mTORC1介导的mRNA翻译调控的统一模型

细胞裂解物的制备和亲和纯化

用冰镇PBS冲洗细胞一次，并在冰镇裂解缓冲液中进行裂解（缓冲液A:50 mM HEPES-KOH[PH7.4]、2 mM EDTA、10 mM焦磷酸、10 mM-β-甘油磷酸、40 mM NaCl、1%Trition X-100和每25 ml一片EDTA游离蛋白酶抑制剂（Roche））。通过13000 rpm离心10 min分离细胞裂解液的可溶部分。对于免疫沉淀，将初级抗体添加到裂解液中，并在4°C下旋转培养2 hr。然后添加20μl 50%的蛋白G-sepharose浆液，再继续培养1小时。用裂解缓冲液洗涤免疫沉淀物三次。免疫沉淀蛋白通过添加20μl样品缓冲液并煮沸5min进行变性，用8%-16%SDS-PAGE进行分离，并用western blot进行分析。对于FLAG纯化，用裂解缓冲液洗涤FLAG M2亲和凝胶3次。然后将50%浆液中的20μl小球添加到细胞裂解液中，并在4°C下旋转培养2小时。最后，用裂解缓冲液清洗珠子3次。通过添加50μl样品缓冲液并煮沸5分钟，使免疫沉淀蛋白变性。对于m7GTP亲和纯化，用裂解缓冲液洗涤m7GTP-sepharose。将50%浆液中的20μl小球添加到细胞裂解液中，并在4°C下旋转培养2小时。最后，用裂解缓冲液洗涤珠子3次，通过添加50μl样品缓冲液使其变性，并用western blot进行分析。对于氨基酸饥饿，细胞在无氨基酸的RPMI中清洗两次，然后在含有10%透析FBS的RPMI（含或不含氨基酸）中培养。

细胞的代谢标记

细胞接种在6孔板中并培养过夜。然后用适当的化合物处理细胞2小时，用无半胱氨酸/无蛋氨酸的Dulbecco改良Eagle's培养基清洗一次，然后在2 ml半胱氨酸或无蛋氨酸Dulbecco's改良Eagles培养基、10%透析灭活胎牛血清、化合物和165μCi（15μl，11μCi/μl）EasyTag™EXPRESS中培养细胞³⁵S蛋白标记混合物。30分钟后，裂解细胞，并通过以13000rpm离心10分钟分离可溶性级分。然后将裂解物点在Whatman滤纸上，用5%三氯乙酸沉淀蛋白质，在冷的10%三氯乙酸中洗涤两次5分钟，在冷乙醇中洗涤两次2分钟，在丙酮中洗涤一次2min，并在室温下风干。金额³⁵使用贝克曼LS6500闪烁计数器测量并入蛋白质的S。总蛋白质含量通过Bradford分析（Bio-rad）测定。

哺乳动物慢病毒shRNA和cDNA

所有shRNA载体均来自Broad Institute的RNAi联盟³⁰这些shRNAs以RNAi Consortium公共网站上的编号命名：小鼠shEIF4G1-1（TRCN0000096809）、小鼠shEIF 4G1-2（TRCN0000096811）、小鼠shEIF4G2-1，小鼠shTiar（TRCN0000102619）、小鼠shRaptor（TRCN0000077472）、人类sh4EBP1。如前所述，使用FuGENE 6转染试剂将shRNA编码质粒与psPax2包膜和水泡性口炎病毒G包装质粒共同转染到生长活跃的HEK-293T中³¹转染后48 h收集含病毒上清液，过滤去除细胞，在8μg/ml Polybrene存在下感染靶细胞。24h后，用嘌呤霉素筛选细胞，于感染后第4天进行分析。通过将大鼠4E-BP1的T36、T47、S65和T70残基突变为丙氨酸，构建4E-BP1-4A突变体，然后将其插入Tet-On质粒。

多聚体分析、RNA分离和QPCR

细胞以5×10的速度接种在15厘米的培养皿中⁶细胞/培养皿培养过夜。然后，细胞在裂解前用100μg/ml环己酰亚胺处理5分钟，在冰冷的PBS−+100μg/ml环己酰亚胺中洗涤，然后在多聚体裂解缓冲液（15mM Hepes KOH[pH 7.4]，7.5mM MgCl₂、100 mM KCl、2 mM DTT、1.0%Triton X-100、100μg/ml环己酰亚胺和每25 ml一片无EDTA蛋白酶抑制剂（罗氏））。使用Bradford试剂（Bio-rad）根据蛋白质含量对裂解液进行标准化，并将其分层到11 ml 10-50%蔗糖密度梯度上（15 mM Hepes-KOH，7.5 mM MgCl₂，100 mM KCl，2 mM DTT，100μg/ml环己酰亚胺，20 U/ml SuperaseIn，10-50%无RNA蔗糖）或调整为0.5%SDS并保留用于总RNA分离。梯度在SW-41Ti转子中以32000 rpm、4°C的转速离心2 h，然后使用连接至Isco Tris泵的Labconco Auto-Densi-Flow梯度分馏器进行采样，并在254 nM下持续监测光密度（OD）。整个过程中收集1 ml组分，调整为0.5%十二烷基硫酸钠，并在65°C下培养5分钟。向每个组分中添加5 ng聚A+合成荧光素酶mRNA（Promega）以进行归一化。然后用200μg/ml蛋白酶K（Ambion）处理样品，并在50°C下消化45分钟，然后用无RNA酶的水进行1:1稀释。用热酸-苯酚法从稀释组分中提取RNA，并用NaOAc和异丙醇沉淀。根据制造商的说明，使用Superscript III逆转录酶（Invitrogen）和随机六聚体引物制备cDNA。使用SYBR Green PCR混合物（Applied Biosystems）和每个转录物的特异引物，通过定量PCR（QPCR）确定转录物丰度。然后将测量值归一化为荧光素酶丰度，并绘制为检测百分比。

用于小鼠mRNA QPCR的寡核苷酸如下。eEF2：正向5′-GAGAATCCCGTCGCCATCCACA-3′，反向5′-CGGGCTTGATGGCTCAGCGA-3′；β-肌动蛋白：正向5′-TCGTTGCGGTCCCACACCG-3′，反向5′-CTCCTCAGGCCACACG-3′；Mrpl22：正向5′-TCTGGGCACACGAGCTG-3′，反向5′-GCCAAGCGACCTCGGCACAT-3′；Rps20：正向5′-TGACTCACCGCGTTCTCC-3′，反向5′-GAGTCCTTGGATCCTCTGG-3′；Hsp90ab1：正向5′-GCCGTCGAGTCGGACTTGGT-3′，反向5′-CCGAACCAACTGCCCGATCA-3′；Vim：正向5′-ACTGCTGCCCTGCGTGATGT-3′，反向5′-TCTCACGCATCTGGCTCC-3′；Ybx1：正向5′-GGGGTCCTCCCACGCAATTACC-3′，反向5′-CGGCGATACCACGTGAGGT-3′；Pabpc1:5′-CGCTGACTGGCTCAGGGTGC-3′，反面为5′-GGGGG CGCAGATGCAACAT-3′；Myc：正向5′-GCCAGCCCTGAGCCCCTAGT-3′，反向5′-GGGTGCGGCGTTAGTTGCT-3′；Gabarapl1:5′-AGCCCAAAAGCTCGGATAGGA-3′，反面为5′-GGTGTCCTGACAGCTGACC-3′；Slc2a1：正向5′-CTGGCAGGCTGTGCT-3′，反向5′-CGCCCCAGAGGTGAGAGA-3′；Ccnd1：正向5′-GCCCGAGCTGCTGCAAA-3′，反向5′-GCCTGCATCGCAGCCACCA-3′；萤火虫荧光素酶：正向5′-ATCCGGAGCGACCAACCC-3′，反向5′-GTCGGAACCCTGCCACGCC-3′。

用于人类mRNA QPCR的寡核苷酸如下。β-actin：正向5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3′，反向5′-GCGCGATCATC-3′；Gnb2l：正向5′-TGGGATCTCACAACGGGCACCA-3′，反向5′-CCGGTTGTCAGAGGAGGCCA-3′；Rps20：正向5′-CAGTTCGAAATGCCTACCAAGACTT-3′，反向5′-ACTTCCAACTCCAACTGGCTCA-3′；eIF4G3：正向5′-CCAGAGGGCCTGCCTCCTATCA-3′，反向5′-TGGCAATCCATGCCTTCTGC-3′。

蛋白质-RNA联合免疫沉淀分析

将稳定表达所示Flag-tagged结构的MEF接种在2×10的10cm板中⁶细胞/平板培养过夜。然后用载体或250 nM Torin1处理细胞2 h，并在含有40 U/ml SuperseIn的缓冲液A（见上文）中溶解。通过离心去除不溶性物质，通过蛋白质浓度对裂解产物进行标准化，并在4C旋转条件下用FLAG-M2琼脂糖培养2h。然后用1 ml缓冲液A洗涤免疫沉淀物6次，用多聚体裂解缓冲液洗涤两次，并用100μL 3×FLAG肽在多聚体水解缓冲液中洗脱10 min，洗脱温度37℃°C.洗脱液分为免疫印迹和RNA提取两部分。对于RNA提取，向洗脱液中添加10 ng荧光素酶mRNA、1μg酵母tRNA、200μg/ml蛋白酶K和SDS（最终浓度为0.5%），然后在50°持续45分钟。用酸性苯酚提取RNA两次，用氯仿提取一次，并用NaOAc和异丙醇沉淀。以分离的RNA为模板，使用寡核苷酸-dT引物合成cDNA，并通过定量PCR进行分析。每个样本中的mRNA丰度标准化为荧光素酶峰值。对于western印迹，将样品缓冲液添加到洗脱液中，按照上述方法进行分析。

荧光素酶报告分析

对于荧光素酶报告子分析，通过将上游序列的5′UTR和1 kb克隆到切除CMV启动子的pIS1肾小球荧光素酶表达载体的衍生物中，构建质粒。pIS1 3′UTR保持完整。Vim/Actb杂交5′UTR报告子是通过将启动子和Actb报告子的前30 nt替换为启动子和Vim报告子的第一30 nt来构建的。然后在10时将细胞接种在6孔板中⁵同时转染100ng的报告质粒和400ng的空载体。过夜培养后，用新鲜培养基清洗细胞，并用载体或250 nM Torin1处理24 h。根据制造商的说明，使用标准实验室光度计，使用Renilla荧光素酶测定系统（Promega）定量荧光素素酶的表达。

在mRNA转染实验中，Eef2和Actb 5′UTR紧接着T7 RNA聚合酶启动子被克隆到pRL的衍生物中，pRL含有肾素荧光素酶ORF、短的3′UTR和poly-a[62]尾部，后面是Ecl136限制性位点。用Ecl136消化50μg每个报告质粒过夜，通过酚氯仿提取纯化，并在含有5倍m7GpppG帽类似物的反应中用作T7 RNA聚合酶的模板。然后通过酸性苯酚提取纯化mRNA。为了进行转染，细胞以50000个细胞/孔的速度接种在24孔板中，并根据制造商的说明，使用TransMessenger mRNA转染试剂转染200 ng Eef2或Actb renilla荧光素酶报告mRNA和200 ng对照萤火虫荧光素酶mRNA 2 h。然后用含有血清的新鲜培养基清洗细胞，培养1 h，然后用载体或250 nM Torin1处理。培养16小时后，根据制造商的指示，使用双荧光素酶报告试验（Promega）对荧光素素酶产量进行量化。然后将Renilla表达值归一化为firefly表达值，以控制转染效率。

小RNA文库制备

封装外形库按前面所述进行了小修改⁸简单地说，细胞以5×10的大小接种在15厘米的培养皿中⁶细胞/平板培养过夜。重要的是，我们确保细胞在第二天之前没有达到汇合，因为汇合会显著影响mRNA翻译³²然后用载体（DMSO）、雷帕霉素或Torin1处理细胞2 h。裂解前5 min，向每个板中添加100μg/ml环己酰亚胺。然后用冰冷的PBS−+100μg/ml环己酰亚胺洗涤细胞一次，并在印迹裂解缓冲液（15mM Hepes KOH[pH 7.4]，7.5mM MgCl₂，300 mM KCl，100μg/ml环己酰亚胺，2 mM DTT，1.0%Triton X-100，每25 ml 1片EDTA游离蛋白酶抑制剂（罗氏）。通过在4°C下以13000 rpm离心10分钟来清除裂解液，并将上清液转移到干净的试管中。核糖核酸酶I_（f）添加至最终浓度为1U/μl，并将样品在25°C下恒定旋转孵育45分钟。然后将消化后的样品分层至10-50%蔗糖密度梯度（15 mM Hepes-KOH[pH 7.4]，7.5 mM MgCl₂，300 mM KCl，2 mM DTT，100μg/ml环己酰亚胺，20 U/ml SuperaseIn，10-50%无RNase蔗糖），并在SW-41Ti转子中以36000 rpm离心2.5 h。按照所述对梯度进行分馏以进行多体分析，收集并保留单体部分。将样品调整为0.5%十二烷基硫酸钠，并在50°C下用200μg/ml蛋白酶K消化45分钟。使用热酸-苯酚法提取RNA，并用NaOAc和异丙醇沉淀。RNA随后在500μl 10 mM Tris 8+2.5μl SuperaseIn中再次悬浮，并在Millipore YM100微型浓缩池中离心28分钟，以去除长度超过100 nt的RNA片段。RNA从流通中沉淀，并在15%TBE-尿素凝胶上分离，在约30 nt处显示出清晰的条带。从凝胶的这个区域提取RNA，并使用安捷伦生物分析仪进行定量。将样品归一化为等效浓度，并按照前面描述的方法制备小RNA Illumina测序⁸。

对于总mRNA分离，将载体或Torin1处理的细胞在冰镇PBS中洗涤，并在总RNA裂解缓冲液中溶解（15 mM Hepes-KOH[pH7.4]，15 mM MgCl₂，0.3 M氯化钠，1.0%十二烷基硫酸钠）。通过21G针头连续传代使裂解液均匀化，并在65°C下培养5分钟。然后使用热酸-苯酚法提取RNA，并重新悬浮在200μl 10 mM Tris 8中。使用寡核苷酸dT从150μg总RNA中分离PolyA+RNA₂₅根据制造商的说明，将Dynabeads（Invitrogen）重悬于20μl 10 mM Tris 8中，然后通过添加20μl碎片缓冲液（2 mM EDTA，100 mM NaCO_三pH 9.2），并在95°C下培养20分钟。在15%TBE-尿素凝胶上沉淀并分离片段RNA。然后从30 nt区域分离出短RNA片段，并使用安捷伦生物分析仪进行定量。将样品归一化为等浓度，并与足迹样品平行制备Illumina小RNA测序样品。足迹文库在两个生物复制中制备，而总转录文库作为单复制制备。

RNA序列分析

在对齐之前，对足迹和总mRNA库进行处理，以消除克隆伪影。然后，使用Bowtie短读比对程序将处理后的读数据与小鼠rRNA序列数据库进行比对，以消除污染读数据³³这些rRNA读取代表了40-80%的足迹库，与之前的工作一致^8,34然后将其余的读数与mm9小鼠基因组进行比对。未能与基因组位置对齐的读取数据被重新与Refseq基因序列数据库对齐，以捕获那些映射到剪接连接的数据。对于这两种对齐方式，在一个25 nt的“种子”区域中允许出现2个不匹配，并且需要读取才能对齐到单个唯一位置。然后，将得到的对齐文库映射到Refseq注释所描述的基因模型，该注释于2010年3月从UCSC基因组浏览器网站下载。对每个转录本平均计算映射到唯一基因组位置但映射到多个转录本的读取数。中的许多哺乳动物基因都有重复的假基因，这些假基因存在于整个基因组中，因此导致对这些基因的读取被丢弃，因为它们无法映射到单个独特的位置。为了避免低估这些基因，使用相同的参数对之前未对齐的读取重复比对过程，但最多允许在5个独特的位点进行比对。然后，这些“多重读取”的计数根据它们在我们独特比对库中的相对表示分布到每个映射的基因模型，类似于前面描述的策略³⁵表达值计算为每千碱基外显子模型每百万映射读取数（RPKM）的修正版本，该模型将映射读取数标准化为基因长度和库大小³⁵.原始RPKM值计算为R_我=10⁹·（C）_我/荷兰_我)，其中C_我是映射到基因外显子的读取数_我，N是整个库中映射读取的数量，L_我是nt中剪接基因的长度。由于污染rRNA构成我们测序文库的很大一部分，我们计算N作为编码基因模型外显子的读数。翻译效率计算为足迹（RPKM）/mRNA（RPKM）。将生物复制的值平均起来。

在计算车辆和Torin1处理条件之间的平移效率变化之前，应用了几个额外的约束条件。首先，我们只考虑了载体和Torin1治疗条件之间的总读取数超过128的基因。如前所述，读取次数较少的基因的折叠变换计算中的复制错误主要是由简单的二项式抽样错误引起的⁸其次，我们只考虑了编码蛋白质编码基因的转录本，并进一步排除了少数转录本，其中超过25%的足迹读取映射到内含子。手动删除三个与核糖体蛋白编码基因同源的假基因（NM_001081036和NM_001111116，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_001101561”，“术语id”：“283945553”}}NM_001101561). 最后，我们通过足迹读取计算组蛋白mRNA的翻译变化。组蛋白mRNA存在于足迹库中，但由于它们没有polyA尾部，因此无法在总的mRNA库中可靠检测到。

足迹库分析可用于确定每个样本中翻译每个mRNA的核糖体比例（RPM，百万读数），但不能直接测量样本间翻译核糖体总数的差异。然而³⁵S Cys/Met掺入显示mTOR抑制使蛋白质合成的总速率降低约65%。由于mTOR主要调节翻译的起始步骤，并且Torin1处理的细胞的多聚体分析清楚地显示了起始过程中的严重缺陷³⁵S-Cys/Met掺入主要反映了翻译核糖体数量的减少。因此，当mTOR被抑制时，在载体和Torin1处理条件下由相同比例的核糖体翻译的mRNA被核糖体减少约65%。该系数可合并为Δ_翻译= Δ_{核糖体密度}× Δ_{翻译核糖体}对于每个mRNA，式中Δ_{核糖体密度}是足迹RPM和Δ的变化_{翻译核糖体}=0.35（减少65%）。应用这种校正，我们发现除了4个mRNA外，Torin1处理细胞中的核糖体翻译的所有mRNA都少于载体处理细胞。

5′UTR的复杂性

所有转录物的5′UTR序列均来自NCBI参考序列收集。使用QuikFold2预测每个序列的最小折叠ΔG°(http://mfold.rna.albany.edu/？q=DINAMelt/Quickfold)使用RNA折叠能量规则3.0版的默认参数³⁶。