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《实验医学杂志》。2012年4月9日；209(4): 679–696.
数字对象标识：10.1084/jem.20111512
预防性维修识别码：项目经理3328367
PMID：22430491

三阴性乳腺癌中MYC通路的激活与CDK的抑制是合成致死的

Dai Horiuchi公司,1 伦纳德·库斯德拉,1 诺埃尔·E·哈斯基,1 桑杰·钱德里安尼,2 马克·伦伯格,6 安娜·玛丽亚·冈萨雷斯-安古洛,7 凯特琳·克拉斯曼,1 阿列克谢·巴扎罗夫,1,8 詹姆斯·斯迈思,4 莎拉·戴维斯,三，5 保罗·亚斯温,8 戈登·米尔斯,7 劳拉·J·埃瑟曼,三，5和安德烈·戈加通讯作者1,5
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

MYC升高的三阴性乳腺癌对CDK抑制敏感。

摘要

雌激素、孕激素和HER2受体阴性三阴性乳腺癌是临床上最具挑战性的亚型，缺乏靶向治疗。我们发现，三阴性肿瘤表现出MYC表达升高，以及MYC调节基因表达改变，导致MYC途径的活性增加。在原发性乳腺肿瘤中，MYC信号不能预测新辅助化疗的反应，但与不良预后相关。我们通过使用依赖于细胞周期依赖性激酶（CDK）抑制的合成-致死方法，利用在三阴性乳腺癌中发现的MYC表达增加。CDK抑制可有效诱导三阴性肿瘤异种移植物的肿瘤消退。促凋亡BCL-2家族成员BIM在CDK抑制后上调，并参与了这种合成致死机制。这些结果表明，MYC升高的侵袭性乳腺肿瘤对CDK抑制剂具有独特的敏感性。

用于指导乳腺癌靶向治疗药物使用的临床相关生物标记物包括HER2（人类表皮生长因子受体2）的过度表达以及雌激素和孕激素受体的表达。对于这些受体阳性的乳腺肿瘤（受体阳性），在过去几十年中已经成功开发了几种靶向治疗策略。这些包括使用小分子激酶抑制剂、用抑制性单克隆抗体治疗和抗激素治疗。不幸的是，对于最具挑战性的受体三阴性亚型乳腺癌，还没有建立这样的生物标记物来预测选择性治疗的反应(Carey等人，2006年;Bauer等人，2007年;Liedtke等人，2008年). 显然，如果要开发有效的治疗方法，需要对三阴性乳腺癌的生物学进行进一步研究(Irvin和Carey，2008年;Schneider等人，2008年).

人类原发性乳腺肿瘤的基因表达谱已经确定了几种不同的分子亚型，包括管腔A和B、HER2+、基底样和正常样(Perou等人，2000年;瑟利等人，2001年). 大约70%的三阴性肿瘤属于基底亚型(Bertucci等人，2008年)通常表现出侵袭性特征，如分化差、增殖率高和转移能力增强(Livasy等人，2006年;Sarrió等人，2008年). 在临床研究中，发现三阴性肿瘤患者对新辅助化疗的反应与受体阳性肿瘤患者相同或更好(Carey等人，2007年;Liedtke等人，2008年)可能是由于在三阴性肿瘤中观察到较高的有丝分裂指数。然而，在三阴性肿瘤患者中很少能获得完全的病理反应，这些患者有早期复发的倾向，并且5年无病生存期减少(Bauer等人，2007年;Dent等人，2007年). 三阴性乳腺癌中发生的分子事件尚未阐明，因此，该亚型预后不良的机制尚不清楚。因此，识别将三阴性乳腺癌与其他乳腺癌亚型区分开来的信号通路具有重大意义。

一些融合的研究表明，MYC原癌基因可能在侵袭性乳腺癌中发挥重要作用。MYC是一个基本的螺旋-环-螺旋拉链（bHLHZ）基序，包含转录因子，其活性受其与另一bHLHQ蛋白MAX的直接结合紧密调节。MYC激活可导致特定基因的转录激活或抑制(艾尔斯和艾森曼，2008年). MYC的全局转录影响也通过MYC调节网络介导，其中MYC活性由多个竞争的抑制性MAX结合伴侣（即MAD、MGA、MXD4和MNT；Grandori等人，2000年;Cowling和Cole，2006年). MYC在多种信号通路中发挥作用，包括参与细胞生长、细胞增殖、代谢、microRNA调节、细胞死亡和细胞存活的信号通路(Dang，1999年;艾尔斯和艾森曼，2008年;Meyer和Penn，2008年). 此外，最近研究表明，MYC信号在具有癌症干细胞特性的高级别乳腺肿瘤中上调(Ben-Porath等人，2008年;Wong等人，2008年).

基因组位点8q24含有MYC癌基因，是各种亚型乳腺癌中最常见的扩增区域之一(Jain等人，2001年). 然而，扩增区包含大量转录物，因此，扩增与MYC表达升高没有严格的相关性。最近的研究已经确定了与基础分子亚型相关的MYC转录基因特征(Alles等人，2009年;Chandriani等人，2009年;Gatza等人，2010年). 其他研究检查了原发性乳腺癌组织中MYC蛋白表达的染色，并没有发现MYC过度表达与患者预后之间的明确联系(布兰德等人，1995年;Naidu等人，2002年). 因此，评估MYC信号对三阴性乳腺癌的作用将为治疗这种侵袭性肿瘤开辟新的机制见解和潜在的新治疗方法。

关于MYC信号与三阴性乳腺癌相关性的几个悬而未决的问题仍未解决。三阴性肿瘤中MYC的表达是否单独改变，或其他MYC信号成分（即竞争性MAX结合蛋白）的表达是否也改变？此外，MYC信号是否改变了常规用于治疗三阴性乳腺癌的常规化疗药物的反应？最后，如果MYC信号在三阴性肿瘤中上调，人们可以利用这一特点开发新的靶向治疗药物吗？在本研究中，我们使用了几种互补的方法来解决这些问题。

合成致命性已被提出作为一种治疗癌症的策略，这种癌症缺乏明显的药物靶点(Reinhardt等人，2009年). 例如，BRCA1/2突变患者中多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的小分子抑制为临床开发合成致死性提供了概念证明(Fong等人，2009年;Tutt等人，2010年). 我们之前的工作通过使用转基因MYC驱动的淋巴瘤和肝癌模型发现MYC过度表达和有丝分裂细胞周期依赖激酶（CDK）1抑制之间存在合成致死相互作用(Goga等人，2007年). 然而，这种合成-致死方法在治疗三阴性乳腺癌方面是否有用尚不清楚。

在这项研究中，我们研究了利用依赖于升高MYC信号的合成-致死方法对治疗三阴性乳腺癌是否有效。为了全面了解MYC在三阴性乳腺癌中的作用，在当前的研究中，我们将患者肿瘤的基因表达和蛋白分析与细胞系和肿瘤模型的功能研究相结合。在这里，我们检查了CDK抑制剂目前在临床开发中对三阴性乳腺癌的疗效，并研究了合成致死机制。

结果

三阴性乳腺癌中MYC的表达异常升高

我们试图了解MYC信号传导是否是三阴性乳腺肿瘤中的一个重要致癌事件。I-SPY试验（通过成像和分子分析预测治疗反应的系列研究调查）是NCI赞助的一项针对II期和III期乳腺癌患者的多机构研究，旨在确定诊断标志物，验证假设，并制定新的乳腺癌治疗策略(Barker等人，2009年;琼斯，2010年;Esserman等人，2012年). 本临床试验收集了原发肿瘤样本的广泛临床注释和全局mRNA表达。利用146例激素受体和HER2表达的原发性肿瘤样本的mRNA表达数据，我们发现三阴性肿瘤中MYC mRNA水平显著升高(图1 A). 接下来，我们使用反向定量蛋白阵列检测了208例独立原发性乳腺肿瘤样本中MYC蛋白和磷酸化MYC（T58/S62）的表达。66例三阴性肿瘤表达显著升高的MYC蛋白和磷酸化MYC(图1 B)与142例受体阳性肿瘤进行比较。这些位点的MYC磷酸化已被证明可以增强MYC转录活性并改变蛋白质稳定性(Chang等人，2000年;Sears等人，2000年;Seo等人，2008年). 最后，使用先前发布的mRNA表达谱数据(Neve等人，2006年)，我们检测了50个已建立的人类乳腺细胞系中MYC的表达是否与受体状态相关。这50个人类乳腺细胞系已被证明能够准确模拟乳腺癌生物学的各个方面(Neve等人，2006年)并被广泛用于力学研究。与非三阴性的细胞系相比，三阴性细胞系的MYC mRNA显著升高(图1 C). 总之，这三个独立的数据集证实了MYC表达升高与三阴性肿瘤之间的联系。

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人类三阴性肿瘤中MYC表达升高。（A） 通过I-SPY TRIAL收集的三阴性与受体阳性原发性乳腺肿瘤中MYC mRNA的表达（P<0.0001）。（B） 三阴性原发肿瘤中MYC和磷酸化MYC（T58/S62）蛋白的表达。显示的是一个208名患者的独立队列，对其进行了定量反相蛋白阵列。（C） MYC mRNA在一组已建立的人类乳腺细胞系中的相对表达(Neve等人，2006年). 误差条代表平均值±SEM。P值由双尾Student’st吨测试。

三阴性肿瘤中MYC信号上调

为了评估原发性肿瘤中MYC的活性，我们应用了一个先前验证的MYC调节的转录特征(Chandriani等人，2009年)，它由352个基因组成，用于I-SPY数据集。我们根据Pearson与MYC基因表达特征的相关性对患者肿瘤样本进行排序(图2A)，将肿瘤分为高相关性组、中相关性组和低相关性组（见材料和方法）。高MYC基因表达组的三阴性乳腺肿瘤明显增多（P<0.005；图2 A). 这些结果表明，不成比例的原发性三阴性乳腺肿瘤表现出较高的MYC功能。MYC基因表达特征先前与乳腺癌的一个基本分子亚型相关(Alles等人，2009年;Chandriani等人，2009年;Gatza等人，2010年)其中约70%为三阴性癌症。在人类乳腺癌的其他分子亚型中，MYC信号是否也增加尚不清楚。因此，我们在I-SPY数据集中检查了乳腺癌不同分子亚型的MYC基因表达特征。与先前的研究一致，我们发现高MYC基因表达特征与基本亚型的相关性最强；然而，我们还观察到，管腔B分子亚型的MYC特征显著高于管腔A或HER2亚型(图2 B). 虽然大多数管腔B型肿瘤表达激素受体，但这种亚型通常与肿瘤增殖增加和预后比管腔A差有关(Voduc等人，2010年). 我们的结果表明，除了基底细胞外，管腔B分子亚型也与MYC信号增加有关，这可能至少部分解释了这种肿瘤的不良预后(Cheang等人，2009年).

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人类三阴性乳腺癌中MYC信号升高。（A） 149个原发性肿瘤按每个肿瘤与352个基因MYC特征质心的Pearson相关性排序（P<0.005；Fisher精确检验）。三阴性肿瘤样本用红点表示，而分子亚型用彩色条表示。（B） MYC基因表达特征与乳腺癌分子亚型的相关性。相对MYC基因表达基于每个肿瘤的Pearson相关性与MYC的基因特征。误差条代表平均值±SEM。P值由双尾Student’st吨对每个比较进行测试。（C） 在三阴性乳腺癌中，MYC信号通路中多个基因的表达发生改变。Schema显示了各种MAX相互作用的基因，这些基因被解除了调控，可以正向或负向调节MYC转录活性。如果在三阴性和受体阳性肿瘤中表达受到抑制，则基因显示为绿色，如果在三阳性肿瘤中的表达增加，则显示为红色。最大值，P=0.02；MYC，P<0.0001；MYCN，P=0.06；MXD4，P=0.03（双尾学生t吨测试）。

接下来，我们试图了解三阴性乳腺癌中MYC活性增加的分子基础。MYC靶基因的激活或抑制涉及由MAX结合到激活物（如MYC或MYCN）或结合到阻遏物（例如MXD1-4或MAX）组成的多个信号复合物(Grandori等人，2000年;Cowling和Cole，2006年). 因此，MYC/MAX杂聚复合物可以激活转录，而MXD/MAX或MAX/MAX复合物可以抑制MYC靶基因的激活(Eilers和Eisenman，2008年). 因此，乳腺癌中MYC通路活性的变化是由MYC调节网络结构的改变引起的，这种改变是通过改变MAX相互作用伙伴的相对丰度来实现的。据我们所知，原发性乳腺肿瘤中MYC调节网络的拓扑结构以前没有描述过。因此，我们试图确定除MYC外，其他MAX相互作用基因的mRNA表达在三阴性原发性肿瘤中是否也有显著改变。通过分析I-SPY数据集中的mRNA阵列数据，我们发现在三阴性肿瘤中多个MAX相互作用基因发生改变(图2 C). 除MYC外，我们发现激活物MYCN在三阴性肿瘤中也上调，而阻遏分子MXD4和MAX则显著下调(图2 C). 因此，三阴性肿瘤中MYC活性增强可能不仅是MYC上调的结果，也可能是其他MYC调节基因表达改变的结果。

MYC信号上调与预后不良相关

接下来，我们根据新佐剂I-SPY试验中患者的MYC基因特征检查了患者的临床结果。我们发现MYC基因特征增加与无病生存期显著缩短相关，平均随访3.9年（P=0.005；图3 A). 令人惊讶的是，我们发现，在常规新辅助化疗完成后，手术时原发肿瘤的反应根据MYC特征评分没有显著差异(图3 B). 为了进一步研究MYC信号与新辅助化疗反应之间的关系，我们将总患者人群分为两类。一组患者由完全缓解或残留癌症负担最小的患者组成（RCB 0/I；Symmans等人，2007年)常规化疗后。另一组由患有实质性残留病（RCB II/III）的患者组成。对于对新辅助化疗（RCB 0/I）有显著反应的患者，MYC信号的增加并没有显著改变预后(图3 C). 相比之下，对于那些肿瘤对新辅助化疗（RCB II/III）只有最低反应的患者，MYC信号增加与早期疾病复发相关(图3 D; P=0.001）。

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MYC信号升高与不良结果相关。（A） 不同MYC通路激活水平患者乳腺癌复发的总体风险。I-SPY试验患者(n个=149）根据其预处理活检样本中MYC特征基因的相对表达分为三分位。使用Cox比例风险模型和Wald检验评估了这些组之间疾病复发风险的差异。（B） 新辅助化疗后MYC通路激活与肿瘤负担的相关性。具有基因表达数据的I-SPY TRIAL患者的MYC途径激活三分位，其中RCB（0-III；Symmans等人，2007年)是在手术时确定的(n个=133），已检查。使用Fisher精确检验评估残余肿瘤负荷与MYC途径激活三分位之间的相关性。（C） RCB 0/I患者的MYC特征疾病复发。（D） RCB II/III患者的MYC特征疾病复发。（E） 将受体状态和MYC通路激活作为连续变量进行多变量分析。

虽然MYC表达升高与三阴性乳腺癌之间有着密切的联系(图1和​和2），2)，在受体状态和MYC途径激活方面也存在相当大的异质性(图2 A)，引导我们探索不良结果是否与MYC途径激活相关（单变量Cox比例危险比=19.0，MYC通路激活作为连续测量；95%置信区间[CI]:4.4–82.3；P<0.001；n个=146）反映了三阴性疾病的侵袭性（相对于受体阳性肿瘤，三阴性肿瘤的单变量Cox比例危险比=2.2；95%CI:1.2-4.0；P=0.015；n个=146）或MYC通路激活是否可能是不良预后的独立预测因子。在同时考虑受体状态和MYC途径激活的多变量模型中，受体状态和预后之间的关联性显著降低（危险比[HR]=1.6；95%CI:0.8-3.0；P=0.176；n个=146），而MYC途径的激活和结果仍然显著相关（HR=14.2；95%CI:3.1-64.4；P<0.001；n个= 146;图3 E). 这些结果表明，MYC途径激活包含有关复发风险的额外信息，而这些信息并没有仅反映在受体状态中。

MYC表达升高的三阴性乳腺细胞对CDK抑制敏感

鉴于MYC活性升高的肿瘤患者预后不佳，我们试图确定一种针对这些肿瘤的治疗策略。以前在工程细胞和转基因小鼠模型中观察到MYC过度表达和有丝分裂激酶CDK1抑制之间的合成致死性(Goga等人，2007年). 然而，这种合成致死性尚未在乳腺癌中进行检测。Purvalanol A，一种对CDK1具有较高特异性的实验性小分子CDK抑制剂(格雷等人，1998年)诱导淋巴瘤细胞和过度表达MYC的肝细胞凋亡(Goga等人，2007年). 重要的是，CDK1的抑制对对照细胞或正常小鼠组织的活性几乎没有影响(Goga等人，2007年).

我们推断，MYC过度表达的三阴性乳腺癌细胞也可能对CDK抑制的合成致死相互作用敏感。为了模拟我们在I-SPY临床样本中的观察结果，我们测试了一组MYC表达升高的三阴性细胞系和一组基于先前公布的mRNA数据预计MYC蛋白表达降低的受体阳性细胞系(Neve等人，2006年)对CDK抑制剂的敏感性(图4 A). 在这些实验中，我们测试了两种CDK抑制剂：purvalanol A和另一种CDK抑制物dinacilib(Parry等人，2010年)目前正在进行针对各种肿瘤类型的第二阶段临床试验(Dickson和Schwartz，2009年). 与之前在临床试验中评估的其他CDK抑制剂相比，地那西林抑制浓度为1-5nM的CDK1、2、5和9，这在体内很容易实现，并且表现出更好的药代动力学（PK）和药效学（PD）特性。

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升高的MYC表达使三阴性肿瘤对CDK抑制敏感。（A） 用CDK抑制剂purvalanol A（10µM）或dinaciclib（10 nM）处理一组三阴性和受体阳性的乳腺细胞，以及一对经改造过表达MYC的匹配的非肿瘤模型上皮细胞（RPE细胞）72小时，并进行生存力测定。虚线表示在添加CDK抑制剂时（时间0）的相对起始细胞数。正数表示细胞生长，负数表示细胞死亡。实验被独立重复五次。误差条代表平均值±SEM。P值由双尾Student’st吨用两种抑制剂处理的细胞系的比较试验。显示了显示所示细胞系MYC和肌动蛋白表达的蛋白质印迹。（B） 用10µM蒲戊醇A或10 nM地那昔布处理72小时后，三个三重阴性细胞系和三个受体阳性细胞系的细胞周期曲线。根据基于碘化丙啶染色的DNA含量测定细胞周期G1和G2-M期细胞的百分比。（C） 用抗CDK1或CDK2的siRNA处理一组三阴性和受体阳性乳腺癌细胞72小时，并评估细胞活性。实验被独立重复三次。误差条代表平均值±SEM。P值由双尾Student’st吨测试。显示CDK1、CDK2和肌动蛋白表达的蛋白质印迹。

分别用10µM purvalanol A或10 nM dinacilib处理乳腺细胞系，并进行细胞活力测定。在正常人上皮细胞中，这些选定的浓度诱导细胞周期停滞而不会导致细胞死亡(图4 A;Goga等人，2007年). 当用蒲戊醇A处理过表达MYC（RPE-MYC）的人上皮细胞（RPE-YC）时，其细胞死亡，而内源性MYC表达水平（RPE-NEO）的上皮细胞则不会，分别作为阳性和阴性对照(图4 A;Goga等人，2007年). 与蒲戊醇A相比，地那昔布在诱导上皮细胞凋亡方面表现出约1000倍的效力，该上皮细胞被设计用于过度表达MYC，但在对照RPE-NEO细胞中没有(图4 A). 在乳腺细胞系中，CDK抑制剂治疗在所测试的五种三阴性细胞系中均诱导了大量细胞死亡（范围25-65%），而大多数受体阳性细胞系对这种治疗表现出耐药性(图4 A). 一个受体阳性株SKBR3对这些抑制剂敏感（导致>25%的细胞死亡）；然而，这可能是这些细胞中MYC表达增加的结果(图4 A)，这不是从先前公布的mRNA分析数据中预测的(Neve等人，2006年). 流式细胞仪的细胞周期分析表明，普伐洛尔A对三阴性和受体阳性乳腺癌细胞株的治疗均能诱导G2-M阻滞细胞的积累增加，而迪那西布可使G1-S和G2-M的细胞阻滞(图4 B). 这与结果一致，结果表明，蒲戊醇A对CDK1具有高度选择性(格雷等人，1998年)而迪那西布利以类似的效力作用于CDK1和CDK2(Parry等人，2010年).

尽管这些小分子CDK抑制剂对CDK1（purvalanol A）或少数CDK（dinacilib）具有选择性，但其他非CDK激酶也可能被抑制，因此可能有助于整体细胞死亡表型。为了解决这个特异性问题，并进一步研究MYC过度表达和CDK抑制之间的合成致死性，我们进行了siRNA实验，在一组三阴性和受体阳性细胞系中敲除特异性CDK(图4C). 我们发现，用CDK1 siRNA处理所有三个三阴性细胞系72小时后，导致大量细胞死亡，而受体阳性细胞系的生存能力仅受到轻微影响(图4 C). 有趣的是，我们发现CDK2 siRNA也可以诱导细胞死亡，但在两个三阴性细胞系和一个受体阳性细胞系中的诱导程度较低，这与最近的观察结果一致，即CDK2功能可能对某些癌症类型的生存能力至关重要(Molenaar等人，2009年). 地那昔布诱导的更高的细胞杀伤效力可能部分是由于它能够同时抑制CDK1和CDK2(Parry等人，2010年). 出乎意料的是，我们发现CDK1 siRNA处理显著增加了所有三个三阴性细胞系和一个受体阳性细胞系中CDK2蛋白的表达，而CDK2 siRNA没有改变CDK1蛋白的表达(图4C). CDK2的上调是否意味着细胞周期内唯一有丝分裂CDK的丢失是一种代偿机制，尚待确定。

高MYC乳腺癌细胞对CDK抑制敏感性的一个可能解释是，它们更具增殖性。因此，人们预计这些细胞对靶向细胞增殖机制的其他化疗药物也会更加敏感。为了研究这种可能性，我们测试了本研究中使用的乳腺线对化疗药物紫杉醇和阿霉素的敏感性(表1)在临床实践中常用于治疗乳腺癌，包括在I-SPY试验中。本研究中使用的细胞系对化疗药物没有表现出任何MYC表达特异性敏感性。这些基于细胞的研究与I-SPY试验的观察结果一致，即MYC信号与原发性肿瘤对传统化疗药物的反应改善无关。因此，除了在细胞增殖中的作用外，MYC的其他功能可能也有助于观察到的合成致死机制。

表1。

人类乳腺细胞系对化疗药物的敏感性（LC50）

细胞系受体状态升高的MYC紫杉醇阿霉素
微米微米
MDA-MB-231型TN公司是的0.820.73
HCC3153号TN公司是的0.15>5.0
英国电信549TN公司是的0.140.61
MCF10A型MYC公司TN公司是的0.210.77
SUM149系列TN公司是的0.674.6
HCC1428公司RP公司不>5.00.72
UACC812型RP公司不1.30.85
T47D型RP公司不0.060.37
LY2型RP公司不>5.00.55
SKBR3公司RP公司中级0.050.91

定量Western blotting显示MYC蛋白在三阴性（TN）和受体阳性（RP）细胞系中的表达。未观察到MYC表达升高与紫杉醇或阿霉素敏感性之间的相关性（双尾Student’st吨测试）。

接下来，我们询问在MYC表达升高的细胞中观察到的CDK抑制诱导的细胞死亡是否依赖于其MYC状态。为了解决这个问题，我们首先使用RNAi方法来敲低MYC蛋白的表达。我们发现，用MYC特异性siRNA预处理RPE-MYC细胞可显著降低CDK抑制依赖性细胞死亡的程度(图5 A). 类似地，在加入蒲戊醇A之前用MYC siRNA处理的三个三阴性细胞系的敏感性大大降低(图5 B). 接下来，我们使用慢病毒转导方法在受体阳性细胞中过度表达MYC，以检查MYC的过度表达是否足以使这些原本耐药的细胞对CDK抑制敏感。我们发现，普伐洛尔A对T47D和HCC1428细胞的过度表达MYC治疗导致细胞死亡显著增加(图5 C). 因此，这些结果表明，升高MYC表达是必要的，它增加了乳腺癌细胞对CDK抑制剂的敏感性。有趣的是，虽然MYC RNAi显示MYC蛋白表达显著下降(图5 B)，它并没有明显改变细胞活力（未描述）。

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CDK抑制剂诱导的细胞死亡是MYC依赖性的。（A） RPE细胞中CDK抑制诱导的细胞死亡的MYC依赖性。首先用MYC siRNA或对照非特异性siRNA处理RPE-MYC细胞24小时，然后用蒲戊醇A处理72小时。收集的细胞通过Guava ViaCount分析细胞活力，并通过Western blotting分析PARP激活。实验重复三次，共三次。误差条代表平均值±SEM。P值由双尾Student’st吨测试。（B） 接受普伐洛尔A治疗的三阴性细胞中siRNA-介导的MYC敲除。实验被独立重复三次。误差条代表平均值±SEM。P值由双尾Student’st吨测试。（C） 受体阳性细胞系T47D和HCC1428，设计用于过度表达MYC，并暴露于蒲戊醇A治疗72小时。实验重复三次，共三次。误差条代表平均值±SEM。P值由双尾Student’st吨测试。

CDK抑制在三维培养系统中诱导三阴性细胞死亡

虽然我们在单层培养中看到了三阴性细胞对CDK抑制的敏感性(图4)有证据表明，在体外和体内条件下，肿瘤细胞对抗癌药物的反应可能不同(Weaver等人，2002年). 为了解决这个问题，我们首先在3D Matrigel培养系统中检测了CDK抑制对细胞活力的影响。3D上皮细胞培养已被广泛用作体外系统，以更接近上皮细胞的生理微环境(Lee等人，2007年). 事实上，已经证明，3D基因签名可以更准确地预测几个独立数据集的结果(Fournier等人，2006年;Martin等人，2008年). 将两个受体阳性细胞系（T47D和HCC1428）和两个三阴性细胞系（SUM149和BT549）接种到固体Matrigel基质上，形成菌落，然后用10µM purvalanol或10 nM dinacilib处理，并允许其生长6天。在该试验中，如果细胞发生细胞死亡，平均菌落大小在处理孵育时间的第一天和最后一天（第0天和第6天）之间减小。然而，如果细胞对CDK抑制诱导的细胞死亡不敏感，在细胞周期停滞的情况下，菌落的大小保持不变或可能增加。我们发现，在普伐洛尔a或地那昔利治疗后的6天内，两个三阴性细胞系的平均菌落大小显著降低(图6，A和B)，表明这些培养物中的细胞经历了广泛的细胞死亡。相反，由两个受体阳性细胞系形成的集落没有显著变化(图6，A和B)提示细胞周期阻滞的诱导。作为阳性对照，所有四种细胞系的DMSO处理培养物在第6天显示出强劲的生长(图6，A和B). 因此，与我们在2D培养中观察到的结果一致，表达低MYC的受体阳性细胞似乎对细胞死亡具有抵抗力，而MYC表达升高的三阴性细胞在3D培养中对CDK抑制特别敏感。

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CDK抑制降低3D Matrigel基质中三阴性癌细胞的集落大小。（A） T47D、HCC1428、BT549和SUM149细胞系的3D Matrigel培养物的低倍和高倍图像，分别在DMSO处理的第0天和第6天、purvalanol A处理的和dinacilib处理的培养物中。不可折射的暗粒子表明存在细胞死亡。棒材，10µm。（B） 3D基质胶培养物菌落大小的量化。获得Matrigel培养物的低分辨率图像，并在治疗的第一天（第0天）和最后一天（第6天）测定每个培养物中菌落的平均大小。将每个细胞系第0天的平均菌落大小设置为100%，并将第6天的菌落大小与第0天大小进行比较。实验被独立重复三次。误差条代表平均值±SEM。P值由双尾Student’st吨测试。

CDK抑制诱导小鼠三阴性乳腺癌异种移植模型体内肿瘤消退

对任何治疗策略的严格测试都是抑制或逆转体内肿瘤生长的能力。利用乳腺癌异种移植模型，我们检测了在MYC表达升高的人类三阴性肿瘤中抑制CDK的体内疗效。由于与普伐洛尔A相比，地那昔布具有更高的效力和更好的PK特性，因此我们重点关注它。我们试图生成三个三阴性和三个受体阳性的人类乳腺癌细胞系的肿瘤异种移植物。将肿瘤细胞移植到BALB/c Nu/Nu小鼠中，并允许其形成可测量的肿瘤（200–250 mm三体积）。两个MYC表达升高的三重阴性细胞系MDA-MB-231和HCC3153形成外显率高的肿瘤，并用于后续研究。尽管我们努力通过使用Matrigel来增加肿瘤植入，但我们种植受体阳性细胞肿瘤的尝试并没有成功，这要么是因为无法形成肿瘤，要么是因为只形成了零星的小肿瘤。

然后，对三阴性肿瘤荷瘤小鼠每周进行两次治疗，持续2周，使用地那昔布（50 mg/kg/剂量i.p.）或溶媒对照。在实验期间，用稀释剂治疗的小鼠肿瘤生长增加了约120-150%(图7，A和B). 相比之下，替萘西林治疗的小鼠对约50%的肿瘤消退有显著的反应(图7，A和B). 在独立实验中，我们还检测了治疗24小时后，地那昔布对已建立的MDA-MB-231和HCC3153异种移植物的影响。我们发现具有一致性CDK基序的假定CDK底物的总磷酸化水平以及经验证的CDK1底物PP1-α（蛋白磷酸酶1–α；T320；Dohadwala等人，1994年;Bletrow等人，2008年)在原发性肿瘤中(图7 C). 这伴随着肿瘤组织中PARP裂解所显示的诱导凋亡(图7 C). 总之，这些结果表明，CDKs的小分子抑制是一种新的、可行的治疗人类三阴性乳腺癌的策略。

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抑制CDK对小鼠异种移植性三阴性肿瘤有效。（A） 三阴性乳腺癌小鼠异种移植模型中的肿瘤生长。显示了单独使用载体或使用替尼昔布（50 mg/kg i.p.，每周两次）治疗2周后肿瘤的典型照片。（B） 用CDK抑制剂迪那昔利（50 mg/kg i.p.，每周两次）治疗2周的裸鼠体内三重阴性肿瘤的生长。每种肿瘤细胞类型的每个治疗组包含指定数量的小鼠。误差条代表平均值±SEM。P值由双尾Student’st吨测试。（C） 肿瘤中的PARP裂解和假定CDK底物的丝氨酸磷酸化发生在服用替尼昔布24小时内。该抗体可识别包含磷酸化CDK共有表位的氨基酸序列，即（K/R）（磷酸化S）（PX）（K/R），其中X可以是任何氨基酸。每个细胞系显示了每个治疗的两个独立肿瘤样本（载体或dinaciclib）。

BIM上调介导CDK抑制依赖性细胞死亡

接下来，我们试图了解上皮细胞中MYC表达升高和CDK抑制之间合成致死相互作用的机制。我们之前报道过CDK抑制诱导的凋亡独立于p53，但需要激活线粒体固有的凋亡途径(Goga等人，2007年). 因此，我们推断，抑制CDKs可能会增加促凋亡BCL-2家族成员的活性或降低促生存因子的活性。为了验证这一假设，我们检测了用于过度表达MYC（RPE-MYC）或对照细胞（RPE-NEO）的匹配RPE细胞中线粒体内在途径成分的蛋白表达。RPE细胞内源性MYC表达水平适中(图4 A)这使它们成为研究MYC过度表达反应的合适模型。我们发现，促凋亡的BH3-only成员BIM在RPE-MYC细胞中显著上调(图8 A)正如先前在其他细胞类型中观察到的那样，设计用于过度表达MYC(Egle等人，2004年;Hemann等人，2005年). 令人惊讶的是，在RPE-MYC细胞被蒲戊醇A处理后，BIM进一步显著上调，而在整个时间过程中，RPE-NEO细胞中的BIM蛋白水平仍然无法检测到(图8 A). RPE-MYC细胞中的BIM上调与PARP的裂解相一致，这一事件表明细胞凋亡的诱导(图8 A). 蛋白质定量显示，BIM蛋白在该特定细胞系中上调的程度是2.2倍(图8 B). 这种BIM上调水平可能是显著的，因为BIM上调会诱导细胞凋亡，除非其活性同时受到抗凋亡BCL-2家族成员的过度表达的抑制(O'Connor等人，1998年). 定量PCR（TaqMan）分析显示，用普伐洛尔A处理RPE-MYC细胞后，BIM mRNA上调（约2.5倍）(图8 C). 这些结果表明，CDK抑制后BIM上调在一定程度上是BIM mRNA水平升高的结果。普伐洛尔A治疗后，RPE-NEO细胞中的BIM mRNA也增加，但仍显著低于RPE-MYC细胞中观察到的水平(图8C). 有趣的是，我们发现dinaciclib处理RPE-MYC细胞不仅导致purvalanol A处理发现的BIM-EL亚型的上调，还导致较短的BIM-L和BIM-S亚型的上调(图8 D)已被证明在诱导细胞凋亡方面更有效(O'Connor等人，1998年). 这至少可以部分解释与替那西利相比，普伐洛尔A具有更高的效力(图4 A).

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BIM在MYC表达升高的细胞中有助于CDK抑制诱导的细胞死亡。（A） 用10µM purvalanol A处理具有或不具有组成性MYC过度表达的RPE细胞72 h，并测试多个促凋亡和抗凋亡BCL2家族成员的蛋白表达，以及裂解的PARP和负载控制的β-肌动蛋白。所示结果代表了至少五个独立实验。（B） 用purvalanol A处理72小时后，RPE-MYC细胞中BIM蛋白表达的相对折叠变化。purvalalanol A时间过程实验重复至少五次，并按照材料和方法中的描述对BIM蛋白进行定量。误差条代表平均值±SEM。（C）普伐洛尔A治疗后BIM mRNA表达。在有或没有组成型MYC过表达的RPE细胞中，通过qPCR定量BIM mRNA水平。显示了三个实验的平均值±SEM。（D） 用替那昔布处理36小时后，RPE-MYC细胞中BIM的表达。（E）用一组特异性BIM siRNA或一组对照非靶向siRNA转染RPE-MY细胞，用10µM purvalanol a处理72小时后测定细胞活力。实验重复三次。误差条代表±SEM。（F）BIM蛋白在一组三阴性细胞中的表达。用10µM purvalanol A处理72 h后，对细胞株进行BIM蛋白表达测试。结果显示至少有三个独立实验的代表性。（G） BIM蛋白表达的量化。所示为至少三个独立实验的平均值，分别得出以下SEM：±0.2（HCC3153）、±0.88（BT549）、±0.48（MCF10AMYC公司)和±0.57（SUM149PT）。（H） shRNA-介导的两种三阴性细胞株MCF10A的BIM基因敲除MYC公司和BT549。抗GFP的shRNA作为阴性对照。（一） BIM敲除对MCF10A细胞死亡的影响MYC公司和BT549细胞。实验重复至少三次，一式三份。误差条代表平均值±SEM。P值由双尾学生的t吨测试。

我们假设，CDK抑制后MYC过度表达细胞中观察到的细胞死亡取决于BIM的阈值水平，而RPE-NEO细胞中没有达到该阈值水平。为了验证这一假设，我们询问在MYC过度表达的情况下，BIM对CDK抑制诱导的细胞死亡是否必要。用BIM-特异性siRNAs预处理RPE-MYC细胞，保护细胞免受purvalanol A诱导的细胞死亡(图8 E). 这些发现证实BIM是CDK抑制剂诱导凋亡的主要促因。接下来，我们测试了MYC表达内源性升高的三阴性乳腺细胞系，并观察到CDK抑制剂治疗后BIM的类似上调(图8，F–G). 为了确定在CDK抑制剂治疗后这些细胞中是否需要BIM来诱导细胞死亡，我们生成了表达对照或BIM shRNA的稳定细胞系(图8 H). 我们发现BIM耗竭可以减轻普伐洛尔A治疗后的细胞死亡(图8一). 这些结果表明，CDK抑制剂诱导MYC表达升高的三阴性细胞凋亡的机制涉及BIM上调。

除了促凋亡的BCL-2家族成员BIM外，我们还发现，在没有普伐洛尔A的情况下，与RPE-NEO细胞相比，RPE-YC细胞中BCL-2、BCL-xL和MCL-1这三个前存活BCL-2家庭成员也上调了表达(图8 A). 这与以下假设相一致，即已进化为维持高MYC表达的癌症已在促凋亡因子和抗凋亡因子之间达到平衡，以限制自发凋亡(Lowe等人，2004年;Hemann等人，2005年). 这也与先前的观察一致，即MYC和BCL-2在高级别人类乳腺肿瘤中共同过度表达(Sierra等人，1999年). 然而，在我们的研究中，当CDK被抑制时，这些前生存成员的表达水平没有明显变化(图8 A). 因此，用CDK抑制剂治疗MYC表达升高的肿瘤，如三阴性乳腺癌，可能会通过增加BIM表达而使平衡偏向于凋亡。

讨论

显然，迫切需要针对三阴性乳腺癌制定有针对性的治疗策略。因此，为了确定这些治疗靶点，需要更好地了解三阴性乳腺癌的生物学。在这项研究中，我们研究了三阴性肿瘤的生物学，并确定这些肿瘤中MYC信号升高。先前的研究已经检测了乳腺癌中MYC的表达；然而，我们首次发现，在三阴性肿瘤中，多个MAX结合伙伴的表达改变了，它们可以调节MYC活性，因此可能有助于MYC通路的活性。

几项研究表明，基底型乳腺癌亚型表现出MYC转录基因特征的富集(Alles等人，2009年;Chandriani等人，2009年;Gatza等人，2010年). 然而，基底部乳腺肿瘤仅占三阴性肿瘤的约70%，而MYC信号在其余30%肿瘤中的重要性之前尚不清楚。在临床实践中，对肿瘤进行雌激素受体、孕激素受体和HER2受体状态的常规评估，因此，三阴性亚型的病理学测定与决定治疗疗程更具临床相关性。我们发现，在I-SPY试验的36个三阴性肿瘤中，33个（92%）具有较高或中等的MYC基因特征分数(图2 A)与较差结果相关(图3、A和D). 本研究还首次证明，MYC信号与肿瘤对新辅助化疗反应不佳的患者无病生存率降低有关(图3 D).

为了确定升高的MYC信号是否可以用于治疗三阴性乳腺癌，我们评估了MYC上调和CDK抑制之间的合成致死方法的效用。在MYC表达升高的三阴性细胞系以及小鼠异种移植模型中，小分子抑制CDK活性可有效诱导显著的细胞死亡。我们发现，这种细胞死亡的机制包括促凋亡BCL-2家族成员BIM的上调。因此，这项研究在确定治疗三阴性乳腺癌的凋亡机制方面迈出了重要一步。

虽然先前的研究关注MYC的许多生物学功能，但如何将这些信息转化为治疗乳腺癌的新方法尚不清楚。在一个新兴的个性化医疗时代，确定哪些特定患者群体最能从给定的治疗策略中受益至关重要。我们发现，对于常规新辅助化疗的肿瘤反应有限的患者，MYC表达强烈影响无病生存。因此，深入了解MYC信号的组成部分将提供潜在的靶点，可以作为这部分乳腺癌患者的新疗法。然而，尽管MYC信号在多种人类癌症中上调，直接抑制MYC的潜在效用仍不清楚。例如，尚未发现通过RNAi敲低MYC会降低培养的肿瘤衍生细胞的生存能力(Guan等人，2007年)与我们在乳腺癌细胞研究中的观察结果一致。相反，使用实验化合物10058-F4抑制MYC-MAX二聚体，导致培养的人类白血病细胞中诱导凋亡(Huang等人，2006年). 此外，在KRAS启动的小鼠肺肿瘤模型中，使用条件显性阴性突变抑制MYC转录活性可诱导细胞死亡并导致肿瘤退化(Soucek等人，2008年). 这些观察结果之间的差异是否是所用方法的结果（即，击倒MYC蛋白表达与抑制其转录活性），或者每种癌症类型在某种程度上取决于放松管制的MYC活性，需要进一步调查。

另一种直接抑制MYC的方法是使用MYC依赖的合成-致死策略。我们之前使用工程细胞系和体内模型系统确定了MYC过度表达和CDK1抑制之间的一种合成-致死相互作用(Goga等人，2007年). 最近的研究表明，RNAi介导的或小分子抑制另外两种细胞周期激酶，CDK2和极光激酶B，分别与某些癌症细胞类型中MYC过度表达的合成致死相互作用(Molenaar等人，2009年;Yang等人，2010年). 另一项研究也报道了激动剂介导的TRAIL（肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）受体（DR5）激活诱导MYC依赖的合成致死性(Wang等人，2004年). 这些不同形式的合成致死似乎需要根本不同的细胞死亡机制，包括对完整的p53抑癌途径的不同要求(Wang等人，2004年;Goga等人，2007年;Molenaar等人，2009年;Yang等人，2010年). 例如，44-82%的原发性基底部乳腺肿瘤缺乏p53或含有p53突变等位基因(瑟利等人，2001年;Carey等人，2006年). 因此，CDK1-MYC合成致死性与p53无关(Goga等人，2007年)，可能对治疗这些肿瘤特别有用。

靶向细胞周期激酶选择性杀伤肿瘤细胞的想法很有吸引力，这种肿瘤细胞通常比非肿瘤原性细胞具有更高的增殖率，这确实导致了几种小分子CDK抑制剂的临床开发(夏皮罗，2006;Malumbres等人，2008年). 然而，有几个问题与他们的临床发展有关。前几代CDK抑制剂普遍存在体内效价低和PK/PD特性差的问题。最新的第三代CDK抑制剂，包括地那昔布，表现出显著改善的PK/PD特性，为体内使用提供了更大的前景。事实上，迪纳西布利在第一阶段试验中耐受性良好，目前正在针对各种肿瘤类型的第二阶段试验中进行评估(Dickson和Schwartz，2009年;Parry等人，2010年). 之前的临床研究也缺乏对哪种肿瘤类型最可能对CDK抑制剂产生反应的认识(Malumbres等人，2008年). 因此，基于分子靶点（如MYC过表达）选择患者队列可能会提高CDK抑制剂在临床试验中的治疗潜力。

在本研究中，我们发现CDK抑制不仅在被改造为过表达MYC的模型细胞中增加了BIM蛋白水平，而且在一组MYC表达升高的患者来源的三阴性乳腺癌细胞系中也增加了BIM蛋白水平。BIM升高在CDK抑制诱导的细胞死亡中起着直接作用。先前的研究发现BIM亚型可以在转录和翻译后水平上进行调节。最短亚型Bim-S的蛋白表达足以有效诱导细胞凋亡(O'Connor等人，1998年). 相反，最长亚型BIM-EL的活性也可以通过不同的磷酸化机制进行调节，磷酸化机制可以稳定蛋白质或通过蛋白酶体途径诱导其降解(Hübner等人，2008年). 在我们的研究中，我们发现在CDK抑制剂治疗后，上皮细胞中这两种亚型都可以上调。

先前的研究表明，MYC过度表达后BIM表达升高(Egle等人，2004年;Hemann等人，2005年). 在发现CDK抑制触发BIM表达的诱导后，我们开始有兴趣研究一组未经治疗的乳腺癌细胞系中MYC和BIM蛋白表达水平之间的关系。我们没有发现MYC和BIM在这些细胞中的表达之间的相关性，无论其分子亚型或受体状态如何（未发表的数据）。因此，在特定的细胞环境中，BIM活性的相对增加可能是对CDK抑制的反应，而不是BIM表达的绝对基础水平，决定了是否可以启动凋亡。因此，BIM和抗凋亡BCL-2家族成员（如BCL-2、BCL-xL和MCL-1）之间的蛋白质化学计量可能决定是否触发了凋亡。在这方面，CDK抑制与抗凋亡BCL-2家族成员抑制的组合方法预计在MYC过度表达三阴性肿瘤中诱导细胞死亡方面具有协同作用。事实上，一些BH3模拟物(崇海乐和乐泰，2008年)即ABT-737/263(Oltersdorf等人，2005年)和obatoclax(Nguyen等人，2007年)，目前正在开发用于临床。

总之，我们证明了小分子CDK抑制剂在治疗MYC表达升高的三阴性乳腺肿瘤中的实用性。CDK抑制剂可能不仅对MYC过度表达的三阴性肿瘤有效，而且对MYC表达升高的侵袭性受体阳性肿瘤（即管腔B）也有效。先前已经描述了石蜡包埋原发性肿瘤活检中MYC蛋白表达的免疫组织化学分析方法(Gurel等人，2008年;Ruzinova等人，2010年). 此外，原发性乳腺肿瘤的基因表达谱分析方法正在临床上使用（van’t Veer等人，2002年）。这些技术可用于评估患者肿瘤样本中MYC信号是否升高(Alles等人，2009年;Chandriani等人，2009年;Gatza等人，2010年). 因此，这些检测MYC活性的方法有可能转化为临床常规使用。考虑到缺乏针对三阴性肿瘤的既定靶向治疗药物，我们建议MYC状态将被证明是治疗三阴性乳腺癌对CDK抑制剂反应的预测性生物标记物。

材料和方法

I-SPY试验。

149个肿瘤在治疗前得到了表达微阵列结果。由于缺乏一种或多种受体类型的染色，三种肿瘤不能被指定为三阴性或受体阳性，剩下146种可供分析。I-SPY试验方案、患者阵列数据和登记患者特征的详细信息在其他地方描述(Esserman等人，2012年)也可在NCI I-SPY数据门户网站上获取(http://ispy.nci.nih.gov/). 我们分析中的所有患者都进行了预处理核心活检，其基因表达测量值是使用44K微阵列（安捷伦科技公司）确定的。按照制造商的要求进行微阵列杂交，减去背景，计算Cy3和Cy5强度值的Lowess-normalized log2比值。对于MYC mRNA水平，在已知受体状态的146个样本中比较了MYC特异性探针（a_32_P60687）。参与试验的患者在最终手术切除前接受常规新辅助化疗，包括阿霉素和环磷酰胺，和/或根据I-SPY方案接受紫杉醇。使用RCB量化残留疾病的程度，并按RCB分类报告（RCB 0-III；Symmans等人，2007年).

生物信息学和I-SPY数据分析。

MYC签名的表达(Chandriani等人，2009年)在I-SPY数据集中，首先将两项研究中的平台特异性探针标识符转换为UNIGENE簇标识符（UNIGENE Build 219智人），以此对其进行检验。对映射到相同UNIGENE簇ID的多个探针的数据进行平均。MYC途径活性是指MYC基因特征分数质心，如前所述计算(Chandriani等人，2009年). 确定每个肿瘤的这些基因表达谱与MYC特征质心的皮尔逊相关性。然后根据皮尔逊相关值将肿瘤从高到低排序。缺乏确凿受体状态信息的肿瘤被排除在分析之外。剩余的肿瘤被分为三个三分位，分别代表与MYC特征质心高、中或低相关的三组。使用考克斯比例风险模型分析无复发生存率，并使用瓦尔德检验进行评估。该分析使用R环境统计计算中的生存数据包进行(http://www.r-project.org/). 使用Fisher精确检验评估分类变量之间的关联。该分析是使用R Environment for Statistical Computing中的stats包进行的(http://www.r-project.org/).

MYC和磷酸化MYC表达的反向蛋白质阵列分析。

从人类肿瘤中提取蛋白质，如前所述进行反向蛋白裂解物微阵列(Tibes等人，2006年;轩尼诗等，2007年;Hu等人，2007年;Liang等人，2007年). 简言之，裂解缓冲液用于通过均质化来裂解冷冻肿瘤。使用双辛酸分析将肿瘤裂解液标准化为1µg/µl浓度，并用1%十二烷基硫酸钠煮沸，用裂解缓冲液将上清液手动稀释为6或8倍的两倍系列稀释液。一个阵列仪（2470；Aushon Biosystems）在硝基纤维素涂层的快速载玻片（Schleicher&Schuell BioScience）上从系列稀释液中创建了1056个样品阵列。然后用经验证的初级MYC和磷酸化MYC T58/S62抗体（细胞信号技术）探测载玻片，并用催化系统（Dako）放大信号。二级抗体被用作扩增的起点。使用MicroVigene软件（VigeneTech Inc.）对载玻片进行扫描、分析和定量，以使用逻辑拟合模型生成每个样品的系列稀释信号强度曲线：ln（y）=a+（b−a）/（1+expc*[d−ln（x）]). 然后使用幻灯片上每个样本曲线的代表性自然对数值（曲线平均值）作为每个样本中每个蛋白质数量的相对定量。如前所述，使用>150个蛋白质的平均表达水平校正蛋白质负荷后，每个样品中的未磷酸化和磷酸化MYC（T58/S62）水平表示为对数中心值(Tibes等人，2006年;轩尼诗等，2007年;Hu等人，2007年;Liang等人，2007年;Stemke-Hale等人，2008年;Gonzalez-Angulo等人，2009年).

细胞培养。

本研究中使用的人类乳腺细胞系的繁殖及其全球mRNA表达谱已在前面描述过(Neve等人，2006年). 先前描述了工程化人类上皮细胞系RPE-NEO和RPE-MYC细胞(Goga等人，2007年). 通过将pLVX-AcGFP-N1质粒制备的慢病毒与克隆到EcoRI–XhoI位点的全长人类MYC cDNA或表达MYC的重组逆转录病毒感染细胞以生成MCF10A-MYC细胞，建立了MYC过表达型受体阳性细胞系T47D和HCC1428。。

细胞活力测定。

CellTiter（Promega）细胞活性测定如所示图4 A根据制造商的说明，使用运行麦哲伦软件的Safire2平板读取器（TECAN）在96个平板上进行。每个细胞系在每次实验中被放置在10个孔上，并且该实验至少重复五次。对于本手稿中描述的其余细胞活力实验，根据制造商的说明进行了基于流式细胞术的Guava ViaCount活力测定（Millipore）。

细胞周期分析。

用二甲基亚砜、10µM purvalanol A或10 nM dinacilib（由国家癌症研究所（马里兰州贝塞斯达）癌症治疗和诊断科发展治疗计划药物合成和化学分院和MERCK提供）处理细胞株72小时。治疗后，细胞在70%乙醇中固定，并用碘化丙啶染色以测量DNA含量。样品在LSRII流式细胞仪上进行分析。对细胞群进行门控以排除细胞碎片和倍体，并使用FlowJo分析软件（Tree Star）确定细胞周期分布。

蛋白裂解物制备和蛋白质印迹分析。

用冰镇PBS清洗培养细胞，并将其直接收集到含有完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）和磷酸酶抑制剂（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，0.5%脱氧胆酸钠，1%NP-40，0.1%SDS，2 mM EDTA，pH 7.5）中。分离的肿瘤组织首先在冰镇PBS中清洗，然后使用Tissue Tearor（Biospec Products，Inc.）在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中在冰上均质。蛋白质浓度是通过以BSA为标准进行DC蛋白质测定（Bio-Rad Laboratories）来确定的。以下抗体用于西方分析：MYC（表观分子）、β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich）、PARP（细胞信号技术）、BIM（分析设计）、Puma（细胞信号科技）、Bid（研发系统）、Bax（细胞信号技术）、Bak（圣克鲁斯生物科技公司）、BCL-2（细胞信号高科技）、，BCL-xl（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、MCL-1（Abcam）、磷酸-（Ser）CDK底物（细胞信号技术）、PP1-α（Epitomics）、PP1-α（pT320；Epitomic）、CDK1（圣克鲁斯生物技术公司）和CDK2（圣克鲁兹生物科技公司）。

相对蛋白质表达水平的测定。

VersaDoc成像系统（4000 MP；Bio-Read实验室）用于量化蛋白质表达。通过将预饱和的BIM信号标准化为β-肌动蛋白信号，确定蛋白质水平上的BIM上调。为了确定一组乳腺细胞系中MYC蛋白的相对表达水平，将通过抗MYC蛋白质印迹获得的MYC信号与之前描述的Ponceau S染色带的总荧光进行标准化(Nijjar等人，2005年). 由于本研究中使用的乳腺细胞系中主要内务蛋白的蛋白质表达水平存在显著差异，因此有必要使用这种方法。

小分子CDK抑制剂。

Purvalanol A（Sigma-Aldrich）在100%DMSO中进行重组。除非另有说明，否则在之前显示的浓度（10µM）下使用它可诱导各种哺乳动物细胞系中的细胞周期阻滞(格雷等人，1998年;Goga等人，2007年). 在细胞培养用的100%二甲基亚砜中或在小鼠研究用的20%HPBCD（羟丙基β-环糊精）中重建地那西林。

Matrigel 3D文化。

如前所述，建立3D培养物(Lee等人，2007年). 简单地说，将细胞以每孔2000个细胞的速度接种在96周板中的固化基质（BD）层顶部，并培养6天以形成多细胞集落。此时获得相位对比图像，并指定为第0天。用DMSO、10µM purvalanol A或10 nM dinacilib处理培养物，并再培养6天，然后获得处理和对照培养物的图像，并指定为第6天。使用ImageJ图像分析软件（美国国立卫生研究院）对图像进行分析。减去背景以消除培养图像中阴影效应造成的强度差异，并使用ImageJ中的粒子分析算法确定场中菌落的平均面积。为了减少碎片被纳入分析的可能性，排除了面积为5000像素（3.1µm）或更小的颗粒（根据经验确定的图像中非细胞碎片的平均尺寸）。将每个细胞系第0天培养物的平均表面积设置为100%，并确定第6天处理培养物相对于第0天的平均表区域。学生的t吨检验用于确定统计显著性。

小鼠异种移植研究。

对于本研究中使用的所有乳腺癌细胞系，107将200µl PBS中的细胞皮下注射到6–8周龄的免疫缺陷雌性小鼠（BALB/c裸/裸）中。允许肿瘤生长3-4周（肿瘤达到～200-250 mm三（体积），然后通过腹腔注射给予动物50 mg/kg的替那昔布或单独载体（20%HPBCD）。所有动物实验均由加州大学旧金山分校动物护理和使用委员会批准。

siRNA/shRNA实验。

除非另有说明，根据制造商的协议，分别使用针对人类CDK1、CDK2、MYC和BIM的siRNA（BCL2L11）和非靶向对照siRNA池（siGENOME SMART池siRNA；Dharmacon）。对于中描述的MYC击倒实验图5 A，分别针对人类MYC和荧光素酶（阴性对照）的脂质体siRNA制剂由Alnylam Pharmaceuticals，Inc.提供。本研究中使用的逆转录病毒shRNA构建物为pMKO shRNA Bim（质粒17235；Addgene；Schmelzle等人，2007年)和pMKO shRNA GFP（质粒10675；Addgene；Masutomi等人，2005年).

分析BIM公司mRNA水平使用定量PCR。

对有或无构成性MYC过度表达的RPE细胞，用purvalanol A处理0、24、48和72小时。用mirVana（Ambion）从细胞中分离出总RNA，并用DNaseI消化以去除污染DNA（Ambio）。使用Superscript II逆转录试剂盒（Invitrogen）从1µg总RNA制备cDNA。使用人类特异探针进行实时PCRBIM公司和β-肌动蛋白（ABI），根据制造商的说明。样品在实时热循环（Bio-Read Laboratories）上运行三份。变更BIM公司使用ΔΔCT方法计算表达式(Livak和Schmittgen，2001年)带有β-肌动蛋白mRNA作为内部控制。

在线补充材料。

表S1提供了352个基因的列表，这些基因构成了用于本研究分析的MYC基因特征。在线补充材料可在http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20111512/DC1.

致谢

我们感谢参与I-SPY试验的患者、研究人员和机构。我们感谢Luika Timmerman博士、Koei Chin、Wen-Lin Kuo、Adi Gazdar、Stephen Ethier和Joe Gray提供细胞系。我们感谢Clifford Hudis博士、J.Michael Bishop博士和Brittany Anderton女士对手稿的评论和批判性阅读。

我们感谢以下支持：加州乳腺癌研究计划博士后（D.Horiuchi和L.Kusdra）和博士前（N.E.Huskey）奖学金、NCI 2T32CA108462博士后培训补助金（L.Kuskra）、霍华德·休斯医学院（S.Chandriani）、加州大学癌症协调委员会（N.E.Hoskey）、，AHA科学家发展基金SDG3420042（J.W.Smyth）、NCI 1K23CA121994（A.M.Gonzalez-Angulo）、Susan G.Komen基金会（A.M.Gonzaledz-Angula、G.B.Mills和A.Goga）、NCI1K08CA104032、1R01CA136717（A.Goga。我们还感谢I-SPY计划提供的额外统计支持：NCI SPORE，CA58207；ACRIN、U01 CA079778和CA080098；以及CALGB、CA31964和CA3360。

作者没有宣布任何竞争性的财务利益。

脚注

使用的缩写：

CDK公司
细胞周期蛋白依赖激酶
PD公司
药效学
PK（主键）
药代动力学
RCB公司
残留癌症负担

工具书类

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文章来自实验医学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社