分子细胞心血管杂志。2012年3月；52(3): 667–676.
心脏交感神经共同递质甘丙肽减少乙酰胆碱释放和迷走神经心动过缓：心脏兴奋性的神经控制意义
,a、，⁎ ,一 ,一 ,一 ,一 ,b条 ,c（c） ,一 ,c（c） ,b条和一
尼尔·海岭
一英国牛津大学帕克斯路BHF卓越研究中心生理、解剖和遗传学系伯登·桑德森心脏科学中心
詹姆斯·克兰利
一英国牛津大学帕克斯路BHF卓越研究中心生理、解剖和遗传学系伯登·桑德森心脏科学中心
迈克尔·洛卡勒（Michael N.Lokale）
一英国牛津大学帕克斯路BHF卓越研究中心生理、解剖和遗传学系伯登·桑德森心脏科学中心
李丹（Dan Li）
一英国牛津大学帕克斯路BHF卓越研究中心生理、解剖和遗传学系伯登·桑德森心脏科学中心
朱莉娅·香克斯
一英国牛津大学BHF卓越研究中心生理学、解剖学和遗传学系Burdon Sanderson心脏科学中心，Parks Road，OX1 3PT
埃里克·N·阿尔斯通
b条美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学生理学和药理学系
比阿特丽斯·吉拉德
c（c）美国佛蒙特州伯灵顿佛蒙特大学医学院解剖学和神经生物学系
艾玛·卡特
一英国牛津大学帕克斯路BHF卓越研究中心生理、解剖和遗传学系伯登·桑德森心脏科学中心
罗德尼·L·帕森斯
c（c）美国弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学医学院解剖与神经生物学系
贝斯·哈贝克
b条美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学生理学和药理学系
大卫·J·帕特森
一英国牛津大学帕克斯路BHF卓越研究中心生理、解剖和遗传学系伯登·桑德森心脏科学中心
一英国牛津大学帕克斯路BHF卓越研究中心生理、解剖和遗传学系伯登·桑德森心脏科学中心
b条美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学生理学和药理学系
c（c）美国弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学医学院解剖与神经生物学系
2011年7月8日收到；2011年11月6日修订；2011年11月28日接受。
摘要
充血性心力衰竭的自主表型以交感驱动力高和迷走神经张力受损为特征，这是死亡率的独立预测因素。我们假设，在高水平交感驱动下，外周迷走神经刺激导致的心动过缓受损是由于肾上腺素能共同递质甘丙肽和神经肽Y（NPY）的交感迷走神经串扰所致。此外，我们假设甘丙肽通过受体介导的蛋白激酶依赖性途径减少迷走神经乙酰胆碱释放，从而起到与NPY类似的作用。在具有双重自主神经支配的离体豚鼠心房制剂中，长时间右星状神经节刺激（10 Hz，2 min，在10μM美托洛尔的作用下）可导致在随后20 min内维持的迷走性心动过缓（5 Hz）幅度显著降低（p<0.05）（n=6）。免疫组织化学显示，在刚解剖的星状神经节组织切片中，少数酪氨酸羟化酶阳性神经元中存在甘丙肽。然而，在组织培养3天后，大多数星状神经元表达甘丙肽。星形胶质细胞刺激导致低水平的甘丙肽和显著升高的NPY释放到周围灌注液中（使用ELISA，n=6）。交感神经刺激后迷走神经性心动过缓的减少在10分钟（1μM，n=5）后被甘丙肽受体拮抗剂M40部分逆转，而NPY Y则完全逆转2受体拮抗剂BIIE 0246在所有时间点（1μM，n=6）。外源性甘丙肽（n=6，50–500 nM）也降低了迷走神经刺激的心率反应，但对产生类似程度心动过缓的氨甲酰胆碱反应没有影响（n=5）。甘丙肽（500 nM）也显著减弱了三场刺激期间从孤立心房提取的H-乙酰胆碱（5 Hz，n=5）。甘丙肽受体拮抗剂M40（n=5）可以消除甘丙肽对迷走神经性心动过缓的影响。重要的是GalR1受体与窦房结含有胆碱乙酰转移酶的神经元进行免疫荧光共定位。蛋白激酶C抑制剂钙磷蛋白（100 nM，n=6）消除了甘丙肽对迷走性心动过缓的作用，而蛋白激酶A抑制剂H89（500 nM，n=6）则没有作用。这些结果表明，长时间交感神经激活除释放NPY外，还释放缓慢扩散的肾上腺素能共传递体甘丙肽，这有助于通过减少乙酰胆碱释放来减缓迷走神经性心动过缓。这种作用是由GalR介导的1迷走神经细胞上的受体与蛋白激酶C依赖的信号通路耦合。在急性损伤反应后，甘丙肽的表达增加，甘丙素的作用可能变得更加重要。
关键词：自主神经系统、交感神经、迷走神经、共传递体、乙酰胆碱、心率
集锦
► 在豚鼠星状神经元中发现甘丙肽，在心脏迷走神经细胞上发现GalR1。► 星状甘丙肽表达在细胞培养3天后增加。► 高水平交感神经刺激释放甘丙肽，减少迷走神经性心动过缓。► 甘丙肽通过GalR减少乙酰胆碱释放和心动过缓1依赖性途径。► 甘丙肽通过蛋白激酶C而不是蛋白激酶A依赖的途径发出信号。
1.简介
除了主要的神经递质去甲肾上腺素外，整个自主神经系统的交感神经细胞还含有共同递质，如ATP、神经肽Y和甘丙肽[1–3]共递质的释放高度依赖于神经元刺激的水平，它们往往是缓慢扩散的分子，通常起神经调节剂的作用，而不是经典的神经递质[3]β-肾上腺素能阻断时的高水平心脏交感神经刺激与右心迷走神经外周刺激的变时反应降低有关[4,5]一种可能是交感神经共同递质通过在心脏内胆碱能神经元部位局部作用来减少乙酰胆碱的释放，从而导致自主平衡中潜在的心律失常前改变，从而导致这种现象[6]高心交感驱动和迷走神经张力降低是与心肌梗死和充血性心力衰竭相关的特征性自主神经表型，是一个不良的预后指标（例如。[7–10]). 有趣的是，在这两种情况下，血浆神经肽Y水平均升高，且与死亡率相关[11–13].
虽然其他研究表明肾上腺素能或嘌呤能受体的刺激不能改变人类心脏乙酰胆碱的释放[14]或豚鼠[15,16]，我们最近报道了神经肽Y如何通过Y抑制心脏乙酰胆碱释放和迷走神经性心动过缓的直接证据2胆碱能神经元上与蛋白激酶C依赖信号通路偶联的受体[17]此外，Y2受体拮抗剂BIIE 0246也能部分逆转体内长时间交感神经刺激后心脏迷走神经对心率反应性的损害[18]、和狗[19]]在此期间，直接测量了狗体内神经肽Y的释放[20]]. Y基因敲除2受体的作用与BIIE 0246相似[21].
神经肽共同递质甘丙肽在脑干水平上参与心血管系统的中枢调节，与相关肽一起，也可能在血管系统中起到血管活性物质的作用（参见[22]以供审查）。有趣的是，击倒甘丙肽GalR1受体还部分防止小鼠外周交感神经刺激后迷走神经性心动过缓受损[4,18]然而，在这些条件下甘丙肽的心脏释放尚未得到证实，以及GalR作用背后的机制1基因敲除尚不清楚。因此，我们假设galanin在星状神经节的酪氨酸羟化酶阳性神经元中表达，并在具有完整右侧星状和迷走神经支配的豚鼠窦房结标本中经高频交感刺激后释放。此外，我们假设甘丙肽受体位于支配窦房结的胆碱能神经元上，内源性释放或外源性应用甘丙肽通过GalR减少迷走神经性心动过缓1受体介导的途径。我们还研究了甘丙肽是否通过蛋白激酶依赖途径抑制乙酰胆碱释放，从而起到与神经肽Y类似的作用。
2.方法
实验符合美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第85-23号，1996年修订）和《1986年动物（科学程序）法案》（英国）。成年（300–400 g，n=90）雌性豚鼠(茯苓Dunkin Hartley）因颈椎脱位死亡，并根据附表1进行了失血。实验是在英国内政部项目许可证PPL 30/2130和PPL 302630下进行的。
2.1、。免疫组织化学
将中脑、右心房和星状神经节游离解剖（n=6只动物），放置在含有新鲜固定剂（2%多聚甲醛，含0.2%苦味酸）的单独小瓶中过夜，然后放置在含有20%蔗糖的0.1M磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行保护，直至切片。如前所述，采用直接贴装技术处理组织切片（20μm星状、40μm右心房和豚鼠中脑）[23,24]在一组单独的实验中，分离星状神经元并将其保存在培养基中3天，如前所述[25–27]在接触固定剂（含0.2%苦味酸的2%多聚甲醛）1小时之前。固定组织切片或分离的细胞在PBS中冲洗，用0.5%Triton X-100渗透，并在4°C下与酪氨酸羟化酶（TH）初级抗血清（来自RBI的小鼠单克隆抗体1:400，Natick MA）孵育过夜和抗甘丙肽的初级抗血清（来自加利福尼亚州伯林盖姆凤凰药业的兔子多克隆1:1000）。去除初级抗血清后，在室温下用异硫氰酸荧光素（FITC）共轭或吲哚碳菁（Cy3）共轭次级抗血清（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson Immunoresearch Laboratories，1:100和1:500）将神经节切片/分离细胞孵育1小时。
使用配备HBO 100-W紫外线光源和FITC和Cy3滤光片的Olympus AX70荧光显微镜观察整个安装的星形制剂和分离的神经元。使用CCD摄像机（MagnaFire SP；Optronics；Optical Analysis Corp.，Nashua，NH）获取数字图像，并导入Adobe Photoshop CS3（Adobe Corporation，Mountain View，CA）以组合图形，对对比度和亮度进行最小调整。所用的两种抗血清均具有良好的特性，并已用于先前的研究（例如。[28]). 此外，仅用次级抗血清处理整个坐骑时，未观察到神经元染色。
固定右心房切片（或豚鼠中脑作为阳性对照）与兔抗GalR孵育1（西格玛，1:200），抗GalR2（亲和生物试剂，1:150）或抗GalR三（Sigma，1:150）一级抗体，然后是生物素化山羊抗兔抗体（Vector，1:200）。然后使用荧光素染色进行接合，然后使用链霉亲和素生物素封闭试剂盒封闭剩余的未结合生物素。为了评估甘丙肽受体-胆碱乙酰转移酶（ChAT）的共同定位，进一步用山羊抗-ChAT（Vector，1:200）标记神经元，然后用次级生物素化马抗-山羊（Vector，1:2000）标记神经元。然后用德克萨斯红染色法进行接合。使用尼康Eclipse TE2000-U反转荧光显微镜和适当的滤光片（560/40 nm德克萨斯红和460-500 nm荧光素滤光片）获得图像。仅用次级抗血清处理整个坐骑时，未观察到神经元染色。
2.2. 反转录聚合酶链反应
在无RNase条件下解剖星形神经节、心神经节和脑（3只动物），并使用Tri试剂（Sigma）从单个制剂中提取总RNA，如前所述[29]。使用纳米滴ND-1000分光光度计（Nanodrop Technologies，Wilmington，DE）测定每个完整制剂的总RNA数量。使用Omniscript逆转录（Qiagen，Valencia，CA）和寡聚dT和随机六聚体引物的混合物，每个样品使用一微克RNA合成互补DNA。使用TOPO TA克隆试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）将特定引物扩增的MPG DNA产物连接到pCR2.1 TOPO中，以生成质粒标准。插入物的核苷酸序列通过自动荧光二脱氧染料终止子测序（佛蒙特癌症中心DNA分析设施）进行验证，并制备10倍系列稀释的储备质粒以生成测定标准曲线。使用HotStart IT®SYBR®Green qPCR Master Mix（USB）对cDNA模板和质粒标准进行扩增。实时定量PCR在ABI 7500快速实时PCR系统（Applied Biosystems，Norwalk，CT）上进行。
引物（使用Ensembl序列设计）和使用的条件为：甘丙肽：（+）TCCTGCTCCTCGCTCC，（−）CTTCTCTTGCCGGGAA；53°C持续30秒；GALR公司1：（+）ACTTTATCACGCTGGTGGTTTTG，（−）ACCGTGAGACATAGTGGTGAA；60°C持续30秒；GALR公司2：（+）ACTTCCTCCATTCCTCACCA，（−）TGCCAGCGGTTTCGAG；54°C持续30秒；GALR公司三：（+）AGGGAGTTGTGGGGCTGG，（−）AAGAGCCAGGCATCCAGCGT；62°C持续30秒。
2.3. 孤立窦房结/右星状神经节/右迷走神经准备
分离出具有完整右星状神经节和右迷走神经的自发搏动心房（n=70只动物），并将其转移到预热（37±0.2°C）、连续充氧、水套器官浴中，其中含有60 ml Tyrode溶液。前面已经描述了解剖和测量神经刺激反应的方法[17]在开始每项方案之前，让安装的心房平衡80分钟，直到心率稳定（±5次/分，bpm，超过20分钟）。在整个方案中，大约每30分钟更换一次器官浴中的Tyrode溶液。在右星状神经节高水平刺激前后，通过放置在神经节周围的环形电极（10 Hz、20 V、1 ms脉冲持续时间2分钟）和/或将药物应用于器官浴，分别以1、3和5 Hz（20 V、1ms脉冲持续时间30秒）的频率刺激迷走神经。之所以选择这种交感神经刺激水平，是因为之前已经证明它可以降低体内外周迷走神经刺激的心率反应，并导致神经肽Y的释放[5,20]选择这些频率是为了在基线心率高达30–40%的情况下产生生理程度的心动过缓。对照实验表明，迷走神经刺激的心率反应在两小时内保持不变（5 Hz时为±1 bpm）。我们之前已经证明，迷走神经刺激引起的所有心率变化在该制剂中被东莨菪碱完全消除，因此是由于乙酰胆碱的释放所致[30].
2.4. 测定豚鼠离体右心房制剂交感神经刺激时甘丙肽和神经肽Y的释放
分离自发搏动的右心房（n=6只动物），并将其转移到预热（37±0.2°C）、连续充氧、水套的器官浴中，其中含有2 ml Tyrode溶液，心房平放在银刺激电极上。在30 min的平衡期后，改变Tyrode溶液，并以10 Hz（20 V，1 ms脉冲持续时间2 min）刺激星状体。在交感神经刺激前后5、10、15和20分钟从浴槽中采集50μl的灌流液样品，并根据连续稀释的蛋白质标准，使用商用的基于ELISA的分析（S1346神经肽Y和S1347甘丙肽，Pennislar Laboratories，Bachem）测量神经肽Y或甘丙肽浓度。
2.5. 测量三离体豚鼠右心房制剂对场刺激的H-乙酰胆碱释放
分离自发搏动的右心房（n=5只动物），并将其转移到预热（37±0.2°C）、连续充氧、水套的器官浴中，其中含有3ml Tyrode溶液，心房平放在银刺激电极上。确定局部释放的方法三在孵育后，以5 Hz（20 V，1 ms脉冲宽度，持续1分钟）的频率对H-乙酰胆碱进行场刺激三氯化氢胆碱（10μCi，Amersham U.K.）和洗涤，与我们之前描述的相同[17].
2.6. 解决方案和药物
蒂罗尔溶液含有（mM）NaCl 120、KCl 4、MgCl22、氯化钠三25，氯化钙22，钠2高性能操作40.1和葡萄糖11。用95%的O对溶液进行充气2/5%一氧化碳2（pH 7.4），并持续监测其温度（Digitron 1408-K量规），并保持在37±0.2°C。
将长期高频右星状体刺激与浴用肾上腺素（10μM，Sigma）的效果进行比较，其剂量可产生类似程度的心动过速，并使用或不使用美托洛尔（10μM，Sigma-肾上腺素能阻断剂）。甘丙肽（1-29，Bachem）的使用浓度高达500 nM。将交感神经刺激或甘丙肽对迷走神经刺激心率反应的影响与乙酰胆碱氨甲酰胆碱的稳定类似物（90 nM，Sigma）进行比较，以确定其影响是突触前还是突触后。选择该浓度可产生与5 Hz迷走神经刺激相似程度的心动过缓。M40（1μM，Tocris）被用作选择性甘丙肽受体拮抗剂，BIIE 0246（1μM，Tocri）被用作Y的选择性拮抗剂2受体。使用H89（0.5μM，钙生物化学）和使用钙蛋白C（0.1μM，钙生物化学）抑制蛋白激酶A。所选浓度高于隔离酶的报告Ki（GalR为0.007μM M401受体[31]，Y为0.02μM BIIE 02462受体[32]，0.05μM钙蛋白C用于PKC[33]和0.05μM H-89用于PKA[34])但低于药物非特异性作用的报道。它们与以前在类似制剂中使用的相同（例如。[35]对于M40，[17]用于BIIE 0246、H89和钙蛋白C）。
药物溶解在Elga纯化系统的试剂级水中，但Calphostin C和H-89除外，它们溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。对照实验表明，所用浓度的二甲基亚砜不会影响1、3或5 Hz时迷走神经刺激的心率反应。
2.7. 统计分析
数据表示为平均值±S。所有数据均通过了正态性检验。“n”数字是指使用的单独动物的数量，并且对来自特定动物的任何制剂只执行了一个方案。采用单因素重复测量方差分析评价干预效果。未成对学生的t吨-假设方差不相等的检验用于评估两个独立实验组之间的显著性。统计学意义在p<0.05时被接受，并且不受心率变化或脉搏间隔变化数据分析的影响。分析来自三H-乙酰胆碱释放实验中的绝对增加量三H流出对S1和S2刺激，或两种反应之间的比率（S2/S1）没有改变统计学意义。
3.结果
3.1. 星状神经节中甘丙肽的表达及右心房胆碱能神经元上甘丙肽受体
右侧和左侧星状神经节的RT-PCR证实存在低水平的甘丙肽mRNA。2只动物新鲜固定的右侧和左侧星形神经节的免疫组织化学显示，少量酪氨酸羟化酶阳性神经元（<5%）出现甘丙肽染色(B） ●●●●。在这些细胞中，荧光比背景和颗粒的外观更亮。然而，当星状神经元解离并在培养中保持3天时，几乎所有的神经元都表现出酪氨酸羟化酶的免疫反应性(C左面板）和甘丙肽(C右侧面板）。
甘丙肽在星状交感神经元和GalR中的表达1心脏胆碱能神经元。（A） 在对新鲜解剖的星状神经节和脑信使核糖核酸进行扩增后，在溴化乙锭凝胶上观察逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）产物。无模板对照的NTC是一种阴性对照，用于评估是否存在污染。Galanin mRNA存在于左右星状神经节。（B） 新解剖的左、右星状神经节的所有星状神经元均表现出酪氨酸羟化酶免疫反应（TH，左面板，20μm切片），但只有偶尔TH免疫反应神经元也表现出甘丙肽免疫反应（<5%，右面板，校准棒=20μm）。（C） 培养3天的分离星形神经元对TH（左侧面板）和甘丙肽（右侧面板，校准棒=20μm）显示出免疫反应性。（D） 甘丙肽受体GalR的RT-PCR谱带1（253个碱基对）和GalR三（234个碱基对）。以豚鼠脑为阳性对照，无模板反应混合物为阴性对照（NTC）。（E） 显示GalR表达的右心房切片免疫组织化学1仅神经元结构中的受体蛋白（见插图，高倍放大，校准杆=10μm）。GalR公司1、GalR2和GalR三在豚鼠中脑中的表达为阳性对照（校准棒=20μm）。（F） 免疫组织化学显示右心房薄片神经元中胆碱乙酰转移酶（ChAT）染色和甘丙肽GalR染色阳性1绿色受体（荧光素）。通过黄色染色重叠（校准条=20μm）证明了共校准。
来自心脏内神经节的RT-PCR证实了GalR和GalR的mRNA的存在1和GalR三受体(D） ●●●●。然而，免疫组化显示GalR染色1右心房切片中的受体(E） 定位于神经元结构（见放大插图）。与ChAT共同训练显示GalR1仅局限于胆碱能神经元(F） ●●●●。这为我们的假设提供了解剖学基础，即交感神经元释放的甘丙肽可能改变心率的迷走神经控制。
3.2、。交感神经刺激后迷走性心动过缓与内源性甘丙肽和神经肽Y的释放
平衡期结束后，孤立窦房结/双自主神经支配制剂的基线心率为190±3 bpm（n=70），除非另有说明，否则与所使用的药物干预措施相比没有显著变化。如图所示（黑线），在美托洛尔存在下高频交感神经刺激2分钟后，在随后的20分钟内，迷走神经刺激的心率反应显著降低至其起始值的71±5%（基线心率187±9 bpm，n=6）。当使用去甲肾上腺素（10μM）而不是交感神经刺激时，20分钟后迷走神经刺激的心率反应保持在初始值的114±12%（基线心率：187±7 bpm，n=5），则未观察到这种情况。此外，对乙酰胆碱稳定类似物的心率反应，即氨基甲酰胆碱（90 nM），其产生的心动过缓程度与5 Hz时迷走神经刺激相似，高频交感神经刺激20分钟后仍保持初始值的97±6%（基线心率198±8bpm，n=6），未受影响。在这些方案中，在交感神经刺激期间或在美托洛尔存在下添加去甲肾上腺素期间，基线心率的变化是相似的（交感神经电刺激后迷走神经电刺激+14±4%；去甲肾上腺素电刺激后迷走神经电刺激+15±4%；交感神经刺激后使用氨甲酰胆碱+16±8%）。这表明，除去甲肾上腺素外，释放的物质在突触前起作用，改变迷走神经的神经传递，并导致高频交感神经刺激后迷走神经心动过缓的减少。
高频交感神经刺激后共递质的释放以及迷走神经性心动过缓的相应减少。代表性原始数据轨迹（A和D）和组平均数据（B和E）显示了高频刺激右星状神经节（SNS，10 Hz，2分钟，在10μM美托洛尔存在的情况下）之前和之后20分钟期间对迷走神经刺激（5 Hz，30 s）的心率反应。对照实验以黑色显示（基线心率187±9 bpm，n=6），而在另一组以蓝色显示的实验中（A和B），在神经肽Y受体拮抗剂BIIE 0246（1μM，基线心率180±9 bpm，n=5）的存在下重复此实验在另一组以红色（D和E）显示的实验中，在甘丙肽GalR的存在下重复了这一过程1受体拮抗剂M40（1μM，基线心率183±13 bpm，n=5）。使用去甲肾上腺素（10μM美托洛尔时为10μM，n=5）而非交感神经预刺激对迷走神经刺激的心率反应与使用BIIE 0246时交感神经预先刺激的心率响应没有显著差异（数据未显示）。C和F显示了用ELISA分析的50μl器官浴样品在高频交感神经刺激（10 Hz，美托洛尔10μM存在下2 min）前后20 min内测得的神经肽Y（n=6，蓝色）和甘丙肽（n=5，红色）的器官浴浓度。（与对照组相比，p<0.05）。
为了验证这种释放物质可能包括共递质神经肽Y或甘丙肽的假设，在存在神经肽Y Y的情况下评估高频交感神经刺激后迷走神经刺激的心率反应2受体拮抗剂BIIE 0246或甘丙肽受体拮抗剂M40。如图所示A和B（蓝色轨迹），BIIE 0246在所有时间点都阻止了迷走神经心动过缓的减少，模拟了去甲肾上腺素预刺激而非交感神经刺激后观察到的反应模式（基线心率180±9 bpm，n=6）。D和E显示了M40（红色痕迹）的效果。M40仅能阻止交感神经刺激后10分钟及以后迷走性心动过缓的减少（基线心率183±13 bpm，n=5）。高频交感神经刺激后的所有时间点，都可以在窦房结/右侧星状神经节准备物周围的灌注液中检测到神经肽Y和甘丙肽的释放（参见C和F）。然而，与甘丙肽相比，在15和20分钟后释放的神经肽Y要多得多。释放的肽的最大浓度为0.124±0.03 ng/ml（0.03±0.01 nM）神经肽Y（n=6）和0.054±0.012 ng/ml。
我们之前已经证明，外源性神经肽Y在100 nM及以上的浓度下可以减少迷走神经心动过缓和乙酰胆碱的释放[17]如图所示外源性甘丙肽也显著降低了50 nM（频率为1 Hz）和100 nM及以上的所有刺激频率下的迷走性心动过缓，尽管即使在5-10 nM时也有降低迷走性心跳过缓的趋势。甘丙肽的作用可以通过洗去肽而部分逆转（基线心率192±14 bpm，对照组5 Hz−72±6 bpm，500 nM甘丙肽−36±10 bpm，洗脱量−53±9 bpm，控制组3 Hz−40±6 bpm.500 nM甘丙素−17±5 bpm，冲洗量−34±6，对照组1 Hz−11±1 bpm，500nM甘肽−4±1 bpm.洗脱量-9±3，n=6）。
外源性甘丙肽可减少迷走神经性心动过缓。代表性原始数据迹线（5 Hz时为A）和组平均数据（B）显示，在甘丙肽浓度增加（5–500 nM）的情况下，刺激右侧迷走神经（5、3或1 Hz，持续30 s）时心动过缓（每分钟心跳次数，bpm，基线心率192±14 bpm，n=6）的幅度降低。（与对照组相比，p<0.05）。
GalR受体拮抗剂M40还可防止外源性甘丙肽（100和250 nM）降低迷走神经刺激的心率反应（基线心率200±6 bpm，n=5）而神经肽Y受体拮抗剂BIIE 0246在相同浓度（基线心率169±12 bpm，n=5）下并不能阻止甘丙肽减少迷走神经性心动过缓，如相反，M40并未阻止迷走神经性心动过缓向外源性神经肽Y的降低（例如，基线心率174±1 bpm，5 Hz控制−64±4 bpm，1μM M40−52±4 bpm，250 nM神经肽Y−40±4 bpm.n=4）。
甘丙肽通过GalR发挥作用1受体，但不通过神经肽-Y Y2受体。代表性原始数据追踪（A和C）和组平均数据（B和D）显示了甘丙肽（100和250 nM）对GalR拮抗剂存在时迷走神经刺激（5 Hz，30 s）的心率反应（每分钟心跳，bpm）的影响1受体（M40 1μM，基线心率200±6 bpm，n=5，A和B）或神经肽-Y Y2受体（BIIE 0246 1μM，基线心率169±12 bpm，n=5，C和D）。（与对照组和BIIE 0246相比，*p＜0.05）。
3.3. 甘丙肽通过突触前途径减弱迷走神经性心动过缓，以减少乙酰胆碱的释放
而甘丙肽显著降低了对5Hz迷走神经刺激的心率反应（见在500 nM时，基线心率为192±14 bpm，n=6），对产生类似程度心动过缓的90 nM氨甲酰胆碱的心率反应不受甘丙肽的影响（参见B，500 nM时，基线心率190±9 bpm，n=6）。这表明甘丙肽在突触前起调节副交感神经传递的作用。为了直接验证这一假设，我们证明相同浓度的甘丙肽（500 nM）显著减少了三H-乙酰胆碱对隔离心房内5Hz电场刺激的反应（参见C、 n=5）。时间控制实验表明三两次刺激后H-乙酰胆碱释放[17].
甘丙肽的突触前作用可减少迷走神经心动过缓和乙酰胆碱释放。甘丙肽（500 nM）显著降低（*p<0.05）5 Hz时迷走神经刺激的心率反应（每分钟心跳次数，bpm）（基线心率192±14 bpm，n=6，A），但对稳定的乙酰胆碱类似物反应的心动过缓幅度没有影响，氨甲酰胆碱（90 nM，基线心率174±1 bpm，n=6，B）。这表明甘丙肽是通过突触前途径发挥作用的。甘丙肽还显著减少了三H-乙酰胆碱对场刺激（5 Hz，S1 vs S2，n=5），如代表性原始数据轨迹（C，左侧面板）和组平均数据（C，右侧面板）所示。
探讨加兰素通过GalR抑制迷走神经性心动过缓的第二信使通路1为了减少乙酰胆碱的释放，我们评估了在蛋白激酶a抑制剂H89和蛋白激酶C抑制剂钙磷蛋白C存在的情况下甘丙肽的作用。而甘丙肽（在100和250毫微米时）在H89存在时仍然能够减少迷走神经性心动过缓（基线心率204±9 bpm，n=6），钙磷蛋白C（基线心率207±3 bpm，n=6）存在时，相同浓度的甘丙肽不能减少迷走神经性心动过缓表明甘丙肽是通过蛋白激酶C依赖途径发挥作用的。
抑制蛋白激酶C而非蛋白激酶A可阻止迷走神经性心动过缓转为甘丙肽。抑制蛋白激酶A（H89 500 nM，基线心率204±9 bpm，n=6）显著降低（+p<0.05）右迷走神经刺激（5 Hz，30 s）的心率反应（每分钟心跳次数，bpm）。然而，在蛋白激酶A抑制的情况下，甘丙肽（100和250 nM）能够进一步降低迷走性心动过缓的幅度（*p<0.05）（A，原始数据跟踪，B，平均数据）。抑制蛋白激酶C（钙蛋白C 100 nM，基线心率207±3 bpm，n=6）可阻止迷走神经性心动过缓降低为甘丙肽（100和250 nM），这表明甘丙肽是通过蛋白激酶C而非蛋白激酶a依赖性途径起作用的。
4.讨论
本研究的主要新发现如下。
首先，甘丙肽在豚鼠星状神经节的少量酪氨酸羟化酶阳性神经元中表达，但在组织培养3天后，在大多数星状神经元中可以发现，这可能代表急性损伤反应。
其次，甘丙肽在高频交感刺激下与神经肽Y一起释放，高频交感兴奋（在β-受体阻滞剂存在的情况下）后迷走神经性心动过缓的减少被甘丙肽受体拮抗剂部分逆转，而神经肽Y Y则完全逆转2受体拮抗剂。
第三，GalR1受体定位于窦房结的内源性胆碱能神经元。与神经肽Y一样，外源性甘丙肽通过突触前途径减少乙酰胆碱释放，即GalR减少迷走神经性心动过缓1受体介导和蛋白激酶C依赖。
最后，神经肽Y和甘丙肽在其各自的膜受体Y方面似乎没有任何交叉反应2受体抑制不会改变甘丙肽和GalR的抑制作用1抑制不会改变神经肽Y的抑制作用。
4.1. 肾上腺素能共同递质的交感迷走神经串话
我们证明，来自新解剖的左星状神经节和右星状神经节的交感神经元含有甘丙肽的mRNA，尽管表达该蛋白的神经元总数的<5%。其他研究也显示，在完整的星状神经节中，神经纤维和豚鼠星状体的少量小的强荧光细胞中都存在甘丙肽免疫反应[36]，尽管没有酪氨酸羟化酶的共染色。然而，在分离和培养3天后，来自两个神经节的大多数交感神经元表达甘丙肽。这是一个有趣的发现，在心肌梗死后的大鼠模型中，局部心脏甘丙肽表达也增加，可能代表一种损伤反应[37]由交感神经亢奋驱动[38]在这种情况下，过多的甘丙肽生产是否会导致迷走神经递质受损尚待证实。
我们还证明了交感神经刺激后组织灌流液中神经肽Y和甘丙肽的释放，但释放的神经肽Y明显多于甘丙肽。灌流液峰值浓度（交感神经刺激2分钟后20分钟内20–30 pM）与许多神经递质和生物测试所观察到的一样，它们的浓度显著低于显著降低迷走性心动过缓所需的外源性肽浓度（50 nM及以上，在10分钟的潜伏期内，尽管即使在使用的最低5 nM剂量下，迷走性心跳过缓也有降低的趋势）。考虑到局部代谢、再摄取和扩散，两者都不可能准确反映心房组织内神经元水平局部释放的肽的准确浓度。相反，剂量-反应曲线实验应该被视为外源性甘丙肽可以减少迷走神经性心动过缓的原理证明。
我们的灌流液浓度高于人类血浆中观察到的平均值（例如甘丙肽4-6 pM[39]，神经肽-Y 18 pM[40])但低于心脏交感神经刺激后立即从冠状静脉窦采血中采集的神经肽Y（交感神经以10 Hz刺激3分钟后在1 nM处达到峰值[20]). 在我们的静态器官浴准备中，灌注蛋白水平在20分钟内稳步上升，这一点不足为奇。我们的制剂中释放和迷走神经反应的动力学不太可能准确反映体内观察到的确切时间过程。例如，交感神经刺激后冠状静脉窦神经肽Y和迷走神经抑制水平在10分钟内达到峰值，然后在体内交感神经兴奋后一小时内观察到下降[20]重要的是，我们证明交感神经刺激后迷走性心动过缓的减少在所有时间点都被Y逆转2受体拮抗剂，10分钟及以后使用GalR1受体拮抗剂。此外，我们已经证明，这些受体拮抗剂抑制其相应肽的作用，同时不影响对其他肽的反应。这提供了令人信服的证据，证明神经肽Y和甘丙肽有助于减少交感神经刺激后的迷走神经性心动过缓，尽管这两种肽的作用对发生这种情况并不必要。
外源性甘丙肽可降低小鼠对右迷走神经外周刺激的心率反应[4,18]和猫[41]体内，但在大鼠中未观察到[42]或狗[43]体内神经肽的系统输注也因血流动力学和其他循环因素的潜在变化而变得复杂，使数据解释变得复杂。有趣的是，人们在血浆中发现了甘丙肽，运动后甘丙肽水平会升高[44]在对血管迷走性晕厥患者进行直立倾斜试验时，血压和心率增加。事实上，静脉注射甘丙肽会增加人体的静息心率[45,46]与窦性心律失常的消除有关[45]注射甘丙肽还可以预防人类胆碱酯酶抑制剂吡斯的明继发的心动过缓[47]这表明存在迷走神经活动部位，但据我们所知，这是第一个直接证据，证明甘丙肽在心脏交感神经亢进期间释放，并直接抑制胆碱能神经传递。
我们还观察到，在去甲肾上腺素存在的情况下，或在Y后交感神经刺激后，5分钟后迷走神经心动过缓的幅度略有增加（达到对照组的122±13%）2受体抑制（至对照组的123±7%）。这可能与基线心率的微小增加有关，尽管β-受体阻滞剂和突触后对抗加重。例如，在没有β受体阻滞剂的情况下，交感神经刺激（10 Hz，2分钟）后迷走神经刺激（5 Hz）的心率反应从基线心率增加70±11%的对照组增加到168±21%（n=4）。使用去甲肾上腺素和氨甲酰胆碱进行了类似的观察。
4.2. 甘丙肽对迷走神经功能的作用机制
我们清楚地证明，外源性甘丙肽通过突触前机制抑制对周围迷走神经刺激的心率反应。此外，甘丙肽抑制诱发的三H-乙酰胆碱对相同频率和相同剂量的场刺激的反应。加载右心房神经元存储后三H-胆碱，用于测量放射性外流到场刺激的增加，已被用来表示主要由节后迷走神经细胞产生的乙酰胆碱释放。在野外刺激过程中，通过清除细胞外钙来防止器官浴放射性的增加，并可被N型钙通道阻滞剂抑制[48,49]。然而，尚不清楚具体多少三H-乙酰胆碱释放来自节前-节后突触。我们已经尝试使用多种烟碱激动剂刺激节后神经元烟碱受体，但它们产生的心动过缓程度很小（即使在存在β受体阻滞剂的情况下），这与外周迷走神经刺激或毒蕈碱激动剂不可比。这种小反应的进一步衰减很难检测到，因此很难通过这种方法得出关于甘丙肽确切作用部位的明确结论。然而，GalR的免疫化学定位1对节后胆碱能神经元来说，这强烈表明这是我们制备中甘丙肽的突触前作用部位。
我们还证明，蛋白激酶C抑制可阻止迷走神经性心动过缓的甘丙肽作用，而蛋白激酶A抑制则无作用。神经元一氧化氮等神经调节剂[50]和利钠肽[51]增加乙酰胆碱释放和迷走神经心动过缓，这可以通过几种不同的蛋白激酶A抑制剂（包括0.5μM H89）加以预防。如前所述，仅H89和其他蛋白激酶A抑制剂可使迷走神经性心动过缓发生轻微但显著的减少[50]米力农抑制磷酸二酯酶可增加乙酰胆碱释放和迷走性心动过缓[50]这表明神经元cAMP生成的基线水平增加了乙酰胆碱释放的增益。我们以前也证明神经肽Y对乙酰胆碱释放和迷走性心动过缓的抑制作用不受H89的影响，但被几种不同的蛋白激酶C抑制剂（包括0.1μM钙蛋白C）阻止[17]与此假设一致，蛋白激酶C激活物PMA可以通过抑制乙酰胆碱释放来模拟神经肽Y和甘丙肽的作用[17]重要的是，我们还证明了抑制Y2BIIE 0246受体不能阻止甘丙肽的作用，而抑制GalR1M40不能阻止神经肽Y的作用。这支持了这样一种观点，即两个共传递信号途径在第二信使水平上整合，而不是通过共享类似的膜受体。
神经肽-Y和甘丙肽可能直接通过IP3/DAG–蛋白激酶C途径发出信号，尽管Y2
[52]和GalR1受体[53]传统上认为与Gαi耦合。蛋白激酶C也可能间接参与，例如在细胞内钙处理发生变化后，改变神经元兴奋性或囊泡释放机制本身。例如，神经肽Y通过对百日咳毒素和钙蛋白C敏感的途径增加心室肌细胞外向钾电流[54]相反，甘丙肽已被证明能抑制泥足胆碱能神经元中的N型钙电流[55]在百日咳毒素通过突触后机制治疗胆碱能介导的心动过缓的制剂中，很难通过实验研究G蛋白的作用[56]().
肾上腺素能协同递质引起的心脏交感-迷走神经串扰。图中假设了在β-受体阻滞剂（去甲肾上腺素、去甲肾上腺素（NE）、黑圈和美托洛尔（黄十字）存在的情况下，高频交感刺激期间释放肾上腺素能共递质神经肽-Y（NPY，红方块）和甘丙肽（Gal，红方块）的机制。神经肽Y和甘丙肽通过Y发挥作用2和GalR1受体分别减少窦房结处乙酰胆碱（ACh，黑三角）释放和随后的迷走性心动过缓。两个GalR1和Y2受体信号直接或间接涉及蛋白激酶C（PKC）。
4.3. 视角
肾上腺素能活性过高是心肌梗死后的一个负面预后指标[8,9]在充血性心力衰竭期间[7,10]与高血压的病因和进展有关[57]在正常情况下，心脏迷走神经充当天然的β受体阻滞剂，防止细胞内钙超载，减缓心率。它可以直接提高诱发心室颤动的阈值[58]促进高迷走神经张力的条件[例如运动训练[59–61]和nNOS迷走神经基因转移[24]]防止死亡。在已知神经肽Y血浆水平升高的心肌梗死和充血性心力衰竭期间，两种交感神经共递质可能至少在一定程度上减少迷走神经活动。心肌梗死后大鼠模型局部心肌甘丙肽表达也增加[37]这是由交感神经过度活跃引起的[38]如果这些共同递质在与高交感驱动相关的病理条件下导致迷走神经功能受损，那么靶向其受体的药物在与β受体阻滞剂和ACE抑制剂（仅靶向交感-肾上腺轴）联合使用时可能会带来额外的益处。
资金
NH感谢牛津BHF卓越研究中心（RE/08/004）的支持。这项工作得到了英国心脏基金会项目拨款（PG/11/6/28660）、医学科学院临床讲师初学者拨款和国家卫生研究院拨款HL068231和P20RR-016435的支持。NH是牛津大学的临床讲师和BHF CRE中级研究员，也是牛津大学医院NHS信托的心脏病专家注册官。JC拥有牛津林肯学院的奖学金。
工具书类
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