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核酸研究。2012年5月；40(9): 4237–4246.
2012年1月20日在线发布。 数字对象标识：10.1093/nar/gkr1235
预防性维修识别码：PMC3351189型
PMID：22266653

WDR5肽结合间隙的可塑性使组蛋白甲基转移酶SET1家族能够结合

帕梅拉·张,1 华宾·李,1 约瑟夫·布伦泽尔,2和Jean-Francois时装1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

在哺乳动物中，赖氨酸甲基转移酶SET1家族（包括MLL1-5、SET1A和SET1B）催化组蛋白H3上赖氨酸-4（Lys-4）的甲基化。最近的报道表明，由WD重复蛋白-5（WDR5）、视网膜母细胞瘤结合蛋白-5（RbBP5）和缺失的小同源盘-2样（ASH2L）组成的三亚基复合物刺激MLL1的甲基转移酶活性。研究表明，这种刺激在一定程度上由WDR5和MLL1催化域附近的一个小区域（称为WDR5相互作用基序（Win））之间的相互作用控制，因此有人认为WDR5可能在支架其他SET1复合物中发挥类似作用。我们在此提供的生化和结构证据表明，WDR5结合MLL2-4、SET1A和SET1B的Win基序。对WDR5-Win复合物的比较分析表明，Win基序的结合是通过WDR5肽基-精氨酸结合间隙的可塑性实现的，使得Win基元的C末端保持在结构上不同的构象中。酶分析一致表明，WDR5在RbBP5-ASH2L异二聚体对MLL2-4、SET1A和SET1B甲基转移酶活性的最佳刺激中起着重要作用。总的来说，我们的研究结果说明了WDR5在支架化KMT SET1家族中的功能，并进一步强调WDR5对调节全球组蛋白H3 Lys-4甲基化的重要作用。

简介

每个染色体的景观都来自一个复杂的核蛋白复合体，称为核小体。该蛋白-DNA复合体由组蛋白H3、H4、H2A和H2B的两个拷贝组成，并由约146 bp的DNA片段包裹，构成DNA压实的第一步，在控制不同DNA结合机制进入染色体不同区域方面发挥着重要作用。该过程由ATP依赖的染色质重塑器和组蛋白修饰酶动态调节，并调节无数生物学过程，包括但不限于染色体沉默、转录、DNA复制和DNA损伤修复(1).

一些翻译后修饰，如乙酰化、磷酸化、泛素化/琥珀酰化、ADP核糖基化、PARylization和甲基化，已被映射到组蛋白上并与各种细胞功能相关(2). 有趣的是，SET结构域蛋白（变异抑制因子3-9、Zeste增强因子和Trithoris）对赖氨酸残基的甲基化经常表现出对精确残基的偏好，并且能够将多达三个甲基转移到赖氨酸ε-胺，这与重要的生物过程有关。值得注意的是，组蛋白H3上甲基赖氨酸标记的系统定位表明组蛋白H3-Lys-4单、二和三甲基化（H3K4me1/2/3）修饰了活性转录基因的启动子和强增强子区域。同一研究还表明，H3K4me1定位于平衡增强子和正在进行转录转换的染色质区域(三,4). 这些结果进一步支持了将H3K4甲基化与活性转录基因的启动子区联系起来的初步发现(5–7).

在发芽酵母中酿酒酵母，与SET1关联的COMPlex A（COMPASS）(8,9)是催化H3K4甲基化的唯一蛋白质，而在哺乳动物中，该反应至少由六个成员催化：MLL1-4、SET1A和SET1B。每一种哺乳动物甲基转移酶在COMPASS样复合物中组装，尽管在底物特异性方面有相似之处，但SET1赖氨酸甲基转移酶（KMT）在功能上并不冗余(10–16)相关的结合研究表明，SET1家族成员与独特的蛋白质亚群相互作用。KMT MLL2和MLL3与激活信号协整器2相互作用(17)而WDR82和menin与SET1A/SET1B相关(18–20)和MLL1/MLL2(11,15)分别是。尽管存在这些差异，SET1家族成员仍具有一些共同特征，包括其域组织的复杂性和催化SET域的存在。此外，除MLL5外，其他所有与一个由WD-重复蛋白-5（WDR5）、视网膜母细胞瘤结合蛋白-5（RbBP5）和缺失的、小的、同源异型盘-2样（ASH2L）组成的三亚基复合物相关，统称为MLL核心复合物(21,22)，这是刺激MLL1二/三甲基转移酶活性所必需的在体外(23)和体内(22,24).

生物化学和结构研究最近已将RbBP5、ASH2L和WDR5在核心复合物组装和MLL1 KMT活性刺激中的离散功能指定给它们。除了它的DNA结合域(25,26)，ASH2L通过其SPIa和ryanodine受体结构域与RbBP5结合，ASH2L/RbBP5异二聚体刺激MLL1甲基转移酶活性(27). 除了其ASH2L相互作用区域外，RbBP5还包含直接结合WDR5的残基，这种相互作用对于维持核心复合物的完整性和间接刺激MLL1 KMT活性至关重要(28,29). 在WDR5β-螺旋桨结构域的另一侧，WDR5结合MLL1的SET结构域之前的一个小基序(23,30). 也称为WDR5相互作用基序（Win），MLL1 Win基序（MLL1赢)WDR5在MLL1–WDR5–RbBP5–ASH2L复合物的支架和MLL1 KMT活性的刺激中很重要在体外(23). 基于这些发现和Win基序之间的序列同源性，同一作者推测WDR5在结合SET1家族的其他成员，即MLL2-4、SET1A和SET1B时也会发挥类似的作用(31).

我们在此提供生化证据，证明WDR5以不同的平衡解离常数结合与其他SET1家族成员的Win基序相对应的肽。相应地，WDR5与MLL2-4、SET1A和SET1B Win基序的配合物的晶体结构表明，WDR五利用氢键和疏水接触的发散网络调节不同的Win基模。最后，我们表明WDR5与ASH2L-RbBP5异二聚体复合时，对充分刺激MLL1-4、SET1A和SET1B甲基转移酶活性很重要。总的来说，这些发现进一步支持了WDR5在支架SET1复合物和间接刺激H3K4甲基化中的基本作用。

材料和方法

蛋白质纯化

与MLL1（3745–3969）、MLL2（5344–5536）和MLL4（2512–2715）的Win和SET域相对应的结构被克隆到基于pGST的载体中，而MLL3（4714–4911）、SET1A（1487–1707）和SET1B（1701–1923）的结构则被克隆到自制载体（pSMT3）中。MLL1和MLL3分别作为GST和His-SUMO融合蛋白在罗塞塔细胞（Novagen）中以0.1 mM IPTG在18°C下表达16 h。由于溶解度低，MLL2、MLL4、SET1A和SET1B在10°C下用1 mM IPTG在北极细胞（Stratagene）中过度表达48小时。在50 mM磷酸钠（pH 7.0）、500 mM氯化钠和5 mMβ-巯基乙醇（pSMT3）或磷酸盐缓冲液（pGST）中收集细胞，通过超声波溶解，通过离心和过滤澄清，通过亲和色谱纯化，并在4℃下将ULP1-（pSMT_3）或TEV-（pGST2）在珠上切割16 h。在裂解后，将酶透析到20 mM Tris–HCl pH 7.5、300 mM氯化钠和5 mMβ-巯基乙醇的最终缓冲液中。如前所述，核心复合物的成员，包括ASH2L、RbBP5和WDR5（S22-334）被过度表达和纯化(33). 凝胶过滤后，在20 mM Tris–HCl pH 7.5、300 mM氯化钠和5 mMβ-巯基乙醇中透析核心复合亚基。通过UV或考马斯染色的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶定量SET1蛋白的浓度。

等温滴定量热法

如前所述，使用VP-ITC量热计（MicroCal）进行等温滴定量热法（ITC）实验(29,33). 简言之，将源自MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、SET1A或SET1B的Win基序的肽溶液（0.5–1 mM）注入WDR5（0.06 mM）的溶液中。在19°C下，在20 mM磷酸钠（pH 7.0）、100 mM氯化钠和5 mMβ-巯基乙醇中进行滴定。为了降低WDR5肽基精氨酸结合裂缝的饱和率，MLL4的注射量赢注射9-19后，肽减少了一半（从10µl减少到5µl）。使用Origin软件分析滴定曲线。

蛋白质结晶、数据收集和结构测定

等摩尔量的纯化WDR5和Win肽在冰上孵育1小时，并使用坐滴或悬挂滴蒸气扩散法结晶。WDR5–Win配合物的晶体是在如下所示的条件下获得的补充表S1简单地说，每个络合物的结晶条件不同，但母液中的主要成分是硫酸铵和聚乙二醇3350。将晶体依次浸泡在补充有5%、10%、15%和20%甘油的母液中，然后收获并在液氮中快速冷冻。数据集是在阿贡国家实验室先进光子源的生命科学协作访问团队（LS-CAT）光束线收集的，并用HKL2000索引(34). 使用Phaser和apo-WDR5作为搜索模型（RCSB 2H13.pdb），通过分子替换求解每个WDR5–Win复合物的结构(35). 每个WDR5–Win复合体的结构通过使用Refmac的迭代优化循环得到了进一步改进(36)或巴斯特(37)和COOT建模(38). 使用Molprobity验证了结构的质量(39).

体外甲基转移酶测定

甲基转移酶测定如前所述进行(29,33). 简单地说，每个重组纯化的SET1 KMT与等摩尔量的WDR5、RbBP5和ASH2L在50 mM Tris pH 8.0、200 mM NaCl、3 mM二硫苏糖醇（DTT）、5 mM MgCl中培养2、5%甘油和1 mM组蛋白H3或对应于第一个N末端15残基的肽或10µM重组纯化H3。通过添加1µCi放射性标记物引发反应S公司-腺苷-我-蛋氨酸（AdoMet）（0.07 mM氚化AdoMet的含量），并通过在Whatman P-81滤纸上观察反应而停止。通过在250 ml 50 mM pH 9.0碳酸氢钠中清洗滤纸四次，去除游离AdoMet，并通过液体闪烁计数定量甲基转移酶活性。

结果

WDR5中Win基序的平衡离解常数

最近对WDR5肽基精氨酸结合裂进行的生化分析表明，该蛋白结合一个对应于MLL1的10残基肽赢具有平衡解离常数(K（K）D类)1.7µM。WDR5与MLL1配合物的晶体结构赢确定MLL1的R3765在与WDR5结合、支架化MLL1–WDR5–RbBP5–ASH2L复合物以及相关地刺激MLL1甲基转移酶活性方面起着关键作用(23). 因此，同样的作者认为，在SET1家族其他成员身上发现的类似区域也会发挥类似的作用(31)而另一项研究表明，只有MLL1和MLL4可以结合WDR5(30). 为了研究这些假设，我们首先试图测量K（K）D类MLL1-4和SET1A/BWin图案的WDR5值。使用ITC，我们确定WDR5绑定MLL1赢和MLL4赢具有a的肽K（K）D类分别为1.13微米和0.03微米。WDR5与MLL2的类似滴定实验赢和MLL3赢肽导致K（K）D类分别为0.16µM和2.03µM，而SET1A赢和SET1B赢与WDR5结合的肽K（K）D类分别为0.26µM和0.10µM。总的来说，这些结果表明WDR5绑定了KMT SET1家族所有成员的Win区域。然而，考虑到继保守精氨酸残基之后的氨基酸序列的差异以及WDR5对Win基序的约37倍的结合亲和力范围(表1和图1)，我们的绑定分析表明，WDR5使用发散模式与SET1 KMT交互。

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WDR5结合MLL1-4、SET1A和SET1B Win基序。用MLL1进行ITC滴定实验赢(A类)，MLL2赢(B类)，MLL3赢(C类)，MLL4赢(D类)，设置1A赢(E类)和SET1B赢(F类)肽和WDR5（上迹线）以及拟合的结合曲线（下迹线）。Win主题的序列和K（K）D类以插图形式表示。用Win肽滴定WDR5显示结合化学计量学(N个值）介于0.9和1.0之间。

表1。

SET1 Win图案的对齐

氨基酸序列
Win图案P（P）−3P（P）−2P（P）−1P（P）0P（P）+1P（P）+2P（P）+3P（P）+4P（P）+5P（P）+6P（P）+7
MLL1级赢G公司3762S公司A类R（右）A类E类V（V）H（H）我R（右）K（K）
MLL2级赢G公司5062C类A类R（右）S公司E类P（P）K（K）我我T型
MLL3级赢G公司4707S！A类R（右）A类E类P（P）K（K）M（M）一S公司A类
MLL4级赢G公司2508A类A类R（右）A类E类V（V）Y（Y）我R（右）K（K）
设置1A赢G公司1492S公司A类R（右）S公司E类G公司Y（Y）Y（Y）P（P）我
设置1B赢G公司1882C类A类R（右）S公司E类G公司F类Y（Y）T型我

晶体结构中未建模下划线残留物！，C4708S取代肽。

一侧链缺失。

WDR5–MLL的晶体结构赢复合体

深入了解WDR5结合Win肽结构上不同的C末端的能力的机制(表1)，我们确定了WDR5与肽复合物中的晶体结构，这些肽对应于MLL2（1.4Å分辨率）、MLL3（2.2Å分辨率）、MLL4（1.57Å分辨率）、SET1A（2.1Å分辨率）和SET1B（2.2Å分辨率）的Win基序(补充表S1). WDR5–Win复合物与所有对齐原子的总r.m.s.d.<0.3°重叠，表明Win肽的结合不会导致WDR5的整体结构发生显著变化。模拟退火省略图显示了每个Win基序的中心精氨酸残基两侧的几个残基的清晰电子密度(补充图S1). 然而，肽中的远端残基，包括M4715侧链（单字母代码指Win基序的残基）、MLL3的S4716和A4717赢MLL4的K2518赢SET1A的P1501和I1502赢以及SET1B的F1889和Y1890的侧链赢缺乏可解释的电子密度，未建模。对WDR5-Win结构的仔细检查表明，所有肽都结合WDR5肽基精氨酸结合间隙，该间隙位于WDR5β螺旋桨结构的一侧(图1)其中每个肽都参与几个氢键、范德华接触以及与WDR5的疏水相互作用。为了便于讨论WDR5和Win基序之间的相互作用，我们使用了Schechter–Berger符号的修改版本来指定Win基模的残基，其中中心精氨酸残基表示为P0(表1). 此外，WDR5和Win基序之间的相互作用根据与P之前和之后残基的相互作用被分为两类+2Win基序的谷氨酸残基(表1).

与中心精氨酸两侧残基的序列同源性一致（P0)，包括P处的−3，P−2，P−1，P+1和P+2位置(表1)，该肽区域采用相似的取向，并与WDR5进行一些共享的直接和水介导氢键和疏水相互作用。与MLL1类似赢、P−2至P+2区域折叠为310螺旋，其中P的侧链−3，P−2和P−1残基紧密地堆积在WDR5肽基-精氨酸结合裂缝内，并与Ala-65、Gly-89、Ile-90和Asp-107侧链进行疏水性接触。WDR5中的相同残留物形成了一个保持P侧链的壁−2方向上的残基允许和P的主链酰胺形成氢键+1残留。P中的丙氨酸残留−1该位置在所有WDR5–Win复合物中类似地结合。事实上，P−1酰胺基团与Asp-107羧酸基团形成氢键，其侧链与Phe-133和Phe-149的侧链形成疏水性接触。类似组蛋白H3 R2(35,40–42)和MLL1 R3765(30,31)、中央精氨酸（P0)Win基序在WDR5的中心环形腔中延伸，其中胍基与Phe-133和Phe-263的侧链相互作用。P0残基还与Ser-91、Phe-133和Cys-261主链形成若干直接氢键，与Ser-175主链羰基形成水介导氢键。在中心精氨酸残基之后+1该位置由少量残基占据，如丝氨酸（MLL2、SET1A和SET1B）或丙氨酸（MLL3和MLL4），而P+2该位置被谷氨酸残基占据。与P之间的序列同源性一致+1和P+2残基，这部分Win基序与WDR5有一些相互作用。P+1残留物使范德瓦尔斯接触Ala-47和Tyr-260的侧链，而在MLL4中，P+2羧酸部分与P的主链酰胺形成两个额外的水介导氢键+3和P−3残留物。此外，MLL2的羟基赢和SET1B赢P（P）+1丝氨酸残基和P的巯基形成氢键−2半胱氨酸残留。

尽管P的序列同源性高，结合模式类似−3，P−2，P−1和P0WDR5–Win复合物的结构比对揭示了显著的结构差异。与MLL1Win相比，MLL2的主干赢和MLL4赢P（P）−3残留物旋转180°，导致与WDR5形成额外的水介导和直接氢键(图3). 这种旋转导致P的小结构位移−2对C5063（MLL2）、S4708（MLL3）、A2509（MLL4）、S1493（SET1A）和C1883（SET1B）侧链的定位及其与WDR5的相互作用影响可忽略不计的主干。然而，与P形成鲜明对比−2，P−1，P0，P+1和P+2残留物，P+3至P+5残留物采用不同的方向。MLL2级赢和MLL3赢与WDR5类似结合的肽相互作用的方式是，它们各自的C末端指向WDR5的叶片5，而MLL4赢和MLL1赢采用一种构造，将其C端端朝向β螺旋桨的叶片4。设置1A赢和SET1B赢肽以中间方向结合，使其C末端保持在WDR5的叶片4和5的表面(图2A） ●●●●。考虑到P之后的残基所采用的结构差异+2残留物(图3)，我们声称每个肽都会与WDR5发生不同的相互作用。P的主干+3MLL4的Y2514赢，其与MLL1的H3769类似地结合赢分别与Asp-172和Lys-259羧酸和羰基形成直接氢键和水介导氢键。此外，其芳香环与Tyr-191、Pro-173和Phe-149的侧链进行疏水接触。与溶剂暴露相比P+4L2516，P+5R2517侧链位于叶片4表面和连接WDR5叶片4和5的环形成的小裂口中(图3B） ●●●●。该缝隙由Tyr-191、Asp-192、Gly-193、Asn-214、Pro-215和Pro-216组成，可能使R2517侧链以允许的方向定向，以与Tyr-1971和Asn-215的主链羰基直接氢键结合，范德瓦尔斯与Pro-216接触。

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WDR5的晶体结构与MLL2-4、SET1A和SET1B Win基序复合。(A类)WDR5（深灰色）的总体结构显示了七个叶片以及MLL2（黄色）、MLL3（绿松石色）、MLL（绿色）、SET1A（耐火砖）和SET1B（青色）Win图案的相对方向。(B类)WDR5–MLL4的晶体结构赢复杂。WDR5肽基精氨酸结合间隙的缩放视图，其中WDR5和MLL4碳原子分别呈现为灰色和绿色。(C类)WDR5–MLL2的晶体结构赢和WDR5–MLL3赢复合物。MLL2和MLL3碳原子高亮显示，如（A）所示。(D类)WDR5–SET1A的晶体结构赢和WDR5–SET1B赢复合物。SET1A和SET1B碳原子的颜色如（A）所示。水分子和关键氢键分别用红色球体和橙色虚线表示。

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比较分析Win motif的装订方式。(A类)WDR5结合的MLL1（米色）和MLL2（黄色）肽的叠加。(B类)MLL1（米色）和MLL4（绿色）肽与WDR5（灰色）复合物的重叠。(C类)WDR5–MLL1的结构线形赢和WDR5–SET1A赢肽的碳突出显示为图2WDR5肽基精氨酸结合残基在配合物之间采用不同构象，呈现为粉红色碳原子。氢键和水分子呈现为图2.

滴定分析显示MLL4赢与WDR5的结合比高度同源的MLL1紧密约37倍赢肽(图1和表1). 由于这两个基序之间的高度序列同源性和WDR5结合的MLL1之间的结构同源性赢和MLL4赢复合物，结合亲和力的差异似乎不一致。然而，虽然对WDR5–MLL1进行了比较分析赢和WDR5–MLL4赢复合物显示两种MLL1赢和MLL4赢P（P）+4残基与WDR5有广泛的相互作用，这也表明MLL1的水介导相互作用赢P（P）+4带有WDR5 Asp-172羧酸基的H3769侧链被WDR5中相同残基和MLL4侧链羟基之间的直接氢键取代赢P（P）+4Y2514；可能解释MLL1之间差异的差异赢和MLL4赢WDR5的结合亲和力。

由于P中存在脯氨酸残基+3MLL2的位置赢和MLL3赢，我们假设这些肽与WDR5的结合方式不同于MLL1赢和MLL4赢与此假设一致，WDR5–MLL2的结构对齐赢和WDR5–MLL1赢复合物显示MLL2的C末端赢向β18之前的环转移，导致MLL2之间的一些新的相互作用赢和WDR5(图3B） ●●●●。在MLL2中赢、P+3P5068残基使范德瓦尔斯与Lys-259和Tyr-260的侧链紧密接触。WDR5肽基精氨酸结合间隙也发生了显著的结构变化。Tyr-191的酚侧链旋转90°，使其芳香环与P几乎平行+4MLL2的赖氨酸残基赢/MLL3级赢此外，MLL2中的赖氨酸残基相同赢/MLL3级赢与Lys-259羰基形成新型氢键，并与Leu-234疏水接触。最后，与所有其他Win主题相比，MLL2赢P（P）+5L5071残基位于由Pro-216和Leu-234组成的疏水裂缝内。总的来说，MLL2的晶体结构赢绑定到WDR5表明P+3残基是WDR5肽基精氨酸结合间隙内肽结合模式的结构决定因素。

观察到P+3MLL2中的位置赢/MLL3级赢肽是Win肽之间结构差异的关键点，我们假设P+3SET1A甘氨酸残留赢/集合1b赢与其他Win图案相比，图案也会表现出结构上的差异。因此，与MLL1-4 Win肽相反，SET1A的主链羰基赢P（P）+2谷氨酸残基经过180°旋转，在P的酰胺基团之间形成新的氢键+3和P+4P的残基和主链羰基−1WDR5的残留物和Lys-259。值得注意的是，与WDR5–MLL1相比赢复合物，Lys-259和Tyr-191的侧链向Win肽转移，导致与SET1A形成额外的疏水接触赢P（P）+3甘氨酸和P+5酪氨酸残基(图3C） ●●●●。此外，SET1A中的相同酪氨酸残基与Leu-234和Pro-216的侧链进行了几次疏水性接触。

总的来说，WDR5–Win复合物的晶体结构突出了WDR5使用替代结构决定簇结合Win基序的能力。更重要的是，我们的结构研究表明，WDR5肽基-精氨酸结合裂的可塑性源于其能够操作细微但关键的结构变化，以适应P位置结构上不同残基的结合+3最后，WDR5–Win配合物的晶体结构表明P+3位置可能在WDR5肽基-精氨酸结合裂缝内肽所采用的结合模式中发挥重要作用。

WDR5在刺激SET1甲基转移酶家族KMT活性中的作用

MLL1的Win基序对其与WDR5–RbBP5–ASH2L复合物的相互作用很重要，从而刺激其甲基转移酶活性(23). 在显示WDR5与MLL1-4和SET1A/B的Win基序结合后，我们研究了WDR5–RbBP5–ASH2L复合物在刺激SET1甲基转移酶家族其他成员中的作用。在不存在或存在WDR5–RbBP5–ASH2L复合物的情况下对SET1 KMT活性进行的比较证实，核心复合物增强了除MLL5外所有成员的甲基转移酶活性，但刺激倍数不同。具体而言，WDR5–RbBP5–ASH2L复合物分别刺激MLL2/MLL3和MLL4活性约52/256倍和约15倍，而SET1A和SET1B与核心复合亚基的共同孵育使组蛋白H3的甲基化增加约40倍和约1290倍(图4). 在不存在WDR5–RbBP5–ASH2L复合物的情况下，这些KMTase对组蛋白H3几乎检测不到的活性可以合理解释SET1B核心复合物的刺激作用。总的来说，这些观察结果支持初始体内数据表明，核心复合物的成员对组蛋白H3K4甲基化的全球水平至关重要。

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核心复合物对组蛋白H3上KMTs SET1家族活性的刺激。用MLL2进行辐射甲基转移酶分析(A类)，MLL3(B类)，MLL4(C类)，设置1A(D类)和SET1B(E类)无论是否存在WDR5和RbBP5–ASH2L复合物。在MLL2（1µM）、MLL3（0.5µM。活动表示为三次独立实验的平均值。误差条表示分析之间的标准偏差。

在显示核心复合物亚基刺激MLL2-4、SET1A和SET1B的甲基转移酶活性后，我们试图测量WDR5在复合物酶活性中的作用(图4). 有趣的是，ASH2L/RbBP5异二聚体与每个KMT的孵育未能在不同程度上完全刺激SET1家族每个成员的酶活性。具体而言，WDR5的缺失导致SET1A、MLL3和MLL4的活性降低2倍，而SET1B和MLL2与ASH2L-RbBP5异二聚体共同孵育分别使组蛋白H3的甲基化降低5倍和1.5倍(图4). 总的来说，这些结果清楚地证明了WDR5在刺激MLL2-4、SET1A和SET1B的甲基转移酶活性方面的重要性，并支持了最近的研究，即WDR5是KMT SET1家族所有成员活性的关键。

在确定WDR5–RbBP5–ASH2L复合物刺激SET1家族的所有成员后，我们试图在没有核心复合物亚单位的情况下通过MLL1-4评估组蛋白H3的甲基化。为了检测每个MLL的催化活性，我们用组蛋白H3肽和氚化辅因子孵育每个KMT。如所示图5，我们未能通过MLL1、MLL2和MLL4检测组蛋白H3甲基化，而对MLL3进行的类似检测导致甲基化肽显著积累。这些观察结果表明，MLL3酶活性可能独立于WDR5–RbBP5–ASH2L复合物发挥作用。

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MLL3在缺乏核心复合亚基的情况下甲基化组蛋白H3。在缺乏核心复合亚基的情况下MLL酶活性的比较分析。在存在5.0µM酶的情况下进行检测。活动表示为图4.

讨论

本文的结果提供了生物化学和结构证据，证明WDR5肽基精氨酸结合间隙在核心复合物刺激的SET1甲基转移酶家族所有成员的结合中很重要。

有趣的是，我们观察到MLL2和MLL3-Win基序与WDR5的结合类似。由于P中存在脯氨酸残基+3，歌曲等. (30)之前曾建议MLL2/MLL3可以使用不同的绑定模式与WDR5交互。WDR5–MLL2的对比分析赢和WDR5–MLL1赢复合物支持这一假设，因为每个肽的C末端都由特定的氢键组、疏水接触和范德瓦尔斯相互作用维持。同样，我们还观察到WDR5–SET1A之间的显著差异赢和WDR5–MLL1赢包括SET1A旋转的复合体赢P（P）+2这一变化可能归因于P中存在甘氨酸残基+3导致P的重新定向+4和P+5残留物。这些结构差异通过重组形成WDR5肽基精氨酸结合间隙的残基来调节，包括Lys-259和Tyr-191。尽管如此，几项突变研究证明了这一点(23,28,30,33,35,41)Win基序的N-末端对于结合WDR5是重要的，我们的比较分析表明，WDR5结合KMT SET1家族成员的倾向是通过其肽基-精氨酸结合间隙的可塑性实现的，更具体地说，是通过其调节Win基序发散的C末端区域的能力实现的。

在后生动物中，WDR5在调节/维持组蛋白H3K4甲基化的适当水平方面起着关键作用(21,22,24)在中时果蝇属，将缓慢死亡蛋白（WDR5同源物）的缺失导致甲基化的全面丧失，最终导致死亡(43). 类似地，在爪蟾导致严重的发育缺陷，包括肠道、造血和躯体缺陷(21). 我们认为WDR5肽基-精氨酸结合间隙的可塑性在支架所有SET1复合物中起着重要作用，并且是WDR5在调节各种发育程序中的基本作用的基础(21,44).

MLL3是香港地铁SET1家族的独特成员

本文提出的组蛋白H3上SET1酶活性的表征为SET1甲基转移酶家族提供了首次比较分析。虽然在缺少WDR5–RbBP5–ASH2L复合物的情况下，MLL1、MLL2和MLL4的SET结构域的酶活性可忽略不计，但我们观察到MLL3的组蛋白H3甲基转移酶活性可检测到，且不依赖于核心复合物。有趣的是，MLL3在没有核心复合物的情况下有效地甲基化组蛋白H3，而MLL2（啮齿动物中的MLL4）严格依赖于核心复合物亚单位的存在。事实上，虽然最初的研究表明，MLL3和MLL4在小鼠胚胎成纤维细胞的维甲酸受体反式激活中功能冗余(45)MLL3的靶向失活导致了一些缺陷，包括下半身质量、生育能力低下和输尿管上皮肿瘤的形成增加(45,46). 基于我们的研究结果，我们认为MLL3在缺乏核心复合亚基的情况下甲基化组蛋白H3的能力可能是MLL3和MLL4之间一些非重叠功能的基础。

WDR5的扩展作用

最近发现WDR5与与三胸类蛋白无关的蛋白质结合，这为WDR5不断扩大的作用提供了新的线索。最近有研究表明，Oct4与WDR5形成复合物，与RbBP5、ASH2L或SET1家族成员的存在无关(44). 通过鉴定WDR5和胚胎干细胞核心转录网络之间的相互作用，本研究的作者确定了WDR5的表达对于诱导多能干细胞的有效形成是必要的(44). 此外，甘等. (47)最近证明，WDR5通过与垂体同源盒2的同源域相互作用调节平滑肌细胞选择性基因激活。类似地，WDR5在病毒感染引发的IRF3和NF-κB活化过程中与VISA相关的信号复合物相互作用(48)以及NRC/NCoA6相互作用因子1(49). 最后，最近的MudPit分析确定WDR5是非特异性致死复合物的一个亚单位(50). 这些例子进一步强调了WDR5在支架这些复合物中的重要作用，我们认为WDR5肽基-精氨酸结合裂或其最近表征的V型裂的可塑性(29)在这些生物过程中起着重要作用。

接入号码

WDR5-MLL2Win、WDR5-MIL3Win、LDR5-MLL4Win、WPR5-SET1AWin、WDR5-SET1BWin复合物的坐标和结构因子已保存在蛋白质数据库（rcsb.org）中，其登录号分别为3UVK.pdb、3UVL.pdb，3UVM.pdb和3UVO.pdb。

补充数据

补充数据参见NAR Online：补充表1和补充图1。

基金

加拿大卫生研究所拨款（给J.-F.C.）；研究与创新部（安大略省）颁发的早期研究奖。Couture博士担任加拿大结构生物学和表观遗传学研究主席。加拿大自然科学和工程研究委员会（CREATE）（P.Z奖学金）。开放获取费用的资金：加拿大卫生研究院拨款（给J.-F.C.）；研究与创新部（安大略省）颁发的早期研究奖。

利益冲突声明。未声明。

补充材料

补充数据：

致谢

我们要感谢阿兰·杜塞特博士、西尔万·拉努特和凡妮莎·蒙金对手稿的评论。

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文章来自核酸研究由以下人员提供牛津大学出版社