两种膜间间隙蛋白Ups1p和Up2p在线粒体内磷脂转运中的作用^*

重组蛋白表达

生成含有N-末端His的酵母Psd1p₆标签，将整个开放阅读框克隆到His的帧内和下游的pET28a载体（EMD）中₆标签。伊斯₆在BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中诱导Psd1p大肠杆菌（安捷伦科技公司），从天然蛋白质提取物（50 m）中分离出包涵体米不₂人事军官₄，300米米氯化钠，10米米咪唑，pH 8.0，补充1%（v/v）吐温20和0.5 m米EDTA）在10000×克在4°C下保持20分钟。用3 ml包涵体溶解缓冲液（1.67%（w/v）Sarkosyl，0.1 m）溶解包涵体米EDTA，10米米DTT，10米米Tris-Cl，pH 7.4，和0.05%聚乙二醇3350），在冰上孵育20分钟，并用6ml 10ml稀释米Tris-Cl，pH 7.4，在12000×克温度为4°C。经磷酸盐缓冲盐水（PBS）透析后，His₆在自然条件下使用镍纯化Psd1p²⁺-琼脂糖（Qiagen）按照制造商的说明，通过SDS-PAGE、考马斯蓝染色和BSA标准曲线进行定量。使用His在兔子体内培养抗体₆Psd1p作为抗原。

磷脂分析

将酵母细胞稀释至A类₆₀₀=0.02，在2 ml YPD中，10μCi/ml存在³²P（P）_我培养至固定相。从粗线粒体组分中提取磷脂并通过TLC进行分离，如所述(7,42–44).

脉冲追逐实验[¹⁴C] 丝氨酸

酵母细胞在SCD-Ura中生长并在YPD中稀释(A类₆₀₀=0.05）并进一步培养至对数阶段。细胞在含有3μCi/ml的PBS中进行脉冲标记[¹⁴C] 丝氨酸在30°C下保持15分钟。标记后，用水冲洗细胞，并将一小部分细胞保存为起始材料（零时间点）。其余细胞悬浮在YPD中培养不同时间。按说明提取总磷脂(24). 简单地说，细胞通过离心沉淀，再悬浮在330μl甲醇中，并保存在冰上，直到收集到所有脉冲相样品。然后用100μl玻璃珠将样品涡旋15分钟。加入660μl氯仿，并以12000×克将200μl水加入上清液中并旋转5min。通过400×离心分离有机相克在speedvac中干燥5分钟，然后在氯仿中重新悬浮。所有样品均装载并通过TLC进行分析。

显微镜

使用Olympus BX61显微镜观察细胞，显微镜为×100，1.3 NA，目的。荧光和差分干涉对比度图像使用Roper/Photometrics Cool Snap HQ使用Slidebook软件版本5.0（3i）捕获，并使用Photoshop软件（Adobe）进行处理。

免疫印迹法

对于免疫印迹，蛋白质通过与二级抗体（Alexa Fluor 488或647山羊抗鼠或兔IgG（H+L）（Invitrogen））结合的荧光团进行可视化，并使用PharosFX Plus分子成像仪（Bio-Rad）和Quantity One（Bio-Read）及Photoshop（Adobe）软件进行分析。

碱性处理

从表达FLAG-Mdm31-TEV-FLAG和Cyt的细胞中分离线粒体c（c）₁-YPGE种植TEV。150μg线粒体悬浮于0.1米钠₂一氧化碳₄涡流后，将样品在冰上培养30分钟，并在4°C的TLA55转子（贝克曼）中以45000 rpm离心30分钟。用10%三氯乙酸沉淀上清液部分中提取的蛋白质。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析沉淀蛋白和膜结合组分。

Ups1p的缺失会加重ERMES缺失细胞的细胞生长缺陷和CL水平，尽管Ups2p的缺失可以挽救这些表型

我们以前曾报道过Ups1p和Ups2p对抗性地影响CL水平，并且Ups2p的额外损失向上1Δ细胞恢复CL水平和生长缺陷(7). 此外，我们已经证明IMS蛋白Mdm35p是将Ups蛋白导入线粒体所必需的(44). 毫不奇怪，mdm35（百万立方米）Δ细胞显示Ups蛋白水平降低，CL数量正常，细胞生长正常(图1和​和22A类)，类似于向上1Δ向上2Δ电池(44). 由于ERMES蛋白和Ups1p的缺失对磷脂的影响相似，我们研究了Ups1p缺失是否会加剧ERMES缺失细胞中细胞生长和磷脂组成的缺陷。我们还评估了Ups2p或Mdm35p的丢失是否会抑制这些过程。为了获得双缺失突变体，我们删除了UPS1型,通用产品2，或MDM35型ERMES缺失细胞中携带URA3公司表达ERMES基因的质粒(即MMM1,百万平方米,MDM10型，或MDM12型). 这些细胞生长在含有5′-氟有机酸（5′-FOA）的培养基上，以使细胞失去补体URA3公司质粒并产生双缺失突变体。缺乏Ups1p和Mmm2p或Mdm10p的细胞表现出合成生长缺陷(图2A类). 相反，所有ERMES缺失细胞的生长缺陷都通过额外的Ups2p或Mdm35p损失而得到部分修复(图2A类).

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图2。

Ups2p缺失可改善ERMES缺失细胞的细胞生长和CL水平。 A、，将所示酵母细胞的系列稀释液置于YPD上，并在30°C下培养2天。B、，指示的酵母细胞在YPD中在³²P（P）_我从粗线粒体组分中提取磷脂并进行TLC分析。C、，测定了每种脂质相对于总磷脂的含量，并将ERMES缺失线粒体中检测到的含量设置为100%(例如mmm1Δ,毫米2Δ,mdm10型Δ，或中密度12Δ). 数值为平均值±S.E(n个= 3).圆周率，磷脂酰肌醇。

与细胞生长类似，在ERMES缺失的细胞中，由于Ups1p的额外丢失，CL的缺陷得到了增强，并通过Ups2或Mdm35p的丢失得以修复。如所示图2,B类和C类，我们发现Ups1p的缺失进一步降低了毫米1Δ和mdm10型Δ细胞，而CL水平毫米1Δ,mdm10型Δ和中密度12在没有Ups2p或Mdm35p的情况下，Δ线粒体显著增加。相反，这些双突变体的PS水平保持不变。因此，我们的数据进一步表明ERMES复合体和Ups1p具有类似的功能。

Ups1p和Ups2p的丢失会对PE到PC的转换产生负面影响

接下来，我们研究了Ups1p或Ups2p的丢失是否会改变脉冲相实验中磷脂代谢[¹⁴C] 丝氨酸。在本试验中，我们评估了[¹⁴C] 丝氨酸转化为PS，PS转化为PE，PE转化为PC。新合成¹⁴C-标记的PS从内质网转运到线粒体，并通过线粒体PS脱羧酶Psd1p转化为PE(17–19). 由此产生的PE随后移回内质网并通过两种内质网定位酶Cho2p和Opi3p甲基化而成为PC(20). 为了直接评估这一途径，我们使用psd2型Δdpl1型Δ细胞作为亲本菌株。Psd2p是另一种PS脱羧酶，位于高尔基复合体和液泡中，尽管Dlp1p是一种二氢鞘氨醇磷酸裂解酶，可通过鞘脂代谢生成磷酰乙醇胺，即PE的前体。我们用脉冲标记psd2型Δdpl1型Δ,向上1Δpsd2型Δdpl1型Δ和向上2Δpsd2型Δdpl1型Δ电池[¹⁴C] 丝氨酸及其不同时间点总磷脂的薄层色谱分析(图3A类). 我们发现[¹⁴C] 丝氨酸进入PS、PE和PC的情况在三个菌株中相似(图3A类,总计). 我们还发现这些细胞中PS的消耗率相似(图3A类,PS/总计). 这些观察结果表明向上1Δ和向上2Δ突变不影响[¹⁴C] 丝氨酸转化为PS或PS的稳定性。

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图3。

Ups1p和Ups2p的丢失会影响PE到PC的转换。 A、，细胞被脉冲标记[¹⁴C] 丝氨酸培养15分钟，并在指定的时间段内进一步培养。从细胞中提取总磷脂，并通过TLC和放射成像进行分析。15分钟时PS、PE和PC的总量设置为100%(总计). 在每个时间点测定PS、PE或PC相对于总量的比率。数值为平均值±S.E(n个= 3).B、，全细胞提取物由野生型和psd1级Δ细胞，用Yme1p和Psd1p抗体进行免疫印迹分析。C、，从指示细胞中分离线粒体，并用抗Psd1p、Tim23p和Tom22p抗体进行免疫印迹分析。

有趣的是，我们发现向上1Δ和向上2Δ突变对PE积累产生相反的影响。向上1Δ累积了更多PE，而向上2Δ降低PE金额(图3A类,PE/总计). 此外，向上1Δ突变减缓了PC的产生，表明PE向PC的转化在向上1Δ电池(图3A类,PC/总计). 相比之下，尽管PE金额在向上2Δ细胞，PC的生成正常，表明PE到PC的转换在向上2Δ电池(图3A类,PC/总计). 不同量的PE并非由于线粒体PS脱羧酶Psd1p水平的差异。用抗Psd1p抗体对分离的线粒体进行免疫印迹，结果显示，在psd2型Δdpl1型Δ,向上1Δpsd2型Δdpl1型Δ和向上2Δpsd2型Δdpl1型Δ细胞略有减少向上1Δpsd2型Δdpl1型使用抗Psd1p抗体免疫印迹的Δ细胞(图3,B类和C类).

Mdm31p的过度表达挽救ERMES缺失细胞的生长、CL水平和线粒体形态缺陷

缺乏Mdm31p或Mdm32p的细胞形成大的球形线粒体，类似于ERMES缺失细胞(31,36). ERMES蛋白和Mdm31p或Mdm32p的联合丢失导致合成致死性(36)这表明所有这些蛋白质都具有类似的功能。为了验证这一点，我们检测了Mdm31p或Mdm32p的过表达是否可以补偿细胞生长、CL水平和线粒体形态中ERMES蛋白的损失。我们将表达Mdm31p或Mdm32p的多拷贝质粒导入ERMES缺失的细胞中，该细胞携带URA3公司-包含编码相应基因的质粒(MMM1型,百万平方米,MDM10型，或MDM12型). 含有空载体的细胞也作为阴性对照进行分析。为了消除URA3公司-将含有质粒的细胞划线到含有5′-FOA的平板上(图4A类). 当编码ERMES的多拷贝质粒MDM31型基因被引入(MDM31型)与携带空载体或2μm质粒编码MDM32型基因(MDM32型). 我们通过使用针对Mdm31p和Mdm32p的抗体对全细胞提取物进行免疫印迹，证实了Mdm31p和Mdm32 p的过度表达(图4B类). 为了更仔细地比较ERMES缺失细胞的生长情况，将细胞的系列稀释液置于含有可发酵（YPD）或不可发酵（YSGE）碳源的培养基上(图4C类). Mdm31p的过度表达部分修复了在YPD和YPGE上生长的所有ERMES缺失细胞中观察到的生长缺陷(图4C类). 这些结果表明，Mdm31p，而不是Mdm32p，至少可以部分替代细胞生长中的ERMES蛋白。

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图4。

Mdm31p的过度表达可改善ERMES缺失细胞的细胞生长、CL丰度和线粒体形态。 A、 毫米1Δ,毫米2Δ,mdm10型Δ和中密度12Δ单元格URA3公司-携带相应基因的单拷贝质粒与TRP1号机组多拷贝向量窝藏MDM31型或MDM32型或空向量。将转化物划线到SCD-Trp+FOA板上，培养3天以去除URA3公司质粒。B、，全细胞提取物由千立方米Δ (上部面板)或千立方米Δ电池(下部面板)并用所示抗体进行免疫印迹分析。单拷贝转化细胞(欧洲标准化委员会)和多副本(2μ） 表达Mdm31p或Mdm32p的质粒。空白载体用作阴性对照。C、，将所示酵母细胞的系列稀释液涂在YPD和YPGE上，并分别培养2天和5天。D、，ERMES-deleted细胞，其中一个单拷贝质粒携带相应基因(MMM1型,百万平方米,MDM10型，或MDM12型)，一个空向量(矢量)或多拷贝质粒MDM31型(MDM31型)在YPD种植³²P（P）_我从粗线粒体组分中提取磷脂并进行TLC分析。测定了CL相对于总磷脂的量，并用野生型质粒从ERMES缺失的细胞中分离出线粒体中检测到的CL(例如MMM1,百万平方米,MDM10型，或MDM12型)设置为100%。E、，使用基质靶向Su9-GFP在指定细胞中观察线粒体。细胞在YPD中生长到对数期，并通过荧光显微镜和微分干涉显微镜进行检查。对含有管状线粒体的细胞进行评分。数值为平均值±S.E(n个= 3). 每个实验中至少检测100个细胞。酒吧，5微米。

接下来，我们评估了Mdm31p过度表达是否也抑制ERMES缺失细胞中的CL缺陷。我们用编码相应基因的单拷贝质粒培养ERMES缺失细胞(即MMM1,百万平方米,MDM10型，或MDM12型)，编码MDM31型基因(MDM31型)，或存在的空向量（向量）³²P（P）_我然后我们分离出粗线粒体部分。提取磷脂并进行TLC分析。如所示图4D类当Mdm31p过度表达时，所有ERMES缺失的线粒体中CL的数量显著增加。因此，除了细胞生长外，Mdm31p的过度表达还可以增加ERMES缺失细胞中的CL水平。

此外，Mdm31p过表达也部分恢复了ERMES缺失细胞中的管状线粒体形态。为了观察线粒体形状，我们在ERMES缺失的细胞中表达线粒体靶向GFP（Su9-GFP），无论是否过度表达Mdm31p。我们证实，几乎所有ERMES缺失的细胞都表现出异常的线粒体形态，如大球形或小球体聚集(图4E类). 相反，当Mdm31p过度表达时，ERMES缺失的细胞和管状线粒体的数量显著增加(图4E类). 因此，过度表达Mdm31p可以部分修复ERMES缺失细胞中细胞生长、CL水平和线粒体形态的缺陷。

Mdm31p跨越IM两次，其功能需要第二个跨膜结构域

Mdm31p具有一个N-末端基质靶向前序列和两个假定的跨膜结构域。Mdm31p在第一疏水区域跨越线粒体内膜至少一次，并且第一和第二疏水区域之间的部分暴露于IMS(36). 然而，Mdm31p的确切拓扑结构尚未确定。因此，我们研究了第二疏水区的功能重要性和拓扑结构。首先，我们介绍了Mdm31p(MDM31型)，截断的Mdm31p缺少第二个疏水结构域(MDM31型ΔTM（TM）) (图4A类)，或将空向量（向量）转换为千立方米Δ细胞并观察其生长和线粒体形状(图5,B类和D类). 通过使用抗Mdm31p抗体的免疫印迹法，我们确认了全长和截短的Mdm31p的可比表达水平(图5C类).千立方米表达Mdm31pΔTM的Δ细胞在细胞生长中有缺陷，并且含有类似于载体控制细胞的球形线粒体，因此证明Mdm31p功能需要第二个疏水结构域(图5,B类和D类). 为了确定膜的拓扑结构，我们通过在蛋白的两个不同位置引入3×FLAG标签来标记Mdm31p。一个标签被放置在预序列之后，第二个标签被插入第一个和第二个疏水域之间。此外，在第二个3×FLAG标记（FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG，图4A类). FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG的表达挽救了细胞生长和线粒体形态缺陷千立方米Δ细胞，证实该FLAG标记蛋白具有功能(图5,B类和D类). 然后我们表达了IMS靶向的TEV蛋白酶（Cytc（c）₁-TEV）或基质靶向TEV蛋白酶（Cox4p-TEV）千立方米Δ细胞表达FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG。用抗FLAG抗体免疫印迹法分析全细胞提取物(图5E类). 虽然Cox4p-TEV表达细胞仅显示全长FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG（68 kDa），但在Cyt中检测到与Mdm31p的N端（Mdm31p-N；50 kDac（c）₁-TEV表达细胞(图5E类). 这些结果表明Cytc（c）₁-TEV在IMS中处理FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG。

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图5。

Mdm31p膜拓扑分析。 A、，为了分析Mdm31p第二疏水区的功能，删除了该区域(马里兰州ΔTM（TM）). 为了确定Mdm31p的膜拓扑结构，在蛋白的两个不同位置引入3×FLAG标签。一个标签被插入到预序列之后，第二个标签被放置在第一个和第二个疏水域之间。此外，一种烟草蚀刻病毒(TEV公司)-在第二个3×FLAG标记之前引入了解理位点(Mdm31p-TEV-标志).B、，连续稀释千立方米Δ承载单个(欧洲标准化委员会)或多副本(2μ） 表达Mdm31p、Mdm31pΔTM的质粒(千立方米ΔTM（TM）)，标记-Mdm31p-TEV-FLAG(MDM31-TEV-FLAG标志)，或空向量(矢量)在YPD上发现并孵育1天。C、，从所示细胞中制备的全细胞提取物B类用所示抗体进行免疫印迹分析。D、，线粒体通过基质靶向Su9-GFP显示千立方米Δ细胞表达不同形式的Mdm31p。Mdm31pΔTM(千立方米ΔTM（TM）)由多拷贝质粒表达。E、，表达FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG和Cox4p-TEV或Cyt的细胞的全细胞提取物c（c）₁-使用抗FLAG抗体通过免疫印迹法分析TEV。F、，从表达FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG和Cyt的细胞中分离线粒体c（c）₁-TEV公司。OM和IM囊泡是通过渗透性休克和超声作用产生的。这些囊泡通过蔗糖密度梯度离心分离。使用针对所示蛋白质的抗体通过免疫印迹法分析每个组分的蛋白质。G、，表达FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG和Cyt的分离线粒体c（c）₁-TEV用0.1米钠₂一氧化碳₄通过超速离心分离上清液和颗粒组分。使用针对所示蛋白质的抗体通过免疫印迹分析蛋白质。C类和N个Mdm231p的C端和N端的一半。

接下来，我们检查了这些TEV裂解片段Mdm31p-N和-C的定位。从表达FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG和Cyt的细胞中分离出线粒体c（c）₁-TEV公司。线粒体中的OM和IM衍生小泡通过超声波产生，并在蔗糖密度梯度上分离。如果Mdm31p跨越OM和IM，则IM和OM中将分别存在Mdm31p-N和Mdm31p-C。或者，如果Mdm31p跨越IM两次，则Mdm31p-N和-C都将与IM关联。使用针对OM蛋白的抗体分析来自蔗糖梯度的级分(即Tom70p、Tom40p和Tom22p），IM蛋白(即Tim23p、Tim17p和Mdj1p）和FLAG。尽管从分数14开始检测到Tim23p、Tim17p和Mdj1p，但Tom70p、Tom40p和Tom22p主要存在于分数7-10中(图5F类). 全长Mdm31p和两个TEV裂解片段显示出与IM蛋白相似的定位模式，表明Mdm31p的N端和C端区域附着在内膜上(图5F类).

我们还进行了碱提取，以测试Mdm31p-N和-C是否插入IM中。表达FLAG-Mdm31p-TEV-FLAG和Cyt的线粒体c（c）₁-用Na治疗TEV₂一氧化碳_三然后提取外周膜蛋白。如所示图5G公司，两种外周相关IM蛋白，Tim44p和F₁β、 尽管颗粒中存在两种完整的膜蛋白Tom40p和Tim23p，但仍将其提取到上清液中。与Tom40p和Tim23p类似，Mdm31p全长、-N和-C耐碱性处理(图5G公司). 综上所述，我们的结果表明Mdm31p跨越IM两次，第二个疏水区对其功能至关重要。

Mdm31p的过度表达拯救了ups1Δ细胞

鉴于在向上1Δ和ERMES缺失的细胞，我们试图了解Mdm31p过度表达是否也能拯救向上1Δ单元。我们引入了一种携带MDM31型基因或空载体向上1Δ细胞，并将转化的细胞点到YPD上(图6A类). 我们发现Mdm31p的过度表达促进了向上1Δ电池(图6A类). 同样，Mdm31p过表达也部分恢复了CL水平向上1Δ线粒体，其中CL与线粒体相比下降至～25%。Mdm31p过度表达后，CL水平显著增加2倍(图6B类). 肾小管线粒体形态向上1在Mdm31p存在的情况下，Δ细胞也部分恢复(图6C类). 如前所述(7,34)，～80%向上1Δ细胞线粒体形态异常，如小管碎片和聚集结构。然而，当Mdm31p过度表达时向上1Δ细胞呈管状线粒体(图6C类). 这些结果表明，较高水平的Mdm31p可以部分恢复细胞生长、CL和线粒体形态向上1Δ单元。测试这些影响是否特定于删除的ERMES和向上1Δ细胞，我们在CL生物合成缺陷的其他突变体中过度表达Mdm31p。我们发现，Mdm31p过度表达并不能拯救缺乏心磷脂合成酶（Crd1p）或磷脂酰甘油磷酸酶（Gep4p）的细胞的生长表型，这表明Mdm31p过度表达产生的抑制作用是ERMES缺失和向上1Δ电池(图6D类).

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图6。

Mdm31p过度表达可改善细胞生长、CL数量和线粒体形态向上1Δ单元。 A、，连续稀释向上1表达单拷贝质粒的Δ细胞UPS1型(UPS1型)，空向量(矢量)，表达Mdm31p的多拷贝质粒(MDM31型)，或Ups2p(通用产品2)在YPD上发现并在30°C下培养2天。B、，酵母细胞用于A类在YPD种植³²P（P）_我从粗线粒体组分中提取磷脂并通过TLC分离。测定了每种脂质相对于总磷脂的数量，以及从线粒体中检测到的磷脂数量向上1含有Ups1p质粒的Δ细胞设置为100%(例如UPS1). 数值为平均值±S.E(n个= 3).圆周率，磷脂酰肌醇。C、 向上1含有多拷贝质粒的Δ细胞MDM31型(MDM31型)或空向量(矢量)在YPD至对数阶段生长。使用基质靶向Su9-GFP观察线粒体。对含有管状线粒体的细胞进行评分。数值为平均值±S.E(n个= 3). 每个实验中至少检测100个细胞。酒吧，5微米。D、，连续稀释crd1型Δ和gep4基因携带多拷贝质粒的Δ细胞MDM31型(MDM31型)或通用产品2(通用产品2)，或空向量(矢量)，被发现在YPD上并生长了2天。

Ups2p过度表达拯救mdm31Δ细胞

ERMES缺失细胞的生长缺陷通过添加向上1Δ，尽管向上2Δ救了他们。然而，与ERMES删除的细胞不同，千立方米Δ细胞与向上1Δ和向上2Δ (图7A类). 因此，我们评估了Ups1p或Ups2p的过度表达是否可以挽救千立方米Δ单元。有趣的是，Ups2p的过度表达，而不是Ups1p，缓解了千立方米Δ单元，表明Mdm31p和Ups2p的功能重叠(图7B类). 然后，我们检测了小鼠体内磷脂的稳态水平和线粒体形状千立方米Δ线粒体是否存在Ups2p过度表达。我们的数据显示，CL水平在千立方米Δ线粒体与野生型线粒体的比较(即mdm31Δ线粒体表达Mdm31p）(MDM31、， 图7C类). 此外，类似于向上1Δ和ERMES缺失的线粒体，千立方米Δ线粒体中PS水平升高(矢量， 图7C类). 有趣的是，我们发现Ups2p过度表达部分降低了PS水平，增加了PE水平(图7C类).千立方米Δ细胞含有球形线粒体，常呈中空非管状结构。我们发现线粒体的管状形态因Ups2p过度表达而增加千立方米Δ电池(图7D类). Ups2p抑制生长缺陷似乎是针对千立方米Δas Ups2p过度表达未能挽救生长缺陷crd1型Δ和gep4基因Δ电池(图6D类). 因此，Ups2p可以改善细胞生长、CL水平和线粒体形态千立方米Δ单元。

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图7。

Ups2p过表达可部分修复细胞生长、CL水平和线粒体形态缺陷千立方米Δ单元。 A、 UPS1型,通用产品2，或MDM35型基因在中被删除千立方米Δ承载URA3公司携带MDM31型基因。将产生的酵母细胞转化为TRP1号机组单拷贝质粒包涵MDM31型或aTRP1号机组空向量。将这些细胞点在含有5′-FOA的SCD-Trp培养基上并孵育2天。B、，连续稀释千立方米携带表达Mdm31p的单拷贝质粒的Δ细胞(MDM31型)，表达Ups1p的多拷贝质粒(UPS1型)或Ups2p(通用产品2)，或空向量(矢量)在YPD上发现并生长2天。C、，酵母细胞用于B类在YPD种植³²P（P）_我从粗线粒体组分中提取磷脂并进行TLC分析。对每种脂质的量进行量化，并将其标准化为千立方米Δ线粒体表达Mdm31p。数值为平均值±S.E(n个= 3).圆周率，磷脂酰肌醇。D、，线粒体形态千立方米携带多拷贝质粒的Δ细胞通用产品2(通用产品2)或空向量(矢量)使用Su9-GFP进行可视化。观察前在YPD中培养细胞记录。对含有管状线粒体的细胞进行评分。数值为平均值±S.E(n个= 3). 每个实验中至少检测100个细胞。酒吧，5微米。