细胞生物学杂志。2009年1月12日；184(1): 45–55.
第条
拉明B1通过Oct-1控制氧化应激反应
,1 ,2和1
阿什拉夫·马哈斯
1威廉·邓恩爵士病理学院2英国牛津大学物理系克拉伦登实验室，牛津OX1 2JD
邱凡利（Chiu Fan Lee）
1威廉·邓恩爵士病理学院2英国牛津大学物理系克拉伦登实验室，牛津OX1 2JD
大卫·J·沃
1威廉·邓恩爵士病理学院2英国牛津大学物理系克拉伦登实验室，牛津OX1 2JD
1威廉·邓恩爵士病理学院2英国牛津大学物理系克拉伦登实验室OX1 2JD
收到日期：2008年4月28日；2008年12月11日接受。
- 补充资料
【补充材料索引】
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GUID:82AA513A-9F74-4C39-87DB-78684E80296C
摘要
层粘连蛋白与染色质和转录因子的相互作用调节转录。Oct-1先前已被证明部分与B型层粘连蛋白共定位，并且对氧化应激反应基因的转录调控至关重要。通过顺序提取、免疫共沉淀（IP）、光漂白中的荧光损失和荧光共振能量转移，我们确认了核外周的Oct-1–lamin-B1关联，并表明这种关联在最小1Δ/Δ细胞。我们发现，包括参与氧化应激反应的子集在内的几个Oct-1依赖基因在最小1Δ/Δ细胞。电泳迁移率变化分析和染色质IP显示，Oct-1与失调基因的假定八聚体结合序列结合，并且在缺乏功能性层粘连B1的细胞中，这种活性增加。喜欢10月1日−/−细胞，最小1Δ/Δ细胞活性氧水平升高，更容易受到氧化应激的影响。层粘连蛋白B1在核外周的Oct-1序列可能是核膜调节基因表达并促进细胞对应激、发育和衰老的反应的机制。
结果
Oct-1–层粘连蛋白B1相互作用
Oct-1蛋白的Western blotting检测证实在野生型（WT）小鼠胚胎成纤维细胞和最小1Δ/Δ缺乏层粘连蛋白B1的C-末端273氨基酸的细胞(Vergnes等人，2004年). 使用之前描述的涉及差异萃取的核膜亚分馏协议(Maske等人，2003年)我们发现，在WT细胞中，Oct-1在萃取强度增加的所有馏分中检测到，包括4-M尿素馏分。然而，在最小1Δ/Δ细胞，早期组分中释放出更多的Oct-1，而在4 M尿素组分中未检测到Oct-1(). 这种提取过程与核膜紧密相关，因为在WT细胞中，该池中的细胞核中含有>40%的全长层粘连B1(Maske等人，2003年). 用抗层粘连蛋白B1抗体免疫沉淀WT细胞裂解物导致共免疫沉淀Oct-1(). Oct-1未与层粘连蛋白B1在10月1日−/−尽管成功沉淀了层粘连蛋白B1。免疫沉淀（IP）中使用的抗层粘连蛋白B1抗体是针对C末端的，而C末端缺乏最小1Δ/Δ因此，这些细胞裂解物的IP样品既不含层粘连B1也不含Oct-1(). 这为层粘连蛋白B1和Oct-1之间的直接相互作用提供了证据。通过在WT和WT中表达荧光标记的Oct-1也证实了这一点最小1Δ/Δ细胞。Oct-1在WT细胞的核外周观察到，但在最小1Δ/Δ单元格(和图S1，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200804155/DC1). 光漂白中的荧光损失（FLIP）表明，当在WT细胞中表达时，Oct-1–EGFP显示出非常缓慢的转换，只有8%在100秒内被交换(). 年营业额更快Lmnb1型Δ/Δ单元，其中43%的10月1日EGFP在同一时间段内进行交换。该实验表明，在存在全长层粘连蛋白B1的情况下，Oct-1结合的稳定性比不存在后者的C末端时更为严格。
Oct-1与层粘连蛋白B1紧密相关。（A） 来自WT和最小1Δ/Δ细胞进行连续提取并通过Western blotting进行分析。数字表示一个代表性实验中每个分数中Oct-1信号的百分比。（B） Oct-1与WT裂解物中的层粘连蛋白B1共免疫沉淀，但不是10月1日−/−或最小1Δ/Δ细胞。左侧面板显示输入样本的免疫印迹，右侧面板显示免疫沉淀物的免疫印记。免疫沉淀物与抗羊重链的对照染色证实了每个样品中的等效沉淀效率。（C） 10月1日–EGFP在活WT中显示出核外周联系，但在最小1Δ/Δ细胞。（D） WT中的FLIP和最小1Δ/Δ表达Oct-1–EGFP的细胞。（左）使用光漂白区域外的核周边ROI测量光漂白后的荧光损失（显示平均值±SD；n个= 10). 这些结果表明，Oct-1–EGFP与包含全长层粘连B1的外周核板紧密相关。（右）核质ROI的定量FLIP表明，WT或WT中表达的核质Oct-1–EGFP的稳定性没有显著差异最小1Δ/Δ细胞。（E） Oct-1与层粘连蛋白B1紧密相关，但与层粘着蛋白A/C无关。FRET按照材料和方法进行。红色方框（图像）和线条（图）表示使用543-nm激光进行受体光漂白所选的ROI，而绿色方框和线条表示在光漂白区域内选择的ROI以进行FRET分析。图中阴影区域显示漂白时间。请注意，漂白层粘连蛋白B1（顶部）后，供体（绿色）荧光增强，而不是层粘连蛋白质A/C（底部），这表明与Oct-1相关的核层粘连成分确实是层粘连酶B1而不是层粘蛋白A/C。显示了一幅代表性图像（层粘连素B1的FRET效率为5%），但在三个独立的实验中，20个核团的FRET效率平均值（层粘连B1和层粘连A/C分别为4.63±1.4%SD和0±0.75%SD）在使用Student’st吨试验（P<0.01）。
为了测试FLIP结果是否由Oct-1和层粘连蛋白B1之间的紧密联系引起，我们使用受体光漂白法进行了荧光共振能量转移（FRET）共焦显微镜检查。简言之，该方法包括对受体荧光团（例如Cy3）进行光漂白，并寻找对供体（例如EGFP）检测到的荧光信号的增加。以FRET效率表示的供体荧光的增加（见材料和方法）表明，这两种蛋白质确实在1–10 nm范围内，因此可能直接相互作用。在这种情况下，供体是Oct-1–EGFP，受体是用Cy3偶联的二级抗体检测的层粘连蛋白B1或层粘连蛋白A/C。GFP-Cy3 FRET对的Förster半径（FRET效率为一半最大）为6.0 nm(沃特斯和巴斯蒂安，1999年). 使用这种方法，我们发现用于检测层粘连B1的Cy3漂白后，Oct-1–EGFP的荧光增强（FRET效率为4.6%；n个= 20;). 然而，在阴性对照中，用于检测层粘连蛋白A/C的Cy3的光漂白并未导致Oct-1–EGFP荧光的增加（P<0.001；)，确认没有Oct-1层粘连蛋白A FRET信号。
增加的可用核质Oct-1最小1Δ/Δ细胞
接下来，我们想研究Oct-1–lamin-B1的相关性及其在最小1Δ/Δ细胞具有任何功能性后果。使用等量的WT核提取物，使用荧光标记的Oct-1共有寡核苷酸（FAM–Oct-1）进行电泳迁移率变化分析（EMSA），最小1Δ/Δ、和10月1日−/−单元格(). 观察到WT和最小1Δ/Δ但不是用10月1日−/−核提取物。此外，用最小1Δ/Δ提取物比WT提取物多，这表明Oct-1在最小1Δ/Δ细胞，现在可以与它的DNA靶序列结合。
10月1日，从核层释放Lmnb1型Δ/Δ细胞更容易与其靶DNA序列结合。EMSA使用FAM标记的Oct-1共识结合寡核苷酸进行。在WT和最小1Δ/Δ但不在10月1日−/−核提取物。使用最小1Δ/Δ提取也增加了（位移带的相对强度最小1Δ/Δ与此代表性实验中的WT=1.94相比），表明从核薄片释放的Oct-1可以占据更多的靶点。
Oct-1和层粘连蛋白B1缺陷细胞的基因表达变化
尽管上述实验表明，在缺乏全长层粘连B1的情况下，从核板层释放的Oct-1现在可以与其靶序列结合，但它们并不能证明这对Oct-1靶基因表达有任何影响。为了确定这一点，我们首先要确定10月1日在最小1Δ/Δ细胞（即依赖层粘连蛋白B1和Oct-1正常表达的基因）。我们比较了最小1Δ/ΔWT细胞使用每种细胞的六个生物复制品和六个用染料交换进行的杂交。我们之前已经在缺乏正常全长层粘连B1的情况下发现了790个失调基因（使用CyberT，P<0.05）（ArrayExpress登录号：。电子邮箱-538). CyberT是一个基于网络的贝叶斯概率框架的实现，用于分析微阵列数据，用于分析具有高测量噪声和可变性以及通常低重复数的数据(Baldi and Long，2001年). 与微阵列的显著性分析相比，这种贝叶斯方法更适合微阵列数据的分析(Tusher等人，2001年)课程和学生的t吨测试时间n个很小(Choe等人，2005年)，尽管当n个>和我们的实验中一样(Baldi和Long，2001年).
我们比较了Lmnb1型Δ/Δ之前报告的单元格10月1日−/−细胞（基因表达综合[GEO]登录号。GDS1446型;Tantin等人，2005年). 我们发现1937个基因在这两种细胞类型中都没有改变，因此与Oct-1或层粘连B1无关(，蓝色区域）。54个基因在10月1日−/−但不在最小1Δ/Δ因此依赖于Oct-1而非层粘连B1的表达(，黄色区域），而1030个基因在最小1Δ/Δ而不是10月1日−/−细胞，这意味着它们的表达依赖于层粘连B1而不是Oct-1(，橙色区域）。白色象限中的57个基因()代表两种细胞类型中均失调的细胞，因此依赖于Oct-1和层粘连B1的表达（表S2，见http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200804155/DC1). 为了评估在两种实验条件下发现这一数量的基因改变的重要性，对500000个样本使用了自举方法（见材料和方法）。该方法表明，两个实验中57个基因发生变化的概率小于0.00012（图S3）。
原木散点图2基因的折叠变化10月1日−/−和最小1Δ/Δ细胞。阴影区域显示的是未改变或适度失调的基因，以0.5为界。在Oct-1缺陷细胞中只有54个基因显著失调，而在最小1Δ/Δ细胞（黄色），而1030个基因在Lmnb1型Δ/Δ细胞，而不是Oct-1缺陷细胞（橙色）。阴影区外的基因是指在两种缺陷细胞类型中显著失调的基因（即，其调节依赖于Oct-1和层粘连B1）。还有1937个基因在两种细胞类型（中央蓝色区域）中都没有失调。
EMSA和染色质IP（ChIP）
我们使用上述基因表达分析选择了一些被鉴定为Oct-1靶点的基因，以测试它们是否具有功能性Oct-1结合位点。假定的Oct-1–基因启动子区域内的结合位点是使用在线版本的隐藏马尔可夫曲线比较工具（调控元件位置和模式的多基因组分析[MAPPER]；http://bio.chip.org/mapper; 图S4，网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200804155/DC1;Marinescu等人，2005年). EMSA使用FAM标记的寡核苷酸双链，预测的Oct-1结合序列为路1,像素3,管理1、和百万像素13证实序列可以特异性结合Oct-1，因为在分析中，将非标记的寡核苷酸与Oct-1共有序列包含在一起，可以降低移位带的强度(). 在最小1Δ/Δ细胞提取物分析与WT细胞提取物进行比较，进一步证实了在最小1Δ/Δ能与被测基因启动子区的靶序列结合的细胞(和图S2）。
Oct-1可以与Oct-1和层粘连蛋白B1缺陷细胞中失调基因调控区内的靶序列结合。（A） 核提取物中的Oct-1最小1Δ/Δ细胞在启动子区使用一致的Oct-1结合寡核苷酸（Cons）和预测的Oct-1-结合序列显示带移位路1和像素3结合的特异性通过包含过量的非标记一致性寡核苷酸（+通道）来证实，这降低了移位带的强度。（B） 在以下情况下，位移带更强烈最小1Δ/Δ作为从核纤层释放Oct-1的结果的提取物。相对强度值(Lmnb1型Δ/Δ/WT）为2.44路1和1.68像素3。使用Oct-1结合序列获得了类似的结果管理1和百万像素13（图S3，网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200804155/DC1).
要确认这发生在最小1Δ/Δ细胞，我们在WT和最小1Δ/Δ并使用定量实时PCR（qRT-PCR）测定潜在靶点的Oct-1占有率的相对富集度。我们选择了7个基因进行ChIP分析，包括之前显示受Oct-1促性腺激素释放激素受体调节的基因(格纳尔)以及本研究中确定为Oct-1和层粘连蛋白B1依赖的基因。10月1日预计结合位点的占用增加Csnb公司,百万像素13,路1,像素3,管理1、和Serping1号机组在中检测到最小1Δ/Δ细胞相对于野生型细胞，而β-肌动蛋白的占有率没有相对增加，它没有Oct-1结合位点(). 有趣的是，10月1日的现场格纳尔先前使用迁移率变化分析鉴定的启动子在10月1日的占有率没有变化格纳尔1.为了理解这个意外的差异，我们检查了格纳尔使用MAPPER启动子区，并发现了其他预测的Oct-1结合位点，得分高得多(). 当我们使用对得分最高的Oct-1位点具有选择性的引物对重复ChIP/qRT-PCR实验时，我们发现占有率发生了显著变化(，比较格纳尔1和格纳尔2).
Oct-1与靶序列结合的富集最小1Δ/Δ细胞。ChIP之后最小1Δ/Δ和WT细胞使用抗Oct-1抗体，通过定量实时PCR检测目标基因，如材料和方法中所述。除格纳尔1.（A和B）注意Actb公司该序列没有Oct-1结合序列，因此，未检测到结合富集。还显示了使用ChIP分析的Oct-1结合位点的MAPPER得分和E值以及MAPPER Oct-1-结合模型。（C） 老鼠格纳尔启动子区域有几个潜在的Oct-1结合位点。使用两组产生两个PCR产物的引物来检测10月1日在格纳尔发起人。格纳尔2被富集，而格纳尔1没有，表明Oct-1优先与格纳尔2.所示数据来自两个单独的核提取物，一式三份，均数±SD。序列比对数据如图S4所示（可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200804155/DC1).
最小1Δ/Δ细胞更容易受到氧化应激的影响
一些基因在10月1日和最小1Δ/Δ细胞参与细胞对氧化应激的反应，如图所示Oct-1缺陷细胞已经被证明具有升高的ROS水平，并且更容易受到氧化应激的影响(Tantin等人，2005年). H存在下的细胞存活分析2O（运行）2表明最小1Δ/Δ细胞也更容易受到氧化应激的影响(). 使用细胞渗透探针2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）用于ROS液位检测(Sanchez Ferrer等人，1990年)，的10月1日−/−和最小1Δ/Δ与WT细胞相比，细胞的ROS水平显著升高(). 为了证明这种变化直接依赖于层粘连蛋白B1的功能，我们使用最小1小干扰RNA(). 层粘连蛋白B1水平降低的细胞显示ROS水平升高(). 这种效应本身不是siRNA转染的结果，因为对照siRNA对ROS水平没有影响(). 作为进一步的控制，我们在最小1Δ/Δ层粘连蛋白B1表达恢复后的细胞（通过转染细胞表达全长层粘连蛋白质B1），并显示表达层粘连蛋白酶B1的转基因成纤维细胞中ROS水平降低至WT水平().
最小1Δ/Δ细胞更容易受到氧化应激的影响，并具有高水平的活性氧。（A） 百分比表示与平行分析的相同类型细胞的未处理孔相比，处理孔的活细胞计数。最小1Δ/Δ细胞比WT更容易受到氧化应激的影响（根据Student’st吨测试）。（B） 细胞渗透性荧光探针H2DCFDA用于细胞内活性氧检测。10月1日−/−,最小1Δ/Δ、和最小1siRNA处理的WT细胞在染料处理后显示出明显更强烈的荧光信号，这表明它们的ROS水平高于未处理的野生型细胞。（C） WT中ROS水平的定量，10月1日−/−、和最小1Δ/Δ细胞治疗前后最小1siRNA，表明突变体细胞中的ROS水平升高，并且在WT细胞中的层粘连B1表达降低后。ROS水平也归一化为接近WT水平10月1日siRNA处理Lmnb1型Δ/Δ细胞。每种情况下分析50个细胞。（D） WT细胞转染最小1小干扰RNA。转染48小时后测量ROS水平（绿色）和层粘连蛋白B1（红色）。层粘连蛋白B1表达水平降低的细胞具有较高的活性氧水平。箭头显示一个表达层粘连蛋白B1的细胞，与周围细胞相比，其活性氧水平较低。（E） 用对照siRNA（Trap1）转染的细胞没有显示ROS水平升高。箭头表示Trap1表达减少且ROS水平没有增加的单元格示例。（F） 转基因最小1Δ/Δ表达全长层粘连蛋白B1（红色）的细胞会降低活性氧的水平，这表明对细胞内活性氧水平的影响Lmnb1型Δ/Δ细胞与全长层粘连蛋白B1表达的丧失直接相关。显示了平均值±SD值（通过方差分析，P<0.001）。棒材，10μm。
ROS水平也降低至接近WT水平最小1Δ/Δ细胞，而使用10月1日小干扰RNA(). 此外，Oct-1水平在最小1Δ/Δ与分别转染对照siRNA或对照EGFP构建物（H2B-EGFP）的细胞相比，WT细胞中Oct-1的过度表达降低了其对氧化应激的敏感性(). 这些实验表明，ROS水平升高和对氧化应激的敏感性最小1Δ/Δ细胞确实由Oct-1介导。
层粘连蛋白B1缺陷细胞中失调的基因表达和对氧化应激的易感性是由Oct-1介导的。（A） 用Oct-1–EGFP或H2B-EGFP转染WT细胞作为对照（灰色条），而Lmnb1型Δ/Δ细胞被转染10月1日siRNA或对照siRNA（白色条）。用2 mM H处理后2O（运行）2，按照材料和方法进行细胞存活分析。标准化细胞存活率是治疗细胞与对照细胞的细胞存活百分比的比值。比率>1，如最小1Δ/ΔOct-1水平降低的细胞反映了细胞存活率的提高。与WT细胞过度表达Oct-1的情况一样，比率<1反映了细胞存活率的降低。WT中Oct-1的过度表达增加了其敏感性，而WT中的Oct-1水平降低最小1Δ/Δ细胞降低了其敏感性，表明层粘连B1缺陷细胞对氧化应激的敏感性由Oct-1介导。（B） 的表达式级别像素3,路1、和百万像素13转染Oct-1–EGFP（灰条）和最小1Δ/Δ转染细胞10月1日测量siRNA（白色条），并将其表示为与相关对照组相比的折叠变化。结果表明，在WT中Oct-1的过度表达或在层粘连蛋白B1缺陷细胞中其水平的降低逆转了这些基因的基因表达模式，这些基因参与氧化应激反应。水平线表示比率为1，如果与对照组相比，未观察到基因表达或敏感性的变化，则为条形。数据是三个独立执行的重复的平均值±SD。
对10月1日直接影响的进一步支持来自实验，其中10月1号水平在最小1Δ/Δ细胞被siRNA减少。（白色条）显示了10月1日siRNA对参与氧化应激反应的三个基因的表达。其中两个基因(Gpx3型和Rdm1型)通常被10月1日抑制（因此在最小1Δ/Δ细胞）；当Oct-1被siRNA降低时，这种下调被逆转（即控制siRNA–标准化倍数变化大于1）。类似地，一个被Oct-1激活的基因，因此在最小1Δ/Δ单元格(百万像素13)当Oct-1被siRNA减少时（即控制siRNA–标准化倍数变化小于1），显示了这种效应的逆转。最终证实这是Oct-1的直接作用来自相反的实验，其中Oct-1在WT细胞中独立过度表达(，灰色条）。在这种情况下，基因通常被Oct-1抑制(像素3和路1)Oct-1过表达下调，而Oct-1正常激活的基因表达增加。
讨论
鉴于并非所有在缺乏全长层粘连B1的情况下观察到的基因表达变化都可以用染色质-层粘连相互作用的改变来解释(Malhas等人，2007年)，我们寻求其他机制。特别是，以前有报道称，Oct-1与层粘连蛋白B共定位，并且Oct-1从核外周分离导致胶原酶基因上调(Imai等人，1997年). 因此，我们考虑了在最小1Δ/Δ细胞可能是在缺乏全长层粘连B1的情况下，Oct-1从核膜分离的结果。
我们首先表明，Oct-1与层粘连蛋白B1相关，这种相互作用的丧失导致核质中Oct-1水平升高，并且释放的Oct-1可以与其一致靶序列结合。然后，我们想研究这种增加的结合是否会产生功能性影响，因此，我们试图确定在最小1Δ/ΔOct-1分布改变导致的细胞。为了验证这一点，我们利用了小鼠Oct-1基因敲除细胞中基因表达的现有数据(Tantin等人，2005年). 我们发现，在缺乏Oct-1的情况下，1030个基因要么保持不变，要么中度失调，但在缺乏全长层粘连B1的情况下显著失调，表明对层粘连B_1的依赖性，而不是Oct-1。这一组包括我们确定的依赖于加工层粘连B1的大多数少数基因(Malhas等人，2007年)但也必须包括许多层粘连蛋白B1依赖性不能通过层粘连蛋白B1-染色质相互作用或层粘连蛋白B1-Oct-1相互作用来解释的基因。目前正在继续努力确定缺乏稳定的B型椎板影响这些基因表达的机制。只有54个基因的正常表达依赖于Oct-1，而不是层粘连蛋白B1。我们推测，这些基因对低水平的Oct-1有严格的要求，并且在WT和最小1Δ/Δ单元，Oct-1水平超过了这一允许要求。我们确定了57个依赖层粘连蛋白B1和Oct-1正常表达的基因。其中一些基因被发现与氧化应激反应有关(Tantin等人，2005年). 其中15个基因在最小1Δ/Δ单元格(). 如果假设10月1日在最小1Δ/Δ细胞是正确的，我们预计Oct-1依赖基因在10月1日−/−和最小1Δ/Δ细胞。这对参与氧化应激反应的15个基因中的13个来说是正确的。乍一看，人们可能会认为结果的表型是相反的（即，如果氧化应激的易感性增加10月1日−/−细胞，将减少最小1Δ/Δ单元格）。然而，值得注意的是，对于其中六个基因，已经发表的证据表明，表达增加或减少都会增加氧化应激的易感性(). 值得注意的是，增加的Oct-1占有率、靶基因失调以及由此产生的表型是由Oct-1释放引起的，而不是其过度表达，因为10月1日基因本身在最小1Δ/Δ细胞与WT的比较（转录水平和蛋白质水平；).
众所周知，Oct-1对基因表达具有抑制和激活作用。氧化应激反应基因在10月1日−/−细胞主要在最小1Δ/Δ单元格()，表明在WT细胞中，Oct-1被层粘连蛋白B1螯合，因此具有八聚体序列的氧化应激反应基因以正常水平表达。在Lmnb1型Δ/Δ在细胞中，由于层粘连B1的隔离丢失，核质Oct-1水平较高，Oct-1从外围移动，与八聚体序列结合，并下调与氧化应激反应相关的靶基因，我们分别使用EMSA、ChIP和微阵列检测到这些靶基因。因此最小1Δ/Δ细胞具有高水平的活性氧，更容易受到氧化应激的影响。Oct-1抑制基因的其他例子是格纳尔基因(Cheng等人，2002年)血管细胞粘附分子1（Vcam1；dela Paz等人，2007年)，在最小1Δ/Δ细胞（折叠比分别为0.3和0.7）。
这个格纳尔基因提供了一个更有趣的见解。之前已经通过体外迁移率变化分析确定并确认了Oct-1结合位点(Cheng等人，2002年)，但我们的ChIP/qRT-PCR分析未能检测到该场地的入住率变化最小1Δ/Δ而所有其他测试点的10月1日入住率都有所增加。然而，MAPPER算法对该位点作为Oct-1结合位点的预测非常微弱，并且在启动子区域的其他地方预测了更强的Oct-1位点格纳尔(). 当我们使用设计用于检测这些额外预测的Oct-1位点的引物重复ChIP和qRT-PCR时，我们发现Oct-1在最小1Δ/Δ细胞。我们得出结论，WT和最小1Δ/Δ细胞使我们能够检测到同一启动子中不同Oct-1结合位点行为的细微差异。显示了1.22英寸范围内的现场占用率变化Csnb公司至2.85英寸Gpx3型，表明不同的Oct-1位点对Oct-1水平的相同增加有不同的反应。因为在EMSA中观察到短双工体上的结合增强，所以它们不能依赖于序列上下文和转录因子与相邻位点结合的空间效应。此外，由于这些差异仍然被ChIP检测到，它们不会被完整细胞核中更广泛序列环境中的转录因子结合所消除。
Oct-1也被认为是一些靶点表达的激活剂，如U6小核RNA和骨桥蛋白(Opn（操作）或Spp1型;Botquin等人，1998年;Remenyi等人，2002年)，在最小1Δ/Δ细胞（折叠比分别为1.7和10）。同样，这可以解释为Oct-1隔离的丧失和核质Oct-1的增加，核质Ock-1现在可以促进这些基因的转录。Imai等人（1997年）观察到人类间质胶原酶基因的上调伴随着细胞老化过程中核外周组织Oct-1的丢失。我们还观察到小鼠间质胶原酶基因上调百万像素13启动子区Oct-1结合序列的Oct-1占有率升高。
活性氧水平升高会导致与衰老相关的蛋白质、脂质和DNA的修饰（有关综述，请参阅芬克尔和霍尔布鲁克，2000年)这一过程也与核外壳组件中的缺陷有关。在正常老化过程中观察到核结构的变化(威尔逊，2005年;Scaffidi和Misteli，2006年)，延长使用寿命秀丽隐杆线虫与核膜完整性增加有关(Haithcock等人，2005年). 此外，编码核结构成分（如层粘连蛋白A）的基因突变与多种疾病有关，包括早衰症哈金森-吉尔福德早衰综合征(埃里克森等人，2003年). 动物模型和培养细胞中由核结构缺陷引起的一些异常可以通过法尼基转移酶抑制剂的治疗来逆转，该抑制剂通过使核结构正常化发挥作用(Glynn和Glover，2005年;Toth等人，2005年;Yang等人，2006年). 因此，有越来越多的证据表明，核结构和老化是相互关联的，受损的核结构可能在老化过程中发挥中心作用(Haithcock等人，2005年;威尔逊，2005年)尽管确切的机制尚待阐明。我们在本研究中的发现通过证明破坏层粘连蛋白B1和Oct-1之间的相互作用会导致氧化应激反应基因的整体下调和活性氧水平的升高，从而提高了我们对这一机制的理解，这两者都是正常衰老过程的标志。
材料和方法
细胞培养、构建和顺序核提取
Lamin B1 WT和Lmnb1型Δ/Δ细胞取自S.Young（加利福尼亚大学洛杉矶分校，加利福尼亚州洛杉矶）和M.Bergö（瑞典哥德堡Sahlgrenska心血管和代谢研究中心），而10月1日−/−细胞由D.Tantin（犹他大学，盐湖城，UT）提供。所有小鼠胚胎成纤维细胞在添加10%FCS的DME中培养，我-谷氨酰胺和非必需氨基酸。对于细胞存活分析，在200μM或2 mM h处理前24小时接种细胞2O（运行）2使用CellTiter-Blue细胞活性测定（Promega）或使用Neubauer血细胞仪（Thermo Fisher Scientific）手动对活细胞进行定量。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行DNA转染，而使用转染试剂（HiPerFect；QIAGEN）进行siRNA转染。所有实验均在转染后48小时进行。10月1日,最小1和对照siRNA购自Applied Biosystems。本研究中使用的全长GFP标记的层粘连B1已在前面描述过(Maske等人，2003年). 10月1日——EGFP施工由S.Murphy（英国牛津大学）提供。根据前面描述的方法改编了差异核提取Otto等人（2001）简而言之，将纯化的细胞核重新悬浮在核隔离缓冲液中（10 mM Hepes，pH 7.4，2 mM MgCl2、25 mM KCl、250 mM蔗糖、1 mM DTT和蛋白酶抑制剂鸡尾酒；Sigma-Aldrich），并以10μm振幅对两次5 s脉冲进行声波处理。不溶性材料在20000下造粒克在核提取缓冲液（20 mM Hepes，pH 7.4，1 M NaCl和蛋白酶抑制剂混合物）中重新悬浮5 min，并在室温下搅拌培养20 min。在连续提取中，使用含有2%Triton X-100和4 M及8 M尿素的核提取缓冲溶液重复提取。
知识产权
在完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）存在下，使用放射免疫分析裂解缓冲液对细胞进行裂解。使用蛋白G PLUS琼脂糖（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）对裂解液进行两次预处理，并使用山羊抗层粘连蛋白B1（Santa Cruz Bintechnologies，Inc.）在4°C下免疫沉淀过夜。使用蛋白G PLUS琼脂糖捕获IP复合物，使用Laemmli负载缓冲液洗脱，并使用抗层粘连蛋白B1（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、抗Oct-1（Santa Cruz Bietchnologies，Inc.）或驴抗羊HRP结合物（Jackson ImmunoResearch Laboratories）通过Western blotting进行分析。
RNA分离和基因表达分析
RNA分离、基因表达分析和验证已在前面描述过(Malhas等人，2007年). 幻灯片布局、培养条件、详细协议和主要提取数据文件的详细信息已提交给ArrayExpress（ArrayExpress登录号：。电子邮箱-538). 10月1日的数据集从GEO数据库下载，上传至BioArray软件环境(Saal等人，2002年)，并使用层粘连蛋白B1数据集进行所有比较分析。
为了计算两个实验中特定数量的基因发生改变的概率，使用了重复采样自举方法。具体来说，对于每个周期，从3080个常见基因的列表中随机抽取113个基因，生成集A，从同一个3080列表的生成集B中随机抽取1089个基因。然后，A和B中存在的基因数量(n个)已记录。500000次循环后n个绘制以给出概率分布直方图。概率分布如图S3所示。
免疫荧光标记和激光扫描显微镜
在室温下，将细胞固定在4%PFA和250 mM Hepes（pH 7.4）的冰上10分钟，以及8%PFA和250mM Hepes（pH为7.4）中50分钟。细胞在PBS中的25 mM甘氨酸中培养10分钟，用0.4%Triton X-100在PBS内渗透5分钟，并在室温下用0.4%鱼皮明胶在PBS里封闭30分钟。在室温下分别用一级和二级抗体孵育1小时。用伴刀豆球蛋白A–Alexa Fluor 633（Con A 633；Invitrogen）染色的细胞在室温下与100μg/ml Con A结合物孵育1h。使用的主要抗体为山羊抗层粘连蛋白B1、小鼠单克隆抗层粘稠蛋白B1（8D1；Maske等人，2003年)、兔抗Oct-1（Thermo Fisher Scientific）和鼠抗层粘连蛋白A/C（Novocastra）。使用的二级抗体是与Alexa Fluor 488、HRP、Cy3或Cy5结合的驴抗羊、抗鼠和抗兔（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。对于ROS检测，用PBS清洗细胞，用20μM H培养2DCFDA（EMD）在苯酚无红DME中放置30分钟，并用PBS清洗。所有成像均使用Axio成像仪上的显微镜（LSM 510 META；Carl Zeiss，Inc.）进行。Z1（卡尔蔡司公司），带63×NA 1.4油浸物镜。使用的激光线分别为405 nm、488 nm、543 nm和633 nm，以激发DAPI、Alexa Fluor 488、Cy3和Cy5或Alexa Fuor 633。使用以下滤光片检测荧光：碱基对420-480、碱基对505-530、碱基对560-615和长通650。使用MetaMorph（MDS Analytical Technologies）或图像浏览器（Carl Zeiss，Inc.）软件分析图像。
光漂白实验
FLIP的执行如前所述(Malhas等人，2007年)除了使用倒置显微镜（LSM 510 META）。简言之，感兴趣区域（ROI）在全激光功率下进行光漂白，而在其他地方以4%激光功率进行扫描。为了进行定量分析，减去背景强度，随着时间的推移测量光漂白区域外特定ROI的强度，并使用转染但未漂白细胞中的ROI强度进行归一化。
FRET公司
FRET使用受体光漂白方法(肯沃西，2001)用8D1免疫标记外周血层粘连蛋白B1后，以与Cy3结合的抗小鼠作为受体，Oct-1–EGFP作为供体。选择一个ROI，对供体和受体进行10次扫描（1.61μs/像素）。在100%激光功率下，用543-nm激光漂白ROI。随后进行扫描，以检测受体和供体强度的任何变化。FRET效率使用以下公式计算：100×（1−[Ib条/我一])，我在哪里b条和我一分别是漂白前后供体的强度。
炸薯条
细胞（～106每个最小1+/+和最小1Δ/Δ细胞）用1%甲醛固定10分钟，并在室温下用125 mM甘氨酸孵育5分钟。所有随后的洗涤和裂解步骤都是在完全蛋白酶抑制剂混合物（Roche）的存在下进行的。用冰冷的PBS洗涤细胞，刮去、沉淀并用10mM Tris、10mM NaCl和0.2%NP-40（pH 8）在冰上裂解10分钟。将细胞核沉淀并用核裂解缓冲液（50mM Tris、10mM EDTA和1%SDS，pH 8）在冰上裂解10分钟。对染色质进行超声处理以产生范围从300到1000bp的DNA片段，如电泳所证实的。将裂解液在ChIP稀释缓冲液中稀释10倍（20 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM EDTA和1%Triton X-100，pH 8），并保留1%作为输入样品。用鲑鱼精子DNA阻断蛋白G琼脂糖（Millipore）预处理裂解液，并在4°C下与4μG兔抗-Oct-1抗体孵育过夜，在4°C下与蛋白G琼脂孵育2小时。沉淀样品用低盐洗涤缓冲液（20 mM Tris、50 mM NaCl、2 mM EDTA、0.1%SDS和1%Triton X-100，pH值8）洗涤一次，用高盐洗涤缓冲溶液（500 mM NaCl的低盐缓冲液）洗涤一回，用氯化锂洗涤缓冲液洗涤两次（10 mM Tri、250 mM氯化锂、1 mM EDTA0.5%NP-40和0.5%SDS，pH值为8），使用Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris，pH 7.5和1 mM EDTA）进行两次。使用0.1 mM NaHCO洗脱蛋白质-DNA复合物三和1%十二烷基硫酸钠（也添加到输入样品中），并通过在65°C下加热过夜逆转交联。用40μg/ml蛋白酶K处理样品，通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀回收DNA。将所有免疫沉淀DNA样品重新悬浮在50μl的10 mM Tris-HCl中，pH值为8.5。
免疫沉淀DNA的qRT-PCR
qRT-PCR使用Rotor-Gene 3000（Corbett Research）和MESA GREEN qPCR MasterMix Plus进行SYBR分析（Eurogentec）。PCR混合物包含2μl免疫沉淀或输入样品，最终引物浓度为400 nM。使用2-ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen，2001年). C类t吨qRT-PCR的值使用输入样本的值进行归一化，并用于计算Oct-1结合的折叠富集最小1Δ/Δ细胞与WT细胞进行比较。
引物和寡核苷酸设计
的启动子序列（1000个碱基）路1,像素3,百万像素13,管理1、和Serping1号机组使用BioMart获得。MAPPER公司(Marinescu等人，2005年)用于识别这些序列中潜在的Oct-1结合位点，并使用Oligo Perfect Designer（Invitrogen）设计合适的qRT-PCR引物。用于检测的底漆Csnb公司和Actb公司已在前面描述过(Zhao等人，2004年;董和赵，2007). 由Invitrogen合成了FAM标记的寡核苷酸和对应于潜在Oct-1结合位点的互补寡核苷酸。将寡核苷酸在20 mM Tris-HCl、pH 8、50 mM NaCl和1 mM EDTA中退火，方法是将其加热至95°C 5分钟，并逐渐将温度（0.5°C/s）降低至22°C。表S1提供了Oct-1共有寡核苷酸和所有其他预测的Oct-1结合位点的序列（可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200804155/DC1).
EMSA公司
大约107使细胞在10mM Hepes、pH 7.9、1.5mM MgCl中膨胀2，10mM KCl、1mM DTT和0.5mM PMSF，并在冰上放置10分钟。将NP-40添加到0.3%的最终浓度，并将裂解物在冰上再放置20分钟。离心后，将所得沉淀重悬于20mM Hepes、pH 7.9、25%甘油、0.42M NaCl、1.5mM MgCl中2，1mM DTT和1mM PMSF，在4°C下持续搅拌孵育，并在16000下离心克培养20min，取上清液（核提取物）进行凝胶位移试验。将等量的核提取物（15μg）与FAM标记的寡核苷酸和多余的未标记的Oct-1共有寡核苷酸一起培养在EMSA结合缓冲液中（如适用）（最终浓度为10 mM Tris-HCl，pH 7.5，10%甘油，50 mM KCl，1 mM MgCl2、0.5 mM DTT和0.5 mM PMSF）在22°C下保持40分钟。反应混合物在含有8%非变性聚丙烯酰胺凝胶的0.5×三硼酸盐-EDTA中运行，并使用成像系统对凝胶进行拍照（VersaDoc MP3000；Bio-Read Laboratories）。
致谢
我们希望记录下我们对Stephen Young和Martin Bergo的感激之情，感谢他们在本研究和之前的研究中提供了WT和层粘连B1低形态转基因小鼠胚胎成纤维细胞(Maske等人，2003年;Malhas等人，2007年)S.Murphy博士提供了10月1日的EGFP构造，D.Tantin教授提供了WT和10月1日−/−细胞。我们感谢生物成像设施（威廉·邓恩爵士病理学院）和计算生物学研究小组（牛津大学医学部）在本项目中提供的服务。
这项工作由爱德华·彭利·阿布拉罕信托基金会和蒂姆和基特·坎普资助。A.N.Malhas是牛津大学林肯学院的肯普博士后研究员。
笔记
本文中使用的缩写：ChIP，染色质IP；电泳迁移率漂移分析；FLIP，光漂白中的荧光损失；FRET，荧光共振能量转移；免疫沉淀；MAPPER，调控元件位置和模式的多基因组分析；qRT-PCR，定量实时PCR；ROI，关注区域；活性氧；WT，野生型。
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