刺激胰岛素/mTOR通路延迟色素性视网膜炎小鼠模型的锥体死亡

摘要

介绍

色素性视网膜炎（Retinitis Pigmentosa）是一个遗传性视网膜变性（RD）家族，目前无法治疗，经常导致失明。大约每3000人中就有1人受到影响，它是由单一疾病等位基因引起的最常见的RD形式（RetNet，http://www.sph.uth.tmc.edu/Retnet网站/). 该表型的特征是由于杆型PR的功能失常和死亡导致最初的夜视能力丧失，随后是锥体细胞的逐渐丧失¹由于视锥细胞负责颜色和高视力，因此视锥细胞的丢失会导致生活质量下降。在许多情况下，致病等位基因只在杆状体中表达；尽管如此，锥体也会消亡。事实上，迄今为止，在人类或小鼠中还没有已知的RD形式，其中杆细胞死亡，锥体细胞存活。相反，锥体特异性基因的突变只会导致锥体死亡。人们提出了几种理论来解释这一发现。例如，球果死亡可能是由于死亡的杆产生的毒素释放，或健康杆产生的营养因子丧失所致^2–7或者，锥状细胞死亡可能是由棒状细胞死亡过程中最初动员的小胶质细胞引起的⁸或通过氧化应激^9,10。氧化应激也可能直接损害锥体。氧气通过视网膜色素上皮（RPE）不断流向视网膜色素上皮细胞，而杆细胞的丢失（人和小鼠95%的视网膜色素上皮）可能会导致剩余视锥细胞的氧气超载¹¹所有这些机制的证据都存在于老鼠身上，但没有一个能够完全解释为什么人类的锥体可以在没有棒子的情况下存活多年。尽管如此，啮齿动物是这类RD的一个很好的模型。虽然啮齿动物的视网膜缺少黄斑，而黄斑是人类存在的富含锥体和无杆的区域，但黄斑在疾病的初期并不起作用。在人类中，视网膜色素变性始于黄斑外，而在人类和小鼠中，视杆细胞和视锥细胞的分布是相似的。

为了确定RP锥体死亡的共同潜在机制，我们比较了4种杆状特异性基因（PDE-β）突变的小鼠模型^−/−12，PDE-γ-KO¹³、Rho-KO¹⁴和P23H¹⁵，参见材料和方法）。Affymetrix阵列被用来识别伴随锥体细胞死亡的基因表达的常见变化。与细胞代谢相关的大量基因的变化与锥体死亡的发生相一致。这些变化表明球果缺乏营养。锥体随后显示出自噬迹象，这是一种细胞自我消化过程，与长期饥饿相一致。我们还发现，调节细胞代谢的关键途径胰岛素/mTOR途径的几个方面在锥体变性期间受到影响。由于这一发现，我们增加或减少了胰岛素水平，并在其中一个模型中测量了锥体细胞的存活率。全身注射胰岛素的小鼠锥体存活时间延长，而内源性胰岛素缺乏则有相反的效果。因此，锥体饥饿可能是导致RP患者锥体细胞缓慢消亡的原因之一。因此，旨在改善锥体细胞营养的治疗是一种可行的治疗途径。

结果

杆和锥死亡动力学

为了建立一个比较4种不同RP模型中基因表达的框架，通过检测杆动力学来确定疾病病理的等效阶段(图1)（另请参见补充图1和2在线）和圆锥体(图2)（另请参见补充图3在线）死亡。通过确定杆死亡的开始、进展和结束阶段，建立了杆死亡动力学(图1). 从棒死亡开始到外核层（ONL）减少到1行细胞的时间将被称为主要棒死亡阶段。此后直至棒死亡完成的时间将被称为棒死亡的结束阶段。为了确定杆死亡主要阶段的开始，核膜蛋白LaminA的裂解(图1一)和凋亡蛋白酶Caspase3(图1b条)以及TUNEL(图1c、 d日)使用了。通过这些分析以及组织切片检查来监测主要棒死亡阶段的持续(图1e–h)，因为棒占所有PR的95%以上。一旦ONL到达一排细胞，棒细胞死亡的主要阶段就结束了。使用杆特异性标记物来确定杆死亡的结束阶段就地杂交（参见补充图1在线）或免疫组织化学(图1i–l)在视网膜切片上。然而，除非收集到单个视网膜的每一部分，否则很难确定是否有杆状物残留。因此，视网膜扁平支架也被用于对杆死亡的终期进行全面分析(图1m–q（平方米）). 有趣的是，虽然在两个PDE突变体和Rho-KO突变体中，杆死亡的结束阶段已明确定义，但P23H突变体中的杆死亡如此缓慢，以至于即使在杆死亡的主要阶段结束后50周（分析的最新时间点），仍有一些杆存在（参见补充图2在线）。

在单独的窗口中打开

图1

Rho-KO突变体中的杆死亡动力学。(a–d)核膜裂解蛋白LaminA观察到杆死亡的发生(一)，裂解半胱天冬酶3(b条)（箭头：分别为洋红色和红色信号）以及TUNEL(c、 d日)（箭头：棕色信号）（蓝色a、 b条显示细胞核DAPI染色）。(d日)显示了一个视网膜平面支架，可以看到感光层。(e–h)HE染色显示ONL的减少决定了杆死亡的进展。(i–q号)通过截面分析评估杆死亡的结束阶段(i–l)或通过视网膜扁平支架(m–q（平方米）). 在Rho-KO中，控制棒死亡发生在PW5左右(一)并升级至PW25(我). 通过PW17，ONL减少为一行单元格(h、 j个)在接下来的8周内，剩余的棒死亡(j–q)用针对鸟嘌呤核苷酸蛋白α-转导蛋白（Gnat1）的抗体在进行性衰老动物切片上进行免疫荧光观察(j–l). (m–q（平方米）)视网膜平架显示免疫荧光显示的杆状物，带有针对Gnat1的抗体。(米)显示整个视网膜，同时(n、 哦)在视神经头周围显示更高的放大倍数(第页)显示外围区域。(q个)PW25处也未检测到棒段上的信号(我). 面板中显示了年龄（产后周（PW））。垂直条输入(ac、e–l)表示ONL的厚度。

在单独的窗口中打开

图2

锥死亡动力学。(一)qRT-PCR分析操作1开关椎体退化期间。变化表示为Y轴上相对浓度随时间变化的对数，而X轴表示出生后的周数。(b–h、j、k、m–o)显示视网膜扁平支架。(k个)显示视网膜切片。绿色信号表示PNA表达，红色信号表示红/绿视蛋白表达(b、 j–n)或蓝色视蛋白表达(c、 d，o日). (b–d段)P35处的野生型视网膜。红色/绿色视蛋白(b条)和PNA(c、 d日)在背部和腹部检测到表达，而蓝色视蛋白(c、 d日)只在腹部检测到。(e–g,j–o（j–o）)PDE-β突变体的分析。(e–g)PNA中心至周边梯度和锥体外节缩短（OS）。在P20，在主锥死亡阶段之前，中心有较少的细长OS(e（电子）)与外围相比。(（f）)中央或外围的高倍放大(克)OS来自(e（电子）). (小时)野生型OS（中的白线f–h标记OS）。(我)中央和外围区域OS长度的量化。这些数据代表了对3周龄小鼠的3个不同视网膜进行的平均15次测量。随着退化过程中OS的缩短，红/绿视蛋白定位在整个细胞体膜上，检测细胞外蛋白的PNA被还原成一个小点，附着在残留的OS上(j个)（箭头：黄色表示红色/绿色，PNA重叠）。(k个)高倍放大的锥体显示主细胞体膜上的红色/绿色定位（箭头所示）。(我)细胞体中显示红色/绿色的横截面（箭头；j–l第70页）。主要在背部检测到红色/绿色视蛋白(我)在退行性变期间，而PNA(m、 n个)或蓝色视蛋白(o个)没有更改(m、 n个：P21，相同比例尺；o个：第49页）。

采用两种方法来确定锥状细胞死亡的发生和进展。首先，通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）确定锥体消亡的总体时间框架(图2一)用于腹部¹⁶锥体特异性转录本操作1sw（视蛋白1短波敏感：蓝锥视蛋白）。这允许在不同菌株之间进行初步定量比较，但不足以确定锥体的数量，因为转录水平可能在细胞死亡之前发生变化。接下来，红/绿视蛋白的整体免疫组化(操作1毫瓦：使用opsin1介质-波敏）和花生凝集素凝集素（PNA）(图2b–n). 这两种标记物都在小鼠视网膜上表达，使视锥细胞可见(图2b–d段). 有趣的是，锥体死亡总是发生在杆死亡的等效阶段，即在主要杆死亡阶段之后，当ONL的厚度减少到只有一行细胞时。如PNA染色所示，所有4个模型的锥体死亡都是从中心向外围进行的(图2e（电子）). 在此之前，外段（OS）长度逐渐缩短(图2f–i型)通过视蛋白从OS定位到整个细胞膜(图2j–l). 此外，红/绿视蛋白(操作1毫瓦)蛋白质，通常在小鼠视网膜中检测到(图2b条)，主要在椎体退行性变的背侧发现(图2m、 n个). 然而，PNA染色在背/腹轴上没有明显差异(图2m、 n个). 同样，蓝色视蛋白的表达，通常只在腹部检测到¹⁶(图2c、 天)，在退化期间未受影响(图2o个). 在RP的人类病例中，也描述了锥体OS缩短和锥体特异性标记物丢失¹⁷.

总之，在这4个模型中，伴随着视杆和视锥死亡的动力学和组织学变化具有一些共同的特征。首先，圆锥退化总是在主棒死亡阶段之后开始(图3a、 b条). 这一点是在4个突变体中的3个在非常不同的年龄达到的，因为杆死亡的整体动力学差异很大。其次，圆锥体死亡始终是外围的中心，并且之前OS长度减少。第三，在所有4个突变体中，红/绿视蛋白水平主要在锥体退化期间的背侧检测到(图3c（c）). 这些共同特征表明，可能存在锥体死亡的共同机制，并且在锥体死亡开始时，4种模型中常见的基因表达变化可能暗示了有关该机制的线索。

在单独的窗口中打开

图3

(一)在4个RP小鼠模型中发现的杆和锥死亡动力学的示意图。锥死亡的开始被设置为时间零点。x轴上相应的时间窗口以周为单位。主棒死亡阶段见正文。主要锥体死亡阶段是大约85%的锥体死亡的时间。圆锥体死亡的结束阶段是此后的时间。(b条)杆和锥死亡动力学总结。时间以产后天数（P）或产后周数（PW）表示。(c（c）)视网膜扁平支架上的免疫荧光显示，在锥体变性期间，在4个突变体中发现红色/绿色视蛋白表达的腹侧减少。每张图片下面都显示了出生后的应变和时间。（有关野生型的更高放大倍数，请参见图2b条).

微阵列分析

为了确定常见的基因表达变化，在杆死亡主要阶段的中途、锥死亡开始时以及锥死亡阶段的两个时间点采集了所有4种模型的RNA样本(图4一). 然后将RNA与Affymetrix 430 2.0小鼠阵列杂交。比较同一菌株在4个时间点内的基因表达变化。为了在4个菌株之间进行交叉比较，必须满足两个标准来选择一个基因。首先，随着时间的推移，变化必须具有统计学意义（参见材料和方法). 其次，与其他三个时间点相比，一个基因在锥体死亡开始时必须上调至少2倍。第二个标准删除了锥死亡开始时仍在发生的杆特异性变化，同时增加了锥死亡发生时的变化。共发现240个Affymetrix ID在4个菌株中均满足这两个标准。240个ID与230个基因匹配（参见补充表1在线）。在195个可以注释的基因中，34.9%（68个基因）是参与细胞代谢的基因(图4b条,c（c）). 点击次数最多的信号通路（12个基因）是胰岛素/mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）信号通路(图4b条)是调节细胞代谢许多方面的关键途径。因此，数据表明锥体死亡开始时的事件与细胞代谢的变化相一致，可能受胰岛素/mTOR途径的调节。

在单独的窗口中打开

图4

Affymetrix微阵列分析。(一)进行微阵列分析的4种不同突变体中的等效时间点（R：杆死亡主要阶段的大约一半；C0：锥死亡的开始；C1和C2分别是锥死亡期间的第一个和第二个时间点）。时间以产后天数（P）或产后周数（PW）表示。描述圆锥体死亡进程的卡通显示在相应的时间点下方。(b条)注释的195个基因的百分比分布。(c（c）)作为新陈代谢一部分的68个基因（34.9%）的分布百分比(b条).

野生型和变性视网膜中的mTOR

根据微阵列分析的结果，在锥体死亡期间检测胰岛素/mTOR信号通路。激酶mTOR是蛋白质合成和核糖体生物生成的关键调节因子¹⁸当细胞能量水平较高时，mTOR允许能量消耗过程，如转化，并防止自噬，而营养不良的条件则会产生相反的效果。因此，增加细胞ATP水平的葡萄糖和氨基酸可用性，特别是亮氨酸的可用性，对mTOR活性有积极影响。为了了解细胞能量水平或氨基酸可用性在锥体变性过程中是否会受到损害，用免疫荧光检测磷酸化mTOR（p*-mTOR）的水平。mTOR的磷酸化增加了激酶活性，因此p*-mTOR的水平可以作为其活性水平的指标。由于每个真核细胞都表达mTOR，因此每个细胞中都可能存在一定水平的p*-mTOR。令人惊讶的是，高水平的p*-mTOR仅在野生型视网膜的背锥中检测到(图5a–c). 这种磷酸化模式让人联想到锥体退化期间看到的红/绿视蛋白模式(图3c（c）). 由于mTOR是翻译的关键调节器，我们研究了是否可以通过mTOR活性的降低来模拟锥体变性期间腹侧红/绿视蛋白的下调。为此，用雷帕霉素（一种mTOR抑制剂）治疗野生型小鼠¹⁸这种治疗导致红色/绿色视蛋白的腹侧下调，而不影响蓝色视蛋白或PNA染色或mTOR本身的背侧磷酸化(图5d–g). 因此，野生型mTOR的抑制重演了变性过程中突变体中红/绿视蛋白和蓝视蛋白的表达以及PNA染色的模式，表明变性过程中红/绿色视蛋白的腹侧下调可能是由于mTOR活性降低所致。正如对mTOR功能的预期，在未经治疗的突变小鼠以及用雷帕霉素治疗的野生型小鼠（参见补充图4在线）。最后，对突变体视网膜的分析表明，在锥体变性期间，背锥中的p*-mTOR水平降低(图5小时–分钟). 为了测试在背部野生型锥体中发现的高水平p*-mTOR是否是葡萄糖依赖性的，将野生型小鼠的视网膜移植体在有或无葡萄糖的培养基中培养4小时。即使培养基中亮氨酸浓度增加，在没有葡萄糖的情况下，Dorsal p*-mTOR也被消除（参见补充图5在线）。因此，关于mTOR的数据在mTOR活性、退化过程中看到的红/绿视蛋白的表达变化与微阵列数据之间建立了联系，微阵列数据表明锥体死亡开始时的代谢变化。这些变化可能是由锥细胞葡萄糖摄取受损引起的。

在单独的窗口中打开

图5

野生型和变性视网膜中的p*-mTOR。除(b、 c，克)显示视网膜切片。蓝色表示细胞核DAPI染色。(a–c)野生型视网膜中p*-mTOR水平。(一)p*-mTOR的背侧（向上）富集。右侧显示了背部和腹部区域的高倍放大，PNA检测到p*-mTOR为红色，锥体部分为绿色。(b、 c（c）)视网膜背侧切片p*-mTOR（红色信号）和PNA染色(b条)（绿色信号）或α-β-半乳糖苷酶(c（c）)（绿色信号）。β-半乳糖苷酶受人类红/绿视蛋白启动子的控制，并在所有锥体中表达⁴⁸（见材料和方法）。中的插图(b、 c（c）)显示锥形段的更高放大率，表明p*-mTOR信号位于外部段（OS；is：内部段）的下部。(d–g)雷帕霉素治疗野生型小鼠导致腹侧红/绿视蛋白下调(e（电子）)但不是背向(d日)（红色信号）。腹蓝视蛋白(（f）)（红色信号）不受影响，PNA也不受影响(d–g)（绿色信号）。雷帕霉素治疗也不影响野生型mTOR磷酸化(克)（红色信号）。(小时–分钟)感光细胞变性期间背部p*-mTOR水平降低（红色信号）。(小时)野生型控制。(i、 j个)PDE-β突变体。在P15停棒期间开始降低(我)当OS（绿色信号：PNA）开始从视网膜色素上皮上脱落时。(我)通过P30，只有几个锥体（绿色信号：α-β-半乳糖苷酶)显示高水平的p*-mTOR（红色信号）。(k–l)其他三个突变体的背锥也有类似的减少（PNA标记为绿色的锥）。(k个)PDE-γ-KO第35页。(我)Rho-KO PW20。(米)P23H PW70。

球果对营养失衡的反应

mTOR的数据表明，在视锥退化过程中，视锥的营养失衡可能是由视锥中的葡萄糖水平降低引起的。为了验证这一观点，检测了异二聚体转录因子缺氧诱导因子1（HIF-1α/β）的水平，该因子在低氧等应激条件下改善糖酵解。HIF-1和mTOR紧密相连，因为低氧导致由于氧化磷酸化减少而产生的低能，因此mTOR活性降低^18–23.调节亚单位HIF-1α的上调可能反映了锥细胞中的低葡萄糖水平，而不是缺氧条件，因为氧水平因杆状体丢失而升高¹¹。锥体变性期间HIF-1α的免疫荧光分析显示，所有4种小鼠模型的锥体蛋白上调(图6a–f; &补充图6a–d在线）。与HIF-1α靶基因葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）上调相一致^24,25在锥体中也被发现上调，同样在所有4个小鼠模型中(图6g–j; &补充图6e–h在线）。因此，HIF-1α和GLUT1上调与锥体细胞克服葡萄糖不足的反应一致。它还与退行性变期间发现的p*-mTOR水平降低以及p*-mTOR对葡萄糖的敏感性有关。

在单独的窗口中打开

图6

锥细胞中Hif-1α和GLUT1的上调。所有面板显示免疫荧光染色。左侧列(a、 天、克、小时，)显示了视网膜平面支架和右立柱(b、 c、e、f、i、j)视网膜切片。蓝色表示细胞核DAPI染色，绿色表示标记有PNA的锥体。(a–f)HIF-1α染色（红色信号）。(一)放大倍数较高的野生型（PW10）（插图）。(b、 c（c）)野生型横截面（PW10）。(c（c）)DAPI重叠(b条). (d–f）PDE-β锥体变性期间^−/−（PW10）锥体中HIF-1α水平增加(d日，插图）。(e、 （f）)横截面显示，Hif-1α的增加主要发生在锥体中（箭头指向在此阶段位于内核层顶层的锥体）。(（f）)DAPI重叠(e（电子）). (克)野生型GLUT1表达（PW10）（红色信号）。锥体之间的大多数信号反映了杆的表达。(h–j)扁平支架退化过程中视锥中GLUT1表达增加(小时)和节(i–j). (我)的重叠(j个)带有PNA。

为了确定球果是否缺乏营养，对球果内的自噬进行了评估。不同程度的营养剥夺可诱导两种类型的自噬：大自噬和伴侣介导自噬（CMA）^26–29大自噬是非选择性的，靶向蛋白质或整个细胞器，其特征是从头开始形成膜，形成与溶酶体融合的中间小泡（自噬体）。大量自噬所需的机制已被证明存在于PR中³⁰相反，CMA具有选择性，以单个蛋白质为靶点，将其转运至溶酶体。通过感染编码绿色荧光蛋白（GFP）和轻链3（LC3）融合蛋白的病毒载体来评估大自噬的存在，LC3是一种自噬体膜标记物^31–33在野生型和突变型小鼠的锥体中没有观察到GFP分布的差异，这表明锥体死亡期间没有自噬体的形成（参见补充图7a–f在线）。此外，在所有或大多数锥细胞中都发现高水平的磷酸化核糖体蛋白S6（参见补充图7g–h反映了核糖体S6激酶1（S6K1）活性的增加，S6K1是一种大自噬抑制剂²⁸与这些发现相一致的是，大量自噬反映了对营养缺乏或细胞应激条件的急性短期反应^26,27新合成蛋白质的长期非选择性降解以克服应激条件对细胞不利，并可能导致大多数锥体细胞的相对快速死亡，而不是RP中的缓慢死亡。

CMA通常在长时间饥饿时激活，导致溶酶体膜2A型溶酶体相关膜蛋白（LAMP）水平增加^26,27,34.饥饿和氧化应激均可诱发CMA²⁶饥饿通过阻止其降解而增加LAMP-2A，而氧化应激导致从头开始LAMP-2A的合成³⁵一种识别所有3种剪接亚型产生的蛋白质的LAMP-2抗体³⁶（A、B、C）在锥体变性期间，所有4个突变体的溶酶体膜上均显示高水平的LAMP-2(图7a–c; 仅显示PDE-β的数据^−/−). 高水平是锥细胞特有的，在内核层的细胞中未发现(图7b条,c（c）)这可能反映了视锥细胞是RP视网膜中唯一饥饿的细胞的可能性。三种剪接亚型的qRT-PCR显示，LAMP-2A（1.2x）的mRNA水平仅略有增加，而LAMP-2C的mRNA含量则有所下降(图7d日)这表明膜蛋白的增加主要是由于营养缺乏，而氧化应激的影响较小^9,10,35综合起来，数据表明球果中的营养失衡导致CMA的激活，这一过程与长期饥饿相一致。

在单独的窗口中打开

图7

溶酶体膜LAMP-2水平升高。(a–c)视网膜扁平支架上的免疫荧光显示LAMP-2为绿色，红色/绿色视紫红质为红色，蓝色信号显示细胞核DAPI染色。右上角的插图（带方框）显示放大的单元格（箭头）。(一)PW5处的野生型视网膜显示溶酶体（小绿点），LAMP-2分布正常。在PR核的水平上检测到弱的红/绿视蛋白信号，因为在野生型中，它主要存在于OS中。(b、 c)PW5时PDE-β突变。(b条)由于LAMP-2在溶酶体膜上的积聚，溶酶体（圆点）扩大，具体见于锥体。(c（c）)与中相同场的共焦截面(b条)在内核层水平上测得的LAMP-2水平与野生型相似(一). (d日)3种不同LAMP-2剪接形式的qRT-PCR显示PDE-β突变体与野生型的相对浓度和比率。

刺激胰岛素受体途径延长锥体存活时间

mTOR、HIF-1α、GLUT1和CMA诱导的数据表明锥体中葡萄糖不足导致饥饿，并表明胰岛素/mTOR途径在锥体死亡中起重要作用。为了确定胰岛素/mTOR通路是否会影响锥体存活，我们通过系统治疗PDE-β刺激了该通路^−/−注射胰岛素的小鼠。由于PDE-β突变体具有更快的锥体死亡动力学，因此被选为其他三个突变体，从而可以更好地读出锥体存活率。从锥体细胞死亡开始，在4周的时间内每天腹膜内注射胰岛素治疗小鼠。为了减少胰岛素，还对单次注射链脲佐菌素（一种杀死胰腺中产生胰岛素的β细胞的药物）进行了检测。胰岛素的全身给药由于途径中的反馈回路导致胰岛素受体脱敏，导致血糖水平升高。注射链脲佐菌素也会导致血糖水平升高，可以控制血糖升高的影响，还可以降低动物的胰岛素水平。PDE-β^−/−与未注射胰岛素的对照组小鼠相比，注射胰岛素的小鼠的锥体存活率有所提高。PDE-β^−/−注射链脲佐菌素的小鼠锥体存活率下降(图8a–d). 因此锥体存活率的提高是由于胰岛素而不是血糖水平的升高(图8e（电子）). 此外，用胰岛素治疗的突变小鼠的锥体细胞在退行性变过程中没有表现出正常的HIF-1α上调，这与锥体细胞对胰岛素直接反应的概念一致(图8g、 小时).

在单独的窗口中打开

图8

胰岛素水平影响椎体存活率。(a–c)PDE-β突变体在PW7处的视网膜扁平镶嵌物染色用于lacZ^49,48检测锥体（参见材料和方法补充图8在线）。(一)未经处理的对照示例。(b条)注射链脲佐菌素的小鼠示例。(c（c）)每天注射胰岛素的小鼠示例。(d日)治疗4周后椎体存活率的量化。数据表示至少8个视网膜的平均值，并在y轴上显示锥体表面积的百分比对整个视网膜的表面积（参见补充图9和10在线）。(e（电子）)血糖水平和体重的测量(（f）)在实验期间每周进行一次。(g、 小时)未经治疗的对照组PDE-β视网膜扁平支架上HIF-1α（红色信号）和PNA（绿色信号）的免疫荧光染色^−/−(克)和PDE-β^−/−用胰岛素治疗4周的小鼠(小时). 蓝色表示核DAPI。

讨论

在这里，我们报告了在RP小鼠椎体退化期间，椎体显示出营养失衡的迹象。微阵列分析表明，锥体死亡开始时，涉及胰岛素/mTOR通路的细胞代谢发生变化。我们发现，在野生型小鼠中抑制mTOR会导致与退化期间相同的红/绿视蛋白丢失模式。根据p*-mTOR的变化及其对葡萄糖的敏感性，我们观察到HIF-1α和GLUT1的上调，表明RP小鼠锥体的葡萄糖摄取和/或细胞内葡萄糖水平可能受到影响。此外，全身注射胰岛素可延长锥体存活时间，而内源性胰岛素的消耗则会产生相反的效果。胰岛素的系统治疗阻止了锥体退变期间正常视锥细胞HIF-1α的上调，表明胰岛素直接作用于锥体。有趣的是，在7周而不是4周的时间跨度内延长胰岛素治疗并没有显示出锥体存活率的任何显著改善（见补充图10在线）。这可能反映了S6K1直接作用于胰岛素受体底物（IRS）的通路反馈回路。虽然胰岛素受体、mTOR、HIF-1α、S6K1和IRS之间的锥体内串扰仍有待研究，但结果加强了以下概念：锥体内的营养物质可用性可能在锥体退化期间发生改变，胰岛素/mTOR途径起着关键作用。最近的一份报告显示，rd10小鼠RP模型中胰岛素原的组成性表达可延迟视杆细胞和视锥细胞的光感受器死亡³⁷然而，胰岛素原似乎并不通过胰岛素受体发挥作用，因为用胰岛素原治疗的小鼠没有出现高血糖。胰岛素原阻断发育细胞死亡，因此可能干扰出生后视网膜的凋亡途径。虽然下游效应器，如PI3K/Akt，是由胰岛素和胰岛素原调节的信号传导，但此处报道的胰岛素研究结果与胰岛素原效应之间的关系尚待确定。

大自噬是由mTOR通过其下游靶点S6K1控制的，在锥体变性过程中未检测到，而CMA似乎被激活。溶酶体膜LAMP-2A水平升高提示CMA激活。此外，关于mTOR、HIF-1α和GLUT1的观察结果与饥饿和CMA一致。然而，还需要更多的实验来证明饥饿和CMA确实在发生，并且进一步证明它们是锥状死亡的重要原因。缺乏可检测的宏自噬并不排除在激活CMA之前的短时间内（例如24小时）可能发生宏自噬的可能性。数据只表明，在一段较长的时间内，宏自噬不是自噬的主要形式，这与宏观自噬是一种短期反应的概念是一致的。从p*-S6水平的增加可以看出，S6K1活性的增加可能是巨自噬抑制延长的原因。S6K1受mTOR和AMP-activated protein kinase（AMPK）正调控²⁸读取细胞ATP水平。因此，虽然mTOR可能报告葡萄糖摄取方面的代谢问题，并通过HIF-1α减少能量消耗过程和改善糖酵解，但AMPK可能报告正常的细胞ATP水平并抑制宏观自噬。这可能代表对圆锥体能量需求的特定响应。PR吸收的大部分葡萄糖从未进入Krebs循环³⁸因此，葡萄糖不足可能不会导致ATP不足。由Muller胶质细胞提供的乳酸可以通过Krebs循环生成ATP³⁹然而，葡萄糖是在戊糖磷酸循环中生成NADPH所必需的，NADPH是合成磷脂（细胞膜的组成部分）所必需的。PR不断在OS尖端脱落膜。由于葡萄糖水平降低会导致膜合成减少，因此RPE对OS的吞噬率可能高于锥细胞的膜合成率。与此一致的是，在这4个模型中，OS缩短先于细胞死亡，在RP的人类病例中也观察到了这一点¹⁷此外，通过微阵列分析也可以观察到影响脂质代谢的变化。

为什么棒的丢失会导致RP中的锥体死亡？引言中提到的先前假设有一个共同点，即它们不能完全解释在人类身上发现的病理学。这里显示的杆和锥死亡动力学清楚地证明，死亡的杆产生的毒素是锥死亡的原因，因为锥死亡总是发生在主要杆死亡期之后。如果杆毒素导致锥体死亡，那么锥体死亡的开始应该与杆死亡的开始同时发生，或者应该在此后不久开始，因为这是毒素产生的高峰时期。有趣的是，缺乏健康的杆状体产生的营养因子和锥状体存活所需的营养因子，这与所有四种模型中所见的锥状体死亡的发生相一致，因为人们预计锥状体在杆状体死亡最后阶段会发生死亡。然而，锥体死亡的进展和杆死亡的结束阶段使得这个不太可能的假设成为锥体死亡唯一的原因。在两个PDE突变体和Rho-KO突变体中，球果在杆死亡结束阶段后死亡数周，这表明它们可以在没有杆的情况下存活相当长的一段时间。此外，在P23H模型中，在棒死亡的最后阶段，棒死亡的速度如此缓慢，以至于在整个锥形死亡期间，棒仍然存在。考虑到这些差异，认为缺乏杆营养因子是锥体死亡的主要原因的假设似乎不太可能。然而，鉴于所用的4种小鼠模型具有4种不同的遗传背景，本研究不能排除缺乏杆状营养因子的可能性。背景差异可能导致差异，例如这种因素的不同水平，这可能是观察到的锥状死亡进展差异的原因。

我们对缺乏营养的球果的观察如何解释球果对杆的依赖？OS-RPE相互作用至关重要，因为RPE将营养和氧气从脉络膜血管输送到PR。小鼠和人类约95%的PR为杆状，约20–30个OS接触一个RPE细胞^40,41因此，这些RPE-OS触点中只有1-2个是通过锥体的。在ONL崩溃期间，剩余的锥：RPE相互作用可能受到干扰。如果这些相互作用降低到营养物质正常流动所需的阈值以下，杆的损失可能会导致营养物质流向球果的流量减少。在所有4个小鼠模型中，当ONL到达一行细胞时，锥体死亡开始。因此，该细胞密度可以代表临界阈值。然后，当剩余的杆状体由于杆状体特异基因的突变而死亡时，锥状体死亡可能是由于营养缺乏而开始的。与这一概念一致，当剩余的杆缓慢死亡时，锥死亡进展得更慢。这种机制也可以解释为什么锥体的丢失不会导致杆死亡^42,43。由于在人类和小鼠中，锥体不到所有PR的5%，因此无法达到干扰OS-RPE相互作用的临界阈值。斑马鱼的研究进一步支持了这一观点，斑马鱼中杆与锥的总比率颠倒（1:8）。此外，斑马鱼的杆状体和球状体分布不均匀，因此某些区域富含球状体，而其他区域富含杆状体。最近一个锥特异性基因的突变导致了杆状体死亡，但只发生在锥密度高的区域⁴⁴导致Stearns及其同事得出结论，细胞密度是关键的决定因素。我们认为，一旦突破细胞密度的临界阈值，不当的OS-RPE相互作用会导致营养物质（例如葡萄糖）流量减少。这导致OS膜合成减少，进而进一步降低RPE对营养素的吸收。最终，CMA激活所表明的长期饥饿会导致细胞死亡。由于饥饿可能会在较长时间内缓慢发生，而且由于营养摄入的波动，饥饿率可能会波动，因此可能会出现在人类身上观察到的锥细胞缓慢而不规则的死亡。因此，这项研究不仅提供了一种新的RP锥体死亡机制，可以指导未来的治疗方法，而且还巩固了文献中有关不同RP突变小鼠和患者中杆状体和锥体死亡动力学的数据。

材料和方法

补充材料

致谢

工具书类