公共科学图书馆一号。2012; 7（5）：e36510。
基于代谢状态适应性筛选转移性乳腺癌细胞
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巴尔拉吉·辛格
美国德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心肿瘤外科
戴凯伦
美国德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心肿瘤外科
西蒙·马丹
美国德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心肿瘤外科
米兰·R·雷萨哈
美国得克萨斯州休斯顿得克萨斯大学医学博士安德森癌症中心肿瘤外科
阿曼达·M·卡迪
美国德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心肿瘤外科
梅根·布劳林
美国德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心肿瘤外科
拉塔西亚·欧文
美国德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心肿瘤外科
安库尔·巴贾杰
美国德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心肿瘤外科
安东尼·卢奇
美国德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心肿瘤外科
哈维尔·卡斯特雷萨纳，编辑器
美国德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心肿瘤外科
西班牙纳瓦拉大学
构思和设计实验：BS AL。执行实验：BS KT SM MRR AMC MB LRI AB。分析数据：BS KT SM MRR AM C MB LR I AL。撰写论文：BS AL.评论手稿：BS KT-SM MRR AMC MB LRL I AB AL。
收到日期：2011年11月28日；2012年4月9日验收。
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- 补充资料
图S1：
Gln-ind细胞中谷胱甘肽含量低。我们从SUM149-Luc细胞系（亲本）和Gln-ind细胞系中制备细胞裂解物，二者均在含有Gln的培养基中生长，并使用BioVision（Milpitas，CA）的试剂盒测量还原性谷胱甘肽（GSH）和氧化性谷胱甘肽（GSSG）。GSH和GSSG水平代表3个测量值的平均值，这些测量值标准化为相同的蛋白质基础。（畅通节能法）
GUID:3EE57512-672E-4ED3-952F-0DA1A4F61CD4
图S2：
BAY-11-7082治疗后COX-2水平降低。我们将亲本SUM149-Luc和Gln-ind细胞系暴露在含有谷氨酰胺的培养基中（顶部和中间面板），以及生长在不含Gln的培养基（底部面板）中，使其接触指示浓度的BAY-11-7082或仅接触二甲基亚砜溶剂24小时，然后使用等体积的细胞裂解物进行western印迹。（畅通节能法）
GUID:1F711AA4-040A-4288-A3CB-26D23ED4E81C
图S3：
预先选择化疗耐药后Gln-ind表型的富集。亲代SUM149-Luc细胞单独用二甲基亚砜溶剂或用200 nM阿霉素处理3天，在无药物培养基中恢复17天，然后在染色前用胰蛋白酶处理并在无谷氨酰胺培养基中电镀32天（上图）。同样，亲代SUM149-Luc细胞单独用二甲基亚砜溶剂或用5 nM紫杉醇处理3天，在无药物培养基中恢复28天，然后在染色前用胰蛋白酶消化并在无谷氨酰胺培养基中电镀34天（下图）。（畅通节能法）
GUID:B644A561-56DA-44E8-BD79-E83ED320B0F9
图S4：
塞来昔布耐药细胞中谷氨酰胺非依赖性表型增加。用二甲基亚砜溶剂或10µM塞来昔布处理亲代SUM149-Luc细胞系7天。允许塞来昔布耐药细胞在无药物培养基中恢复3天，然后胰蛋白酶化并在无谷氨酰胺培养基中以每10 cm培养皿50万个细胞的速度培养。34天后用结晶紫对Gln-ind菌落进行染色。（畅通节能法）
GUID:E6138518-064E-4DC8-9D19-9AE6405B3CDF
图S5：
与亲代细胞系相比，Gln-ind细胞在裸鼠体内更具致瘤性和转移性。将细胞（2亿至200万）重复注射到44天龄裸鼠的胸部脂肪垫中（细胞数量从左至右递减）。注射癌细胞后第34天收集的荧光素酶图像显示，注射Gln-ind细胞（底部）的小鼠的肿瘤生长（比较脂肪垫周围的荧光素酶信号）和皮肤转移（比较远离注射部位的点的信号）高于亲代SUM149细胞系（顶部）。左边的空插槽对应于因肿瘤负担高而需要处死的小鼠。（畅通节能法）
GUID:6E4E79F3-8CA0-4D9E-8389-43260D816201
图S6：
注射Gln-ind细胞的裸鼠皮肤转移增加。在不同的时间收集注射了指示细胞类型和细胞数的小鼠的荧光素酶图像。在注射亲本SUM149（顶部）和Gln-ind细胞（底部）的小鼠中，选择的图像在原发肿瘤中具有近似相似的荧光素酶信号。皮肤转移显示为红色矩形的荧光素酶信号。（畅通节能法）
GUID:B60CDE09-7169-4D92-AF0C-FED3F2FEA2DD
图S7：
体外
影像学检查以确认皮肤转移。在第25天，从注射了200万个亲代SUM149-Luc细胞（顶部）或Gln-ind细胞（底部）的小鼠身上解剖出远离原发肿瘤的皮肤。将皮肤置于含有0.5 mg D-荧光素的10 ml PBS培养皿中5分钟，并用Xenogen IVIS System 200成像。（畅通节能法）
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图S8：
检测脑和肝转移。在指定的日期收集注射指定细胞类型和细胞数的两只小鼠的荧光素酶图像。注射亲本SUM149-Luc细胞的小鼠在第67天（荧光素酶成像后5天）被处死，注射Gln-ind细胞的鼠在第50天（荧光素酶成像之后2天）被杀。称重肿瘤，并将组织匀浆（肺和脑各1ml，肝1.5ml），并按肺转移所述测定荧光素酶活性材料和方法组织中的总萤光素酶活性显示为相对发光单位。（畅通节能法）
GUID:278426FF-B56D-4D63-BA43-A61D089CEC08
摘要
在极不均匀的人群中，一小群适应性强的乳腺癌细胞会导致癌症转移。在这里，我们描述了一种基于功能的策略，用于选择适应性强并导致恶性肿瘤的罕见癌细胞。虽然癌细胞依赖某些营养物质，例如葡萄糖和谷氨酰胺，但我们假设，导致恶性肿瘤的适应性癌细胞必须具有适应性代谢状态，并且可以使用稳健的选择策略来识别这些细胞。不出所料，从侵袭性乳腺癌细胞株SUM149中提取谷氨酰胺后，超过99.99%的细胞死亡。不含谷氨酰胺存活和增殖的罕见细胞具有很强的适应性，这是通过不含葡萄糖或血清的长时间细胞培养进行的额外强健适应性测试来判断的。我们成功地从我们测试的几种侵袭性乳腺癌细胞系中分离出了罕见的代谢可塑性谷氨酰胺非依赖性（Gln-ind）变体。Gln-ind细胞过度表达环氧合酶-2，这是肿瘤侵袭性的指标，他们能够调节谷氨酰胺酶水平以适应谷氨酰胺的可用性。Gln-ind细胞不依赖于凤尾草，对化疗药物阿霉素和紫杉醇耐药，对高浓度COX-2抑制剂塞来昔布耐药。在事先选择对化疗药物或塞来昔布耐药的细胞后，能够适应谷氨酰胺不可用的细胞数量增加，进一步支持了细胞适应性和治疗耐药之间的联系。Gln-ind细胞显示出氧化应激的迹象，并产生钙粘蛋白11和波形蛋白，这是间充质表型的指标。根据发生率和发生时间判断，Gln-ind细胞在裸鼠体内的致瘤性和转移性高于亲代细胞系。随着我们减少异种移植中癌细胞的数量，注射亲本细胞系的小鼠的肺转移和原发性肿瘤生长受到损害，但注射Gln-ind细胞的小鼠没有受到损害。
介绍
癌症的成功取决于癌细胞中不断产生的遗传和表观遗传异质性，以及选择能够适应和克服体内众多障碍的细胞[1]——[6]转移过程需要多个速率限制步骤，效率很低。血液循环中只有不到0.01%的癌细胞存活下来，从而产生实验性肺转移[5]——[7]转移瘤中的癌细胞也具有异质性，其中只有一小部分能够在患者或实验模型中产生新的转移[5]肿瘤异质性可以用1）发育层次来解释，其中一小部分细胞是干细胞样的，从而产生与母细胞不同特征的后代[6]和/或2）转移癌细胞基因组高度不稳定性[8],[9]在乳腺癌中，实际上在大多数癌症中，临床转移是长达数十年的达尔文进化式选择过程的最终结果，其中最具适应性的癌细胞持续存在。体内的选择压力包括新陈代谢挑战和免疫系统的攻击。为了开发有效的治疗转移性疾病的策略，最好使用在体外包含细胞异质性和高度适应性的系统，类似于临床转移中存在的系统。
体外选择方法非常适合选择能够经受代谢挑战的细胞变体。许多研究涉及研究致癌基因如何导致代谢失调，特别是有氧糖酵解，这会增加癌细胞的葡萄糖利用率[10]我们的方法不同，因为我们决定利用代谢状态的适应性从异质人群中选择转移癌细胞。我们这种方法背后的一个重要原因是，I-III期乳腺癌患者骨髓中存在的播散性肿瘤细胞在导致临床转移之前可以在相对休眠状态下存活数年[11],[12]因此，最终导致临床转移的癌细胞应该能够在长期的代谢挑战中存活下来。
谷氨酰胺（Gln）除了是蛋白质的构建块外，在癌细胞中也有重要作用，包括是合成代谢途径的碳和氮来源[13]谷氨酰胺对必需氨基酸的摄取也是必不可少的，这涉及使用双向转运体同时外排谷氨酰胺[14]在本研究中，我们研究了侵袭性乳腺癌细胞系中是否存在能够在缺乏Gln的情况下存活的变异细胞，以及这些细胞是否具有适应性，因此比亲本细胞系更易致癌和转移。癌细胞对外源性谷氨酰胺的依赖性由Myc蛋白驱动，Myc蛋白抑制miR-23a和miR-23b，导致谷氨酰胺酶（GLS）的诱导[15]Myc蛋白在侵袭性乳腺癌中经常过度表达，是代谢的关键调节器[16]众所周知，它还驱动预后不良的基因表达特征和胚胎样表型[17],[18].
COX-2在乳腺癌转移中起着关键作用，如对COX-2过表达的乳腺癌细胞系、骨转移的异种移植物小鼠模型以及在骨转移模型中使用COX-2抑制剂的研究所揭示的[19]在转移性克隆中，其表达与COX-2过表达相关的分子包括众所周知的NFκB靶点尿激酶纤溶酶原激活剂和白细胞介素-8，它们参与侵袭和血管生成[20],[21]其他人提供了令人信服的证据，证明COX-2参与乳腺癌向肺和脑的转移[22],[23]使用另一个实验室开发的常用球形培养方法，我们发现COX-2在肿瘤干细胞中起着重要作用[24]COX-2过度表达促进基因组不稳定，也导致治疗耐药性[25],[26]侵袭性乳腺癌，包括炎症性乳腺癌（IBC），过度表达大量NFκB靶基因。在对60个NFκB靶基因的分析中，发现35个在IBC原发肿瘤中过度表达[27]有趣的是，COX-2和CXCL1是35个基因中唯一在转移瘤中同时表达的两个基因[27]重要的是，Ⅰ-Ⅲ期乳腺癌患者原发肿瘤中COX-2的表达可预测肿瘤细胞向骨髓的扩散[28]它可以预测未来的转移[11]SUM149 IBC细胞系中NFκB的抑制显著抑制裸鼠的转移[29]有了这一压倒性证据支持COX-2参与乳腺癌转移，我们选择分析COX-2过度表达作为乳腺癌转移潜能的指标在体外在裸鼠异种移植实验之前，选择代谢可塑性癌细胞。我们还利用siRNA介导的敲除技术研究了与其他COX-2过表达细胞相比，Gln-ind细胞中COX-2信号的差异。
结果
从侵袭性Gln依赖乳腺癌细胞系中筛选Gln-ind变体
我们从研究乳腺癌细胞系对培养基中Gln的依赖性开始。我们的方法是确定长期存活的细胞亚群。我们观察到，Gln撤除对正常MCF10A、癌前MCF10A-COX2或低转移MCF7细胞系的生长没有明显抑制作用(). 与对照组相比，在4天内，所有3例患者的细胞数量减少了约50%，但存活的细胞生长到汇合处，可以长期培养。相反，Gln撤除严重抑制了转移细胞系MDA-MB-231、SUM149和4T1（所有3种细胞系中99%以上的细胞死亡）。这些结果表明乳腺癌细胞株对谷氨酰胺有依赖性，依赖程度与细胞株的转移能力有关。我们在缺乏Gln的培养基中追踪荧光素酶转染的SUM149-Luc细胞，以确定一些罕见的细胞在没有Gln的情况下能否存活数周。超过99.99%的细胞在这些条件下死亡。然而，我们惊讶地发现，在无Gln-free培养基中，少数细胞不仅存活，而且恢复了增殖。我们在一个最初含有50万个细胞的具有代表性的培养皿中，在四周内获得了13个肉眼容易看到的此类细胞集落。因此，存活和增殖的细胞比例为0.01%或更低。我们能够在无Gln-培养基中培养这些Gln-非依赖性（Gln-ind）变异细胞进行多次传代（>16）。我们同样能够从大多数乳腺癌细胞系中选择罕见的Gln-ind细胞，包括一些非常侵袭性的乳腺癌细胞株和SUM149，尽管它们的性质不同(,). 例如，从以下细胞系中选择的稀有Gln-ind菌落可以在无谷氨酰胺培养基中长期培养：SUM149-FP（我们实验室从脂肪垫肿瘤建立的细胞系）、SUM190 IBC细胞系、4T07和168FARN（两种小鼠乳腺癌细胞系）。另一方面，尽管MDA-MB-231和MDA-MB231-BSC60（转移克隆）人和4TI小鼠乳腺癌细胞系中有一些罕见的细胞存活，但它们需要Gln才能长期增殖。值得注意的是，我们能够从接种了亲本SUM149细胞系或其亲本SUM249细胞系的裸鼠新鲜分离的脂肪垫肿瘤中培养Gln-ind细胞在体外选定的Gln-ind变体（B Singh、S Madan和A Lucci，未发表的观察结果），进一步强调了这些细胞在肿瘤形成中的相关性。
谷氨酰胺缺乏对乳腺癌细胞株的影响。按照中所述，用或不用Gln培养指示细胞系材料和方法显示了完全培养基（+Gln）和无Gln培养基（−Gln）中培养物的照片。结果汇总于.
从乳腺癌细胞系中筛选Gln-ind变体。（A–C）将50万个细胞接种在一个10厘米的培养皿中。第二天，将培养基更换为含有透析胎牛血清的无谷氨酰胺培养基。拍摄在这些条件下生长2-4周的细胞集落。（D，E）用结晶紫染色的菌落盘。（F） SUM149-Luc-Gln诱导细胞在无Gln-培养基中生长。
表1
乳腺癌细胞系的谷氨酰胺依赖性。
| 细胞系 | 属性 | 无谷氨酰胺培养基中的生长抑制 |
| MCF10A型 | 正常 | 抑制力弱，逐渐融合 |
| MCF10A-COX2型 | 恶性肿瘤前期 | 抑制力弱，逐渐融合 |
| MCF7型 | 转移性较差 | 抑制力弱，逐渐融合 |
| MDA-MB-231型 | 元静态 | 严重抑制，但变异体存活 |
| 英国标准60 | 高转移性寻骨克隆 | 严重抑制，但变异体存活 |
| SUM149系列 | 变质和局部侵蚀 | 严重抑制，但变异体长期生长 |
| SUM149-黄色 | 变质和局部侵蚀 | 严重抑制，但变异体长期生长 |
| SUM149-螺纹-FP | 从脂肪垫异种移植物中培养 | 严重抑制，但变异体长期生长 |
| SUM190系列 | 变质和局部侵蚀 | 严重抑制，但变异长期增长 |
| 4T1型 | 高度转移 | 严重抑制，但变异产生菌落 |
| 2007年4月 | 在肺部形成微转移 | 严重抑制，但变异体长期生长 |
| 168法恩 | 产生淋巴结转移 | 严重抑制，但变异体长期生长 |
Gln-ind细胞代谢可塑性的分子基础
为了首先解决Gln-ind细胞如何在缺乏Gln的情况下存活，我们确定了它们是否比亲本细胞系的GLS（将Gln转化为Glu）水平降低。我们的western blot分析表明，Gln-ind变体的GLS水平低于亲本SUM149细胞的20%(). 我们认为，缺乏外源性Gln使增殖的Gln-ind细胞有必要合成并保存必要功能（如蛋白质合成）所需的足够Gln，从而降低其GLS水平。此外，包括GLS在内的代谢酶因其变构调节以适应底物和产物的细胞内水平而广为人知；在缺乏外源性谷氨酰胺的情况下，这种调节也可能发生。接下来，我们确定GLS的关键调节因子，即Myc蛋白，在Gln-ind细胞中是否也下调。值得注意的是，我们发现Gln-ind细胞中GLS水平的降低并没有伴随Myc水平的降低。相反，Gln-ind细胞含有适度升高的Myc蛋白（比亲本细胞系多50%；).
Gln-ind细胞中谷氨酰胺酶水平低。在Gln-ind和亲本SUM149-Luc细胞中，通过western blotting分析可能参与Gln成瘾（GLS，Myc）和转移（COX-2，Myc）的选定蛋白。由于通过western blotting发现Gln-ind细胞中的β-actin水平低于亲本细胞系，因此我们纳入了额外的凝胶负载对照：使用Hsp90和GAPDH抗体进行western blotting，并对凝胶进行考马斯蓝染色。
我们注意到，通过western blotting和考马斯蓝染色，Gln-ind细胞中的β-肌动蛋白水平低于亲本细胞系（肌动蛋白大小的条带由). 因此，我们使用了额外的对照（Hsp90和GAPDH）来规范凝胶负载。Gln-ind细胞中GAPDH和其他一些糖酵解酶（未显示）的蛋白质水平也低于亲代细胞系，这可能是在缺乏谷氨酰胺的情况下糖酵化总缓慢速率的一部分。
COX-2在Gln-ind细胞中的过度表达
为了确定Gln-ind细胞是否比亲代细胞系具有更高的恶性潜能，我们首先分析了COX-2蛋白水平。我们通过western blotting发现，Gln-ind细胞产生的COX-2蛋白水平大约是亲本细胞系的5倍(). 接下来，我们确定Gln-ind细胞中COX-2水平升高和GLS水平降低之间是否存在密切联系。我们发现，siRNA介导的COX-2敲除并没有改变Gln-ind细胞中的GLS水平，这表明COX-2的高表达与GLS水平的降低没有直接关系(). 这一结果促使我们进一步研究COX-2信号与代谢酶合成的关系，代谢酶由Myc蛋白调节，包括GLS、己糖激酶II和乳酸脱氢酶A（LDHA）。我们通过siRNA在过度表达COX-2的Gln-ind细胞和过度表达COX-2的塞来昔布耐药SUM149-CER细胞中敲除COX-2[30]，以确定COX-2在代谢可塑性细胞中的信号是否与其他细胞不同。根据无Gln的选择存活的细胞数量（<0.01%）与塞来昔布治疗存活的细胞数（1-10%），Gln-ind细胞可能是COX-2的一个小亚群高的SUM149细胞系中存在的细胞在塞来昔布存在下存活。SUM149-CER细胞中COX-2的敲除，但Gln-ind细胞中没有，导致Myc蛋白和Myc调节的代谢酶：GLS、己糖激酶II和LDHA的水平降低（比较和). 我们认为Gln-ind细胞中的信号节点，例如COX-2和Myc，以高度自适应的方式与代谢状态进行通信（参见). 即使Myc和COX-2水平较高，Gln-ind细胞也可以降低GLS水平，以应对外源性Gln的不可用性。
COX-2敲除不影响Gln-ind细胞中Myc、GLS、HK II和LDH A蛋白水平。我们用COX-2特异性siRNA或对照siRNA转染生长不含Gln的SUM149-Gln-ind细胞，并通过western blotting与亲本SUM149-Luc细胞系中的细胞相比，分析Myc和参与Myc介导的糖酵解（己糖激酶II和乳酸脱氢酶a）和谷氨酰胺酶（谷氨酰胺酶）的一些蛋白的水平。
在COX-2过表达、塞来昔布耐药的SUM149-CER细胞系中，COX-2的功能与Myc在调节糖酵解和谷氨酰胺解方面有关。我们用COX-2特异性siRNA或对照siRNA转染SUM149-CER细胞，并通过western blotting分析Myc和参与Myc介导的糖酵解（己糖激酶II和乳酸脱氢酶a）和谷氨酰胺酶（谷氨酰胺酶）的一些蛋白的水平。
模型总结了western blot分析和其他数据。适应性Gln-ind细胞具有高水平的COX-2和Myc蛋白，但它们能够分离Myc表达和GLS表达。大多数缺乏这种适应性的细胞可能在无谷氨酰胺培养基的初始选择中死亡。如本研究所述，折断的箭头表示Gln-ind细胞中COX-2功能与Myc功能分离的适应性，以及Myc功能与GLS水平分离的适应性。
我们还通过western blotting分析了SUM149-CER细胞中COX-2敲除对表皮生长因子受体（EGFR）水平的影响。EGFR在包括IBC在内的侵袭性乳腺癌中起主要作用。EGFR过表达在低糖培养条件下对乳腺癌细胞的存活也很重要，这种作用与其蛋白激酶活性无关[31]有趣的是，我们发现COX-2敲除导致SUM149-CER细胞中EGFR水平显著降低()表明COX-2信号和EGFR表达之间存在串扰。
COX-2过度表达的机制
氧化应激是COX-2过度表达的常见触发因素。为了确定氧化应激是否会驱动Gln-ind细胞中COX-2的过度表达，我们分析了细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）的水平，这是氧化还原状态的指标。我们发现Gln-ind细胞的谷胱甘肽水平低于亲本SUM149-Luc亲本细胞系，因此支持我们的假设(图S1). 由于Gln-ind细胞中还原性谷胱甘肽的水平极低，接近我们的检测下限，我们无法准确测定还原百分比。我们还发现Gln-ind细胞也有低水平的氧化谷胱甘肽（GSSG）（约为亲本细胞系水平的40%；图S1)，表明它们调节氧化还原状态的能力较低。在另一种方法中，我们发现在培养基中添加N-乙酰半胱氨酸（NAC）24小时以降低氧化应激导致Gln-ind细胞中COX-2的生成降低(). 1 mM剂量的NAC抑制Gln-ind细胞中COX-2的生成，但不抑制亲代SUM149-Luc细胞中的COX-2生成(). 在较高的2.5 mM剂量下，NAC对Gln-ind和亲代细胞系中的COX-2均有抑制作用，但对Gln-nd细胞的抑制率较高。应激介导的COX-2诱导可能涉及NFκB转录因子与COX-2基因启动子结合，尽管也可能有其他机制。为了确定NFκB是否参与其中，我们在培养基中添加了一种NF-κB活化途径的特异性抑制剂BAY-11-7082，持续24小时。通过western blotting对COX-2的分析表明，BAY-11-70 82处理导致生长有或无Gln的Gln-ind细胞中COX-2水平降低(图S2). 在这些条件下，亲代细胞中的COX-2水平未受影响(图S2).
N-乙酰半胱氨酸治疗后COX-2水平降低。我们将双亲SUM149-Luc和Gln-ind细胞系（均生长在含谷氨酰胺的培养基中）暴露于N-乙酰半胱氨酸24小时，然后使用等量的细胞裂解物进行蛋白质印迹。由于β-肌动蛋白不是蛋白质负荷的可靠指标，我们平行运行凝胶并用考马斯蓝染色。左侧面板底部的车道编号1–6对应于右侧面板中的车道编号1-6。
Gln-ind细胞的适应性
我们发现Gln-ind细胞可以像亲本细胞系一样有效地利用Gln。在向培养基中添加Gln后的一天内，我们观察到GLS的诱导(顶部）。Gln-ind细胞在无Gln-free培养基中的增殖速度比在含Gln-培养基中增殖的亲本细胞系慢约50%。然而，加入Gln后，Gln-ind细胞恢复了与亲本细胞系相似的增殖速度。这些结果表明，在缺乏谷氨酰胺的情况下存活下来的稀有细胞在谷氨酰胺的利用方面没有缺陷；相反，它们拥有更具适应性的代谢状态。在含有Gln的培养基中培养8代后，Gln-ind细胞在没有Gln的情况下保持增殖能力。正如预期的那样，谷氨酰胺的退出减缓了它们的生长，但大多数细胞存活并恢复了增殖(底部）。这些结果表明，Gln-ind细胞在含有Gln的培养基中保持适应性代谢状态。
谷氨酰胺依赖型表型具有适应性但稳定。
顶部面板：在含谷氨酰胺的培养基中诱导GLS生长。将生长在无Gln培养基中的SUM149-Gln-inded细胞转移到含有Gln的培养基中，并在培养基改变后的不同时间点用western blotting分析GLS。底部面板：显示了不同条件下生长的细胞形态。（A） Gln-ind细胞在没有Gln的情况下生长。（B） Gln-ind细胞在有Gln的情况下生长（它们在生长时表现出更快的生长和形态改变）。（C） Gln-ind细胞在含有Gln-的培养基中培养8代，然后转入无Gln-培养基培养7天。
接下来，我们确定SUM149-Gln-ind变异体在其他代谢挑战下是否具有适应性，例如葡萄糖不可用。我们在无葡萄糖培养基中培养细胞28天（培养基包括两种细胞系的Gln），然后用含有葡萄糖的完整培养基替换培养基。为了确定在缺乏葡萄糖的情况下存活下来的（克隆）细胞数量，我们在完全培养基中培养13天后用结晶紫染色培养皿。根据菌落数量判断，Gln-ind变异体在缺乏葡萄糖的情况下比亲代细胞系存活得更好(). 解释这一结果的一种方法是，谷氨酰胺的不可用性迫使细胞进行选择，从而减缓其整体代谢，包括葡萄糖利用。为了支持这一观点，我们注意到，与亲本细胞系相比，Gln-ind细胞产生的糖酵解酶3-磷酸甘油醛脱氢酶水平降低了约50%(). 因为葡萄糖在细胞新陈代谢中起着主要作用，也在调节新陈代谢状态中起着重要作用[32]——[34]，Gln-ind细胞在没有葡萄糖的情况下生存的能力意味着它们具有高度的适应性。
在缺乏葡萄糖的情况下，与亲代细胞相比，Gln-ind具有更高的适应性/存活率。细胞培养物被剥夺葡萄糖28天，然后恢复并生长13天，然后菌落被结晶紫染色。Gln-ind细胞（右）产生了大量的菌落，尽管菌落较小。
无血清Gln-ind细胞的存活和生长
在疾病的发展过程中，转移癌细胞必须能够生存下来，不仅是新陈代谢的挑战，而且是缺乏生长因子的挑战。因此，了解Gln-ind细胞是否比亲本细胞系更能在无生长因子的情况下存活可能是有用的。我们之前已经报道过，COX-2在MCF10A细胞系中的过度表达可以减少细胞生长培养基中EGF的需求[25]我们分析了从培养基中长时间（25天）提取血清的效果。我们发现一些Gln-ind细胞存活并增殖，产生大的集落，而亲本细胞系没有产生任何这样的集落(). 这一结果表明，Gln-ind细胞对生长因子的依赖性较低。通过减少对基质/微环境的依赖，这种特性在肿瘤生长和转移过程中可能具有潜在的优势。
（A） 在无血清的情况下，Gln-ind与亲代细胞相比具有更高的适应性/存活率。细胞培养物被剥夺血清25天，所得菌落被结晶紫染色。（B） Gln-ind与亲代细胞相比具有更高的锚定独立性。将12000个细胞在含有0.35%低熔体琼脂糖的Gln培养基中培养23天，并用结晶紫对所得集落进行染色。
Gln-ind细胞对凤尾草无依赖性，对阿霉素和紫杉醇耐药
接下来，我们表演了一些在体外检测Gln-ind细胞是否比亲本细胞系更具攻击性。首先，在软黄试验中，为了确定其与凤尾鱼无关的生长，Gln-ind细胞产生了比亲本细胞系更多更大的菌落(). 然后我们比较了Gln-ind和亲代细胞在常用化疗药物阿霉素和紫杉醇存在下的生存能力。细胞在含有谷氨酰胺的培养基中暴露于200 nM阿霉素或5 nM紫杉醇7天。大约99%的细胞在这种治疗下死亡。为了确定耐药细胞的相对存活率，我们通过用不含药物的新鲜培养基更换培养基来去除药物，并在染色前留出菌落生长的时间。通过这种方式，我们发现在阿霉素和紫杉醇治疗下，Gln-ind细胞比亲代细胞产生更多的集落(). 因此，癌细胞中适应性代谢状态的选择也会选择化疗耐药。作为显示Gln-ind表型与化疗耐药之间关系的补充方法，我们发现，根据集落数判断，首次选择用阿霉素或紫杉醇治疗存活数天的SUM149细胞在退出Gln后的存活率高于未选择的细胞(图S3). 在这些实验中，首先让耐药存活细胞在无药物的完全培养基中恢复，然后将其停药4-5周。先前关于COX-2过表达乳腺癌细胞和化疗耐药乳腺癌细胞的研究表明，Gln-ind细胞中COX-2的高表达可能是其对化疗药物耐药的原因[26],[30].
Gln-ind细胞对阿霉素和紫杉醇的耐药性增加。用200 nM阿霉素（顶部）或5 nM紫杉醇（底部）处理亲代SUM149-Luc细胞系或Gln-ind细胞7天，如材料和方法在对菌落染色之前，在无药物培养基中恢复2周（阿霉素治疗）或1周（紫杉醇治疗）。
Gln-ind细胞中COX-2过度表达与塞来昔布耐药相关
乳腺癌细胞中COX-2的表达可能与COX-2抑制剂（例如塞来昔布）的反应有关。但是COX-2的过度表达也可能导致乳腺癌细胞亚群对塞来昔布的耐药性[30],[35],[36]我们发现一小部分SUM149细胞亚群可以耐受10–20µM塞来昔布[30]塞来昔布耐药SUM149细胞表达的COX-2水平高于亲本细胞系，表明塞来昔布耐药是由COX-2过度表达驱动的[30]在另一项涉及小鼠乳腺癌模型的研究中，COX-2抑制剂（塞来昔布或SC-236）延缓/抑制肿瘤生长；然而，由于肿瘤中COX-2的过度表达，对COX-2抑制剂产生了耐药性[35],[36]最初，我们发现亲本细胞系和Gln-ind细胞系都含有大量的细胞，这些细胞在接触10µM塞来昔布后很容易存活。为了确定Gln-ind细胞是否具有很高的驱动塞来昔布耐药性的潜力，我们用50µM塞来昔卜处理Gln-inds细胞和亲代SUM149-Luc细胞系（均在含谷氨酰胺的完全培养基中）5天。然后我们让塞来昔布耐药细胞在不含塞来昔伯的培养基中恢复。通过这种方式，我们发现Gln-ind细胞（而非亲本细胞系）含有能够在50µM塞来昔布存在下存活5天的细胞。这种对塞来昔布具有耐药性的Gln-ind细胞产生的细胞集落可以在培养基中无限期生长().
Gln-ind细胞对塞来昔布的耐药性。用50µM塞来昔布处理亲本SUM149-Luc细胞系或Gln-ind细胞的100万个细胞，使罕见的存活细胞生长成集落。然后通过胰蛋白酶将细胞分散，并将其置于含有谷氨酰胺（完全培养基）或不含谷氨酰胺的培养基中。
为了进一步证明COX-2在Gln-ind表型中的重要性，我们首先从用10µM塞来昔布治疗7天后的亲本细胞系中选择细胞，让它们在无药物培养基中恢复3天，然后使其退出Gln。通过这种方式，我们发现塞来昔布耐药的SUM149细胞产生的Gln-ind集落比单用溶剂二甲基亚砜处理的亲本细胞系更多(图S4). 这些结果表明，COX-2过表达在Gln-ind细胞在缺乏Gln的情况下的存活中具有重要作用。
Gln-ind细胞比亲代细胞系更具致瘤性和转移性
我们测定了Gln-ind细胞在裸鼠异种移植模型中形成肿瘤和转移的能力。我们将2亿到200万个荧光素酶转染的细胞重复注射到裸鼠的胸部脂肪垫中，并使用全身荧光素酶成像监测肿瘤生长和皮肤转移。由于脂肪垫中的原发肿瘤发出的荧光素酶信号相对较高，位于肺部附近，因此通过荧光素酶成像检测肺转移是不可行的。因此，我们选择通过对肺部匀浆进行荧光素酶活性测定来分析肺转移。我们在最近的一项研究中表明，当将裸鼠注射到含有200万SUM149-Luc细胞的脂肪垫中时，所有小鼠都发生了荧光素酶活性检测到的肺转移[37]该结果与另一个实验室的早期研究一致，该实验室注射了100万SUM149细胞，并通过检查病灶分析了肺转移[29]在另一项使用我们的SUM149-Luc细胞系进行的研究中，使用体外荧光素酶成像（向小鼠注射D-荧光素，采集肺部和图像），与肺组织切片苏木精和伊红染色检测相关[38].
在本研究中，注射200万或200000 SUM149-Luc亲代细胞的小鼠发生了肺转移。然而，在注射了20000 SUM149-Luc细胞的两只小鼠中，只有一只小鼠检测到了肺转移（这两只小鼠都发生了原发性肿瘤）。在一只注射了2000个SUM149-Luc细胞的小鼠中，没有检测到肺转移，这些细胞发展成了原发性肿瘤（第二只小鼠没有发展成原发性癌或肺转移）。相反，所有注射了Gln-ind细胞的小鼠，包括那些注射了200个细胞的小鼠都发生了肺转移。包括对照组2只小鼠和Gln-ind组1只小鼠的荧光素酶图像、它们的肿瘤重量和肺中的荧光素酶活性；中显示的所有数据同时并行收集。值得注意的是，随着注射细胞数量的减少，注射亲本细胞系的小鼠即使原发肿瘤生长良好，也未观察到肺转移(). 在注射细胞后的第153天，我们将实验中剩下的所有小鼠处死。我们发现，一只注射了200个亲代SUM149-Luc细胞的小鼠出现了生长非常缓慢的肿瘤，3个月后通过荧光素酶成像检测到，153天时原发肿瘤重0.04克。另一只注射了200个亲代SUM149细胞的小鼠和两只注射2000个亲代SUM149细胞小鼠中的一只在第153天没有肿瘤生长。所有注射了Gln-ind细胞的小鼠，包括只注射了200个细胞的两个小鼠，都发生了早在62天就能通过荧光素酶成像观察到的肿瘤(). 还显示了在第34天荧光素酶成像检测到的所有剩余小鼠早期的相对肿瘤负担(图S5). 总之，当我们减少异种移植中的癌细胞数量时，注射亲本SUM149-Luc细胞的小鼠的肺转移和原发性肿瘤生长受到损害，而注射谷氨酰胺依赖细胞的小鼠则没有。这些观察结果，尤其是注射了20000个或更少细胞的小鼠的观察结果表明，与亲代细胞系相比，Gln-ind细胞具有更强的致瘤性（原发肿瘤发生率更高，出现更快）和更高的转移性（肺转移发生率更大）。
注射Gln-ind细胞的裸鼠肺转移增加。在第83天收集注射到脂肪垫的小鼠荧光素酶图像，显示细胞类型和细胞数量。在第90天处死三只小鼠，称重其原发肿瘤，并测定其肺部的荧光素酶活性。数据表明，注射20000或2000 SUM149-Luc细胞的小鼠肺转移受损。相比之下，所有注射了Gln-ind细胞的小鼠，包括那些注射了200个细胞的小鼠都发生了肺转移。
注射亲本SUM149-Luc细胞而非Gln-ind细胞的小鼠在减少注射细胞数量后，原发性肿瘤生长受损。将细胞（2亿至200万）重复注射到44天龄裸鼠的胸部脂肪垫中（细胞数量从左至右递减）。第62天收集的荧光素酶图像显示，注射亲本细胞系的小鼠的原发肿瘤生长在注射细胞数量减少到2000个以下时显著减少或消失。相反，所有注射了Gln-ind细胞的小鼠都发生了肿瘤，包括两个只注射了200个细胞的小鼠。左边的空插槽对应于因肿瘤负担高而需要处死的小鼠。
众所周知，炎症性乳腺癌会转移到皮肤。为了比较Gln-ind细胞与亲代SUM149-Luc细胞系引起皮肤转移的能力，我们在两组中选择了具有代表性的萤光素酶图像，使得两组的原发性肿瘤负担相当(图S6). 尽管我们在不同的日子对小鼠进行了成像，但我们使用Living Image程序中常见的最小值和最大值设置对图像进行了归一化以进行比较。通过这种方式，我们发现Gln-ind细胞比亲代细胞引起更多的皮肤转移，这种转移被观察到是散布在身体上的荧光素酶阳性斑点（见图S6). 我们通过手术证实了皮肤转移体外实验结束时，在两只小鼠的解剖皮肤上进行荧光素酶成像。该数据显示，注射亲代SUM149-Luc和Gln-ind细胞的小鼠皮肤中的荧光素酶阳性信号(图S7). 这些数据以及上述肺转移数据表明，与亲代细胞系相比，Gln-ind细胞的整体恶性程度更高。
另一方面，虽然我们没有设计这项研究来比较其他器官的转移，但我们分析了一只小鼠的脑和肝转移，每只小鼠分别注射200000 SUM149-Luc细胞和20000 Gln-ind细胞。显示了这些小鼠的数据以及荧光素酶图像、肿瘤重量和肺转移信息(图S8). 通过对组织匀浆进行荧光素酶活性测定，我们发现两种小鼠的脑和肝转移均呈阳性，表明异种移植小鼠模型重现了IBC的侵袭性特征。
钙粘蛋白11和波形蛋白在Gln-ind细胞中的过度表达
为了确定转移增加的分子基础，我们分析了Gln-ind细胞中钙粘蛋白11的水平。我们从COX-2过度表达塞来昔布耐药SUM149-CER细胞系（B Singh和a Lucci，未发表数据）中的基因表达谱预测了钙粘蛋白11的高表达。钙粘蛋白11，也称为间充质钙粘蛋白，在经历上皮-间充质转化（EMT）的癌细胞中表达。钙粘附素11在细胞运动、侵袭、同型细胞间相互作用以及癌细胞与基质的相互作用中可能很重要[39]我们通过western blot分析发现，Gln-ind细胞中的钙粘附素11水平显著高于亲本SUM149细胞(). 其他研究表明，EMT与癌症干细胞表型相关[40]我们还分析了EMT的另一个重要标志物中间丝蛋白波形蛋白，并通过western blotting和考马斯蓝染色发现波形蛋白在Gln-ind细胞中过度表达(). 我们还发现，在瞬时转染实验中，siRNA-介导的COX-2敲除并不影响波形蛋白水平()这是一种相对稳定的蛋白质。
Gln-ind细胞中钙粘蛋白11水平增加。我们通过western blotting检测了亲本SUM149-Luc细胞系和Gln-ind细胞系中钙粘蛋白1的水平，这两个细胞系都生长在含有Gln的培养基中，而Gln-ind-细胞生长时没有Gln，如底部所示。
检测Gln-ind细胞中的波形蛋白。
左侧，我们用COX-2特异性siRNA或阴性对照siRNA转染SUM149-Luc和Gln-ind细胞，让细胞在有或无Gln的情况下生长3天，如底部所示，然后进行western blotting检测波形蛋白。对，用SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析亲本SUM149-Luc细胞系和Gln-ind细胞的裂解物。箭头表示Gln-ind细胞中存在一条明显的波形蛋白大小带，而亲本细胞中不存在。左侧车道显示预处理分子量标记。所有样品均在单一凝胶上进行；然而，我们删除了兴趣车道之间存在的一些无关车道。
在另一项实验中，我们发现，与我们之前的研究相似，COX-2过度表达的乳腺癌细胞系中，前尿激酶纤溶酶原激活物（pro-uPA）高表达[20]，pro-uPA在Gln-ind细胞中过度表达（B Singh、AM Cady和A Lucci，未发表数据），为侵入基底膜提供了基础。这些结果以及细胞适应性的结果为Gln-ind细胞的致瘤性和转移潜能的增加提供了基础。
讨论
肿瘤中癌细胞的遗传和表观遗传异质性是个体化治疗的主要障碍。目前的个性化治疗方法主要是为了抑制单个蛋白的细胞增殖功能，除非我们也针对癌细胞的适应性，否则可能不会成功。我们的研究表明，通过长时间剥夺谷氨酰胺来选择适应性强的稀有癌细胞是可行的。这种方法可以扩展到培养基中的其他成分，如葡萄糖、其他氨基酸、氧气等。不同的剥夺可能会选择在适应性代谢状态中重要的常见元素，以及在这些条件下生存和生长所需的一些营养特异性元素。目前，正在设计治疗方法来抑制大量增殖癌细胞中的癌症代谢[41],[42]研究在没有特定营养素的情况下存活的高度适应性转移癌细胞，可以教会我们对基于代谢和细胞增殖的治疗产生耐药性的机制，并有助于制定对抗这种耐药性的策略。
在不含谷氨酰胺或葡萄糖的培养基中进行选择，可能有利于能够承受高氧化应激的细胞。侵袭性乳腺癌细胞系的特点是高水平的氧化应激，表现为低GSH和低GSSG水平[43]。由于SUM149是一种非常具有攻击性的细胞系，它可能具有相对较高的氧化应激。缺乏营养可能会进一步增加压力，可能会杀死大多数细胞。谷氨酰胺戒断后大多数（>99.99%）细胞死亡的另一个原因可能是营养感应反应，而不是直接涉及应激反应[14]存活下来的罕见细胞要么是通过耐受更多压力的能力，要么是通过其他处理营养缺乏的机制。我们的结果表明，Gln-ind细胞的GSH和GSSG水平甚至低于亲本细胞系(图S1). 我们的结果也提供了证据，表明Gln-ind细胞中的氧化应激可能是COX-2过度表达和NFκB活化的原因(,S2系列). 有证据表明，应激通过影响DNA甲基化和组蛋白修饰来影响表观遗传状态[44]以这种方式创造的表观遗传状态也会允许耐受压力，这是合理的。我们支持这样一种可能性，即能够耐受极端压力（包括代谢挑战所施加的压力）的罕见细胞具有独特的表观遗传状态。
解释肿瘤异质性和治疗耐药性的一种方法是，干细胞样癌细胞的亚群控制着这些特性。乳腺中类似干细胞或祖细胞的罕见癌细胞导致乳腺癌的观点得到了广泛支持。在这项侧重于临床翻译的研究中，我们通过选择具有代谢可塑性的侵袭性癌细胞来探讨细胞异质性问题。我们认为细胞的适应性可能是茎干的一个重要特征。在这方面，最近的一项研究发现，胶质瘤干细胞（而非“分化”胶质瘤细胞）具有灵活的代谢状态，可以利用多种代谢途径来产生能量[45]。在当前和未来的研究中，我们将优先考虑确定是否可以通过针对癌症干细胞的治疗方法来根除Gln-ind细胞。
我们的转移癌细胞富集方法与其他基于功能的方法相比如何在体外选择方法？一种显著的方法是在软琼脂或硬琼脂中选择凤尾鱼非依赖性细胞，该方法已在包括乳腺在内的不同器官部位的癌细胞系的多项研究中使用。该方法选择异种移植小鼠模型中转移的侵袭性细胞[46]——[50]重要的是，以这种方式选择的高度独立于锚定物的细胞不仅在免疫功能低下的裸鼠中具有转移性，而且在免疫功能正常的同基因小鼠中也具有转移性[46],[47]值得注意的是，Gln-ind细胞比亲本细胞更不依赖于凤尾鱼(). 这将有助于发现在硬琼脂上选择的转移癌细胞是否也具有更强的代谢适应性。了解Gln-ind细胞在免疫活性小鼠中是否具有转移性也很重要。这个问题可以通过使用我们从小鼠乳腺癌细胞系4T1、4T07和168FARN中选择的Gln-ind细胞来解决(). 与在硬琼脂中生长相比，我们选择的优点是我们的选择定义明确，易于执行，而且这种选择很可能发生在体内。我们的方法可能适用于大多数肿瘤类型和亚型，并且能够选择大范围的细胞异质性。总之，这两种方法都有其独特的优势，使其发挥作用。虽然这两种选择方法在表面上不同，但它们都可以选择适应性细胞，一种是通过代谢可塑性，另一种是由于结构可塑性。
现在的问题是在体外这些检测将有助于发现安全有效的治疗方法来预防和治疗转移。显然，在微转移进展为临床转移之前解决这个问题会更好。鉴于新疗法在临床上的失败率很高，最重要的是我们有优越的临床前模型，并且候选疗法在患者身上进行测试之前要通过更严格的疗效测试。这样，我们就能更好地应对这种数十年来经常在体内“进化”的疾病。我们相信卓越在体外测试将在开发抗击侵袭性癌症所需的联合疗法方面发挥重要作用。
材料和方法
道德声明
根据德克萨斯大学MD安德森癌症中心动物护理和使用委员会批准的动物方案（ACUF方案#12-11431，题为“乳腺癌转移中的代谢可塑性”，首席研究员Anthony Lucci）对裸鼠进行研究。
细胞系和培养
MCF10A和MCF10A-COX2（COX-2转染）细胞系[25]将其保存在补充有5%热灭活马血清（Invitrogen，Carlsbad，CA）、10µg/ml胰岛素、20 ng/ml表皮生长因子、0.1µg/ml霍乱毒素、0.5µg/m氢化可的松、100单位/ml青霉素和100µg/m1链霉素的DMEM/F12培养基中。在添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中培养MCF7、MDA-MB-231和MDA-MB231-BSC60细胞系。MDA-MB-231-BSC60是我们实验室通过心脏心室接种和骨转移细胞培养在雌性裸鼠体内进行两轮筛选后分离出的MDA-MB-231的转移性变体[21]SUM149和SUM190炎性乳腺癌细胞系最初从Stephen Ethier（Barbara Ann Karmanos cancer Institute，Detroit，MI，USA）获得，在添加了5%FBS、5µg/ml胰岛素、1µg/ml氢化可的松、100 U/ml青霉素和100µg/m1链霉素的Ham’s F-12培养基中在5%加湿CO中生长2大气。我们之前描述过SUM149-Luc，一种荧光素酶转染的细胞系[37]和SUM149-CER，一种塞来昔布耐药COX-2过表达细胞系[30]SUM149-FP是我们实验室最近开发的另一种细胞系，首先在雌性裸鼠体内从SUM149异种移植物培养，然后从脂肪垫异种移生物培养。具有不同转移潜能的4T1、4T07和168FARN小鼠乳腺癌细胞系，最初在弗雷德·米勒实验室分离[51]从Ralph Arlinghaus（MD Anderson癌症中心）获得，并在添加10%FBS的DMEM/F-12培养基中生长。
细胞系谷氨酰胺依赖性的测定
最初，我们调查了乳腺癌细胞系对谷氨酰胺（Gln）生长的相对依赖性。为此，我们在10厘米的培养皿中培养了50万个细胞。第二天，我们取出培养基，用磷酸盐缓冲盐水冲洗盘子两次，并添加含有透析FBS（Invitrogen）和缺乏Gln的新培养基。我们追踪培养物以确定长期剥夺谷氨酰胺的影响。如果培养物（例如MCF10A细胞系）生长时对谷氨酰胺缺乏影响很小，我们将其在无谷氨酰胺培养基中至少传代3次，以确认培养物可以在无谷氨酸的情况下生长。另一方面，如果在最初培养皿中提取Gln导致近完全抑制，例如在高度侵袭性SUM149细胞系中，我们跟踪这些培养皿3-4周，以确定某些变体是否能够存活并产生菌落。
Gln-ind变体的选择和培养
本研究的主要目的是研究侵袭性乳腺癌细胞系中罕见的Gln-ind变异。我们在最初的实验中注意到，在Ham的F-12培养基中培养的细胞株产生了更健康的Gln-ind细胞集落，并且Gln-inds细胞在该培养基中增殖良好。因此，我们利用Ham的F-12培养基和通常培养特定细胞系的培养基来选择Gln-ind变体。通过这种方式，我们发现Ham的F-12培养基在筛选和培养Gln-ind细胞方面优于其他培养基。为了使选择更加稳健，我们至少等待了3-4周，直到Gln上瘾细胞完全消除。当菌落生长到肉眼可见的大小时，我们计算菌落的数量，并开始将其传代进行长期培养。以这种方式选择的大多数Gln-ind变体可以在无Gln-free培养基中长期培养。然而，从一些细胞系分离出的Gln-ind变体需要Gln进行长期培养。
用siRNA敲除COX-2
我们在SUM149-CER细胞系中进行了COX-2敲除[30]根据制造商的说明，使用COX-2特异性沉默剂选择siRNA s11473和沉默剂选择阴性对照#1 siRNA（均来自加利福尼亚州福斯特市的Applied Biosystems），以及siPORT NeoFX转染剂（Applied biosystem）。我们在Gln-ind细胞中进行了类似的COX-2敲除，只是在转染期间我们使用了缺乏Gln的培养基。
蛋白质免疫印迹
如前所述，我们通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，并通过蛋白质印迹检测各种蛋白质[18]使用ECL Advance western blot检测试剂（GE Healthcare Biosciences，Piscataway，NJ）。以下主要抗体用于检测：抗COX-2单克隆抗体（Cayman Chemical，Ann Arbor，MI）、抗GLS（Abcam，Cambridge，MA）、抗Myc、抗LDH A、抗己糖激酶II、抗GAPDH、抗钙粘蛋白11和抗波形蛋白抗体（Cell Signaling，Danvers，MA，）。通过在0.5%Triton X-100中培养膜来剥离过滤器，并使用单克隆β-肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）或Hsp90抗体（Cell Signaling）（用作凝胶负载对照）进行再感染。我们每个蛋白印迹至少进行3次。我们使用ImageJ图像处理程序（美国国立卫生研究院）量化了x射线胶片上的蛋白质带。
适应性分析
为了确定Gln-ind细胞的适应性，我们开发了两种分析方法：一种用于应对代谢挑战的适应性，另一种用于面对缺乏生长因子的情况。为了确定Gln-ind细胞代谢状态的适应性，我们剥夺了他们28天的葡萄糖，并评估了与亲代细胞系中存活的葡萄糖剥夺细胞相比，存活的细胞数量是否更多。癌细胞对葡萄糖有很高的依赖性，因此大多数癌细胞都会在缺乏葡萄糖的情况下死亡。该检测的基础是，极少数细胞在极端葡萄糖缺乏状态下长期存活可能会选择具有高度适应性代谢状态的细胞。我们在一个10厘米的培养皿上培养了50万个细胞，将其换成无葡萄糖培养基（来自马里兰州巴尔的摩AthenaES的定制培养基）培养28天，然后将其换回完整培养基培养2周，直到存活的细胞产生菌落。我们用水晶紫给菌落染色并拍照。
血清中的因子调节细胞，这也涉及指示细胞增殖。我们第二次检测的基本原理是，与大多数癌细胞相比，驱动疾病的高度适应性罕见癌细胞对外源性因素的依赖性相对较小。在这项试验中，我们将50万个细胞置于一个10厘米的培养皿中，并将其永久性地切换到无血清培养基中，从而有足够的时间选择能够存活并生长为菌落的罕见、适应性强的细胞。我们用水晶紫给菌落染色并拍照。
软琼脂集落形成试验
我们在一个6孔培养皿中，将每孔12000个细胞置于0.35%低熔点琼脂糖（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）的1 mL含有谷氨酰胺和透析FBS的培养基中，该培养基位于相同培养基中1 mL 0.5%琼脂糖层的顶部。我们每周每孔添加0.2 ml培养基以补充培养基。23天后，我们用结晶紫给菌落染色并拍照。
化疗药物和塞来昔布耐药检测
我们在培养基中用谷氨酰胺将每10厘米培养皿中100万个细胞重复培养。24小时后，我们添加溶解在二甲基亚砜中的阿霉素（0-400nM）或紫杉醇（0-10nM）。我们继续药物治疗长达七天，同时在显微镜下监测药物反应。然后我们取出含药物的培养基，用PBS洗涤两次，在不含药物的含Gln培养基中培养几天，直到肉眼可见的菌落出现。菌落被水晶紫染色并拍照。我们通过用50µM塞来昔布处理细胞5天，然后让最罕见的耐药细胞生长成菌落，以类似的方式测定对塞来昔伯的耐药性。
异种移植实验
我们用异氟醚吸入麻醉了20只44天大的雌性裸鼠（印第安纳波利斯州哈兰市）。我们将Gln-ind或亲本SUM149-Luc细胞以200万、20万、20000、2000或200个细胞的量在重复小鼠中直接注射到左上乳腺脂肪垫中。每次注射时，我们将癌细胞悬浮在0.05 ml无血清培养基中，并将其与等体积的Matrigel（Fisher Scientific）混合。从癌细胞注射后14天开始，我们使用全身荧光素酶成像（Xenogen IVIS System 200；Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA）检测原发性肿瘤和皮肤转移。通过腹腔注射给每只小鼠服用1 mg D-荧光素钾盐和0.1 ml磷酸盐缓冲盐水，然后用异氟醚麻醉。从D-荧光素注射后5分钟开始，在腹部位置采集生物发光图像各1分钟。通常，一次拍摄五只老鼠的图像。生物发光肿瘤细胞发出的光水平由IVIS摄像系统检测、集成、数字化和显示。为了清楚起见，我们将脂肪垫中的肿瘤称为原发性肿瘤，尽管无法区分原发性肿瘤和局部转移瘤。在实验结束时，我们用一氧化碳对小鼠实施了安乐死2吸入，切除肿瘤并称重。为了量化肺转移，我们在1 ml细胞裂解缓冲液（25 mM三磷酸腺苷，pH 7.8，2 mM二硫苏糖醇，2 mM1,2-二氨基环己烷-N，N，N′，N′-四乙酸，10%甘油，1%Triton X-100）中采集肺，通过用手术刀将肺切成小块，然后均匀化，制备裂解物，并用试剂盒（Promega）和光度计测定相对荧光素酶活性。
支持信息
图S1
Gln-ind细胞中谷胱甘肽含量低。我们从SUM149-Luc细胞系（亲代）和Gln-ind细胞系中制备了细胞裂解物，这两种细胞系都在含有Gln的培养基中生长，并用BioVision（Milpitas，CA）的试剂盒测量了还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。GSH和GSSG水平代表3个测量值的平均值，这些测量值标准化为相同的蛋白质基础。
（畅通节能法）
图S2
BAY-11-7082治疗后COX-2水平降低。我们将亲本SUM149-Luc和Gln-ind细胞系暴露在含有谷氨酰胺的培养基中（顶部和中间面板），以及生长在不含Gln的培养基（底部面板）中，使其接触指示浓度的BAY-11-7082或仅接触二甲基亚砜溶剂24小时，然后使用等体积的细胞裂解物进行western印迹。
（畅通节能法）
图S3
预先选择化疗耐药后Gln-ind表型的富集。亲代SUM149-Luc细胞单独用二甲基亚砜溶剂或用200 nM阿霉素处理3天，在无药物培养基中恢复17天，然后在染色前用胰蛋白酶处理并在无谷氨酰胺培养基中电镀32天（上图）。同样，亲代SUM149-Luc细胞单独用二甲基亚砜溶剂或用5 nM紫杉醇处理3天，在无药物培养基中恢复28天，然后在染色前用胰蛋白酶消化并在无谷氨酰胺培养基中电镀34天（下图）。
（畅通节能法）
图S4
塞来昔布耐药细胞中谷氨酰胺非依赖性表型增加。用二甲基亚砜溶剂或10µM塞来昔布处理亲代SUM149-Luc细胞系7天。塞来昔布耐药细胞在无药物培养基中恢复3天，然后胰蛋白酶化并在无谷氨酰胺培养基中以每10 cm培养皿50万个细胞的速度培养。34天后用结晶紫对Gln-ind菌落进行染色。
（畅通节能法）
图S5
与亲代细胞系相比，Gln-ind细胞在裸鼠体内更具致瘤性和转移性。将细胞（2亿至200万）重复注射到44天龄裸鼠的胸部脂肪垫中（细胞数量从左至右递减）。注射癌细胞后第34天收集的荧光素酶图像显示，注射Gln-ind细胞（底部）的小鼠的肿瘤生长（比较脂肪垫周围的荧光素酶信号）和皮肤转移（比较远离注射部位的点的信号）高于亲代SUM149细胞系（顶部）。左边的空插槽对应于因肿瘤负担高而需要处死的小鼠。
（畅通节能法）
图S6
注射Gln-ind细胞的裸鼠皮肤转移增加。在不同的时间收集注射了指示细胞类型和细胞数的小鼠的荧光素酶图像。在注射亲本SUM149（顶部）和Gln-ind细胞（底部）的小鼠中，选择的图像在原发肿瘤中具有近似相似的荧光素酶信号。皮肤转移显示为红色矩形的荧光素酶信号。
（畅通节能法）
图S7
离体
影像学检查以确认皮肤转移。在第25天，从注射了200万个亲代SUM149-Luc细胞（顶部）或Gln-ind细胞（底部）的小鼠身上解剖出远离原发肿瘤的皮肤。将皮肤置于含有0.5 mg D-荧光素的10 ml PBS培养皿中5分钟，并用Xenogen IVIS System 200成像。
（畅通节能法）
图S8
检测脑和肝转移。在指定的日期收集注射指定细胞类型和细胞数的两只小鼠的荧光素酶图像。在第67天（荧光素酶成像后5天）处死注射了亲本SUM149-Luc细胞的小鼠，在第50天（荧光素酶成像后2天）处死注射了Gln-ind细胞的小鼠。称重肿瘤，并将组织匀浆（肺和脑各1ml，肝1.5ml），并按肺转移所述测定荧光素酶活性材料和方法组织中的总荧光素酶活性以相对发光单位表示。
（畅通节能法）
致谢
我们感谢拉尔夫·阿林豪斯（Ralph Arlinghaus）和保罗·焦立中（Paul Chiao）对手稿的批判性阅读，以及道恩·查莱尔（Dawn Chalaire）对编辑的更正。
脚注
竞争利益：HostGator是一家网络托管商业公司，它捐款支持Anthony Lucci博士关于乳腺癌转移的研究。这并不会改变作者对所有PLoS ONE数据和材料共享政策的遵守程度。所有其他作者都声明，不存在相互竞争的利益。
资金：这项工作得到了美国陆军医学研究与材料司令部（AL）DAMD17-03-1-0669 W81XWH-09-1-0590拨款的部分支持，国家卫生研究院CA16672（核心），HostGator（AL，MD Anderson癌症中心（AL，以及MD Anderson癌症中心的Morgan Welch炎症性乳腺癌多学科研究项目。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
工具书类
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