全基因组测序揭示复发性急性髓细胞白血病的克隆进化

总结

结果

为了研究与AML复发相关的遗传变化，并确定克隆进化是否有助于复发，我们对8例患者的原发性肿瘤复发对和匹配皮肤样本进行了全基因组测序，其中包括UPN 933124，他们的原发肿瘤突变以前曾有报道^三根据华盛顿大学医学院机构审查委员会批准的方案，所有患者均获得明确的全基因组测序知情同意。每个样本的单倍体覆盖率>25倍，二倍体覆盖度>97%(补充表1和补充信息). 这些患者来自五种不同的法美白血型（FAB），从最初诊断到复发的时间间隔为235到961天(补充表2a和2b).

确定了原发肿瘤和复发基因组中的候选体细胞事件^4,5并选择使用中描述的方法进行基于杂交捕获的验证补充信息.从皮肤（匹配的正常组织）、原发肿瘤和复发肿瘤标本中捕获的靶DNA的深度测序⁶(补充表3)产生了每个位点590倍覆盖率的中位数。每个病例的平均突变和结构变异数为539（范围118-1292）(图1a).

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图1

8例急性髓细胞白血病原发肿瘤和复发对捕获验证靶点的深度测序量化体细胞突变

a） 8例病例中检测到的1-3级突变汇总。所有显示的突变均通过捕获和深度测序进行验证。共享突变以灰色表示，原发肿瘤特异性突变以紫色表示，复发特异性突变则以红色表示。浅灰色矩形上方显示了每个病例的1-3级突变总数。b） 原发肿瘤和UPN 933124复发病例中1-3级经验证突变的突变等位基因频率分布（左）。通过454次深度重新计数实验获得了5种原发性肿瘤特异性突变的突变等位基因频率。在原发肿瘤中发现了四个突变簇，在复发时发现了一个突变簇。聚类分析排除了已知拷贝数可变区的五个低水平突变。AML反复突变基因的非同义突变如图所示。5簇突变的突变等位基因频率在原发肿瘤和复发之间的变化如图（右）所示。c） 在来自另外7名AML患者的原发性肿瘤和复发样本中检测到的突变簇。原发肿瘤和复发样本中的簇之间的关系由连接它们的线表示。簇：一组具有相似等位基因频率的突变，可能来自同一克隆。克隆：一组突变内容相同的细胞。

复发分析的一般方法以第一例序列病例（UPN 933124）为例。共验证了第1级至第3级的413起躯体事件（参见Mardis等。⁷用于层级指定；补充图1a，补充表4a和5). 其中78个突变是复发特异性的（63个点突变、1个二核苷酸突变、13个indels和1个易位；复发特异性标准描述于补充信息和所示补充图1b)，5个点突变是原发肿瘤特异性的，330个点突变（317个点突变和13个indels）在原发肿瘤和复发样本之间共享(图1a、图1b、和补充图2). 该病例的皮肤样本被白血病细胞污染（储存皮肤样本时，外周血白细胞计数为105000个/mm3），皮肤样本中估计肿瘤含量为29%(补充信息). 除了最初报告的原发肿瘤样本的10个体细胞非同义突变外^三，我们发现了一个在原始分析中未检测到的缺失(DNMT3A型L723英尺⁸)三个错义突变之前被错误归类为种系事件(SMC3公司G662C，PDXDC1系列E421K，以及TTN公司E14263K）(图1b,表1,和 补充表4b).

在这8名患者中，共发现169个1级编码突变（每例约21个）(表1,补充表4b和6)其中19例为复发特异性。除了已知AML基因突变外，如DNMT3A型⁸,飞行时间3⁹,NPM1型¹⁰,印尼盾1⁷,IDH2公司¹¹,工作任务1¹²,运行NX1^13,14,PTPRT公司^三,六年级¹⁵、和ETV6发动机¹⁶在这8名患者中，我们还发现了新的复发性突变WAC公司,SMC3公司,DIS3（配电盘3）,DDX41型、和DAXX公司作为癌症基因组图谱AML项目的一部分，对200例AML患者的外显子进行了测序(表1,补充表4b和补充图3; T.J.Ley、R.K.Wilson和AML癌症基因组图谱工作组，未出版）。有关新的复发突变的详细信息，请参阅补充信息,表1,补充表4b和7以及补充图3和4.

结构变体的结构和功能分析见补充信息（补充图5-10和补充表2、8和9）.

高深度测序数据的生成使我们能够准确量化所有病例中的突变等位基因频率，从而可以估计每个AML样本中肿瘤克隆群体的大小。根据突变聚类结果，我们推断了AML1/UPN 933124原发肿瘤中具有不同突变集（簇）的四个克隆的身份(补充信息). 簇1至簇4在原发肿瘤中的突变等位基因中位数频率分别为46.86%、24.89%、16.00%和2.39%(图1b和补充表5c). 克隆1是包含簇1突变的“基础”克隆（即其他子克隆是从中衍生出来的）；假设几乎所有这些突变都是杂合的，那么在肿瘤出现和复发时，它们必须存在于几乎所有的肿瘤细胞中，因为这些突变的变异频率约为40-50%。克隆2（有簇2突变）和克隆3（有簇3突变）必须从克隆1衍生而来，因为样本中的几乎所有细胞都含有簇1突变(图2a). 克隆3中的单个细胞很可能获得一组突变（簇4），形成克隆4：这些细胞在化疗后存活下来，并在复发时进化成为优势克隆。我们不知道是否有簇4突变导致化疗耐药；虽然没有一个具有翻译结果，但我们不能排除该集群中存在相关的调控突变。

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图2

UPN 933124中从原发肿瘤到复发的克隆进化的图形表示，以及在8个原发肿瘤和复发对中观察到的肿瘤进化模式

a） UPN 933124原发肿瘤中的创始克隆包含DNMT3A型,NPM1型,PTPRT公司,SMC3，和飞行T3这些都是AML的复发性疾病，可能与发病机制有关；创始克隆中的一个子克隆通过获得额外的突变（包括复发突变）进化为复发时的优势克隆ETV6和MYO18B，和aWNK1-WAC系列融合基因。HSC：造血干细胞。b） AML肿瘤演化的两种主要模式的例子：模型1显示原发肿瘤中的优势克隆通过获得复发特异性突变进化为复发克隆；在3对原发性肿瘤和复发配对（UPN 804168、573988和400220）中发现了这种模式。模型2显示，携带绝大多数原发肿瘤突变的小克隆存活并在复发时扩大。在5个原发肿瘤和复发对中观察到这种模式（UPNs 933124、452198、758168、426980和869586）。

假设在原发肿瘤样本中检测到的所有突变都是杂合的（原发骨髓样本的恶性细胞含量为93.72%，参见补充信息)，我们能够计算出每个克隆中恶性细胞总数的比例。克隆1是创始克隆；12.74%的肿瘤细胞仅包含这组突变。克隆2、3和4是从克隆1进化而来的。克隆2和克隆3中的额外突变可能提供了生长或生存优势，因为分别有53.12%和29.04%的肿瘤细胞属于这些克隆。只有5.10%的肿瘤细胞来自克隆4，表明它可能是最后出现的(图2a). 然而，复发克隆是从克隆4进化而来的。在复发样本中检测到一个包含所有簇5突变的克隆；克隆5从克隆4进化而来，但在第170天取样后获得78个新的体细胞变化。由于克隆5中的所有突变似乎都存在于所有复发肿瘤细胞中，我们怀疑该克隆中的一个或多个突变提供了强大的选择性优势，有助于复发。这个ETV6发动机突变2018亿令吉突变，和/或WNK1-WAC系列融合是最有可能的选择，因为ETV6发动机,2018亿令吉、和WAC公司在AML中反复突变。

我们通过使用核密度估计（KDE）评估等位基因频率峰值来评估另外7个原发性肿瘤复发对中的突变簇(补充图11和补充信息). 因此，我们推断了每个原发性肿瘤和复发样本中克隆的数量和恶性部分。与UPN 933124类似，4名患者的每个原发肿瘤中都存在多个突变簇（2-4）（UPN:869586、426980、452198和758168）。然而，在其他3名患者的原发性肿瘤中仅检测到一个主要簇（UPN:804168、573988和400220）(图1c 和 补充表10). 重要的是，尽管复发样本中的簇数不同，但所有8名患者都获得了复发特异性突变(图1).

复发时检测到两种主要的克隆进化模式(图2b 和 补充图3)：在模式1的病例中，原发肿瘤中的显性克隆获得了额外的突变，并进化为复发克隆（UPNs：804168、573988和400220）。这些患者可能只是治疗不充分（例如，不能耐受侵袭性巩固的老年患者，如UPN 573988），或者他们的创始克隆（或种系变体）发生突变，使这些细胞对治疗更具抵抗力（UPN 804168和400220）。在模式2患者中，携带绝大多数（但不是全部）原发肿瘤突变的一个小亚克隆存活下来，获得突变，并在复发时扩大；一部分原发性肿瘤突变通常通过治疗被根除，复发时未检测到（UPN:758168、933124、452198、426980和869586）。关键亚克隆中的特定突变可能导致化疗耐药，或在肿瘤进化过程中获得对复发重要的突变，或两者兼而有之。值得注意的是，在426980和758168例患者中，第二个原发肿瘤克隆在化疗后存活，并且在复发时也存在(图1c和补充图3). 由于目前我们检测稀有细胞突变的能力受到技术限制（主要与当前可实现的全基因组测序覆盖水平有关），我们的模型对AML的克隆异质性进行了最低程度的估计。

所有8例患者均接受阿糖胞苷和蒽环类药物诱导治疗，并辅以细胞毒性化疗巩固治疗；治疗历史总结如下补充表2和中所述补充信息为了研究治疗对复发突变类型的潜在影响，我们将原发性肿瘤中的六类转换和颠倒突变与所有8例患者的复发特异性突变进行了比较(图3a). 虽然C:G->T:A突变是原发性和复发性AML基因组中最常见的突变，但其频率在原发性肿瘤突变（51.1%）和复发特异性突变（40.5%）之间存在显著差异（P=2.99E-7）。此外，在复发特异性突变中，我们观察到A:T->C:G（P=9.13E-7）、C:G->A:T（P=0.00312）和C:G->G:C（P=0.0366）的颠换分别平均增加4.5%、5.3%和4.2%；值得注意的是，在免疫球蛋白基因突变的慢性淋巴细胞白血病患者中，也观察到A:T->C:G颠换率增加¹⁷.C:G->A:T突变是接触烟草致癌物的肺癌患者中最常见的突变¹⁸(图3b 和 补充表11). 我们将所有8例患者的456个复发特异性突变和3590个原发性肿瘤点突变作为一组进行了检测，发现复发特异性变异（46%）的突变频率显著高于原发性癌突变（30.7%）（P=3.71E-11），表明化疗对复发时的突变谱有实质性影响。当我们将分析局限于原发肿瘤样本中变异频率为0%的213个突变时，也得到了类似的结果(补充图1b); 复发特异性突变的颠倒频率为50.4%，而原发肿瘤样本的颠倒率为31.4%（P=3.89E-09）。在8例复发样本中检测到很少拷贝数改变，这表明突变率的增加与广义基因组不稳定性无关(补充图12).

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图3

原发肿瘤和复发样本突变类型的比较

a） 每种转移和颠倒类型中原发肿瘤和复发特异性突变的比例。b） 8例AML肿瘤和复发对的原发肿瘤和复发特异性突变的转化频率。采用比例检验对8例患者的456个复发特异性突变和3590个原发性肿瘤突变进行统计学意义评估。

讨论

我们首先描述了使用深度测序精确确定933124例AML基因组突变的变异等位基因频率^三这里改进和扩展了这项技术，以检测复发时的克隆进化。对8对原发性AML和复发对的分析表明，明确的证据表明肿瘤亚群的共同起源；所有病例的原发肿瘤样本中均发现一个代表创始克隆的显性突变簇。创始克隆（及其亚克隆）与“白血病起始细胞”的关系尚不清楚；建立这种关系需要克隆群体的纯化和功能测试。我们观察到8例患者中有4例复发时原发肿瘤亚克隆丢失，这表明一些亚克隆确实通过治疗被根除(图1,图2,和 补充图3). 复发时获得的一些突变可能会改变AML细胞的生长特性，或对额外的化疗产生耐药性。无论如何，每个肿瘤在复发时都显示出明显的克隆进化证据，并且可能由化疗引起的DNA损伤引起的更高频率的突变。尽管AML患者需要化疗来诱导初始缓解，但我们的数据也增加了化疗通过在基础克隆或其亚克隆中产生新突变而导致复发的可能性，然后可以进行选择和克隆扩增。这些数据表明，迫切需要确定AML的致病突变，以便开发靶向治疗，避免使用细胞毒药物，其中许多是诱变剂。

这项研究扩展了Mullighan的发现等。¹⁹，安德森等。²⁰，和诺塔等。²¹最近，他使用FISH和/或SNP阵列检测到的拷贝数改变描述了ALL患者的克隆进化模式，并且它增强了对疾病进展过程中获得的遗传变化的理解，如之前对乳腺癌和胰腺癌转移的描述^22–25我们的数据提供了关于AML克隆进化的补充信息，使用了一组更大的突变，并通过深度测序进行了量化；这提供了前所未有的事件数量，可用于精确定义克隆大小和复发时的突变进化。急性淋巴细胞白血病（ALL）和急性髓细胞白血病（AML）在发病时具有克隆异质性的共同特征，在复发时具有动态克隆进化，包括可能与复发发病相关的新突变的增加。在骨髓发育不良发展为急性髓细胞白血病的过程中发现了类似的克隆进化模式（M.J.Walter等。，提交），表明这些是反洗钱演变的共同特征；异基因移植后也可能发生克隆进化（例如，通过单亲双分裂机制丢失不匹配的HLA等位基因），这表明治疗类型本身可以影响复发时的克隆进化^26,27综上所述，这些数据表明AML细胞在复发时通常会获得少量额外突变，并表明其中一些突变可能有助于克隆选择和化疗耐药。个体患者的AML基因组显然是一个“移动目标”；要实现治愈，需要根除创始克隆及其所有亚克隆。

方法总结

使用BWA 0.5.5将Illumina成对端读数与NCBI构建36对齐(http://sourceforge.net/projects/bio-bwa/). 使用SomaticSniper（D.Larson）鉴定体细胞突变等。）和SAMtools indel调用程序的修改版本。使用BreakDancer确定结构变化⁵所有预测的非重复体细胞SNV、indels和所有结构变体都包含在Roche Nimblegen的定制序列捕获阵列中。从捕获阵列洗脱后产生Illumina 2×100 bp配对末端测序读数。VarScan公司⁶以及利用Crossmatch（Phil Green，未发表）和BWA的读取重映射策略来确定预测SNV、indels和结构变体的验证状态。材料和方法的完整描述见补充信息8例AML肿瘤样本的所有序列变异均已提交给dbGaP（登录号phs000159.v3.p2）。

补充材料

鸣谢

脚注

工具书类