活。在PHGDH表达升高的细胞系（BT-20、MDA-MB-468、HCC70、Hs578T和MT3）中，但并非没有（MDA-MB-231、MCF-7），RNAi介导的PHGDH抑制导致细胞数量急剧减少(图3e–f,补充图6d)和细胞死亡(图3g和补充图6e)在缺乏凋亡标志物的情况下(补充图6f). 在PHGDH扩增的细胞（BT-20、MDA-MB-468、HCC70）和PHGDH高表达但缺乏扩增的细胞中（MT3、Hs578T）均观察到这种对PHGDH抑制的敏感性。丝氨酸合成途径的流量在PHGDH高表达细胞中很重要，这与抑制途径中的其他两种酶（PSAT1和PSPH）抑制MDA-MB-468和BT-20细胞的增殖一致，但不抑制MCF7细胞的增殖(补充图6g). 此外，抑制PSPH抑制MCF10DCIS.com细胞的肿瘤形成(补充图6h). 因此，PHGDH表达升高定义了一组丝氨酸途径流量增加的乳腺癌细胞系，其增殖依赖于PHGDH、PSAT1和PSPH。这一发现表明，许多ER-阴性乳腺癌高水平表达PHGDH（约占我们数据集中所有ER-阴性疾病的70%，图2c)可能对丝氨酸合成途径的抑制剂敏感。

为了研究PHGDH抑制是否会影响已建立肿瘤的生长，我们生成了一种可诱导的shRNA(15)在强力霉素治疗后，MDA-MB-468细胞中PHGDH蛋白水平降低(图3h). 将该shRNA转导的MDA-MB-468细胞在一组小鼠中引入强力霉素之前，允许其在25天内形成小鼠乳腺脂肪垫肿瘤(图3h). 与对照组小鼠相比，那些给予强力霉素的小鼠表现出显著的肿瘤生长减少，而用对照诱导shRNA转导的细胞制成的肿瘤在强力霉素存在或不存在的情况下生长同样好(图3h). 这些结果表明，PHGDH抑制会对现有肿瘤的生长产生不利影响(补充讨论).

丝氨酸是生物合成反应的中心代谢物，我们发现PHGDH的过度表达对丝氨酸的生物合成通量有显著贡献。然而，PHGDH抑制甚至抑制了生长在含有正常水平胞外丝氨酸的培养基中的细胞的增殖(图3f)补充额外的丝氨酸或细胞可渗透的甲基-亚麻酸酯并没有减弱PHGDH敲除的影响(图4a、4b). 细胞内和细胞外丝氨酸处于平衡状态(补充图7a)细胞外丝氨酸的导入在所研究的细胞系中没有缺陷(补充图7b). 这些发现表明，丝氨酸产生可能不是PHGDH在高PHGDH表达细胞系中的唯一重要作用。我们考虑了三个假设来解释我们的观察结果：（1）通过PHGDH途径产生的丝氨酸以不同于外源丝氨酸的方式被利用，（2）抑制PHGDH对糖酵解产生不利影响，或（3）PHGDH、PSAT1和PSPH反应除了丝氨酸外，还产生对细胞增殖至关重要的代谢物。第一种假设被认为不太可能，因为细胞内合成的丝氨酸与细胞外丝氨酸处于平衡状态(补充图7a). 第二种假设也不太可能，因为PHGDH抑制不会影响葡萄糖摄取或乳酸生成(补充图7c).

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图4

PHGDH的抑制导致谷氨酰胺对α-酮戊二酸的补充不足

一在规定的条件下生长7天后，细胞系的相对增殖表明表达了针对PHGDH的对照shRNA（GFP）或shRNAs（PHGDH_1和PHGDH_2）。b条，MDA-MB-231细胞在指定条件下的相对增殖。c（c）细胞内α-酮戊二酸（aKG），用抗PHGDH的shRNA或相对于对照shRNA（GFP）归一化的PSAT1细胞数治疗四天后。d日用shRNA抗PHGDH或GFP治疗4天后，柠檬酸循环中间水平（n=4）。颜色栏显示日志₂规模。e（电子）在用shRNA抗PHGDH、PSAT1或GFP治疗四天后，用同位素标记的谷氨酰胺治疗后的指定时间点进行aKG同位素标记。（f），指示途径的相对代谢物通量模型。星号表示与对照组相比p<0.05。误差条表示SEM（n=4）。

为了追求第三个假设，我们考虑了丝氨酸合成途径可能在PHGDH高表达细胞中产生的显著水平的额外代谢物。丝氨酸途径产生等摩尔量的丝氨酸和α-酮戊二酸（aKG，补充图1). 增殖细胞利用柠檬酸（TCA）循环的中间产物，如aKG作为生物合成前体，并上调促谷氨酰胺衍生碳进入TCA循环的补体反应，平衡生物合成外排(16,补充讨论). 我们假设，在PHGDH高表达的细胞中，PSAT1反应可能会对aKG流量贡献很大一部分谷氨酸。如果是真的，丝氨酸生物合成途径将在谷氨酰胺衍生碳的TCA修复中发挥重要作用。与这种可能性一致，MDA-MB-468细胞中PHGDH的抑制导致aKG水平的大幅降低(图4c,补充图7d). 事实上，在测量的主要代谢物中，aKG是PHGDH抑制后变化最显著和最大的代谢物，而丝氨酸水平没有显著变化(补充图8). PHGDH抑制也导致其他TCA成分显著减少(图4d,补充图8). 与抑制PHGDH一样，抑制PSAT1也导致丝氨酸途径流量和aKG水平显著降低(图4c,补充图7d–e). 此外，使用U-C标记研究¹³-谷氨酰胺显示，在RNAi介导的PHGDH或PSAT1抑制细胞中，谷氨酰胺到aKG和其他TCA中间体的绝对流量显著降低(图4e,补充图9a–b). 这些数据表明，在PHGDH高表达的细胞系中，丝氨酸合成途径负责大约50%的谷氨酸净转化为aKG，PHGDH的抑制导致TCA中间产物流量和TCA中间物稳态水平的显著损失(图4f,补充图9a–b). 此外，使用U标记研究-¹³PHGDH扩增细胞系（MDA-MB-468）和未扩增细胞系中的C-葡萄糖表明，在PHGDH高表达的细胞中，通过丝氨酸生物合成途径的流量将8-9%的糖酵解流量分流至丝氨酸生成，而在PHGDH-低表达的细胞系中，这一比例为1-2%(图4f和补充图9a). 因此，通过丝氨酸生物合成途径增加的流量对aKG的产生有重大影响，但对这些细胞中的糖酵解或丝氨酸可用性的影响较小(补充讨论). 相反，另一种重要的aKG产生转氨酶，丙氨酸氨基转移酶，对PHGDH扩增细胞中aKG的产生没有显著作用(补充图10).

我们发现PHGDH的表达是促进丝氨酸途径流量的细胞程序的关键部分(补充图5)并以aKG的形式将相当一部分谷氨酸补充到TCA循环中(补充图1). 约70%的ER阴性乳腺癌的PHGDH升高(图2c)我们的工作表明，靶向丝氨酸合成途径可能对PHGDH表达升高或PHGDH扩增的乳腺癌具有治疗价值(补充讨论). 最后，我们预计这里描述的筛选方法可能适用于其他癌症类型或基因集，从而能够直接在体内上下文。

方法摘要

为了在实体瘤中进行阴性选择RNAi筛选，将表达shRNA文库的MCF10DCIS.com细胞池注射到4^第个免疫功能低下小鼠的乳腺脂肪垫可以形成肿瘤。采用大规模平行测序法测定肿瘤中shRNA的丰度，并与注射细胞中shRNA丰度进行比较。通过分析人类肿瘤和癌细胞系的基因拷贝数数据，将肿瘤生长期间明显缺失的shRNAs靶向基因视为命中并优先排序。慢病毒shRNAs用于抑制有和无PHGDH基因组扩增的乳腺癌细胞系中PHGDH的表达。利用同位素标记的分子进行通量分析，测量丝氨酸合成途径活性和回补。

补充材料

鸣谢

脚注

工具书类