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临床投资杂志。2012年3月1日；122(3): 833–843.
2012年2月6日在线发布。 数字对象标识：2017年10月17日/JCI60256
预防性维修识别码：项目经理3287228
PMID：22307325

细胞周期蛋白D1的ChIP测序揭示了在小鼠染色体不稳定性中的转录作用

马修·卡西米罗,1 马克·克罗萨里奥尔,1 伊曼纽尔·洛罗,1 亚当·埃特尔,1,2 左人于,1 威廉·丹皮尔,三 伊丽莎白·萨里亚,4 亚历克斯·帕帕尼科劳,4 蒂莫西·斯坦尼克,1 李志平,1 王晨光同学,1 保罗·福蒂纳,1,2,5 桑卡·阿迪亚,1,2 艾丁·托泽伦,三 埃里克·克努森,1 安德鲁·阿诺德,4和理查德·佩塞尔1,5
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补充资料

摘要

肿瘤中的染色体不稳定（CIN）以染色体异常和基因表达特征改变为特征；然而，CIN的机制尚不清楚。CCND1号机组（编码细胞周期蛋白D1）在人类恶性肿瘤中过度表达，并已被证明在转录调控中发挥直接作用。在这里，我们使用全基因组ChIP测序，发现细胞周期蛋白D1的DNA结合形式占据了控制染色体完整性和线粒体生物发生的基因的调控区域。将cyclin D1添加回抄送1–/–小鼠胚胎成纤维细胞通过细胞周期蛋白D1的DNA结合形式和CIN基因表达的诱导，导致CIN基因调控区的占据。此外，通过光谱核型分析和免疫荧光，在细胞周期蛋白D1拯救的细胞中观察到染色体畸变增加、非整倍体和中心体异常。为了在体内评估细胞周期蛋白D1的作用，我们制作了具有急性和持续乳腺靶向细胞周期蛋白D表达的转基因小鼠。这些转基因小鼠表现出肿瘤发病率增加和标志性CIN基因图谱。此外，对2254例人类乳腺肿瘤的基因表达的研究表明，细胞周期蛋白D1的表达与管腔B型乳腺癌的CIN相关。这些数据表明，细胞周期蛋白D1通过直接调控调控染色体稳定性的转录程序，参与CIN和肿瘤发生。

介绍

肿瘤中的染色体不稳定性(1–三)以整条染色体（即非整倍体）的增加或丢失率升高和/或结构染色体畸变（即易位、缺失和重复）为特征。非整倍体是癌细胞和正常细胞之间最显著的差异之一。诱导CIN的分子机制以及CIN在肿瘤进展、侵袭和转移中的时机尚不清楚(4,5). 细胞周期相关因素与CIN有关，包括细胞周期蛋白E(6). CIN相关基因分子遗传特征的相对富集已用于量化CIN评分(7); 该特征包括AURKB（染色体乘客复合物[CCPC]的一个成分）、TOP2A、CENPP、MLF1IP（CENPA-NAC动粒复合物蛋白的一个组成部分）、ZW10（动粒相关有丝分裂检查点蛋白）和CKAP2（有丝分裂纺锤体相关蛋白）(三)以及视网膜母细胞瘤（pRb）蛋白。多余的中心体增加了1个姊妹动粒与2个纺锤极的双重附着频率。细胞周期蛋白E活性在S期开始时促进中心体复制。pRb的缺失也会改变中心体的数量和微核的形成，导致染色体的错误分离和非整倍体(8). CIN在肿瘤进展的相对早期发生，而pRb丢失在肿瘤发生的相对较晚，这就提出了在肿瘤发病早期驱动染色体畸变的候选机制的问题。

细胞周期蛋白D1(CCND1号机组)编码全酶的调节亚单位，磷酸化和灭活pRb和NRF1蛋白，以调节核DNA合成和线粒体生物发生(9–13). 定量单细胞分析表明，细胞周期蛋白D1水平在细胞周期中振荡，在G细胞周期中大量细胞类型增加2相位(14). 在人类乳腺、前列腺、肺和胃肠道恶性肿瘤中，细胞周期蛋白D1的表达增加了3到8倍(15–18). 此外，cyclin D1癌基因直接诱导小鼠乳腺肿瘤(19). 细胞周期蛋白D1是肿瘤依赖性生长所必需的，如小鼠的基因消融抄送1终末肺泡乳芽发育受损(20)并导致对Ras或ErbB2诱导的乳腺肿瘤发生和APC诱导的胃肠道肿瘤发生的抵抗(21,22). 在过去20年里，大量证据表明细胞周期蛋白D1在转录调控中起着直接作用(16). 细胞周期蛋白D1与ERα的转录活性有物理关联并调节其转录活性(23)以及30多种其他转录因子（TF）(16). 组蛋白乙酰转移酶p300、p300/CREB结合蛋白相关因子（P/CAF）和AlB1与细胞周期蛋白D1结合(24,25). ChIP在靶基因启动子的局部染色质内证明了细胞周期蛋白D1的结合，该结合与组蛋白（H3）的脱乙酰化相关，特别是在H3赖氨酸9（H3lys9）处。重新引入细胞周期蛋白D1后，H3lys9的脱乙酰化被恢复，该细胞周期蛋白D招募HDAC1/HDAC3(17,22). 因此，cyclin D1在局部染色质的背景下被招募到特定的靶基因(26,27). 细胞周期蛋白D1向局部染色质的募集也与p300的募集有关，p300调节控制DNA损伤修复信号的基因(26). 细胞周期蛋白D1独立于细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）结合功能调节p300的活性。由于p300被认为是一个转录协整因子，细胞周期蛋白D1被认为是通过与p300在靶DNA结合位点共占来调节基因转录的(26).

最近的研究表明，在含有约17000个基因的-5.5 kb至+2.5 kb ChIP-ChIP微阵列上，使用ChIP-Ch IP分析，在局部染色质的背景下，细胞周期蛋白D1的占有率(28). 此外，在蛋白质组学筛选中，细胞周期蛋白D1与p300相关的CREB结合蛋白（CBP）相关，并将CBP招募到槽口1调节其转录的基因。在这里，我们的目的是将对细胞周期蛋白D1 TF结合位点的查询扩展到整个基因组，并包括基因起始位点近端8 kb内外的潜在细胞周期蛋白D 1相互作用。因此，我们先对细胞周期蛋白D1进行ChIP，然后进行ChIP测序（ChIP-Seq），以高分辨率绘制与细胞周期蛋白D结合的整个基因组区域。通过对细胞周期蛋白D1结合的基因调控元件进行功能通路分析，发现调控染色体稳定性的基因富集。我们的数据表明，细胞周期蛋白D1通过直接调控调控染色体稳定性的转录程序，参与CIN和肿瘤发生。

结果

定义全基因组周期蛋白D1结合位点。

鉴于我们先前的发现，细胞周期蛋白D1在与p300募集相关的局部染色质中占据启动子调控区(17,26,29)，我们使用ChIP-Seq分析对cyclin D1基因组占有率进行了全基因组分析。为了表征全基因组周期蛋白D1结合位点，抄送1–/–用编码细胞周期蛋白D1的FLAG表位标记表达载体转导小鼠胚胎成纤维细胞(30). 获救细胞中细胞周期蛋白D1的外源性水平约为基础水平的3倍（补充图1A；本文在线提供的补充材料；doi：10.1172/JCI60256DS1号机组)，与在乳腺和其他肿瘤类型中观察到的细胞周期蛋白D1水平增加3至8倍一致(18,31). 为了在体内表征全基因组周期蛋白D1 DNA结合位点，使用Genpath's FactorPath发现技术进行了ChIP-Seq。我们发现2840个NCBI基因的间隔在起始位点的10kb以内。补充表1中给出了活性区域及其与NCBI设计基因的接近程度的总结。图​图1A1A显示了2840个结合位点相对于转录起始位点的全基因组分布。有趣的是，启动子内活性区域的峰值与10kb及以上的活性区域的值相当（图​（图1B），1B） 这表明cyclin D1定位于启动子近端元件和非常远的元件。对启动子近端区域标记密度分布的分析表明，在转录起始位点约500 bp范围内，细胞周期蛋白D1的占有率增加（补充图1、B和C）。

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细胞周期蛋白D1结合序列的鉴定。

(A类)2840个区间相对于相邻基因的分布。间隔被分为转录起始点（TSS）上游、基因内和TSS下游或基因下游。由于某些间隔具有1个以上的相关基因，因此有些间隔与1个以上术语相关。TSS上游被定义为–10000至0 bp。(B类)反FLAG中的峰值/CCND1号机组ChIP-Seq与IgG对照组比较。启动子区域内的峰值与转录起始点的10kb的峰值相似。ActRegs，活动区域。方框的边界表示SD；方框内的线表示平均值；晶须表示四分位范围；符号表示异常值。(C类)选择在与细胞周期蛋白D1相关的间隔区域内富集的保守TF基序的例子。TF的完整列表见补充表2。

为了确定富含细胞周期蛋白D1峰值间隔序列的TF结合位点，我们使用JASPAR Match服务器(32)，采用排列测试。仅处理转录起始位点2 kb内的间隔。图​图1C1C显示了最热门的TFs Ctcf（锌指蛋白；也称为CCCTC-结合因子）、Zfx（krueppel C2H2型锌指蛋白家族成员）、Sp1（属于Sp/KLF家族的TF）、Mizf（在组蛋白基因表达中起关键作用的锌指蛋白）的DNA识别序列和统计意义；也被称为Hinfp）、雌激素受体R1（Esr1；也称为ERα）、E2f1（E2F家族成员，转录激活许多参与细胞周期调节的基因）、Creb1（cAMP元素结合蛋白，通常通过激素刺激被cAMP激活）、，和Hif1α/Arnt（调节与缺氧应激有关的关键基因）。TF及其统计显著性的完整列表见补充表2。绘制了前20个TF的区间序列中TF基序的流行率（补充图1D）。接下来，我们询问在峰值间隔区域是否存在一致序列。我们使用完整的3222峰间隔数据集，并根据与最近邻转录起始位点的接近程度将数据分为4组。在3组中，该基序是CTCF不变核心序列的精确复制（补充图1E）。我们使用仅包含共有序列多聚体拷贝的萤光素酶报告构建体来验证细胞周期蛋白D1调节TF列表中几个成员（即Myc、E2F和Hif1α；补充图2）的转录活性。这些数据与一个模型一致，在该模型中，细胞周期蛋白D1在局部染色质的背景下被招募来调节基因转录，并占据与TF相关的DNA元素。

细胞周期蛋白D1结合调节染色体稳定性的基因。

使用NIH注释、可视化和综合发现数据库（DAVID）的注释聚类特征对功能通路进行无偏见的测定，结果表明细胞周期蛋白D1结合了RNA处理、线粒体功能、DNA组织和分离相关基因的调控区（图​（图2A）。2A） ●●●●。Bienvenu等人先前的工作，使用ChIP启动子阵列检测了大约1%的基因组，证明细胞周期蛋白D1与大约900个接近转录起始位点的基因相关(P（P）< 1 × 10–4; 裁判。26). 通过ChIP-Seq扩展以查询整个基因组的额外成分，显示出相当大的功能重叠，通过全球基因组分析确定了额外功能（补充图3）。

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细胞周期蛋白D1与参与有丝分裂的基因相关。

(A类)DAVID基于顶级点击的富集分数百分比对细胞周期蛋白D1相关基因进行功能注释聚类。(B类)细胞周期蛋白D1结合启动子区（0-500 bp）在基因中富集，表明与CIN相关(P（P）< 0.0001). (C类)细胞周期蛋白D1结合区的代表性标记密度分布及其与转录起始位点的接近程度（箭头所示）。间隔的峰值用星号表示。(D类)基于细胞周期蛋白D1相关基因选择的靶mRNA的定量PCR。所示为的规范化表达比率抄送1–/–带有MSCV-FLAG的细胞/CCND1号机组与MSCV控制相比(n个=4个独立的细胞系；数据为平均值±SEM）。(E类)ChIP分析抄送1–/–MSCV-FLAG转导的3T3细胞/CCND1号机组使用抗FLAG抗体。根据峰值间隔序列设计引物。

根据功能注释分析，存在大量与细胞分裂相关的基因集。我们进一步分析这些集合以提取相关基因；与基因本体（GO）术语相关的基因列表细胞分裂见补充表3。大多数基因与G有关2/M期和细胞有丝分裂。鉴于调控有丝分裂的基因数量众多，我们确定与细胞周期蛋白D1相关的基因组区域是否与CIN功能相关。当基因根据CIN评分排序时(7)，细胞周期蛋白D1占据的调控区域显著富集(P（P）< 0.0001; 图​图22B） ●●●●。

在M期，大多数有丝分裂基因参与染色质重组和染色体分离。图中描述了列表中几个成员的代表性标签密度曲线​图2C。2C.通过细胞周期蛋白D1的表达，编码调节染色体分离的蛋白质的转录物的相对丰度增加了约1.5至2倍，包括奥克布,Ckap2型,Mlf1ip公司、和Zw10型（图​（图2D）。2D） ●●●●。我们还对另外两个GO术语进行了定量RT-PCR：蛋白质分解代谢过程和RNA加工代表这些术语的基因的表达也受细胞周期蛋白D1调节（补充图4A）。此外，我们通过Western blot分析验证了Aurkb公司细胞周期蛋白D1大量增加（补充图4B）。细胞周期蛋白D1增加了Aurkb靶点H3S10的磷酸化(33,34). AURKB在前列腺癌、结直肠癌、肾癌、肺癌和乳腺癌等人类恶性肿瘤中过度表达(35)它的过度表达导致人类细胞中的多核和多倍体。使用相关和阴性对照引物集进行ChIP分析（图​（图2E2E和补充图4C）证实了ChIP-Seq数据，表明cyclin D1在参与调控染色体分离的基因的启动子区域的占有率（即。，奥克布,排名前2a,森普,Mlf1ip公司,Zw10型、和Ckap2型). 这些结果表明，细胞周期蛋白D1通过有丝分裂相关基因的转录调控参与CIN。

细胞周期蛋白D1促进CIN。

染色体分离和稳定性相关基因的cyclin D1依赖性富集使我们使用cyclin D 1表达谱、荧光激活细胞分选（FACS）分析和光谱核型分析（SKY）来确定功能后果。我们首先使用先前发布的cyclin D1表达谱来确定CIN谱的富集程度。利用细胞周期蛋白D1逆转录病毒诱导CIN相关基因表达诱导MEF中细胞周期蛋白D_1表达(P（P）< 0.0001; 图​图3A）。三A） ●●●●。接下来，我们通过将细胞周期蛋白D1重新引入到抄送1–/–细胞（在此称为cyclin D1救援过程）。多倍体细胞的比例在3次细胞分裂内增加，4N和8N细胞的相对比例分别增加45%和15%（图​（图3，三、B和C）。使用SKY，我们分析了20个细胞周期蛋白D1的中期传播-挽救与对照抄送1–/–单元格（图​（图3，三、D和E以及补充图5、A和B）。所有20个中期染色体核型分析的图示如图所示​图3F。三F.由于小鼠成纤维细胞在培养中连续传代时容易出现基因组不稳定，因此2N和4N时±2条染色体的偏差被认为是正常的。根据这个标准，75%的抄送1–/–MEF中期的染色体组型正常，而cyclin D1中有30%被挽救抄送1–/–中小企业基金(P（P）< 0.001). 与非整倍体一样明显的是在拯救的细胞周期蛋白D1中观察到的染色体畸变数量抄送1–/–行。SKY识别的缺陷被指定为缺失、重复和移位。与对照组相比，被拯救的细胞周期蛋白D1的易位率显著增加抄送1–/–MEF（图​（图3G），三G） ，尽管在缺失和重复方面没有发现显著差异（补充图6，A和B）。最常见的是非互惠易位（NRT）和互惠易位，后者出现在分析的20个中期中的7个。核型分析表明，NRT在人类癌症中占主导地位，并通过在癌基因断点携带癌基因和扭曲正常基因剂量而促进致癌(36). 周期蛋白D1–获救序列中的NRT数量为13次，而对照组为3次。补充表4中给出了重新安排的完整列表。我们还进行了3T3控制和cyclin D1获救的天空分析抄送1–/–第23代的细胞（P23），以确定晚传代细胞中是否存在异常核型（图​（图3，三、H和I以及补充图5、C和D）。尽管控制抄送1–/–细胞表现出明显高于低通径细胞的多倍体抄送1–/–在MEFs中，细胞周期蛋白D1的挽救率更高抄送1–/–单元格(P（P）= 0.05; 图​图3J）。三J） ●●●●。此外，有更多的相互易位和NRT（图​（图3K），三K） ，两行之间的删除和重复事件几乎没有差异（补充图6、C和D）。综上所述，这些数据表明抄送1–/–MEF诱导CIN的NRT率较高。

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Cyclin D1救援抄送1–/–MEF诱导多倍体和非整倍体。

(A类)细胞周期蛋白D1诱导基因的表达谱(63)因CIN得分高而丰富(P（P）< 0.0001). (B类)PI染色显示细胞周期蛋白D1的多倍体增加——与对照组相比，被挽救抄送1–/–MEF公司。(C类)基于3个独立细胞系的PI染色定量（平均值±SEM）*P（P）< 0.005. (D类,E类,H（H）、和我)来自天空控制和细胞周期蛋白D1的代表性中期-已获救抄送1–/–第6页的MEF(D类和E类)P23和3T3细胞(H（H）和我). 每个图都显示了中期的反向DAPI图像（右上角）、中期的原始光谱图像（左上角）和相同中期的分类（下角）。(F类和J型)中期染色体数目从对照组和细胞周期蛋白D1扩散到挽救组抄送1–/–第6页的MEF(F类)P23和3T3细胞(J型)显示了20次有丝分裂扩散的染色体总数。灰色阴影表示2N和4N（±2条染色体）与正常值的预期偏差。P（P）<0.001，抢救与控制，χ2关联测试。(克和K（K）)中期的相互易位和NRT从对照组和细胞周期蛋白D1中传播-挽救抄送1–/–第6页的MEF(克)P23和3T3细胞(K（K）)，显示为所分析的每个单元格的事件数。平均分布用红色曲线表示。

多极纺锤体和中心体扩增在细胞周期蛋白D1中占主导地位——拯救的Ccnd1–/–细胞。

为了筛查有丝分裂中可能导致CIN的潜在异常，我们对3T3对照组和cyclin D1拯救组进行了免疫荧光和高分辨率共焦成像抄送1–/–使用有丝分裂纺锤体和中心体标记物（分别为α-和γ-微管蛋白）的细胞。与对照组相比，细胞周期蛋白D1中具有多极纺锤体的细胞数量增加了27%–得到挽救抄送1–/–单元格(P（P）= 0.0289; 图​图4，4、A和B）。由于多极纺锤体由中心体数量和分布的异常引起，我们将γ-微管蛋白和α-微管素染色细胞，以量化中心体的数量。与对照组相比，拯救的细胞周期蛋白D1中含有2个以上中心体的前中期/中期细胞的百分比增加了19%抄送1–/–单元格(P（P）= 0.0289; 图​图4，4、C和D）。cyclin D1的纺锤结构明显异常-已获救抄送1–/–细胞，导致多极纺锤波从前期持续到中期，中期未能结合（图​（图4D）。4D） ●●●●。DAPI染色检测到纺锤体结构的改变与中期板形态的破坏有关（图​（图4E）。4E） ●●●●。在同一样品中测量中期板和纺锤的宽度和长度；与纺锤体和中心体异常的增加相一致，cyclin D1–rescured中的板宽和纺锤体长度显著增加抄送1–/–单元格(P（P）=0.0087和P（P）分别=0.0486；图​图4，4、E和F）。与对照组相比，在拯救的细胞周期蛋白D1中也观察到滞后染色体、后期桥和微核抄送1–/–单元格（补充图7）。这些结果表明中心体扩增的发生率增加，导致有丝分裂纺锤体异常。

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细胞周期蛋白D1诱导中心体扩增和有丝分裂纺锤体紊乱。

(A类和C类)有丝分裂细胞的典型共焦最大Z投影(A类; α-微管蛋白（紫色）和DAPI（蓝色）的免疫染色以及前期、中期和中期(C类; 对照组和拯救的细胞周期蛋白D1的α-微管蛋白[紫色]、γ-微管素[黄色]和DAPI[蓝色和插图]免疫染色抄送1–/–细胞。原始放大倍数，×60 NA1.4油物镜，数字变焦放大×5。比例尺：5μm。(B类和D类)具有多个极性纺锤体的有丝分裂细胞的频率(B类)具有多个中心体（γ-微管蛋白）和纺锤体紊乱（α-微管素）的前中期/中期细胞(D类). *P（P）= 0.0289, χ2分析。黑条，中心体计数异常（即>2）；灰色条，正常计数（即2）。(E类和F类)中期控制和细胞周期蛋白D1最大Z投影的主轴测量抄送1–/–细胞。数据为平均值±SEM。插图显示了中期板（即染色质；Ch）的宽度和长度（使用DAPI染色测量）以及纺锤（Sp）的长度和宽度（使用微管蛋白染色测量）*P（P）= 0.0486; **P（P）= 0.0087.

细胞周期蛋白D1促进CIN在体内的表达谱。

为了直接评估细胞周期蛋白D1在促进CIN中的作用，我们建立了转基因小鼠乳腺模型，使用四环素诱导系统或MMTV-细胞周期蛋白D_1系统在乳腺中急性表达细胞周期蛋白。对于tet诱导的转基因小鼠（与CCND1号机组转基因/CCND1号机组]; 补充图8A），RT-PCR分析和蛋白质印迹表明，细胞周期蛋白D1的表达水平是通过四环素诱导的（补充图8，B和C）。为了检测cyclin D1在乳腺中诱导的表达谱，我们用四环素治疗小鼠7天，然后进行微阵列分析，以比较cyclin D2转基因小鼠和接受相同四环素方案的rtTA阳性对照小鼠（图​（图5A）。5A） ●●●●。然后，我们将这两组差异最大的基因（即Fold>4和差异基因表达的对数比值比大于3[B>3]）与CIN特征基因集进行比较，发现rtTA/CCDN1号机组CIN基因图谱丰富(P（P）< 0.001; 图​图5B）。5B） ●●●●。通过FLAG标记的细胞周期蛋白D1的Northern印迹和Western印迹（补充图8E）证实MMTV-cyclin D1转基因（补充图8 D）。女性MMTV-CCND1号机组每周监测两次WT小鼠可触及肿瘤的发展情况。那些出现可触及肿瘤的患者在肿瘤检测后一周内被处死。在MMTV之间进行了Kaplan-Meier生存率和肿瘤发病率曲线图，并进行了曲线比较的log-rank检验分析-CCND1号机组和WT管线（补充图8F）。MMTV的第一例肿瘤发病发生在400天左右-CCND1号机组小鼠，而WT小鼠在这个年龄段没有肿瘤。在760天时，MMTV中的无瘤部分-CCND1号机组该组为42%，而WT组为85%(P（P）= 0.0018). 还评估了正常乳腺上皮细胞中细胞周期蛋白D1的相对丰度，发现其与人类乳腺癌样本中细胞周期素D1的增加水平一致（补充图8G和参考文献。31).

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热图显示转基因小鼠模型中细胞周期蛋白D1差异调节的基因。

(A类)rtTA之间差异调节的基因/CCND1号机组肿瘤(n个=3）和来自rtTA对照小鼠的正常小鼠乳腺(n个=2），通过层次聚类可视化(B类)rtTA中CIN的差异调节基因（Fold>2，B>3）最多/CCND1号机组配置文件(P（P）< 0.0001). (C类)MMTV之间差异调节的基因-CCND1号机组–诱发肿瘤(n个=3）和正常小鼠乳腺(n个=2），通过层次聚类可视化(D类)MMTV中CIN的差异调节最大的基因（Fold>2，B>4）富集-CCND1号机组配置文件(P（P）< 0.0001).

确定MMTV调节的基因-CCND1号机组，对年龄匹配小鼠的肿瘤进行微阵列分析，并与WT（FVB）小鼠的乳腺进行比较（图​（图5C）。5C） ●●●●。然后，我们将这两组差异最大的基因（即Fold>4和B>3）与CIN特征基因集进行比较，发现MMTV-CCND1号机组CIN需要丰富的基因图谱(P（P）< 0.0001; 图​图5D）。5D） ●●●●。综上所述，这些数据表明，细胞周期蛋白D1在急性诱导或小鼠乳腺上皮长期表达时诱导CIN评分增加。

细胞周期蛋白D1高表达与B型腔型乳腺癌CIN相关。

为了分析CIN和cyclin D1表达在乳腺癌中的相关性，我们将70个CIN得分最高的基因集的表达与从公共微阵列数据库中收集的2254个乳腺癌样本进行比对(37). 我们根据先前描述的乳腺癌亚型对样本进行分层(38)并将其与数据集中的cyclin D1表达谱对齐。细胞周期蛋白D1、CIN和管腔B亚型之间存在显著相关性(P（P）< 1 × 10–10; 图​图6A）。6A） ●●●●。散点图描绘CCND1号机组转录水平与平均CIN特征表达水平的对比表明，这些表达水平之间的关系是乳腺肿瘤亚型特异性的（图​（图6B）。6B） ●●●●。Kaplan-Meier图显示了该数据集中无转移生存率的差异（图​（图6C）。6C） ●●●●。我们得出结论，患有管腔B型乳腺癌的个体CIN表达水平升高，这与高cyclin D1表达相关。

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乳腺癌微阵列样本的亚型分类。

(A类)热图描绘了来自5种乳腺癌基因表达亚型的联合乳腺癌微阵列数据集的样本。预测的ESR1、表皮生长因子受体（ERBB2）和孕酮受体（PGR）状态与CIN特征评分和CCND1号机组5种亚型的表达水平。概述了管腔B亚型受体状态、CIN特征评分和细胞周期蛋白D1的表达水平。(B类)CCND1号机组转录水平与平均CIN标志性表达水平的对比显示，CIN评分高和cyclin D1表达高之间的关系是管腔B亚型特异性的（红圈）。(C类)Kaplan-Meier图显示了该数据集中无转移状态的差异(P（P）= 6.4462 × 10–8).

讨论

我们目前的研究结果表明，细胞周期蛋白D1诱导CIN。细胞周期蛋白D1诱导的基因表达谱是CIN在成纤维细胞、乳腺和细胞周期蛋白D2诱导的乳腺肿瘤中的特征。周期蛋白D1在乳腺中7天内的瞬时表达足以诱导CIN基因表达。SKY分析证实细胞周期蛋白D1的表达可诱导非整倍体和多倍体抄送1–/–MEF公司。免疫荧光显示出现了形成多极纺锤体的多余中心体。通过对CIN相关基因相对丰度的仔细分析，确定了一组调节G2/M检查点和有丝分裂。定量PCR证实，细胞周期蛋白D1的表达增加了这些基因的相对丰度。细胞周期蛋白D1诱导CIN的发现很重要，因为CIN是肿瘤发生的早期特征，可能先于肿瘤抑制因子的丢失(39,40). 先前的研究表明，细胞周期蛋白E而不是细胞周期蛋白D1能够诱导CIN(6). 然而，cyclin D1的过度表达与小鼠肝细胞的非整倍体、多余中心体和纺锤体缺陷相关(41)淋巴肿瘤中有非整倍体和多倍体(42). 此外，膀胱癌中cyclin D1扩增与中心体扩增相关(43). 由于细胞周期蛋白D1在肿瘤发生的早期表达增加，细胞周期蛋白D_1可能是肿瘤中CIN的重要诱导剂。

对临床样本进行分子遗传分型分析，确定CIN特征与cyclin D1过度表达和管腔型B乳腺癌的相关性。该基因亚型中CIN的存在与不良预后相关。以往研究检测细胞周期蛋白D1在预后中的作用，得出了相互矛盾的结果，一些研究表明细胞周期蛋白D_1表达与预后呈正相关，另一些研究表明生存率降低(16,44,45). 细胞周期蛋白D1水平在管腔A和B亚型中诱导，但与管腔B亚型的CIN相关。启动细胞死亡信号的细胞通常对CIN耐受性较差。由于管腔A和管腔B乳腺癌亚型具有不同的分子遗传特征，管腔B肿瘤中可能存在额外的遗传变化，从而使基因组不稳定的细胞得以存活。很可能，正如当前研究中所进行的那样，遗传亚类化在确定cyclin D1过度表达的临床意义方面很重要。针对CIN的药物的最新鉴定(46,47)可能为治疗性基质化提供合理依据，补充靶向B型乳腺癌管腔CIN的化合物。

在这里，我们使用ChIP-Seq分析在局部染色质的背景下对细胞周期蛋白D1结合进行了全基因组分析。我们之前的研究表明，在局部染色质向TF结合位点的背景下，细胞周期蛋白D1的募集与SUV39H1和HP1α的募集以及相应的H3lys9乙酰化减少和三甲基化增加有关(17,26). ChIP-ChIP随后的研究涵盖了启动子子集的-5.5至+2.5 kb，类似地确定了cyclin D1向主要参与notch信号和细胞增殖的靶基因子集的募集(28).

细胞周期蛋白D1如何在局部染色质的背景下调节基因表达？虽然尚未确定细胞周期蛋白D1的内在DNA序列特异性结合，但已在局部染色质背景下的受损DNA位点确定了细胞周期蛋白D_1(48,49). 在IP–Western blot分析中，各种TF与细胞周期蛋白D1相关，而细胞周期蛋白D_1的丰度可以调节TF的募集(22)和转录协同调节剂(26,29)ChIP分析中的局部染色质。鉴于这些发现，我们提出细胞周期蛋白D1通过序列特异性结合蛋白被招募到DNA中以调节基因表达，或通过Rad51和相关修复复合体被招募到受损DNA中，从而招募BRCA蛋白(29,48). 细胞周期蛋白D1的丰度决定ChIP测定中共整合蛋白和染色质重塑蛋白的募集，包括p300/CBP(26,29)、SUV39H1、HP1α和HDAC1/3(17)，并指示局部组蛋白（例如H3和H4）的乙酰化和二甲基化。允许在给定条件下组装与细胞周期蛋白D1相关联的协整调节复合体的机制顺式元素仍有待确定。先前使用细胞周期蛋白D1和p300敲除小鼠的研究表明，在控制DNA复制保真度的基因（如MCM3、MCM4和RfCH）的情况下，它们的丰度由细胞周期蛋白D1诱导，并由p300相互调节，这与先前的发现一致，即细胞周期蛋白D1抑制p300自乙酰化(26). 尽管TFs和协整因子活性的调节独立于cdk结合域，但细胞周期蛋白D1 cdk结合结构域在体内调节CIN信号中的作用仍有待确定。

目前的研究确定了顺式细胞周期蛋白D1所占据的元素，部分原因是这里对基因组进行了不同的询问。目前的研究检查了非编码和编码DNA以及转录起始位点远端的位点，并确定了细胞周期蛋白D1占据CTCF结合因子位点的倾向。CTCF在染色质重组中的作用和作为增强剂绝缘体的作用(50). 有趣的是，凝集素复合物与CTCF相互作用，它对姐妹染色单体的分离很重要，姐妹染色单体经周期蛋白D1依赖性方式改变。体内大部分CTCF位点也发现了凝集素复合物(51,52). 由于CTCF是一种染色质重组子，并有可能通过凝集素复合体发挥双向作用，因此确定细胞周期蛋白D1在调控CTCF依赖性全局转录中的相对重要性将是有意义的。

方法

有关更多信息，请参阅补充方法。

细胞培养、细胞系和转基因小鼠。

先前描述了MSCV-IRES-GFP逆转录病毒载体和细胞周期蛋白D1野生型构建体(53).抄送1+/+和抄送1–/–如前所述制备原代MEF培养物(54). 细胞保存在补充有10%胎牛血清和100μg/ml青霉素和链霉素的DMEM中。

逆转录病毒的产生和感染。

逆转录病毒的产生和感染抄送1–/–MEF在前面有详细描述(53). FACS分类（FACStar Plus；BD Biosciences）GFP+细胞用于随后的分析。

ChIP-Seq分析和TF富集。

Genpathway的FactorPath方法如Labhart等人所述(55). 基因库使用Genome Analyzer II测序，并使用Eland（Illumina）与小鼠基因组对齐。使用Jasper服务器对ChIP-Seq层段进行TF富集。

蛋白质印迹和荧光素酶分析。

如前所述，对全细胞裂解物或均质组织裂解物（50μg）进行蛋白质印迹(56). 以下抗体用于蛋白质印迹：鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂（GDI；参考文献。57)、cyclin D1（目录号MS-210-P；NeoMarkers）、FLAG-tagged M2（目录编号F1804；Sigma-Aldrich）、β-微管蛋白（目录号T4026；Sigma-Aldrich）、Aurkb（别名AIM-1，目录号611082；BD Biosciences）、phospho-H3S10（目录号06-570；Millipore）和GAPDH（目录号FL-335；Santa Cruz Biotechnology Inc.）。如前所述进行荧光素酶分析(58). 使用50、100或150 ng质粒DNA和200 ng报告基因获得了细胞周期蛋白D1的剂量依赖性。

ChIP测定。

ChIP材料是根据麦格纳ChIP（密理博）制造商指南制备的。简单地说，3-cm×10-cm板是活跃生长的晚消息MEF(抄送1–/–MSCV-IRESD1）用37%多聚甲醛（最终浓度为1%）固定10分钟。未反应的甲醛用1毫升10×甘氨酸猝灭。用冰镇PBS将这三个盘子清洗两次，然后在1 ml PBS中用蛋白酶抑制剂鸡尾酒收集小球，并将其混合在15 ml试管中，以获得1.5×106细胞。使用OMNI-Ruptor 4000（OMNI International Inc）以最大速度进行35次20秒的超声波处理，以实现微丸的DNA片段化。IP采用10μg FLAG-标记M2抗体（Sigma-Aldrich）和等量的小鼠IgG作为阴性对照。根据Magna ChIP协议（Millipore）对IP DNA进行清洗和洗脱。根据与细胞周期蛋白D1相关的峰间隔序列设计PCR引物（补充图5），并通过琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物。

PI染色。

1 × 106随机循环的细胞在PBS中清洗，并在70%乙醇中固定过夜。RNase A（10 mg/ml）在室温下处理30分钟，清洗并用PI（20μg/ml）染色。使用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences）测量PI染色。

实时PCR。

根据制造商指南，使用Power SYBR Green（AB Biosciences）在安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技）中进行RNA定量。逆转录反应中使用了等量的RNA。所有基因的引物（补充图5）均使用GenScript的生物信息学工具（GenScript）设计。

天空。

天空是按照前面所述进行的(59). 简单地说，罗丹明、得克萨斯红、Cy5、FITC和Cy5.5染色的染色体的荧光彩色图像是在配备有光谱立方体和干涉仪模块的尼康显微镜下拍摄的。使用SKY View软件（1.62版）分析染色体数量和结构变化，包括简单平衡易位、不平衡易位（即NRT）、缺失和重复。每个样本至少分析20个中期。

微阵列分析。

Affymetrix Expression Console 1.1或带有limma包的R统计控制台用于计算小鼠基因1.0 ST微阵列和小鼠430A 2.0微阵列的稳健多芯片平均（RMA）表达值。微阵列数据已保存在GEO（登录号：。GSE35076标准; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE35076标准). 探测集簇的核心集与2009年12月发布的注释版本na30一起使用。将数据集导入Matlab版本R2010b（The Mathworks），并使用单向方差分析评估生物条件之间差异表达的重要性。差异表达基因P（P）数值为0.01或更低，绝对折叠变化为1.25或更大，使用聚类图热图进行聚类和可视化。

公共微阵列数据集内的分析。

一个乳腺癌微阵列数据集，该数据集之前是从公共存储库基因表达综合库中编译的(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/; 裁判。60)和ArrayExpress(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/; 裁判。61)用于评估CIN和CCND1号机组临床样本中转录水平的表达(37).

免疫荧光和共焦分析。

按照Silkworth等人之前的描述进行免疫荧光检测(62).

统计。

为了确定ChIP-Seq峰的数量，使用了MAC算法（4.35%的错误发现率）。使用排列测试计算ChIP-Seq数据产生的区间序列中TF富集分析。采用Wilcoxon配对试验比较两组CIN高评分基因的富集情况。采用对数秩和检验对Kaplan-Meier曲线进行比较。使用χ评估cyclin D1表达与CIN的相关性2测试。对于两个独立组之间的比较，双尾学生t吨使用了测试。A类P（P）值小于0.05被认为是显著的。

研究批准。

托马斯·杰斐逊大学动物护理和使用机构委员会批准了本文所述的小鼠研究方案。

补充材料

补充数据：
单击此处查看。（1.9M，pdf格式）

致谢

这项工作得到了Susan Komen乳腺癌基金会BCTR0504227（给C.Wang）和PDF2000167（给A.Arnold）的部分支持；NIH授予R01CA70896、R01CA75503和R01CA86072（给R.G.Pestell）、R01CAS55909（给A.Arnold）和R01CAS12934（给E.S.Knudsen）；中国奖学金委员会；宾夕法尼亚州卫生部拨款（给C.Wang和R.G.Pestell）；以及默里-海利格分子医学基金会（致A.Arnold）。Kimmel癌症中心的工作得到了NIH癌症中心核心拨款P30CA56036（给R.G.Pestell）的支持。宾夕法尼亚州卫生部明确否认对任何分析、解释或结论负责。

脚注

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

本文引文： 临床研究杂志. 2012;122(3):833–843. doi:10.1172/JCI60256。

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文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会