翻译后修饰对p73活性的调节

摘要

事实

• p73表达为多种亚型，具有相反的促凋亡和抗凋亡特性。
• 含有反式激活域（TAp73）的p73亚型可以诱导细胞周期阻滞和凋亡。
• 缺乏反式激活域的p73亚型（ΔNp73）是TAp73和p53功能的抑制剂。
• 促凋亡和抗凋亡p73物种的比例对基因组损伤的反应至关重要。
• p73除了在调节细胞周期阻滞和凋亡方面的功能外，还是神经干细胞维持的关键调节因子。

开放式问题

• 每个p73亚型在发育和成年生活中何时何地在蛋白质水平上表达。
• 调节不同癌症中TAp73:ΔNp73比率的其他关键分子途径。
• 如何调节TAp73:ΔNp73比值以改善不同癌症的靶向治疗？

自1997年发现以来，p73成为研究最广泛的基因之一，因为这两种蛋白之间的显著同源性可以弥补p53功能的丧失。¹事实上，随后的研究表明，p73可以有效地处理许多p53转录靶点，因此p53和p73的促凋亡功能存在大量冗余。^2,三,4因此，失活p73的促凋亡功能是在癌症中提供选择性优势的关键机制，但为了保护细胞免受肿瘤发生，需要增强p73活性以应对DNA损伤。有趣的是，p73在肿瘤中很少发生突变，但在几种癌症中观察到p73水平升高，包括肝细胞癌、神经母细胞瘤以及肺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌和卵巢癌。^5,6这强烈表明，控制p73蛋白丰度和活性的其他调节机制在这些肿瘤中被解除。

蛋白质-蛋白质相互作用

所有p53家族成员、p53、p63和p73均以多种亚型表达。^1,5,7使用替代启动子（产生转录活性TA和显性负ΔN亚型）和广泛的替代剪接产生24种不同的p73亚型，具有不同的诱导或抑制凋亡的能力(图1).^8,9,10除了这种复杂性外，p73转录物第二外显子中的多嘧啶束结合蛋白基序表明另一种ΔNp73样蛋白的IRES依赖性翻译。¹¹ΔNp73-和ΔNp 73样蛋白对TAp73（以及p53）的抑癌功能表现出显著的负活性，主要通过寡聚作用，构成活性四聚体的转录活性。^12,13根据这种抑制功能，ΔNp73赋予癌细胞株化疗耐药性^14,15ΔNp73过表达与原发性肿瘤预后不良相关。^12,16除了ΔNp73亚型的抑制作用外，选择性剪接p73变异体可以通过寡聚结构域相互作用来调节彼此的转录活性。^1,8,17例如，已经显示p73的共同表达ɛ亚型足以阻止p73β异形体介导p21的表达^WAF1/CIP1.¹⁷

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图1

p73转录本3′端广泛选择性剪接的示意图。每个外显子用不同的颜色表示，开放阅读框中的变化用编码外显子颜色的框架表示，并用灰色填充。例如β亚型是通过剪接外显子13产生的，但外显子14是在不同的框架中读取的，这导致了不成熟的终止密码子。同样，γ亚型是通过剪接外显子11产生的，但外显子12和13是从另一个开放阅读框架（ORF）转录的

p53和p73之间的显著同源性（在DNA结合域为63%，在反式激活域为29%，在四聚体域为38%）最初增加了这些蛋白可以寡聚的可能性，并且p73可以潜在地与其他p53结合蛋白相互作用。虽然野生型和突变型p53在酵母双杂交试验中均显示与p73相互作用，但在肿瘤细胞系中基于联合转染的实验表明，只有突变型p73才能与p73结合。^1,18这种结合导致p73的转录活性降低，并抑制p73诱导细胞凋亡的能力。然而，并非所有p73过表达的肿瘤都含有突变型p53，这表明存在其他机制来抑制p73活性。¹⁹

其他家庭成员p63^20,21在调节p73活性和稳定性方面也具有关键作用。p63和p73共享一个额外的α-螺旋，不存在于p53中，位于其齐聚结构域，因此可以有效地相互作用形成稳定的异四聚体。²²这些相互作用的结果在很大程度上取决于促凋亡和抗凋亡家族成员之间的比率。例如，ΔNp63在80%以上的鳞状细胞癌中过度表达或扩增，可能通过形成稳定的异亮氨酸来阻断p73在促凋亡启动子上的转录活性。^23,24

控制p53蛋白丰度和活性的关键调控机制涉及无名指泛素连接酶Mdm2。^25,26,27过度表达的Mdm2蛋白通过直接与p53结合来传递其抑制作用，以抑制其转录活性或将其靶向蛋白酶体降解。^28,29最初，Mdm2似乎是调节p73活性和稳定性的理想候选药物。事实上，后续研究表明，Mdm2可以结合并抑制p73的转录活性。^30,31,32然而，与p53不同，p73在Mdm2（以及Mdm2相关蛋白Mdmx）结合后稳定。³⁰与p53类似，p73也能调节Mdm2的表达。因此，p73-Mdm2网络中还存在一个反馈调节环，它仅依赖Mdm2的抑制功能来阻断p73-转录活性和抑制凋亡，而不是调节其稳态水平。

p300和CREB结合蛋白（CBP）都可以与p73相互作用并控制其转录活性，充当转录共激活剂。³³p73的N末端与p300/CBP的CH1结构域之间的相互作用增强了TAp73亚型的转录活性。然而，p73的N末端区域也是其与Mdm2相互作用的关键，因此Mdm2和p300/CBP之间对p73结合的竞争是p73转录活性的重要决定因素；也就是说，Mdm2的过度表达导致p300/CBP从p73中错位，p73转录活性丧失。³⁴另一个基于竞争的p73活性控制示例涉及p73与c-myc和MM1（myc调制器1）的相互作用。与对p53的影响类似，c-myc是p73转录活性的有效抑制剂。³⁵这种抑制作用可以通过MM1的共表达来减轻，MM1可以在其C末端结合p73并阻止C-Myc-p73的相互作用。

除p300外，p73最明确的转录共激活物是YAP；一种WW域蛋白，具有较强的反式激活活性，但缺乏DNA结合域。^36,37p73和YAP的表达显著提高了其诱导转录的能力，即使在p73单独表达不足以激活其靶基因（如Mdm2和Bax）的水平上。³⁶YAP的活性严格由存活前丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt（蛋白激酶B）的磷酸化控制。^38,39,40Akt对YAP的S127磷酸化促进其定位于胞浆，在胞浆中不再充当转录辅激活剂。另一方面，作为对促凋亡信号的反应，YAP被早幼粒细胞白血病蛋白（PML）征募到核体以促进p73的转录活性。有趣的是，p73的表达对于DNA损伤后YAP向PML核小体的募集至关重要，因为缺乏p73的细胞不能这样做。⁴¹

p53与病毒癌蛋白的相互作用对其凋亡功能至关重要。例如，腺病毒E1B 55-kDa蛋白和多瘤病毒SV40 T抗原通过将其隔离在非活性复合物中来抑制p53功能，而人乳头瘤病毒E6（HPV-E6）蛋白促进其泛素依赖性蛋白酶体降解。⁴²有趣的是，病毒癌蛋白对p73活性和稳定性的调节与p53有很大不同。^32,43虽然E1B 55-kDa和SV40 T抗原都不能结合p73，但HPV-E6不能介导p73降解。然而，HPV-E6仍然可以通过与TA结构域直接相互作用并抑制其转录活性来灭活p73。

p73在与激酶和组蛋白乙酰转移酶（HAT）相互作用后的磷酸化或乙酰化对于调节其在正常条件下，尤其是DNA损伤后的活性和稳定性也至关重要。这些修饰导致p73相互作用蛋白组合的关键变化，主要是通过改变其亚细胞定位。

磷酸化和乙酰化介导的途径

DNA损伤时p53的积累对反应途径的激活至关重要。这主要是通过p53的磷酸化实现的，这使其对Mdm2介导的泛素化具有抗性，并使其能够与转录共激活剂相互作用。⁴⁴DNA损伤诱导的p53磷酸化主要由丝氨酸/苏氨酸激酶、共济失调毛细血管扩张突变（ATM）和Chk2的激活介导。虽然Chk2也以p73为磷酸化靶点，⁴⁵与p53不同，DNA损伤后p73的积累主要由非受体酪氨酸激酶c-Abl介导。^{46,47,48,49,50}在基因毒性损伤（例如g射线照射或顺铂治疗）后，p73通过其在c末端同源低聚化结构域的PxxP基序与c-Abl相互作用，并在Tyr99以及Tyr121和Tyr240处主要磷酸化。⁵¹c-Abl激活p73以应对DNA损伤取决于完整错配修复系统的存在，并涉及Mut L同源物-1（MLH1）。HCT116细胞不表达MLH1型基因不能激活c-Abl-p73通路对顺铂的反应；一种表型，可以通过与MLH1表达互补来挽救。⁴⁶

c-Abl介导的p73磷酸化可被视为一个引发事件，以调节一系列其他修饰。依赖于酪氨酸磷酸化的一个关键调节性p73修饰是p300对p73的乙酰化。p53是第一个被鉴定为HAT底物的非组蛋白。⁵²为了了解p73是否也作为赖氨酸乙酰化的靶点，初步研究发现p73与密切相关的转录辅激活蛋白p300和CBP的相互作用不会导致p73乙酰化，乙酰化酶活性缺陷的p300突变体仍然可以作为p73的辅激活物。⁵³有趣的是，同一组还显示，与全长TAp73不同α，氨基酸311-636之间的C末端片段可以乙酰化在体外第300页。事实上，第二年Costanzo等。⁵⁴结果表明，只有当细胞被DNA损伤剂阿霉素处理时，p300（而不是CBP或PCAF）才能乙酰化p73。有趣的是，尽管p73的非乙酰化突变体的表达未能激活私有p53AIP诱导凋亡，但它对p21的诱导没有影响^WAF1/CIP1表达，表明乙酰化是直接p73介导的DNA损伤反应的关键调控机制。⁵⁴有趣的是，p300对DNA损伤的反应对p73的乙酰化是由酪氨酸激酶c-Abl调节的，因此酪氨酸99磷酸化是p73乙酰化和来自Abl的成纤维细胞的先决条件^−/−DNA损伤后，小鼠无法乙酰化p73。⁵⁴

另一个参与p73调节的关键激酶是p38。⁵⁵值得注意的是，DNA损伤后p73的苏氨酸磷酸化也依赖于c-Abl活性。DNA损伤后，c-Abl激活JNK/p38 MAPK通路，⁵⁶这是通过p38在脯氨酸附近的苏氨酸残基上磷酸化p73来促进其积累的。

如上所述，一个相对复杂的不同翻译后修饰网络合并以控制p73活性/稳定性，c-Abl位于该网络的核心，以启动p73乙酰化和磷酸化。这种以c-Abl为中心的网络的一个关键调节因子是脯氨酰异构酶PIN1，它特异性地识别磷酸化的丝氨酸/苏氨酸残基以及脯氨酸，并诱导其底物发生构象变化。在DNA损伤诱导的c-Abl激活时，PIN1与苏氨酸磷酸化的p73结合，并使其与p300相互作用。⁵⁷在缺乏PIN1的情况下，p300失去其活性，上调p73依赖性Bax的表达，以应对DNA损伤。有趣的是，p73与PIN1的相互作用并不完全依赖于DNA损伤，因为这两种蛋白也可以在非应激细胞中相互作用，这表明p73在正常条件下也在PIN1结合位点磷酸化。

事实上，p73磷酸化不仅仅依赖于DNA损伤，因为它在细胞周期中被细胞周期依赖性激酶CDK2/CDK1和PKC磷酸化δ.^58,59,60CDK2/CDK1依赖性p73磷酸化主要通过p73与细胞周期G2和M期的细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B的相互作用，通过其细胞周期蛋白识别基序，以及苏氨酸86的磷酸化实现。这阻碍了p73的转录活性，可能是为了抑制其在细胞周期的关键阶段的生长抑制特性。相反，PKCδ-丝氨酸388介导的p73磷酸化激活p73的第二个TA结构域（氨基酸381-399之间），以细胞类型特异性的方式调节细胞周期进程。⁵⁹第二个TA结构域不能激活凋亡相关基因，并且在整个细胞周期中受到不同的调节。PKC公司δ-介导的p73磷酸化对于增强其对DNA损伤的凋亡功能也是重要的。这是由PKC的裂解介导的δ通过caspase-3生成组成活性PKCδ-CF片段，可与丝氨酸289处的p73相互作用并磷酸化。⁶¹有趣的是，为了应对压力，PKCδ也被c-Abl激活；⁶²因此，PKC对p73的丝氨酸磷酸化δ也由c-Abl间接调节。

导致亚细胞定位变化的修改

一旦被p38磷酸化，p73与PML相互作用，从而定位于PML核体，与p300、同源域相互作用蛋白激酶2（HIPK2）和YAP相互作用，以促进其稳定性和转录活性。^41,63,64事实上，p73、YAP和p300通过PML的相互作用是选择性激活促凋亡p73靶点以应对DNA损伤的重要决定因素。⁴¹p73与PML相互作用并定位于PML核体后，泛素化也显著降低。⁶³除了p38介导的磷酸化外，c-Abl介导的p73磷酸化还诱导其亚核重分布；随后，p73从核质部分转移到核基质，可能无法被泛素连接酶利用，并逃避蛋白酶体降解。⁶⁵

p73与活化STAT-1蛋白抑制剂（PIAS-1）的相互作用也导致其定位于核基质并随后稳定。⁶⁶然而，由于PIAS-1的sumo E3连接酶活性，这种相互作用也导致了K627处p73的sumo酰化及其转录失活。^66,67

与p53类似，p73在凋亡过程中具有转录依赖性促凋亡功能。^68,69转录缺陷型p73突变体p73R293H（与热点p53R273H突变体相对应）仍然可以有效地诱导细胞凋亡，而不是依托泊苷，其机制涉及p73定位于线粒体并与线粒体p53相互作用。^69,70值得注意的是，与其他家族成员一样，p73在凋亡过程中也被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶靶向，半胱氨酸水解酶片段定位于线粒体以增加凋亡。^21,69,71

与上述两种增强p73活性的亚细胞定位修饰不同，通过NEDD8偶联p73的neddylation具有相反的效果。⁷²一旦neddylated，p73定位于胞浆，因此不能作为转录因子发挥作用。由于p73与Mdm2的相互作用是其nedylation的先决条件，因此只有TAp73亚型受到这种修饰的影响。

p73与含有氧化还原酶蛋白Wwox的WW结构域的相互作用也可以诱导其重新定位到胞浆。⁷³虽然这种相互作用导致p73转录活性的丧失，但其凋亡活性部分保留；进一步支持p73在细胞死亡中的转录依赖性作用。

泛素翻译后修饰与蛋白质稳定性

p73蛋白的稳定性主要由泛素-蛋白酶体系统调节。^31,74,75第一个被鉴定为泛素化p73并靶向蛋白酶体降解的E3泛素连接酶是HECT域E3泛素连接酶Itch。⁷⁶Itch介导的p73降解主要由两种基于竞争的机制控制。第一种机制涉及Nedd4-结合蛋白1（N4BP1）；一种WW域蛋白，可以与Itch相互作用而不会导致其泛素化。⁷⁷N4BP1与p73竞争Itch结合，因此N4BP1-Itch相互作用抑制Itch-p73结合。另一个关键机制是基于YAP与p73上PPXY基序的结合。⁷⁸Itch也使用该基序与p73相互作用，因此YAP与Itch对PPXY基序的竞争导致Itch活性对p73失活。

Itch仅对α和βTAp73和ΔNp73的p73亚型（包含与瘙痒相互作用的PY基序）。^76,79然而，在遗传毒性应激下，TAp73和ΔNp73亚型受到差异调节。有趣的是，杜洛等。⁸⁰确定了一种选择性ΔNp73降解途径。这项工作表明，TAp73的转录靶点可能对ΔNp73亚型的降解负责。事实上，我们最近发现了一种环指E3泛素连接酶PIR2(第页73-我诱导的R（右）邻指蛋白2，PIR2，也称为IBRDC2/Rnf144b），由TAp73诱导并选择性结合、泛素化和降解ΔNp73亚型。PIR2是迄今为止发现的唯一一种泛素连接酶，与TAp73和ΔNp73亚型相比具有不同的特异性。PIR2能够微调TAp73/ΔNp73比率，对调节对凋亡刺激的反应至关重要。⁸¹

TAp73和ΔNp73稳定性差异调节的其他机制涉及应激诱导的c-jun活化，⁸²通过YAP，⁸³和抗酶1系统。⁸⁴

p73活性的翻译后调节在癌症中的意义

正常细胞向癌细胞的癌基因转化涉及连续的基因改变，这些改变赋予选择性优势，以调节生存和避免细胞死亡。⁸⁵细胞死亡是由配体结合时细胞表面受体的激活（外源性途径）或Bcl-2家族前凋亡成员的激活（内源性途径）引起的^86,87,88这两条途径都是通过特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspases）的顺序激活来介导的，以在天冬氨酰残基之后裂解特异性底物。^89,90,91p73和p53家族的其他成员一样，在压力下对两种细胞死亡途径的调节中起着关键作用。^{26,92,93,94,95,96}

抗化学性是肿瘤生物学领域的主要挑战之一。^97,98,99,100在含有突变型p53的癌症中，抑制TAp73促凋亡活性是对化疗产生耐药性的重要机制。癌细胞主要通过调节促凋亡和抗凋亡p73亚型之间的比率来逃避死亡。因此，除了TA的差异转录控制外与如上所述，ΔNp73的表达、通过翻译后修饰对其功能和稳定性的调节，是改变这种关键平衡的一种迅速有效的方式。

结束语

基因组守护者p53的功能在癌症中经常受到损害。由于p53在结构和功能上的高度同源性，调节p73的活性或功能是靶向癌症治疗的一种独特方法。TAp73亚型可能被诱导或激活以替代非活性p53，从而诱导细胞周期阻滞/凋亡，或抑制转移性突变p53功能。尽管基因结构和功能相似，但p53和p73功能的翻译后控制存在很大差异，这强烈表明调控其翻译后修饰的上游信号决定了其在发育和恶性转化过程中的不同活动。例如，尽管E3-双肽连接酶mdm2可以介导p53的降解，但它可以稳定p73，尽管YAP结合p73以增加其转录活性，但它不能结合p53。p73相互作用蛋白和p73翻译后修饰的摘要如所示图2和​和3。三对p73的分子修饰进行彻底的表征，并确定其他家族成员之间的相似性，将有助于填补p53-p73难题中缺失的部分，并有助于确定更好的靶向肿瘤治疗药物。

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图2

p73关键翻译后修改的示意图。TA，交易激活域；DBD，DNA-结合域；OD，齐聚结构域；SAM，SAM域；（P） 磷酸化；（Ac），乙酰化；（SUMO），磺酰化

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图3

调节其活性/稳定性的p73相互作用蛋白概述。相互作用所必需的p73残基用撇号表示，结构域的位置用括号表示。细胞周期蛋白识别基序；MMI、myc调制器1

词汇表

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

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