公共科学图书馆一号。2012; 7（1）：e30193。
尽管载脂蛋白E酶产生相关的超氧化物，但eNOS对动脉粥样硬化的保护作用−/−老鼠
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帕德马布里亚·蓬努斯瓦米
1德国瓦茨堡大学Medizinische Klinik I/Herz-Kreislaufzentrum
安吉丽卡·施罗德尔
1德国瓦茨堡大学Medizinische Klinik I/Herz-Kreislaufzentrum
4德国慕尼黑路德维希·马克西米利安大学斯坦多特·因恩斯塔特医学院血管医学部
伊娃·奥斯特米尔
1德国瓦茨堡大学Medizinische Klinik I/Herz-Kreislaufzentrum
萨宾·格吕纳
2Rudolf Virchow Zentrum für Experimentelle Biomedizin，德国瓦茨堡大学实验生物医学DFG研究中心
保罗·L·黄
三美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院和哈佛医学院心脏科
乔治·埃特尔
1德国瓦茨堡大学Medizinische Klinik I/Herz-Kreislaufzentrum
乌尔里希·霍夫曼
4德国慕尼黑路德维希·马克西米利安大学斯坦多特·因恩斯塔特医学院血管医学部
伯恩哈德·尼斯瓦特
2Rudolf Virchow Zentrum für Experimentelle Biomedizin，德国瓦茨堡大学实验生物医学DFG研究中心
彼得·库伦科特
1德国瓦茨堡大学Medizinische Klinik I/Herz-Kreislaufzentrum
4德国慕尼黑路德维希·马克西米利安大学斯坦多特·因恩斯塔特医学院血管医学部
Peter J.Lenting，编辑器
1德国瓦茨堡大学Medizinische Klinik I/Herz-Kreislaufzentrum
2Rudolf Virchow Zentrum für Experimentelle Biomedizin，德国瓦茨堡大学实验生物医学DFG研究中心
三美国马萨诸塞州波士顿，马萨诸塞州总医院和哈佛医学院心脏科
4德国慕尼黑路德维希·马克西米利安大学斯坦多特·因恩斯塔特医学院血管医学部
法国国立圣母医学研究所
构思并设计了实验：PP BN PK PLH。执行实验：PP AS EO SG PK。分析数据：PP AS EO SG PK BN。贡献的试剂/材料/分析工具：PP AS OE SG GE UH PK BN.撰写论文：PP BN PLH GE UH PK.获得的资金：PK BN GE UH。
？一个当前地址：法国巴黎INSERM U970，巴黎心血管研究中心
？b个当前地址：瑞士巴塞尔F.Hoffmann-La Roche Ltd
2011年10月12日收到；2011年12月15日接受。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了适当的信任。
摘要
背景
所有三种一氧化氮合酶（NOS）亚型均在动脉粥样硬化斑块中表达。NOS酶通常催化NO的生成。然而，在底物和辅因子缺乏的条件下，酶直接催化超氧化物的形成。考虑到这种替代化学，NOS对自发性高脂血症驱动的动脉粥样硬化关键事件的影响尚未被研究。在此，我们评估了内皮型一氧化氮合酶（eNOS）如何调节动脉粥样硬化中白细胞/内皮细胞-（L/E）和血小板/内皮细胞（P/E）的相互作用以及酶产生一氧化氮（NO）和超氧化物。
主要调查结果
颈动脉活体显微镜（IVM）显示载脂蛋白E/eNOS双敲除小鼠（apoE−/−/电子NOS−/−)与apoE相比，P/E相互作用没有差异−/−eNOS缺乏增加了颈动脉中巨噬细胞的浸润和血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）在内皮细胞和平滑肌细胞中的表达。尽管斑块中其他NOS亚型（诱导型NOS、iNOS和神经元型NOS和nNOS）的表达，但NO的电子自旋共振（ESR）测量显示eNOS对总循环和血管壁NO的产生有显著贡献。eNOS的药理抑制和基因缺失降低了血管超氧化物的生成，表明载脂蛋白E中的酶解偶联−/−船只。
结论
明显的斑块形成、血管炎症增加和L/E-相互作用与载脂蛋白E中超氧化物生成的显著降低有关−/−/电子NOS−/−船只。因此，eNOS的缺乏不会导致氧化应激的自动增加。eNOS解偶联发生在apoE中−/−动脉粥样硬化，但并不否定酶的强大保护作用。
介绍
动脉粥样硬化是血管壁慢性炎症的结果[1]其中一个关键事件是白细胞的聚集和血小板与斑块上的内皮细胞的粘附[2],[3]一氧化氮（NO）是血管稳态的重要生理调节因子，与动脉粥样硬化的病理生理学有关[4]在动脉粥样硬化斑块中，所有三种一氧化氮合酶（NOS）亚型均表达：神经元型（nNOS，NOSI）、诱导型（iNOS，NOSII）和内皮型（eNOS，NOSIII）[5]相反，在正常动脉中，eNOS是主要的NOS亚型[6]虽然所有NOS亚型都通过L-精氨酸催化转化为NO和L-瓜氨酸产生NO，但这些亚型在催化活性、基因调节和细胞隔室方面有所不同。使NOS作用的解释复杂化的是，当底物或辅因子受到限制时，所有三种亚型本身都能产生超氧物（称为“解偶联”），而不是NO[7],[8],[9].eNOS和nNOS是产生低浓度NO的构成酶。我们之前的研究表明，eNOS与nNOS均能显著抑制apoE中的动脉粥样硬化−/−老鼠[10],[11]与这些保护作用相反，iNOS产生高浓度NO，在宿主防御肿瘤细胞和病原体方面发挥重要作用，但也有助于慢性炎症中的组织损伤，并增加载脂蛋白E−/−动脉粥样硬化[12],[13].
药物抑制[14]eNOS基因缺失增加微血管中L/E-相互作用[15],[16]此外，NO降低内皮表面粘附分子的表达，包括P-选择素和VCAM-1[17],[18].在apoE中−/−与C57BL/6J对照组相比，动脉粥样硬化、L/E相互作用增加[19]然而，eNOS是否额外调节动脉粥样硬化中的L/E相互作用尚未直接评估。
此外，NO是血小板活化、血小板聚集和P/E相互作用的潜在调节因子，多项证据表明血小板促进动脉粥样硬化[20],[21],[22]在高胆固醇血症动物模型中，血小板与内皮细胞的粘附发生在斑块可见之前[19],[23]血小板通过糖蛋白（GP）与内皮血管性血友病因子（vWF）粘附，阻断血小板GPIbα可显著减少载脂蛋白E的损伤形成−/−老鼠[19]eNOS是否在apoE中报告的变化之上影响动脉粥样硬化血管中P/E的相互作用−/−与C57BL/6J野生型小鼠相比，目前尚不清楚。
由于动脉粥样硬化中NOS的基因表达和替代化学变化（NO与超氧化物生成），无法预测每个NOS亚型在动脉粥样硬化关键事件中的作用。NO的抗动脉粥样硬化和抗粘附性能取决于其生物利用度，而生物利用度取决于其合成和降解之间的平衡。在氧化应激加剧的情况下，NO与超氧物的反应可能导致NO生物利用度低，从而导致过亚硝酸根的形成[24]进而导致氧化应激[25]NOS辅因子四氢生物蝶呤（BH）的氧化4)在体外引起eNOS的“解偶联”，并可能是促进动脉粥样硬化的血管超氧化物生成的主要来源[26],[27],[28].
目前的研究调查了eNOS对动脉粥样硬化中L/E-和P/E-相互作用的具体贡献。eNOS缺失对动脉粥样硬化载脂蛋白E中总血管NO和超氧物生成的影响−/−研究小鼠的目的是确定这两种自由基中的哪一种在很大程度上决定了动脉粥样硬化的关键事件。我们的研究结果表明，eNOS在预防动脉粥样硬化方面发挥着重要作用，尽管该酶是“解偶联的”，并有助于产生相关的超氧化物和一氧化氮。
方法
道德声明
所执行的所有程序均获得了瓦茨堡大学道德委员会的批准（批准号：54-2531.01-40/07）。
老鼠
动物回交10代至C57BL/6J遗传背景。电子NOS−/−，由Paul Huang提供[10]和apoE−/−（Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME，USA）杂交产生双杂合子小鼠。后代进行杂交，后代通过southern印迹法进行eNOS基因分型，通过聚合酶链反应进行apoE基因分型。载脂蛋白E−/−和apoE−/−/电子NOS−/−21天断奶，18周内喂西式饮食（42%的总热量来自脂肪；0.15%的胆固醇；美国哈兰·特克拉德）。为了通过血管壁清楚地显示L/E相互作用，在西式饮食10周后，在该血管段出现宏观病变之前，进行IVM研究。动物被保存在无病原体的设施中，光/暗周期为12小时。
通过IVM研究评估L/E和P/E相互作用
评估L/E-和P/E-相互作用体内利用视频荧光显微镜[19]通过腹腔注射咪唑安定（5 mg/kg体重；Ratiopharm）、美托咪定（0.5 mg/kg体重，辉瑞）和芬太尼（0.05 mg/kg体重）溶液对小鼠进行麻醉。由于易于接近，颈动脉分叉被选作IVM研究。小心暴露右颈总动脉，从颈动脉分叉远端3毫米到近端7毫米。用恒温碳酸氢盐缓冲盐水溶液连续灌注组织，并用5%CO平衡2在氮气中，为了维持生理pH值，将聚乙烯导管植入右颈静脉进行静脉注射。
为了分离血小板，使用含肝素的注射器从供体小鼠的逆行静脉丛采集血液。血液以400 g离心5分钟。将上清液在250 g下离心6分钟，以获得富含血小板的血浆。随后，通过离心富含血小板的血浆分离血小板。将血小板颗粒重新悬浮在PBS（pH 7.4）中，并与荧光铬羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE，Molecular Probes）一起孵育2分钟。对标记的血小板进行离心，将颗粒重新悬浮在PBS中，并在室温下保存，直至使用。将悬浮液调节至最终浓度50×106每250微升血小板数，并静脉输注到受体小鼠体内。如前所述，血小板制备并没有增加P-选择素的表达，这表明由于制备程序，血小板没有活化[29].白细胞染色体内静脉注射100µl 0.02%罗丹明6G（分子探针）。使用蔡司Axiotech显微镜（浸水物镜：20×，W 20×/0.5；蔡司）和汞灯进行外照射，观察颈动脉。实验按照前面描述的进行[19]在200µm×100µm的区域内，在高倍放大（500倍）下测定L/E-和P/E-相互作用。研究了颈动脉分叉近端200µm处的L/E-和P/E-相互作用，该部位是斑块形成的好发部位，IVM时未显示肉眼可见的病变。
使用计算机辅助图像分析程序（Cap image 7.1；H.Zeintl博士、Ingenieurbüro Zeintl医生，德国海德堡）对所有图像进行录像和离线评估。最初与血管壁接触的细胞随后以明显低于中心线速度的缓慢表面移位（有几次进一步接触）被定义为“滚动细胞”。瞬时贴壁细胞被定义为以明显低于中心线速度穿过假想垂直血管的细胞，并被量化为每毫米细胞数2内皮表面。观察20秒内未移动或脱离内皮表面的细胞被定义为牢固粘附细胞。所有实验都是由一名失明的操作员进行的。
VCAM-1 RNA表达评估
使用RNA Miniprep试剂盒（美国加利福尼亚州斯特拉赫尼）从颈动脉中分离出总RNA。cDNA是使用第一链cDNA合成试剂盒（德国Fermentas GmbH）从总RNA合成的。VCAM-1和CD14的mRNA表达通过实时PCR定量（iCycler，Bio-Read Laboratories，USA）。在60°C的引物退火条件下进行40个周期的PCR扩增。VCAM-1和CD14的表达被标准化为HPRT信号。VCAM-1感测：5′-CTT GTG TTG AGC TCT GTG GGT TT-3′和反义：5′-CAA TCT CCA GAT GGT CAA AGG GAT A-3′.CD14感测：5′-TAC CGA CCA TGG AGC GTG TG-3′和反义：5′-GCC GGT TAC CTC GAG ATT TT-3′.HPRT感应：5′-GTT GGA TAC AGG CCA GAC TTT GT-3′和反义：5′-CCA CAG GAC TAG AAC ACC TGC-3′.VCAM-1的荧光探针：5′-6FAM-CTG TGC AGT TGA CAG TGA GTC TCC CXT–PH；CD14：5′-6FAM–TGT TGC TTC TGG ACG CCT CT–TMR；高效放射治疗：5′-6FAM-CTC GTA TTT GCA GAT TCA ACT TGC GC使用XT–PH。所有引物和探针均来自德国TIB Molbiol。
组织化学和免疫组织化学
IVM研究的颈动脉区域用油红O染色。此外，对VCAM-1和巨噬细胞进行免疫组化。将麻醉动物分离的颈动脉嵌入Tissue-Tek®（Sakura Finetek，NL）中，并在液氮中冷冻snap。切割5µm切片并风干。切片用油红O染色或丙酮固定进行免疫组化。使用小鼠巨噬细胞/单核细胞单克隆一级抗体（MOMA-2，Chemicon Int.）对巨噬细胞进行免疫染色，使用抗小鼠VCAM-1抗体（研发系统）对VCAM-1进行免疫染色。使用DAB（Vector laboratories）对巨噬细胞和VCAM-1染色进行可视化。
组织形态计量学
颈动脉的显微照片是用安装在光学显微镜上的Leitz-camera相机拍摄的（德国耶拿Carl-Zeiss）。使用Image Pro Plus（4.1版；媒体控制论）将图片数字化并传输到PC进行平面测量。所有图像均在400倍放大率下进行分析。测量颈总动脉中与IVM研究所用区域相对应的巨噬细胞阳性区域和脂质丰富区域。结果表示为阳性染色斑块面积的%。
双重免疫荧光
研究血管内皮细胞黏附分子-1（VCAM-1）表达的细胞隔，以及载脂蛋白E（apoE）主动脉弓的冰冻切片−/−和apoE−/−/电子NOS−/−小鼠用丙酮固定。在阻断程序之后，二级抗体和交替的一级抗体的交叉反应性被排除。用双重免疫荧光法检测血管内皮细胞和平滑肌细胞VCAM-1蛋白的表达。将载玻片与大鼠抗VCAM-1一级抗体（BD Bioscience，1∶20）孵育，然后与生物素化兔抗大鼠二级抗体（Vector，1比50）孵养，随后用链霉亲和素-德克萨斯红复合物染色。清洗后，将载玻片与针对内皮细胞（大鼠抗鼠CD31，BD Bioscience，1∶100）或血管平滑肌细胞（α-actin，Sigma，1∶60）的抗体孵育。后一种抗体直接用异硫氰酸荧光素（FITC，绿色）标记。最后，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）安装介质安装所有切片，并用共焦显微镜（蔡斯）进行检查。
颈动脉循环的血流动力学
对动物进行麻醉，并使用带有15MHz换能器的超声系统（NICE，东芝医疗系统，荷兰）通过双色超声对颈总动脉进行可视化。颈总动脉阻力指数计算为最大收缩压（V系统)以及舒张末期流速（V迪亚)除以V系统.
电子顺磁自旋捕捉法测量血管NO生成
使用胶体铁（II）二乙基二硫代氨基甲酸酯（Fe（DETC））检测主动脉中的NO2)根据我们采用的检测apoE主动脉环基线NO生成的方法−/−老鼠[30]简单地说，用戊巴比妥（80µg/kg i.p.）麻醉动物，并通过左心室向主动脉灌注2 ml Krebs-Hepes缓冲液（KHB）。迅速取出主动脉，并将其置于含有KHB的哌啶中。在KHB中使用冷板将主动脉保持在4°C时，移除血管周围脂肪组织（德国登宁诺克西根科学传输与诊断公司）。将主动脉切成2 mm的环，放置在含有KHB的24孔板的一个孔中。随后，将主动脉环培养在胶体Fe-（DETC）中2自旋阱溶液1小时。通过混合等量的脱氧1.6mM FeSO，新制备了自旋阱4和3.2 mM DETC溶液。对于药物性NOS抑制样品，在添加自旋阱之前，在37°C下与NOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）孵育30分钟。使用台式电子扫描ESR分光镜（德国Bruker BioSpin GmbH）进行ESR测量。仪器设置如下：中心场：3308 G。扫描宽度：80 G。微波频率：9.495 GHz。微波功率：50 mW。调制幅度：4.6 G。调制频率：86 kHz。时间常数：81.92 ms。转换时间：20.48 ms。扫描次数：100。使用BCA蛋白质检测试剂盒（美国伊利诺伊州皮尔斯）对样品的蛋白质含量进行定量。
血流中NO生物利用度的测定
硝基血红蛋白是脱氧血红蛋白与NO的反应产物，是NO在循环中生物利用度的体内标志物[31]并可通过ESR光谱检测为特征三重峰。血样是根据公开的方法制备的[32]简单地说，静脉血是从右心室抽取的。在2000 g离心后（德国Eppendorf AG），将红细胞铸型冷冻在注射器中，并转移到含有液氮的指状杜瓦瓶中。使用X波段EMX分光镜（德国Bruker BioSpin GmbH）获得光谱，仪器设置如下：中心场：3340 G。扫描宽度：230 G。微波频率：9.452 GHz。微波功率：47.6 mW。调制幅度：4.76 G。调制频率：86 kHz。时间常数：40.96 ms。转换时间：10.24 ms。扫描次数：24。NO浓度是通过用已知浓度的亚硝酸盐和连二亚硫酸钠（Na2S公司2O（运行）4).
用高效液相色谱法检测氧乙锭测定细胞内超氧化物的产生
通过在含有50µM二氢乙硫酸氢钾的KHB中在37°C下孵育血管环1小时来测量超氧化物的产生[33]然后在冰镇甲醇中均质主动脉环，使用C-18柱（Nucleosil 250，4.5 mm；Sigma-Aldrich）和AKTA HPLC系统（Amersham Biosciences，GE Healthcare）通过反相高效液相色谱法（HPLC）过滤和分离主动脉环。用荧光检测器（Jasco，UK）在510 nm的激发波长和595 nm的发射波长下对超氧物和二氢乙硫醚的反应产物氧硫醚进行定量。形成的氧乙锭量标准化为样品的蛋白质含量。
血沉法测定血管超氧化物生成
根据先前公布的方案测量主动脉环中的超氧物生成[34]使用上述电子扫描分光镜。通过将主动脉环与PEG-SOD（100 U/ml）平行于自旋阱1-羟基-3-甲氧羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷（CMH）在KHB中在37°C下预孵育1小时来评估超氧化物的产生。用PEG-SOD未处理样品中CMH转化为CM.自由基来测定活性氧（ROS）的总生成量。仪器设置如下：中心场：3388 G。扫描宽度：132 G。微波频率：9.497 GHz。微波功率：1.25 mW。调制幅度：1.63 G。调制频率：86 kHz。时间常数：40.96 ms。转换时间：10.24 ms。扫描次数：50。使用BCA蛋白检测试剂盒将ESR信号强度标准化为样品的蛋白质含量。
蛋白质印迹分析
使用RIPA缓冲液分离主动脉蛋白，并使用单克隆兔抗eNOS、抗nNOS（BD Biosciences）和多克隆抗iNOS（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）抗体进行western blot。为了确认蛋白质的负载量相等，使用山羊抗α-肌动蛋白抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。使用Scan Pack软件（德国哥廷根Biometra）对印迹进行密度分析，并将iNOS和nNOS的蛋白带密度归一化为相同印迹的相应α-肌动蛋白带。如前所述，对eNOS二聚体/单体蛋白进行低温SDS-PAGE和western blot检测[35].
统计分析
所有数据均表示为平均值±标准偏差。使用双向方差分析进行重复测量，然后进行舍菲F检验（Stat View 4.51，Abacus Concepts，Inc.，Berkley，CA，USA）。学生的t吨-该测试用于未配对数据。概率值p≤0.05被认为是显著的。
结果
eNOS基因缺失增加apoE中L/E相互作用−/−老鼠
我们使用IVM测试eNOS衍生NO是否影响L/E相互作用，以及这些变化是否发生在宏观损伤形成之前。在研究时未显示肉眼可见动脉粥样硬化病变的斑块形成的好发部位，在颈总动脉中监测L/E相互作用。载脂蛋白E中滚动白细胞的数量显著高于−/−/电子NOS−/−（206±24个/mm2，n=16），与apoE相比−/−（125±17个细胞/mm2，n=23，p<0.01，). apoE中瞬时粘附的白细胞数量较高−/−/电子NOS−/−（442±50个细胞/mm2，n=16），与apoE−/−（155±18个细胞/m2，n=23，p<0.0001，). 最后，在apoE中，白细胞粘附性高度升高−/−/电子NOS−/−（94±15个细胞/mm2，n=16），与apoE相比−/−对照组（28±8个细胞/mm2，n=23，p=0.0002，).
通过活体显微镜分析L/E相互作用。载脂蛋白E颈总动脉中滚动的、暂时粘附的和牢固粘附的白细胞数量显著增加−/−/电子NOS−/−（n=16），与apoE−/−对照组（n=23），a）*p<0.01；b） ***p<0.0001；c） **p<0.001）。
eNOS缺乏不会调节apoE中血小板的粘附−/−老鼠
我们研究P/E相互作用，以确定eNOS是否影响高脂血症驱动的自发性动脉粥样硬化模型中的血小板活化和粘附。我们的结果表明，载脂蛋白E与载脂蛋白e之间的滚动血小板数量没有显著差异−/−（53±12个细胞/mm2，n=19）和载脂蛋白E−/−/电子NOS−/−（41±10个细胞/mm2，n=16，p=0.48）。短暂粘附血小板的数量（apoE−/−：505±57个细胞/mm2，n=9 vs.apoE−/−/电子NOS−/−：417±65个细胞/mm2，n=9，p=0.33）和牢固粘附的血小板（apoE−/−：42±10个细胞/mm2，n=19 vs.apoE−/−/电子NOS−/−：20±13个细胞/mm2，n=16，p=0.2，图中未显示）相似。
eNOS缺乏增加VCAM-1的表达
为了确定eNOS缺失是否会增加VCAM-1的表达，我们使用颈动脉总RNA样本进行了实时PCR实验。我们的结果显示，在apoE中VCAM-1的mRNA表达显著升高−/−/电子NOS−/−动物，与apoE相比−/−对照组（4.3±1.1，n=9对1.0±0.45，n=20，p<0.002，). 此外，免疫组织化学显示apoE中内皮VCAM-1的表达增加−/−/电子NOS−/−动物与apoE−/−(). 为了检查VCAM-1表达的细胞室，我们在主动脉弓进行了双重免疫荧光。我们观察到血管内皮细胞（CD31阳性细胞、，)和内侧平滑肌细胞（α-actin阳性细胞，)apoE的−/−/电子NOS−/−与apoE相比−/−样品。
eNOS缺失增加VCAM-1表达。a） 实时PCR分析显示，载脂蛋白E中VCAM-1 mRNA的表达增加了四倍−/−/电子NOS−/−（n=9）颈动脉，与apoE比较−/−（n=20，*p<0.01）。b） 免疫组织化学证实apoE颈动脉内皮细胞VCAM-1表达增加−/−/电子NOS−/−，与apoE相比−/−箭头表示DAB染色阳性（颈内动脉，IVM位置）。c） 动脉粥样硬化病变中VCAM-1蛋白的双重免疫荧光染色。载脂蛋白E主动脉弓切片−/−和apoE−/−/电子NOS−/−用抗VCAM-1抗体（红色）和抗CD31抗体（内皮细胞，绿色）孵育动物。箭头表示VCAM-1在覆盖层内皮细胞中的定位（黄色）。在apoE中观察到血管内皮细胞VCAM-1表达增加−/−/电子NOS−/−与apoE相比−/−d）在apoE的主动脉弓晚期斑块中观察到VCAM-1的内侧平滑肌细胞表达增加−/−/电子NOS−/−与apoE相比−/−VCAM-1（红色）和平滑肌细胞（绿色）的双重免疫荧光染色显示为黄色（箭头）。
eNOS中的NO影响巨噬细胞浸润血管壁
为了评估颈动脉VCAM-1表达增加是否会导致单核白细胞向血管壁浸润增加，我们通过实时PCR检测CD14的表达。载脂蛋白E−/−/电子NOS−/−与载脂蛋白E相比，CD14表达显著增加−/−对照组（4.2±3.3，n=12 vs.1.0±0.43，n=17，p＜0.00002，). 载脂蛋白E血管中巨噬细胞阳性染色面积的增加支持了这一发现−/−/电子NOS−/−（5.1±0.98%阳性斑块面积，n=10），与apoE相比−/−（2.2±0.48%阳性斑块面积，n=9，p=0.02，). 颈动脉分叉近端血管壁油红O阳性、富含脂质的区域的平面测量显示，载脂蛋白E与−/−（8.1±4.0%阳性染色斑块面积，n=9）和apoE−/−/电子NOS−/−动物（5.0±2.5%阳性斑块面积，n=7，p=0.56）。后一项发现记录了用于IVM测量的颈动脉区域中类似数量的脂肪条纹。
eNOS中的NO影响血管壁中巨噬细胞的浸润。a） CD14的实时PCR分析显示载脂蛋白E中CD14 mRNA的表达显著增加−/−/电子NOS−/−（n=12）颈动脉与载脂蛋白E比较−/−（n=17，*p<0.00002）。b） MOMA-2免疫组化显示apoE颈动脉血管巨噬细胞浸润增强−/−/电子NOS−/−（n=10），与apoE相比−/−（n=9，*p<0.05）。
eNOS缺乏的未改变血管阻力指数
颈总动脉的双重超声检查显示，两种血管的阻力指数，载脂蛋白E−/−（0.758±0.015，n=17）和载脂蛋白E−/−/电子NOS−/−（0.754±0.014，n=10，p=0.88，)没有不同。这些结果表明，在研究时，eNOS的基因缺失并没有改变颈动脉循环的血流动力学。
eNOS缺乏时未改变的血管阻力指数。a） 颈动脉双重超声检查的代表性图片。b） 载脂蛋白E颈动脉等阻力指数−/−，n=17，与apoE−/−/电子NOS−/−，n=10，p=0.88。NS表示无显著性。
eNOS是血管壁NO生成和循环NO的重要来源
由于自由基的半衰期短，NO的生物有效浓度很低，定量血管系统中的基线NO生成是一项具有挑战性的任务。我们使用ESR，一种灵敏度和特异性最高的方法，来测量血管NO生成和血液中的NO水平。胶体Fe-（DETC）对NO的自旋捕集2用于测量血管壁的基线NO生成[30]此外，亚硝基血红蛋白的顺磁性与ESR技术一起用于量化体内全血中NO浓度[31]载脂蛋白E的基线血管NO生成显著降低−/−/电子NOS−/−（2.6±0.7 nM/µg蛋白质，n=15）比apoE中的高−/−（7.3±0.6 nM/µg蛋白质，n=14，p<0.0001，). 载脂蛋白E中NO水平显著升高−/−与C57BL/6J血管（4.1±0.7 nM/µg蛋白质，n=12，p<0.01，). 如预期，在常规eNOS中未检测到ESR信号−/−老鼠。有趣的是，apoE的基线NO生成显著高于−/−/电子NOS−/−与eNOS相比（2.6±0.7 nM/µg蛋白质，n=15）−/−（0.0±0 nM/µg蛋白质，n=8，p≤0.01，)船只。使用NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）抑制NOS导致载脂蛋白E中血管NO水平显著降低−/−（0.0±0 nM/µg蛋白质，n=11，与基础蛋白相比，p<0.0001，)和apoE−/−/电子NOS−/−小鼠（0.4±0.2 nM/µg蛋白，n=17与基础蛋白相比，p<0.01，). 此外，血液样本中的亚硝基血红蛋白水平在apoE中降低，这反映了循环中的生物可利用NO−/−/电子NOS−/−（1868±100 nM，n=11），与apoE相比−/−对照组（3463±491 nM，n=13，p<0.01，).
eNOS是血管壁NO生成和循环NO的重要来源。a） NO-Fe-（DETC）的ESR谱2载脂蛋白E的主动脉−/−和apoE−/−/电子NOS−/−粗体线表示apoE−/−，剥线apoE−/−/电子NOS−/−和图案线单独缓冲/自旋陷阱。箭头显示了NO-Fe-（DETC）的典型3个峰值2信号。b） C57BL/6J（n=12）、eNOS中的血管NO生成−/−（n=8），载脂蛋白E−/−（n=14）和apoE−/−/电子NOS−/−（n=15），*p≤0.01，**p<0.001，**p<0.0001）。c） 利用载脂蛋白E中的L-NAME抑制NOS生成血管NO−/−（n=11）和apoE−/−/电子NOS−/−小鼠（n=16），*p<0.01，***p<0.0001。d） 载脂蛋白E血样中的硝基血红蛋白浓度−/−/电子NOS−/−（n=11）vs.载脂蛋白E−/−对照组（n=13，*p=0.01）。
eNOS是解偶联的，有助于血管生成载脂蛋白E中的超氧化物−/−老鼠
HPLC测量显示载脂蛋白E中的血管超氧化物水平较高−/−与apoE相比−/−/电子NOS−/−（20.3±0.9 AU/微克蛋白质，n=23，与13.6±1.1 AU/微g蛋白质，n=13，p<0.0001，). 载脂蛋白E中的总超氧物生成−/−与C57BL/6J相比显著增加（20.3±0.9 AU/μg蛋白质，n=23 vs.16.3±1.1 AU/μg蛋白质，n=14，p<0.01，). C57BL/6J和eNOS之间的超氧化物水平没有显著差异−/−小鼠（16.3±1.1 AU/微克蛋白质，n=14 vs.18.2±1.5 AU/微g蛋白质，n=12，p>0.05，). 有趣的是，apoE中eNOS的基因缺失−/−与eNOS基因缺失相比，C57BL/6J小鼠（apoE−/−/电子NOS−/−与eNOS相比−/−：13.6±1.1 AU/微克蛋白质，n=13 vs.18.2±1.5 AU/微g蛋白质，n=12，p<0.05，)，表明eNOS仅在致动脉粥样硬化小鼠中有助于超氧化物的产生。除了我们的慢性eNOS缺乏遗传模型的结果外，L-NAME对NOS的急性药理抑制导致载脂蛋白E中的超氧物显著减少−/−（14.2±0.9 AU/µg蛋白质vs.基础蛋白，n=15，p<0.0001，)但C57BL/6J（16.6±1.8 AU/µg蛋白质，n=17 vs.基础，p>0.05）和载脂蛋白E中没有−/−/电子NOS−/−小鼠（12.4±0.6 AU/µg蛋白质，n=12 vs.基础，p>0.05），表明NOS解偶联导致载脂蛋白E氧化应激−/−此外，特异性eNOS抑制剂L-NIO显著降低了载脂蛋白E中的超氧化物生成−/−，支持eNOS的部分解偶联（15.0±1.1 AU/µg蛋白，n=19对20.3±0.9 AU/µg蛋白，n=23，p<0.001，). 通过CMH转化为CM测量的总ROS生成的ESR测量表明，载脂蛋白E中的ROS水平显著增加−/−与C57BL/6J（7.3±0.8 nM/µg蛋白质，n=12，p<0.0001）和载脂蛋白E相比−/−/电子NOS−/−小鼠（7.2±0.9 nM/µg蛋白质，n=15，p<0.0001，). 一贯地，使用ESR测量SOD抑制性超氧物水平表明，载脂蛋白E中的超氧物生成显著增加−/−与C57BL/6J（3.9±0.7 nM/µg蛋白质，n=12，p<0.0001，)和apoE−/−/电子NOS−/−小鼠（4.2±0.9 nM/µg蛋白质，n=15，p<0.0001，). eNOS二聚体/单体的western blot证实了eNOS的解偶联。C57BL/6J动物的主动脉裂解物显示eNOS蛋白二聚体增加，而apoE−/−动物表现出高水平的eNOS蛋白单体。
eNOS是解偶联的，有助于血管生成载脂蛋白E中的超氧化物−/−老鼠。a） HPLC测量显示载脂蛋白E中的超氧物生成水平较低−/−/电子NOS−/−（n=13）vs.载脂蛋白E−/−（n=23）。apoE中的超氧化物水平较高−/−（n=23）与C57BL/6J（n=14）相比。有趣的是，载脂蛋白E中的超氧化物水平显著降低−/−/电子NOS−/−（n=13）与eNOS相比−/−（n=12）。b） L-NAME抑制载脂蛋白E中的超氧化物生成−/−（n=15）但不在C57BL/6J（n=17）和apoE中−/−/电子NOS−/−（n=12）主动脉。c） 使用L-NIO对eNOS的特异性抑制导致载脂蛋白E中超氧化物的产生显著降低−/−（n=19）。d） 使用ESR的总ROS生成显示apoE中的ROS水平显著增加−/−（n=23）与C57BL/6J（n=12）和apoE相比−/−/电子NOS−/−（n=15）。e） 同样，ESR测定的SOD抑制性超氧物生成也显示载脂蛋白e中超氧物水平显著增加−/−（n=23）与C57BL/6J（n=12）和apoE相比−/−/电子NOS−/−（n=15）。§p<0.05，*p<0.01，**p<0.001，***p<0.0001，NS表示无显著性。f） apoE中eNOS的解耦−/−eNOS蛋白二聚体/单体的western blot显示与C57BL/6J主动脉相比。
NOS亚型的Western blot分析
eNOS基因缺失导致载脂蛋白E主动脉iNOS蛋白表达显著增加−/−小鼠与对照组相比（1.14+0.27，n=10 vs.0.43+0.16，n=100，p<0.05，). nNOS蛋白的表达水平在apoE之间没有显著差异−/−和apoE−/−/电子NOS−/−小鼠（0.90+0.23，n=10对0.85+0.14，n=11，p>0.05，).
一氧化氮合酶亚型的血管表达。载脂蛋白E主动脉iNOS蛋白表达显著增加−/−/电子NOS−/−（n=10）与apoE比较−/−小鼠（n=10）。nNOS的蛋白质水平在载脂蛋白E之间没有差异−/−（n=10）载脂蛋白E−/−/电子NOS−/−（n=11）。*p<0.05，NS表示无显著性。
讨论
慢性eNOS缺乏显著增加apoE中白细胞的滚动、短暂和牢固粘附−/−/电子NOS−/−，与apoE相比−/−控制。L/E相互作用增加并不是由于局部斑块负担的差异，因为两种基因型在早期IVM所用的颈动脉段显示出相似数量的脂肪条纹。双功超声检查显示两种基因型的颈动脉循环的血流动力学相似。因此，apoE中L/E相互作用的增加−/−/电子NOS−/−动物不是仅次于流体动力学变化的。
据我们所知，这是首次研究eNOS在自发性高脂血症驱动的动脉粥样硬化中L/E相互作用的作用。我们发现eNOS缺乏内源性NO生成会加速载脂蛋白E动脉粥样硬化中的L/E相互作用。我们的数据与先前的研究一致，研究表明内源性NO生成抑制微血管中L/E相互作用[15],[16]我们之前报道过apoE加速动脉粥样硬化−/−/电子NOS−/−并且这种病变形成的增加不是继发于该基因型的血压升高[10],[36]因此，apoE中动脉粥样硬化的发展增加−/−/电子NOS−/−动物可能是由于局部变化，如内皮细胞活性增加和L/E-相互作用。
VCAM-1表达是内皮细胞激活的标志[37]在动脉粥样硬化中，巨噬细胞极晚期抗原-4（VLA-4）和内皮细胞VCAM-1的相互作用介导单核细胞牢固粘附。在用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME治疗人类隐静脉内皮细胞后，VCAM-1表达上调，表明NO对粘附分子表达的强直抑制[18]相反，我们对eNOS中微血管内皮细胞的研究−/−小鼠表明，eNOS缺失单独不会诱导粘附分子表达或增加L/E相互作用，这表明eNOS在内皮细胞活化中起着允许作用[38]这里的数据表明，eNOS缺失不仅增加了内皮细胞VCAM-1的表达，导致内皮细胞活化和白细胞募集，而且也增加了内侧平滑肌细胞的VCAM-1表达。
apoE中的IVM研究−/−小鼠认为P/E相互作用是斑块形成的重要触发因素[19],[39],[40]由于NO被证明抑制血小板活化和聚集在体外，我们研究了eNOS衍生NO在动脉粥样硬化P/E相互作用调节中的重要性。我们的研究表明，在载脂蛋白E中，血小板滚动、短暂或牢固粘附到内皮细胞上没有差异−/−/电子NOS−/−小鼠，与apoE相比−/−控制。这表明apoE中的动脉粥样硬化显著增加−/−/电子NOS−/−，与apoE相比−/−
[10],[41]不是由血小板粘附增加和后续事件引起的。因此，尽管血小板加速载脂蛋白E中斑块的形成−/−小鼠，它们可能不会促进apoE中斑块形成的增加−/−/电子NOS−/−.
Fe-（DETC）对NO的自旋捕集2ESR被认为是检测生物系统中NO的最特异、最灵敏的方法，它表明eNOS对动脉粥样硬化中血管总NO的产生有显著贡献。我们最近报道了在apoE中观察到的血管NO生成的显著增加−/−与C57BL/6J小鼠相比，iNOS[42]有趣的是，apoE−/−/电子NOS−/−与eNOS相比，小鼠的NO水平显著升高−/−老鼠。这种NO生成的增加可能由iNOS介导，因为主动脉iNOS蛋白表达在apoE中增加−/−/电子NOS−/−与apoE相比−/−(). 相反，我们没有观察到apoE中nNOS表达水平的变化−/−和apoE−/−/电子NOS−/−(). 与内皮细胞NO生成减少一致体内在apoE中，反映循环中生物可利用NO的循环亚硝基血红蛋白浓度显著降低−/−/电子NOS−/−老鼠。考虑到所有三种NOS亚型在动脉粥样硬化斑块中的表达，由于几个原因，我们的结果不容易预测。首先，L/E相互作用增加、巨噬细胞浸润、血管iNOS表达增加以及eNOS缺失引起的斑块面积增加也可能导致iNOS产生的细胞毒性NO增加。其次，eNOS的缺失可能会改变底物和辅因子的生物利用度，从而影响iNOS和nNOS的化学性质。我们的数据表明，eNOS是apoE中血管和循环NO的重要来源−/−老鼠，尽管有这些可能性。载脂蛋白E特征三重态ESR峰检测到的残余NO−/−/电子NOS−/−表示iNOS和可能的nNOS在血管壁中产生的残余NO。
我们使用两种独立的技术评估血管超氧化物的形成，结果显示在载脂蛋白E基因eNOS缺失（慢性）后，超氧化物的产生显著减少−/−使用L-NAME抑制NOS亚型导致载脂蛋白E中超氧化物的产生显著减少−/−但在C57BL/6J和apoE中没有−/−/电子NOS−/−表明NOS仅在致动脉粥样硬化apoE中解偶联−/−老鼠。此外，使用L-NIO对eNOS进行急性药理抑制可减少载脂蛋白E中的超氧化物生成−/−.载脂蛋白E中血管超氧化物的减少−/−/电子NOS−/−反映了内皮细胞eNOS衍生的超氧化物生成的贡献。由于两者都存在，eNOS产生的大量NO和超氧物在apoE中可以检测到−/−我们得出结论，在该模型中，eNOS在动脉粥样硬化发展过程中部分解偶联。为了支持这一点，我们的eNOS蛋白质印迹显示eNOS单体增加，这是apoE中eNOS解偶联的间接测量−/−老鼠。如eNOS过度表达apoE所示−/−未偶联eNOS增加小鼠超氧化物生成可能加速动脉粥样硬化[43]然而，尽管我们的载脂蛋白E中血管超氧化物生成减少−/−/电子NOS−/−模型中，这些动物的动脉粥样硬化加剧，这表明超氧物生成减少的动脉粥样硬化保护作用并不超过NO缺乏的致动脉粥样硬化作用。换言之，我们进行了有趣的观察，eNOS衍生的超氧物形成增加并不能覆盖eNOS缺失后伴随的NO生成减少所造成的损害。大量证据表明动脉粥样硬化中超氧物生成增加[44],[45]。我们的数据与此假设一致，因为我们观察到载脂蛋白E中的超氧物生成增加−/−与C57BL/6J动物相比。因此，eNOS解偶联是载脂蛋白E产生超氧物的关键来源−/−模型。
我们研究的主要发现表明，eNOS的缺乏可以减少动脉粥样硬化中的血管壁氧化应激，尽管在apoE中加速斑块形成、增加血管炎症和L/E相互作用−/−/电子NOS−/−船只。载脂蛋白E之间的P/E相互作用没有差异−/−和apoE−/−/电子NOS−/−表明NO生成不足不会增加apoE顶部的血小板相互作用−/−背景。eNOS解偶联发生在apoE中−/−动脉粥样硬化，但并不能否定这种酶的强大保护作用。因此，eNOS衍生的NO仍然可以在高氧化应激系统中发挥保护作用，这可能与过氧亚硝酸盐形成增加有关。
致谢
我们感谢沃兹堡大学临床生物化学和病理生物化学研究所的U.Walter教授和S.Gambaryan博士对手稿提出的建议和批判性评论。我们感谢Bruno Fink博士就ESR实验提出的建议和进行的讨论（Noxygen Science Transfer&Diagnostics，Denzlingen，Germany）。我们还感谢德国卡尔斯鲁厄Bruker BioSpin GmbH使用其EMX ESR设施。非常感谢G.Riehl女士、A.Ganscher女士、P.Koelle女士和P.Lemnitzer女士的出色技术援助。
脚注
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
基金：这项工作得到了德国福斯中gemeinschaft[KU-1206（1）和KU1206（2）]以及德国瓦尔茨堡克林斯福松Interdisziplinäres Zentrum[E-30F]对PJK的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
工具书类
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