结果
A-T细胞中的层粘连蛋白B1蛋白水平增加
Western blot分析表明，在不同的A-T淋巴细胞系中，相对于WT细胞，层粘连B1增加了三到五倍(). 抗层粘连蛋白B1的不同抗体检测到，A-T原代成纤维细胞中的层粘连素B1也增加(;补充图S1)证明了层粘连蛋白B1在A-T细胞中的过度表达与细胞类型无关。监测每个核的平均层粘连蛋白B1荧光强度的成像分析证实，A-T细胞中层粘连蛋白质B1水平比WT细胞增加了三倍(补充图S2A). 最后，在层粘连蛋白家族中，只有层粘连B1在A-T细胞中过度表达。事实上，A-T成纤维细胞提取物中的层粘连蛋白A、层粘连蛋白质C和层粘连物质B2没有增加。
A-T细胞层粘连蛋白B1水平增加。提取物的Western blot分析(A类)来自野生型（WT）和A-T淋巴母细胞和(B类)来自WT（GM03348 p15）和A-T原代成纤维细胞（GM05823 p17和GM02052 p15）。右侧面板：与肌动蛋白相关的层粘连B1水平定量。(C类)ATM抑制后层粘连蛋白B1增加。用DMSO或10μM KU-55933（一种特定的ATM抑制剂）处理WT淋巴母细胞24小时。左侧面板：在2 Gy照射后，通过使用ATM-P（S1981）和Chk2-P（T68）抗体对ATM活性进行western blot分析来控制抑制剂效率。右侧面板：western blot分析和量化（直方图）显示KU-55933治疗24小时后，WT淋巴母细胞（GM03657）中的层粘连蛋白B1水平增加。所有量化值都对应于至少三个独立的实验*表示统计显著差异(P（P）<0.05）在WT和A-T细胞的值之间或在未处理和处理的细胞之间。误差条表示标准偏差。
值得注意的是，所用的A-T细胞来源于不同的患者，并且在自动取款机该基因表明，层粘连蛋白B1的过度表达与ATM的一种特定突变无关，而是ATM失活导致的普遍现象。与此结论一致，一种特定化学抑制剂（KU-55933）使ATM失活也导致WT细胞层粘连B1蛋白水平增加().
A-T原代成纤维细胞的核结构改变
由于层粘连蛋白B1是内核膜的重要组成部分，我们研究了高层粘连蛋白质B1水平对核形状的影响。
免疫荧光显微镜分析显示，在没有任何外源性刺激的情况下，A-T原代成纤维细胞经常出现核畸形(). 图中显示了典型的蚀变示例，特别是成芽核或折叠核(，左侧面板）。通过图像分析量化WT和A-T细胞群的核圆形度。与两个WT原代成纤维细胞相比，两个A-T的平均圆形度显著降低(，右侧面板）。与两个WT成纤维细胞相比，两个A-T原代成纤维细胞测得的平均圆形度显著低于0.65。有趣的是，在这个圆度值下，可以清楚地观察到核膜的变化(，上部面板）。因此，在随后的所有分析中，将圆度值0.65用作核变形的截止值。变形核（圆形度为0.65）的频率从WT细胞（分别为GM03348和GM05757）的16.8%和16.6%增加到A-T细胞（分别是GM05823和GM02052）的57.5%和48.1%(，右侧面板）。利用层粘连蛋白B1的荧光强度值和细胞核的圆度值，我们可以看到层粘连蛋白质B1的强度越高，圆度值越低(补充图S2B).
A-T细胞和层粘连蛋白B1过度表达细胞中细胞核错位的频率。(A类)用抗层粘连蛋白B1（红色）和DAPI（蓝色）免疫荧光法检测WT（GM05757，p17；GM03348，p15）和A-T（GM02052，p15；GM05823，p17）人类原代成纤维细胞的核形状（左面板）。白色箭头和下部面板显示了核形态变化的示例；在A-T细胞中观察到核膜分叶状（1）、核泡状（2和3）或核皱缩（4）。右面板：使用Cellprofiler软件分析核循环。上部面板显示了正常核形状（左侧）和异常核形状（中部和右侧）的圆度值示例。红线表示由软件确定的细胞轮廓。这一分析表明，所有圆度值为⩽0.65的核都有异常形状。中间面板：来自三个独立实验的两个WT和两个AT初级成纤维细胞群体的平均圆度。至少分析了100个细胞核。这些值对应于三个独立实验的平均值***代表P（P）<0.0001 (t吨-测试）。误差条表示s.e.m.下面板：三个独立实验中细胞核变形的细胞百分比（圆形度0.65）。(B类)过度表达层粘连B1的WT细胞细胞核形状异常。转染48小时后，用层粘连蛋白B1表达载体转染的人类野生型（GM03652，p15）原代成纤维细胞与用空表达载体转导的细胞（对照）进行比较。核形状确定为(A类)用抗层粘连蛋白B1（红色）和DAPI（灰色）进行免疫荧光。黄色箭头显示具有衰老相关异染色质病灶（SAHF）的细胞。右上面板：转染对照或层粘连蛋白B1质粒的野生型原代成纤维细胞提取物上的层粘连B1和肌动蛋白的western blot。右下面板：直方图上的值对应于三个独立实验中圆形度为0.65的细胞核百分比。每个条件下至少对100个细胞进行细胞核形状分析*表示统计显著差异(P（P）<0.05). 误差条表示标准偏差。
为了确定A-T细胞的畸形细胞核是否由层粘连蛋白B1的积聚引起，我们在WT原代成纤维细胞中过度表达层粘连蛋白质B1，并通过免疫荧光监测细胞核的形状(). 在转染层粘连蛋白B1表达载体的细胞中，细胞核错位（细胞核圆形度为0.65）的细胞频率为62.3%，而转染空表达载体的细胞核为16.1%(). 因此，单是层粘连蛋白B1的过度表达就足以诱导WT成纤维细胞的核变形，其程度与a-T原代成纤维细胞相似。
层粘连蛋白B1过度表达诱导原代成纤维细胞衰老
由于核改变与衰老有关，我们研究了层粘连蛋白B1过度表达对人类原代成纤维细胞衰老的影响。
衰老的特征是增殖丧失、衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加和染色质结构改变。我们首先使用SA-β-半乳糖试验证实了A-T细胞的衰老表型(). A-T群体中SA-β-gal阳性细胞的百分比早在第12代就增加了，到第22代达到73%，而WT群体中只有15%的细胞衰老。
层粘连蛋白B1过度表达诱导原代成纤维细胞衰老。(A类)加速A-T细胞的衰老。在WT（GM03652）和A-T（GM02052）原代成纤维细胞中SA-β-半乳糖苷酶的表达与传代的关系。显示了WT和A-T细胞在相同放大倍数下的典型显微照片。右侧面板：显示WT（GM03652，灰钻石）与A-T（GM02052，黑方块）原代成纤维细胞中SA-β-gal表达的定量。(B类)转染对照质粒（左图）或层粘连蛋白B1质粒（右图）48小时后，对WT原代成纤维细胞（第15代GM03652）进行SA-β-gal测定。(C类)衰老相关异染色质病灶（SAHF）形成。转染48小时后对细胞进行染色。黄色箭头：SAHF的代表性示例。合并显示HP1和H3mK9染色在浓缩染色质中积聚。(D类)层粘连蛋白B1过度表达对BrdU掺入的影响。用空表达载体（Ct）或层粘连蛋白B1表达载体（LMNB1）转染WT原代成纤维细胞。转染48小时后，将细胞与10μM BrdU一起孵育24小时。直方图表示BrdU阳性细胞的量化。这些值对应于三个独立实验的平均值*表示统计显著差异(P（P）<0.05). 右面板：转染48小时后提取蛋白，免疫印迹法检测层粘连蛋白B1、细胞周期蛋白A和肌动蛋白。
有趣的是，层粘连蛋白B1在WT原代成纤维细胞中的过度表达使SA-β-gal阳性细胞的频率从空表达载体转染细胞中的16%增加到层粘连素B1转染细胞的60%().
我们还观察到，层粘连蛋白B1过度表达导致4′-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色的“聚集压缩”(和，黄色箭头），表示衰老相关异染色质病灶（SAHF）。为了证实这些解释，我们通过免疫荧光检测了赖氨酸9（H3mK9）上异染色质蛋白1（HP1）和二甲基化组蛋白H3的表达。层粘连蛋白B1的过度表达可有效诱导含有HP1和H3mK9的异色病灶的形成，这是衰老细胞的特征().
然后通过BrdU掺入试验评估增殖，该试验标记S期细胞。在将层粘连B1转染WT原代成纤维细胞48小时后，我们观察到通过S期的细胞比例降低，从空载体转染细胞中的41.5%–63.9%降至层粘连B1-转染细胞的16.8%–18.5%(，左侧面板）。与空载体转染的成纤维细胞相比，转染层粘连B1表达载体的成纤维纤维细胞中调节S期转变的细胞周期蛋白a蛋白减少，证实了这种增殖损失(，右侧面板）。
综上所述，这些数据表明，仅层粘连蛋白B1的过度表达就足以诱导WT原代成纤维细胞的衰老，这可以通过三个不同的参数来证明：细胞增殖损失、SA-β-gal活性和SAHF。
值得注意的是，尽管层粘连蛋白B1过度表达诱导衰老，但它并没有激活DDR。事实上，western blot分析显示，转染48 h后γ-H2AX、Chk1、Chk2的活化没有变化，这与衰老检测的时间相对应(补充图S3A). 同样，γ-H2AX病灶细胞的频率不受层粘连蛋白B1过度表达的影响(补充图S3B). 这一结果表明，层粘连蛋白B1的过度表达不会通过DNA损伤诱导衰老。
层粘连蛋白B1的增加是A-T细胞核形状改变和衰老的原因
由于层粘连蛋白B1在A-T细胞中自发过度表达，并且层粘连基因B1的过度表达足以诱导衰老，我们测试了层粘连酶B1是否对A-T细胞的衰老负责。RNA干扰降低了层蛋白B1水平。在WT细胞中将层粘连B1的水平降低到基础水平以下可能会导致核形态改变和潜在的衰老（如Vergnes等人，2004年和Lammerding等人，2006年). 有趣的是，我们能够建立条件，将层粘连蛋白B1降低到与WT细胞相当的水平(). 这种条件将核形状改变的细胞频率从53.4%降低到31.7%，并将SA-β-半乳糖活性测定测定的衰老细胞频率从50.7%降低到23.5%(). 这些数据表明，层粘连蛋白B1参与A-T细胞的核改变和衰老。
层粘连蛋白B1水平降低可挽救A-T原代成纤维细胞的核形态改变和衰老。(A类)Western blot分析转染对照或层粘连蛋白B1 siRNA（20 nM）的A-T原代成纤维细胞提取物中的层粘连蛋白质B1。(B类)转染对照或层粘连蛋白B1 siRNA的A-T人原代成纤维细胞在转染72 h后用抗层粘连素B1（红色）和DAPI（蓝色）免疫荧光法检测细胞核形状的改变（左图）。右侧面板：来自三个独立实验的畸形核百分比（圆度⩽0.65）。对每种情况下至少100个细胞进行核形状分析。(C类)用对照或层粘连B1 siRNA转染A-T人原代成纤维细胞（GM05823）72小时后，对其进行SA-β-gal检测。直方图表示来自五个以上随机选择的区域（×10倍放大）的SA-β-gal阳性细胞的定量*表示具有统计学意义的差异(P（P）<0.05). 误差条表示标准偏差。
OS导致层粘连B1和畸形细胞核增加
由于高水平的内源性OS可能导致A-T患者的许多表型，包括早衰(Barzilai等人，2002年;Browne等人，2004年;舒伯特等人，2004年;Reliene和Schiestl，2006年,2007;Lavin等人，2007年;Reliene等人，2008年)我们研究了OS是否与层粘连B1水平升高和核畸形有关。
前氧化剂H处理WT细胞2O（运行）2或L（左）-丁硫氨酸亚砜胺（BSO）（耗尽谷胱甘肽库）使淋巴母细胞的层粘连蛋白B1水平增加2至5至9倍，使原代成纤维细胞的层粘蛋白B1水平提高2.9倍。反过来，用抗氧化剂治疗A-T细胞N个-乙酰基-L（左）-半胱氨酸（NAC）显著降低层粘连蛋白B1水平(). 这些数据表明，OS导致层粘连B1积聚。NAC也影响WT原代成纤维细胞中的层粘连B1水平，反映了内源性ROS(补充图S4A). 值得注意的是，在A-T细胞中，层粘连蛋白A/C水平不受抗氧化处理的影响(补充图S4B)表明内源性ROS特别影响层粘连蛋白B1。
氧化应激对层粘连蛋白B1水平和核形态的影响。(A类)用H治疗WT和A-T淋巴细胞2O（运行）2或BSO和NAC。(B类)用H处理WT和A-T原代成纤维细胞2O（运行）2和NAC。右上面板：治疗后与肌动蛋白相关的层粘连B1水平定量。这些值对应于三到八个独立实验的平均值*表示统计显著差异(P（P）<0.05）。误差条表示标准偏差(C类)氧化应激对细胞核形状的影响。上面板：用H处理WT和A-T成纤维细胞2O（运行）2和NAC分别持续72小时，并用抗层粘连B1（绿色）和DAPI（蓝色）进行免疫荧光分析。白色箭头：核形态的改变（白色箭头）。下面板：异常核的量化。三个独立实验的平均值用H表示2O（运行）2治疗野生型原发性成纤维细胞（GM03349 p14和GM03652 p14，左图）和NAC治疗A-T原发性纤维细胞后（GM2052 p14和GM 05823 p18，右图）。每组至少计数150个细胞*表示统计显著差异(P（P）<0.05）。误差条表示标准偏差。
因为前氧化处理诱导了层粘连蛋白B1的积累，我们测试了它是否也影响核形状。的确，H2O（运行）2WT原代成纤维细胞的处理导致细胞核改变（在GM3349和GM03652细胞中分别从12.4%到44.1%和从3.5%到50%）(，左面板），与层粘连蛋白B1过度表达的影响一致。相反，NAC治疗挽救了A-T细胞的核形状（GM02052和GM05823细胞分别为47.5%至25%和54.6%至25%）(，右侧面板）。
综上所述，这些数据表明，OS导致层粘连B1的积累和核形态的改变。
层粘连蛋白B1在A-T细胞中稳定
实时PCR分析没有显示A-T细胞中层粘连蛋白B1 mRNA的增加，但显示减少(). 这表明层粘连蛋白B1水平的增加可能是由于转录后蛋白的稳定，而不是由于转录刺激LMNB1型编码层粘连蛋白B1的基因。由于层粘连蛋白B1在蛋白质水平上增加（见以上数据），如前所述，在A-T细胞中观察到的层粘连B1 mRNA的减少可能是由负反馈调节环引起的(林和傅，2009). 因此，我们研究了A-T细胞与WT细胞中层粘连B1蛋白的稳定性。环己酰亚胺治疗3小时后，WT细胞的层粘连B1蛋白水平降低，而a-T细胞的层粘蛋白B1蛋白水平即使在9小时后也不受影响(;补充图S5A). 值得注意的是，这种稳定并不是由于凋亡调节的差异，因为在存在凋亡抑制剂Z-VAD的情况下获得了类似的数据(补充图S5B). 蛋白酶体抑制剂MG132的治疗增加了WT细胞中层粘连蛋白B1的水平，这表明层粘连B1的转换调节至少部分涉及蛋白质体途径(补充图S5C). 相反，用溶酶体抑制剂leupeptin治疗没有任何效果。
层粘连蛋白B1在WT和A-T细胞中的表达和稳定性。(A类)通过实时PCR定量测定mRNA水平。使用ACTIN和18S rRNA引物进行平行扩增作为参考。这些值对应于来自三个独立实验的平均值。*表示统计显著差异(P（P）⩽0.05). 误差条表示标准偏差(B类)在50μg/ml环己酰亚胺处理3、6或9小时后，通过western blot分析WT（GM03657）和A-T（GM03189）细胞中层粘连蛋白B1的稳定性。
总之，这些数据表明A-T细胞中层粘连B1蛋白的稳定性增加。
p38 MAPK激活导致层粘连蛋白B1积聚
接下来，我们研究了可能导致层粘连蛋白B1在A-T细胞或OS后积累的细胞途径。p38 MAPK是一个很好的候选基因，原因有三：（1）p38 MAPK是一种被OS激活的激酶；（2） 它在不同应激诱导的衰老中被激活(Wang等人，2002年;Iwasa等人，2003年;托雷斯和福尔曼，2003年;松泽和一条，2008年;Pan等人，2009年;Freund等人，2011年)（3）它是ATM非依赖性衰老途径的一部分(Naka等人，2004年).
为了测试p38 MAPK的可能作用，我们首先使用针对磷酸化（T180-Y182）-p38 MAPK（即p38 MAPK的活性形式）的特异性抗体，测量了A-T细胞和WT细胞中p38 MAPK-的自发激活。与WT提取物相比，我们观察到a-T中激活的p38 MAPK水平更高(补充图S6A和B). 这些观察结果与A-T细胞中高水平的自发ROS一致。与WT细胞相比，A-T细胞中的激酶p38 MAPK活性持续增加。事实上，当P-p38 MAPK从A-T细胞免疫沉淀时，特异性底物ATF2的磷酸化效率高于WT细胞(补充图S6B).
未激发的A-T细胞中p38 MAPK的激活可能是由于内源性OS，如来自自动取款机(−/−)老鼠(Ito等人，2006年). 事实上，用抗氧化剂NAC处理A-T细胞可显著降低激活的p38 MAPK水平；反过来，用前氧化剂H处理WT成纤维细胞后，激活的p38 MAPK水平增加2O（运行）2(补充图S6C).
为了测试p38 MAPK激活是否影响层粘连B1水平，用茴香霉素（MAPK激活剂）处理WT细胞，用SB203580（p38 MAPK抑制剂）处理A-T细胞。激活p38 MAPK显著增加WT细胞层粘连B1水平(;补充图S6D)p38 MAPK的抑制降低了A-T细胞层粘连蛋白B1的水平().
p38 MAPK对层粘连蛋白B1水平的影响以及p38 MAPK和层粘连素B1之间的相互作用。山莨菪碱对层粘连蛋白B1水平的影响(A类)或SB203580(B类)治疗。左面板：茴香霉素（10μg/ml）或SB203580（10μM）处理24小时后的western blot分析。右侧面板：茴香霉素后层粘连蛋白B1的定量(A类)或SB203580(B类)治疗。对p38 MAPK的底物P（T180-Y182）-p38 MAPK和P-（Ser82）-Hsp27蛋白进行免疫印迹，以分别证实山霉素和抑制剂SB203580对p38 MAPK活性的有效性。(C类)上图：层粘连蛋白B1（蛋白质提取前48小时过度表达）和内源性P-p38 MAPK的联合免疫沉淀。下部面板：现场通过使用抗P（T180/Y182）-p38 MAPK和层粘连B1（底板）抗体的近接连接试验（PLA）监测内源性层粘连蛋白B1和活化的p38 MAPK之间的相互作用。两种蛋白质之间的近端位置被观察为红色荧光点。右上面板：显示治疗48小时后层粘连蛋白B1 siRNA的效率的western blot。右下面板：量化现场用阴性对照siRNA（siCtrl）或层粘连蛋白B1 siRNA（siLMNB1）转染细胞的PLA。每个值表示>155个核中的平均点数*表示统计显著差异(P（P）<0.05). ***代表P（P）<0.0001 (t吨-测试）。误差条表示标准偏差(D类)In-vitro公司p38 MAPK对SV-40成纤维细胞层粘连蛋白B1的磷酸化。用放射分析法评估p38 MAPK对两种WT成淋巴细胞蛋白提取物（Priess和GM03657）免疫沉淀层粘连蛋白B1的激酶活性。在MKK3（p38 MAPK激活剂）和32便士ATP，p38 MAPK磷酸化层粘连蛋白B1在体外（车道3和4）。在第一条通道中，p38 MAPK的特异性底物ATF2-P（T71）对p38 MAPK活性起阳性控制作用。在第二条通道中，p38 MAPK缺失时未检测到层粘连蛋白B1磷酸化。
综上所述，这些数据表明p38 MAPK激活导致层粘连蛋白B1蛋白的积累，并表明p38 MAPK在导致层粘着蛋白B1在a-T细胞中积累的过程中起着关键作用，这使我们测试了层粘连B1和p38 MAPK之间的潜在相互作用。
p38 MAPK对层粘连蛋白B1的体外磷酸化
层粘连蛋白B1免疫沉淀导致P-p38 MAPK的协同免疫沉淀(，上部面板）。我们通过邻近连接试验（PLA）证实了层粘连蛋白B1–p38 MAPK的相互作用，这使得现场免疫荧光显微镜检测内源性蛋白质相互作用(Fredriksson等人，2002年;Soderberg等人，2006年,2008;Laulier等人，2011年). 荧光相互作用点只有在同时使用两种初级抗体时才可见。值得注意的是，当用针对层粘连蛋白B1的siRNA转染细胞时，这种相互作用几乎被消除，显示了层粘连蛋白B1和p38 MAPK之间相互作用的特异性(，下部面板）。总之，这些数据证明了层粘连蛋白B1和p38 MAPK之间的物理相互作用。
重要的是，我们接下来发现活化的重组p38 MAPK能够磷酸化层粘连蛋白B1在体外().
综上所述，这些数据表明p38 MAPK通过影响层粘连蛋白B1的水平参与OS后衰老的诱导。为了解决这个假设，我们用H2O（运行）2在p38抑制剂SB203580存在或不存在的情况下，测量层粘连蛋白B1水平和衰老。H增加层粘连蛋白B1水平2O（运行）2伴随着衰老的诱导(补充图S7A). 重要的是，在p38抑制剂存在的情况下，用H2O（运行）2不能增加层粘连蛋白B1水平和衰老(补充图S7B).
这些数据表明，OS通过激活p38 MAPK增加层粘连B1和衰老。
抑制A-T细胞p38 MAPK可防止层粘连蛋白B1的积累、核改变和衰老
最后，为了直接评估p38 MAPK-lamin-B1通路对A-T细胞核形态改变和衰老的影响，通过RNA干扰沉默p38 MAPK。即使p38 MAPK的部分缺失也会导致a-T原代成纤维细胞层粘连B1蛋白水平降低两到三倍()，与使用SB203580抑制剂的数据一致（比较和). 有趣的是，A-T细胞中p38 MAPK的沉默也导致细胞核形状改变的细胞频率从转染对照siRNA的56.1%和60.4%降低到转染p38 siRNA的27.8%和30.1%()伴随着衰老细胞频率的降低().
沉默p38 MAPK对A-T原代成纤维细胞的影响。(A类)siRNA p38 MAPK（40 nM）对层粘连蛋白B1水平的影响。左侧面板：western blot分析。右侧面板：治疗后层粘连蛋白B1水平的量化。这些值对应于三个独立实验的平均值*表示统计显著差异(P（P）<0.05）。误差条表示标准偏差(B类)对核形状的影响。左面板：用对照和p38 MAPK siRNA处理72小时的A-T成纤维细胞的核形状，并用抗层粘连B1（红色）进行免疫荧光分析。右侧面板：异常核的量化：圆形度⩽0.65（白色箭头）。这些数据是来自三个独立实验的平均值。每组至少计数150个细胞*表示统计显著差异(P（P）<0.05). 误差条表示标准偏差(C类)对A-T原代成纤维细胞衰老的影响。在siRNA转染72小时后分析A-T原代成纤维细胞中SA-β-半乳糖苷酶的表达。左侧面板：代表性显微照片。右图：对照或p38 MAPK siRNA处理后SA-β-gal表达的定量。从五个以上随机选择的区域（×10倍放大）定量SA-β-gal阳性细胞。给出了三个独立实验的平均值*表示统计显著差异(P（P）<0.05）。误差条表示标准偏差。
总之，这些数据表明，p38 MAPK激活增加了内源性层粘连蛋白B1的细胞水平，从而导致A-T细胞核形状的改变和衰老，这与ATM无关。
讨论
A-T具有复杂的临床特征，包括DDR缺陷（辐射敏感性、遗传不稳定性和癌症易感性）、神经疾病和过早衰老导致的表型(拉文，2008). 尽管ATM调节端粒维持，但表达h-TERT的A-T成纤维细胞显示出过早衰老，这表明A-T细胞的衰老并非完全由于端粒缩短(Naka等人，2004年). ATM激酶调节控制DDR、ROS反应和超复制、DNA损伤和OIS诱导的衰老的多条通路网络。然而，ATM在小鼠OIS中的作用有限(Efeyan等人，2009年)A-T细胞维持衰老表型的证据证明了另一种衰老途径的存在。ATM和p38 MAPK通过两条平行途径参与应激诱导的衰老，p38 MAPK可能参与A-T衰老，但其潜在的分子机制尚未明确(Naka等人，2004年). 在这里，我们详细介绍了AT细胞中的衰老诱导途径，因此与ATM无关。我们发现，作为对活性氧的反应，p38 MAPK的激活增加了内源性层粘连蛋白B1的细胞水平，高层粘连素B1水平导致核形状改变和衰老。因此，在ATM替代途径中，层粘连蛋白B1似乎是OS通过p38 MAPK诱导核结构改变的关键分子效应器。值得注意的是，ROS和p38 MAPK是由两种导致衰老的典型情况诱导的，这两种情况构成了衰老诱导的两种范式：OIS和应激诱导衰老(Lee等人，1999年;Iwasa等人，2003年;韩和孙，2007;Lu和Finkel，2008年). 有趣的是，我们还发现在这两种典型情况下，核形状改变和层粘连蛋白B1的积累也被诱导(补充图S8)表明层粘连蛋白B1的积累不仅限于A-T，而且更普遍地与ROS诱导的衰老相关。因此，很容易提出层粘连蛋白B1是OS诱导衰老的一般介质和标记。
值得注意的是，高水平的内源性OS可导致许多A-T表型(Barzilai等人，2002年;Browne等人，2004年;Ito等人，2007年;Lavin等人，2007年;Reliene和Schiestl，2007年;Reliene等人，2008年). 因此，这里描述的OS诱导衰老途径的存在为使用抗氧化剂治疗A-T患者提供了额外的分子论据(Lavin等人，2007年)并通过将p38层粘连蛋白B1途径鉴定为可能的额外治疗靶点而开辟了新的途径。
许多过程都可能导致衰老，包括DDR缺陷、OS和核结构的改变。然而，这三个过程之间的假定关系记录得很差。在我们的研究中，A-T细胞与上述三种缺陷相关。到目前为止，进行性综合征被分为两个不同的类别：层粘连改变的层粘连病和DDR缺陷综合征(Lans和Hoeijmakers，2006年). 因为我们的数据显示，A-T细胞的层粘连B1水平增加，核结构改变，这种病理学可以描述两类进展综合征。值得注意的是，这两个缺陷可能会相互增强。事实上，层粘连蛋白A/C的失调会影响层粘连病中的DNA损伤信号和基因组稳定性(Liu等人，2005年,2006;Misteli和Scaffidi，2005年;Manju等人，2006年;Parnaik和Manju，2006年;di Masi等人，2008年;Liu和Zhou，2008年;Gonzalez-Suarez等人，2009年a,2009年b;Redwood等人，2011年). 因此，很容易推测，层粘连蛋白B1的过度表达同样会影响DNA代谢。
复制LMNB1型导致层粘连蛋白B1过度表达的基因在成人型常染色体显性白质营养不良（ADLD）中有描述(Padiath等人，2006年;Meijer等人，2008年). 有趣的是，层粘连蛋白B1和层粘连蛋白质B2的缺乏与其他神经系统缺陷相关，这表明必须严格控制层粘连素B1的水平，以避免缺陷和过量(Coffinier等人，2011年). 已发表的观察结果表明，层粘连蛋白B1的缺陷导致核形态改变(Vergnes等人，2004年;Lammerding等人，2006年). 我们的数据表明，层粘连蛋白B1也可能因ATM突变而间接失调。值得注意的是，A-T和ADLD具有共同的临床特征，如中枢神经系统（CNS）脱髓鞘，这与严重的神经缺陷有关。中枢神经系统脱髓鞘和A-T神经缺损的分子原因仍然令人困惑(Barzilai等人，2008年;Biton等人，2008年). 最近的一份报告证明LMNB1型过度表达影响髓磷脂合成基因的表达，从而导致中枢神经系统脱髓鞘(林和傅，2009)因此，我们的数据为a-T的神经系统疾病提供了潜在的分子解释。因此，与DDR缺陷平行，层粘连蛋白B1的过度表达可以解释a-T的重要临床特征，包括过早衰老和中枢神经系统缺陷/神经系统疾病。一般来说，层粘连蛋白B1的过度表达可以解释与OS升高相关的不同疾病中的神经缺陷和/或衰老表型。
响应OS的细胞活力需要调节氧化还原平衡。转录因子Oct1通过抑制解毒基因的转录来调节这种平衡，例如PRDX2型,GPX3系列和SOD1标准Oct1在核外周的保留使这些基因得以表达，从而提高了OS下的细胞生存能力(Tantin等人，2005年;马哈斯和沃克斯，2009年). 重要的是，层粘连蛋白B1是Oct1在核外周定位所必需的，层粘着蛋白B1的缺失导致对OS的更高敏感性(Malhas等人，2009年). 因为我们的研究表明，OS增加了层粘连蛋白B1的水平，这些数据共同支持一种模型，即层粘连B1在OS的作用下积累，以保护细胞免受OS的伤害。我们通过显示层粘连蛋白B1的过度表达降低了基础和H2O（运行）2-诱导ROS水平并提高细胞存活率以应对OS暴露(补充图S9). 因此，层粘连蛋白B1过表达参与了内源性细胞对OS的反应。p38 MAPK通常被认为是一种介导细胞死亡的激酶。相反，一些研究发现，应激刺激激活p38 MAPK不一定会促进细胞死亡；相反，它可以通过尚不明确的机制提高细胞存活率(Thornton和Rincon，2009年). 我们的数据揭示了p38 MAPK通过层粘连蛋白B1的积累控制解毒基因表达的分子途径，这可能是p38 MAPK的促生功能的基础。
当前数据可以统一在以下模型中()：（1）OS激活p38 MAPK；（2） p38 MAPK激活导致高水平的层粘连蛋白B1，这是细胞对OS反应的一部分；（3） 层粘连蛋白B1的积累降低了活性氧的水平，从而增加了细胞对OS的抵抗力；（4）在持续性和慢性OS的情况下（例如在遗传性疾病如A-T中），长时间高水平的层粘连B1影响核结构，从而触发衰老（现有数据）和髓磷脂合成基因的表达，导致神经系统疾病(林和傅，2009). 我们的结果强调了OS、核结构改变和衰老之间的交叉点缺失的联系，并确定层粘连B1是OS引起衰老的关键介质。
层粘连蛋白B1积累对氧化还原平衡、衰老和神经缺陷的影响。氧化应激通过激活p38 MAPK导致层粘连蛋白B1水平升高。我们的数据表明，层粘连蛋白B1通过调节活性氧水平和提高细胞活力，在控制氧化应激中发挥重要作用。在持续氧化应激的情况下（如在A-T细胞中），层粘连蛋白B1水平的长期积累会导致衰老和/或神经缺陷。事实上，如本报告所示，层粘连蛋白B1可以影响核结构形态和衰老，也可以影响髓磷脂基因合成，如林和傅（2009）.
材料和方法
细胞培养、治疗和转染
细胞在37°C和5%CO条件下生长2在改良鹰的介质中。人类原代成纤维细胞在MEM（Invitrogen，Carlsbad，USA）中生长，RPMI-1640（Lonza Group Ltd.，Switzerland）中的淋巴母细胞同时补充20%胎牛血清（FCS；Lonza-Group Ltd.）和补充10%FCS的DMEM中SV-40人类原代纤维细胞。所有培养基均补充有2mM谷氨酰胺、200IU/ml青霉素和100mg/ml链霉素（Calbiochem，Merck Biosciences，Darmstadt，Germany）。对于前氧化处理，正常初级成纤维细胞暴露于50μM H2O（运行）2在37°C培养72小时后，将WT淋巴母细胞暴露于100μM h2O（运行）2在37°C培养24小时。为了进行抗氧化处理，A-T原代成纤维细胞和淋巴母细胞分别暴露于2 mM NAC（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）48小时和24小时。分别用茴香霉素（10μg/ml，Sigma-Aldrich）或SB203580（10μM，Invitrogen）治疗24小时，评估p38 MAPK对淋巴母细胞层粘连B1水平的激活或抑制。为了抑制磷酸-丝氨酸-1981 ATM，用10μM KU-55933（Cell Signaling，Ozyme，法国）处理淋巴母细胞24小时。使用Amaxa Nucleofector系统（Lonza Group Ltd.）对原代成纤维细胞进行细胞核移植。转染空质粒或人类层粘连蛋白B1 cDNA（Origene，Clinisciences SA，法国）或层粘连肽B1 siRNA（Eurogentec，法国）72小时后，进行核形态分析或SA-β-gal分析。
蛋白质印迹分析
细胞悬浮在裂解缓冲液中（8 M尿素、1 M硫脲、4.8%CHAPS、50 mM DTT、24 mM脱水精胺、蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Complete lysis buffer；Roche，Meylan，France）和0.1 mM Na三VO（旁白）4). 为了将DNA片段化，然后改进蛋白质提取，通过连接到0.3 ml的针头对裂解液进行重复的机械破坏。在室温下培养1小时后，通过100 000离心将样品清除克TLA-100转子中（贝克曼，富勒顿，加利福尼亚州，美国）。对于每个印迹，每个样品装载等量（30μg）的蛋白质。使用标准技术进行电泳分离、转移到硝酸纤维素膜上和抗体检测。使用ECL蛋白质印迹系统对蛋白质进行可视化。用1:500的抗体检测拉明B1和B2（英国剑桥Abcam公司），用1:1000的特异性抗体检测肌动蛋白（Sigma-Aldrich）。分别用抗P（S1981）-ATM（美国罗克兰，布里奇波特）和抗P（T68）-Chk2、抗P（S82）-Hsp27和抗磷酸（T180-Y182）p38 MAPK-MAPK（美国马萨诸塞州丹弗斯Cell Signaling Technology Inc.，Danvers，MA，USA）抗体检测磷酸化形式的ATM、Chk2、Hsp27和p38 MAP激酶。使用1:5000的特异性抗体（分别为Abcam公司和Cell Signaling Technology公司）进行了Vinculin和PARP蛋白检测。使用1:500的特异性抗体检测细胞周期蛋白A（Abcam Inc.）。
免疫荧光显微镜
细胞生长在玻璃盖玻片上，用2%多聚甲醛或冷甲醇固定，并用0.5%皂苷渗透。阻断后，用含有1%BSA和0.05%吐温的PBS稀释的抗层粘连B1、抗HP1或H3mK9一级抗体（Abcam Inc.）培养细胞。
用含有1%BSA的PBS洗涤后，用FITC-结合的山羊抗鼠Ig或RHOD-结合的羊兔Ig（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA，USA）培养细胞，并用DAPI染色。最后，用荧光安装介质（Fluoromount）安装载玻片。使用×40物镜获得图像，并使用fluo IMSTAR软件（IMSTAR S.a.，法国）进行处理。
在配备CoolSNAP HQ CCD相机和×63物镜的徕卡DM5500显微镜上对层粘连B1进行免疫检测。使用MetaMorph（通用成像）进行数据采集。用图像J平均灰度参数测量每个核的层粘连蛋白B1荧光强度。
现场PLA
如上文所述，使用小鼠磷酸化p38 MAPK（Thr180/Tyr182）（Cell Signaling Technology Inc.）和兔层粘连蛋白B1（Abcam）抗体进行免疫荧光显微镜的初级抗体染色。然后，现场根据制造商的协议，使用Duolink II荧光试剂盒（OLINK Bioscience）进行PLA。使用莱卡DMRxA2共焦显微镜SPE（德国韦尔兹拉莱卡微系统公司），使用ACS APO×63 1.3油透镜进行图像采集。使用Leica和ImageJ软件对图像进行处理。
核形状测量
使用CellProfiler图像分析软件测量细胞形态参数。使用特定的“测量物体大小形状”模块确定层粘连B1染色的细胞核的形状特征。在这些形状特征中，我们重点关注形状因子值（计算为4×π×面积/周长2)量化形状异常的细胞核。形状因子等于1对应于完美的圆形核。
SA的细胞化学检测-β-加仑
如前所述检测到SA-β-gal阳性细胞(Dimri等人，1995年). 简而言之，用2%甲醛和0.2%戊二醛固定细胞单层，并在37°C的染色溶液中培养（Cell Signaling Technology Inc.）。过夜培养后，用蔡司显微镜（Statif Axio vertical 40C，Zeiss）在×10倍放大下测定染色细胞的百分比。从五个以上随机选择的区域对SA-β-gal阳性细胞进行定量。
BrdU染色
细胞生长在盖玻片上，在10μm溴脱氧尿苷（BrdU）中标记24 h，并在冷甲醇中固定。通过在室温下将细胞在4 N HCl中培养20分钟，使DNA变性，并根据制造商的建议使用FITC-结合的抗BrdU（Becton Dickinson）进行BrdU染色。用1μg/ml DAPI对细胞核DNA进行复染。
RNA干扰
根据制造商的条件，使用Amaxa系统对siRNA特异性层粘连B1（5′-AGAGUCUAGCAUGUUG-3′）和对照siRNA（NEG05，Eurogentec）进行核感染。在制造商规定的条件下，使用干扰素（Polyplus Transfection，Illkirch，France）将两个p38 MAPK siRNA序列的混合物（5′-GCACAUGAGAAGAUCAGAU-3′和5′-CCUUCCAGCAGAUGUAU-3′）转染到细胞中。
相对实时PCR定量
定量PCR在Mastercycler中进行®ep-realplex实时PCR系统（法国Eppendorf），使用三个单独实验的技术副本，分别对LMNB1的10 ng/μl cDNA和ACTIN和18S参考基因的0.1和0.01 ng/μl cDNA的每个引物进行实验。使用ACTIN和18S rRNA引物进行平行扩增作为参考。在每种情况下，获得重复的阈值循环（Ct）值并求平均值。然后通过相对定量（Q）方法测定层粘连蛋白B1的表达。
协同免疫沉淀
使用Jet-PEI（Polyplus transfection）转染层粘连蛋白B1表达载体48小时后，SV40成纤维细胞在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的150mM NaCl缓冲液（NaCl 150 mM，NP-40 1%，EDTA 1 mM，Tris 25 mM pH 7.5）中冰上溶解45分钟。为了提高提取效率，我们通过将裂解液通过与0.3毫升注射器相连的针头10次来重复机械破坏。13000离心后克在4℃下预处理30 min，并在4℃与2μg层粘连蛋白B1抗体或无抗体（单独使用珠状物作为阴性对照）搅拌下培养裂解物（250μg蛋白质）过夜。将蛋白G-琼脂糖珠（Sigma-Aldrich）添加到样品中，并在4°C下旋转搅拌将混合物培养4 h。四次洗涤后，将免疫沉淀物重新悬浮在2×Laemmli缓冲液中并煮沸5分钟。离心后，用8%SDS–PAGE分离上清液，放射自显影检测层粘连蛋白B1和p-p38 MAPK。
活化p38 MAPK对免疫沉淀层粘连蛋白B1的体外磷酸化
通过测量免疫沉淀层粘连蛋白B1的磷酸化率来评估p38 MAPK的激酶活性。SV40成纤维细胞在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA（50 mM Tris HCl pH 8，150 mM NaCl，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠和0.1%SDS）缓冲液中在冰上溶解30分钟。为了提高提取效率，我们通过将裂解液通过与0.3毫升注射器相连的针头10次来重复机械破坏。13000离心后克在4°C下孵育30分钟，预筛选裂解物，并在搅拌下与2μg层粘连蛋白B1在4°C下孵育（250μg蛋白质）过夜。将蛋白G-琼脂糖珠（Sigma-Aldrich）添加到样品中，并在4°C下旋转搅拌将混合物培养4 h。四次洗涤后，将层粘连蛋白B1或2μg ATF-2融合蛋白（p38 MAPK底物，用作阳性对照）的免疫沉淀物重新悬浮在含有1μg重组α-p38 MAPK、1μg重构MKK3（Cell Signaling Technology Inc.）、5μM ATP和5μCi[γ]的30μl激酶缓冲液中-32P] ATP。在30°C下培养15分钟后，通过添加2×Laemmli缓冲液在冰上停止反应。样品用10%SDS–PAGE分离，并磷酸化32放射自显影检测P-层粘连蛋白B1。
统计分析
结果表示为至少三个独立实验的平均值±s.e.m。使用非参数Mann–Whitney进行统计分析t吨-测试，以及*表示统计显著性(P（P）⩽0.05). 对于层粘连蛋白B1的荧光强度、平均圆度和PLA定量，使用非参数进行统计分析T型-测试，以及***表示统计显著性(P（P）⩽0.0001).
