简介
维甲酸（RA）受体α、β和γ是核受体，作为配体激活的胚胎发育调节器发挥作用。维甲酸受体α（RARα）是参与造血分化的主要RA受体(1).体外，RARα通过与维甲酸X受体（RXR）二聚并与维甲酸反应元件（RARE）结合来调节RA靶基因的转录活性(2,三)，但对内源性RARα的转录调控知之甚少。
靶向RARα基因的易位事件是急性早幼粒细胞白血病（APL）复发的主题(4–6)从而指出由此产生的RARα融合蛋白的致癌功能。最常见的易位产生PML–RARα融合蛋白，该蛋白足以在小鼠模型中诱导APL(7). 白血病RARα融合蛋白的表达减弱RA的转录诱导(2,4)并诱导特定基因的DNA超甲基化(8). 重要的是，异常启动子甲基化是APL患者的一个关键特征(9,10). APL患者细胞中启动子甲基化的解除以及RARα与缺乏RA诱导基因的基因组区域的结合(11,12)强烈主张RARα通过启动子区的CpG甲基化调节细胞记忆和印迹。
核受体共同调节蛋白TIF1α（Trim24）以配体依赖的方式调节RARα的功能，TIF1α的缺失增加了动物模型中肝细胞癌的发病率(13)，表明在某些情况下未调制的RARα活性可以驱动肿瘤发生。MMTV-wnt1动物模型的研究表明，激动剂激活的RARα抑制乳腺肿瘤的形成和生长，但RARα的丢失延缓了乳腺肿瘤的发生(14)从而支持RARα作为抑癌基因和原癌基因的作用。目前的核受体作用模型表明，RARα的不同功能是由辅因子募集决定的，导致表观遗传学变化，如组蛋白修饰(15).
组蛋白修饰是表观遗传活动的重要标志。组蛋白3赖氨酸9和14（H3K9/K14ac）的乙酰化和组蛋白3赖氨酸4（H3K 4me3）的三甲基化经常在与沉默基因相关的活跃转录基因的启动子近端区域增加(16,17). 相反，组蛋白3赖氨酸9（H3K9me3）的三甲基化与印迹和转录抑制有关(16,18). H3K9me3还标记了人类癌症中差异表达的基因(19). 观察到HP1（异染色质形成的关键因子）与赖氨酸9甲基化的组蛋白H3（而非赖氨酸4甲基化）具有高亲和力，强调了H3K4me3和H3K9me3之间的反向关系(18). 因此，转录状态由各种表观遗传标记反映。
哺乳动物转录的可遗传沉默和印迹调控部分依赖于CpG二核苷酸的对称甲基化(20). 在人类中，印迹缺陷与Beckwith-Wiedemann、Prader-Willi和Angelman综合征有关(21,22). 超甲基化和从头开始DNA甲基化在发育和癌症中已被广泛研究，但对DNA去甲基化的作用知之甚少(23). 这可能是因为尚未确定催化胞嘧啶甲基化活性去除的酶，以及尚未建立适当的模型系统(24). 因此，尚不清楚特定启动子是如何针对甲基化或去甲基化的。
F9胚胎性癌干细胞系统是RA信号传导的一个成熟模型(25). 重要的是，F9细胞基因组稳定，在形态、生长行为和标记表达方面与胚胎干细胞非常相似(25,26). 我们在这里表明，在F9细胞中，RARα的敲除与Mest转录水平的降低和Mest启动子区的基因特异性表观遗传变化有关，这种效应通过恢复RARα而部分缓解2表达式。此外，显性负性PML–RARα癌蛋白的过度表达也可导致Mest转录水平的类似下降。我们的研究结果表明，单个转录因子的丢失会导致DNA甲基化发生广泛的基因特异性变化，从而改变细胞的表观遗传特征。我们的发现为APL和由缺陷基因印记导致的遗传性疾病的机制提供了新的见解。我们得出的结论是，在F9干细胞中，RARα通过维持独立于RA配体的启动子特异性表观遗传特征，维持Mest和Tex13的转录，并阻止Slc38a4和Stmn2的转录。
材料和方法
F9畸胎瘤细胞的细胞培养及RA治疗
F9 Wt和RARα−/−细胞按照描述进行繁殖(27,28). 一批F9 RARα−/−低传代数的细胞从液氮冷冻保存中复活，并且RARα的基因型−/−细胞系经western blot证实(F） ●●●●。用于微阵列分析2.0×106在药物治疗前16h进行细胞培养。全部-反式RA（类别号R2625，Sigma，MD，USA）和环己酰亚胺（chx）（类别号C7698，Sigma-MD，US）溶解在100%乙醇（EtOH）中。在用RA（1µM）或载体（EtOH，0.1%）处理7.5小时之前，用1µg/ml chx预处理细胞30分钟。为了进行基因表达分析，F9细胞在RNA收获前24或8小时在RA（1µM）或载体（0.1%，EtOH）中培养。
野生型和RARα基因敲除细胞的基因表达分析。通过微阵列分析确定相对转录水平，并将差异表达的基因（野生型和RARα基因敲除细胞之间转录水平的2倍或更多差异）绘制为RA存在时的倍差与载体处理细胞的倍差(A类右侧面板，RARα中的转录水平−/−Wt细胞中细胞>2倍转录水平；C类左侧面板，RARα中的转录水平−/−细胞＜Wt细胞中转录水平的0.5倍）。RARα转录水平增加的选定基因−/−细胞（Slc38a4和Stmn2）和RARα转录水平降低−/−通过实时PCR（分别为A左图和C右图）验证细胞（Mest和Tex13）在Wt和RARα之间的差异表达−/−细胞以配体依赖的方式（以与36B4表达相关的任意单位测量，注意对数刻度）。RA治疗的持续时间由条形颜色表示（0 h；灰色，8h；浅灰色，24h；深灰色）。通过半定量PCR验证了其他基因在Wt和RARα之间的差异表达−/−细胞以配体依赖的方式。转录水平增加的基因(B类)基因降低了转录水平(D类). RA治疗的不同时间点用条形颜色表示（0 h；灰色，24小时；深灰色）。显示特定的条带（白色箭头）和相对转录水平（凝胶上方的条带）。家庭基因（36B4和HPRT1）转录水平评估证实，所有样本中的cDNA数量相似（数据未显示）。(E类)在RA处理Wt和RARα的0、8和24小时，通过实时PCR评估RA诱导基因（Cyp26a1、Hoxa5、Hoxb5和Hoxb2）的转录水平−/−细胞（与36B4转录水平相关）。每个图是三个独立的生物复制的汇编。(F类)RARα基因敲除细胞系的Western blot验证。预期大小的条带由Wt中的RARα特异性抗体检测到，但在RARα中未检测到−/−细胞系（左）。在来自转染的COS细胞的裂解物中，通过Ab检测到RARα，而不是RARβ或RARγ（Santa Cruz，sc-551）。数据代表三种独立的分析（微阵列和实时PCR），为每个实验采集新的RNA，或至少三种独立分析中的一种代表性分析（半定量PCR和western blot）。
RNA纯化、微阵列分析和统计分析
根据制造商的规范，提取总RNA，并使用RNEasy迷你试剂盒（美国马里兰州齐根市74104类）进行柱上DNA酶处理。cRNA的制备、凝胶电泳质量控制、芯片杂交和扫描由Weill Cornell医学院（WCMC）的微阵列核心设施进行。按照Affymetrix基因芯片表达分析技术手册进行微阵列分析。将片段cRNA杂交到微阵列芯片（MG-430.2，Cat.#900496，Affymetrix，CA，USA），其中包括45000多个转录本，代表34000个经证实的小鼠基因。使用生物三倍体（例如独立繁殖的细胞）进行杂交分析。使用Genespring v7.0软件（美国加利福尼亚州安捷伦科技公司）对数据进行分析。简单地说，使用GC-RMA算法对数据集进行总结，然后进行三步归一化处理，包括：（i）数据转换，将值<0.01–0.01转换，（ii）芯片归一化到总强度的第50百分位，以及（iii）每个基因归一化为中等强度。根据表达水平筛选基因，以排除原始信号低于100的基因。为了确定在Wt和RARα之间差异表达的RA诱导基因−/−对每个细胞系进行细胞系、治疗（RA+chx）和对照（EtOH+chx。为了确定EtOH处理细胞和RA-处理细胞之间哪些基因在统计上显著差异表达，采用单向方差分析(对< 两组（Wt和RARα−/−单元格）。鉴定Wt和RARα之间差异表达的基因−/−与RA治疗无关的细胞系，Wt与RARα−/−对两种情况（RA+chx和vehicle+chx）进行细胞系比较，并进行单因素方差分析(P（P）< 在两组（EtOH和RA-处理的细胞）上进行。数据已存入GEO数据库（登录号GSE31280）。对于逆转录酶（RT）反应，使用Trizol试剂提取总RNA（Cat.#15596，Invitrogen，CA，USA）。通过260 nm处的光密度对RNA进行定量。
cDNA的生成、半定量和实时PCR反应
从F9细胞中分离的总RNA（1.5µg）被逆转录（Cat.#95048，Quanta Biosciences，MD，USA），然后用H稀释1:102O.使用3-5µl作为模板建立后续PCR反应。用Taq聚合酶（0.5 U，Cat#CB4050，美国新泽西州登维尔科学公司），在BioRad iCycler中：（95°C，120 s）×1，（94摄氏度，15秒；55–65°C，30秒；72°C，30秒）×28–35，（72°C，4分钟）×1根据经验确定每个引物对的退火温度和重复次数，从而使PCR在线性范围内。通过在每个反应（1:1、1:3、1:9）中对RA-处理的Wt细胞的cDNA进行3倍连续稀释，证明线性范围内的扩增。无RT酶的RT反应作为gDNA模板的阴性对照。用1.5%（w/v）琼脂糖和0.3mg/ml溴化乙锭在TAE凝胶上对PCR产物进行电泳。使用FluorChem 8800系统（加州Alpha Innotech）对条带进行可视化和定量。使用SYBR Green Supermix（Cat.#84091，Quanta Biosciences，MD，USA）在包含反应混合物（×1）、每个引物0.25μM和3µl cDNA模板的15µl反应中进行实时PCR。反应在Bio-Rad MyiQ上进行TM（TM）单色实时PCR检测系统（BioRad，CA，USA）。线性范围内的扩增通过每次反应（1:1、1:5、1:10、1:50、1:100、1:500）中RA-处理的Wt细胞的cDNA连续稀释来证明。与H的反应2O和不含RT酶的模板分别作为引物-二聚体和剩余基因组DNA（gDNA）扩增的阴性对照。引物序列列在补充附录S1A使用生物三倍体进行每个表达分析（例如，独立繁殖的细胞，重复三次）。
gDNA纯化和亚硫酸氢盐甲基化分析
从未经处理的F9 Wt和RARα中分离出gDNA−/−细胞和纯化(29,30). 亚硫酸氢盐测序评估启动子特异性甲基化(31). 检测区域为Mest:−337+116，Slc38a4:−123+第374页，第2页：−103+224，Tex13:-248+29和Cyp26a1:−67+152相对于每个基因的转录起始位点，参见补充附录S1A有关详细信息(补充数据). 简而言之，根据制造商的说法，在1.0µg gDNA上进行了胞嘧啶到尿嘧啶的转换（Cat.#D5001，Zymo Research，CA，USA）。用启动子特异性引物对转化的DNA进行PCR反应(补充数据)使用在线Methprimer软件设计(32). 在含有PCR缓冲液（最终浓度为20 mM Tris–HCl（pH 8.4）、50 mM KCl、1.5 mM MgCl）的15µl反应中，使用3-5µl胞嘧啶到尿嘧啶转化的gDNA作为模板，以Taq聚合酶（Cat.#10342，Invitrogen，CA，USA）进行PCR反应2]、每个脱氧核苷三磷酸0.2 mM浓度、每个引物0.2μM浓度和3-5µl cDNA模板。使用转化的gDNA（3–5µl），然后使用1µl初始PCR，作为BioRad iCycler中的模板，使用以下协议进行顺序PCR反应：（95°C，120 s）×1，（94摄氏度，15秒；55°C，30秒；72°C，30秒）×35–40，（72°C，4分钟）×1在第二个PCR反应中，使用半巢式引物对以提高Mest和Stmn2启动子区扩增的保真度。使用PCR纯化试剂盒（Cat.#28106，Qiagen，MD，USA）纯化PCR产物，并通过连接到pGEM-T easy载体（Cat.#A1360，Promega，WI，USA）中回收洗脱的DNA。将连接产物转化为合格的DH5α细菌，并将其置于含有氨苄西林的LB琼脂平板上，在37°C下培养过夜。从耐药菌落中分离出DNA，并通过NotI限制性消化（Cat.#R0189，New England Biolabs，MA，USA）确认含有预期大小的插入物。从每个F9细胞系（Wt和RARα−/−)使用T7（+）和SP6（+）引物对总共10n个包含每个所需PCR产物的独立克隆进行测序(补充数据).
蛋白质斑点
如前所述进行SDS-PAGE和western blot分析(30,33)以1:1000稀释度使用RARα一级抗体（Cat.#sc-551，Santa Cruz，CA，USA），以1:10000稀释度使用HPR-共轭抗兔二级抗体（Cat#sc-2030，Santa Cruz，CA，USA。每个抗体在PBS中用5%布洛托（Biorad，CA，USA）和0.1%吐温-20稀释。使用Supersignal基板（美国伊利诺伊州皮尔斯市，类别号34080）开发膜5分钟，并暴露于Biomax胶片（美国纽约州伊士曼柯达）。
染色质免疫沉淀分析
组蛋白ChIP分析采用一步ChIP方案，该方案利用甲醛交联。对于转录因子ChIP分析（RARα和RXRα），我们使用了两步ChIP方案。5.0×10超声染色质的IP6F9细胞每IP使用2µg Ab(30,31). 扩增区域为Mest:−337；−197，Slc38a4:−123+第171页，第2页：−103+22，Tex13:−132+32和Cyp26a1:−97；−相对于每个基因的转录起始位点为10(补充数据). 使用生物三倍体（例如独立繁殖的细胞）进行每个ChIP分析。Abs:H3K9me3（ab8898，马萨诸塞州Abcam，美国）、H3K4me3（07-473，马萨诸塞诸塞州Upstate，美国），H3K9/K14ac（06-599，马萨诸纳州Upstate-，美国）；RARα（sc-551，美国加利福尼亚州圣克鲁斯），RXRα（sc-553，美国加利福尼亚省圣克鲁斯市），Rabbit-IgG（sc-2027，美国加州圣克鲁斯县）。
稳定克隆的生成
pSG5 mRARα2将pSG5 mPML–RARα表达载体稳定导入F9 Wt和RARα−/−单元格，分别(补充数据). 简而言之，表达载体和选择载体pPGK Hygromycin(34)如前所述，使用脂质体胺2000（Cat.#11668，Invitrogen，CA，USA）联合转染F9细胞(35). 采集并筛选菌落(28). 使用mRARαE6（+）/mRARαE7（−）引物对进行PCR筛选。414-bp的PCR产物证明了gDNA的成功纯化，而239 bp的额外PCR产物则证明了转基因的整合。阳性克隆中的转基因表达通过使用rβ-珠蛋白5′C/rβ-球蛋白3′B引物对的162-bp PCR产物进行验证，该引物对跨越pSG5载体的β-珠蛋白质内含子（引物序列(补充数据)).
统计分析
在表达和ChIP分析中使用单向方差分析分析生物三重性。数据分析采用两步法；第一步评估RA的作用（载体与RA处理的细胞）。第二步评估了RARα（Wt与RARα）的作用−/−单元格）。如果载体和RA处理的细胞之间的差异（第一步）不显著，则在评估基因型的影响时对数据进行集体评估（第二步）。确定每个数据集的标准偏差（在图表中绘制为误差条），以及P（P）< 比较样本之间的0.05具有统计学意义。
结果
F9 Wt和RARα基因敲除细胞的转录组分析揭示了RARα的配体依赖性作用
我们的目的是鉴定表达依赖于RARα的新基因。因此，我们对F9 Wt和F9 RARα基因敲除（RARα−/−)在RA存在或不存在的情况下培养的细胞。通过Wt和RARα的成对比较−/−存在或不存在RA的细胞系（详见补充材料(补充数据))，我们确定了几个差异表达的基因(RARα中A和C显示基因分别增加和减少−/−相对于Wt细胞）。排除相同基因的多次点击，我们发现63个转录物的RARα水平升高−/−细胞和14个RARα水平降低的转录物−/−与Wt细胞水平相关的细胞。
我们回顾了差异表达基因的功能，以阐明RARα可能参与的途径。第38页（溶质载体家族38，成员4；Ata3）是一个受印迹调控的父亲表达基因(36). Slc38a4编码在胎盘组织、成人肝脏和肌肉中发现的精氨酸转运体(37).标准2（Statmin 2；Scg10）在人类前列腺上皮细胞的肿瘤转化过程中有差异表达，可能是癌症发生的早期标志物(38).参考2L（与RNA和输出因子结合蛋白1–II相似）可能与Thoc4相似，作为PML的辅因子(39).RpL39l型（核糖体蛋白L39样）参与精子发生，人类同源物在各种癌症中过度表达，包括卵巢癌(40).Mobp公司（髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白）稳定髓鞘(41).射频（重新排列我-myc融合序列）是染色体内的受体我-myc重排。融合蛋白的表达抑制胚胎干细胞分化和类胚体形成(42).
梅斯特（中胚层特异性转录物；Peg1）是一种受印迹调控的父亲表达基因；Mest启动子在精子中未甲基化，但在卵母细胞中高度甲基化(43,44). Mest表达减少与胶质母细胞瘤相关(45)浸润性乳腺癌和肺癌的Mest表达增加(46).特克斯13（睾丸表达基因13B）位于X染色体上，可能在精子发生中起作用(47).石笼1（生长因子受体结合蛋白2相关蛋白1）是内皮发育的关键因素(48).Tcfap2a型（转录因子AP-2，α）在RA介导的原代星形胶质细胞分化过程中诱导(49). 在乳腺癌、急性淋巴细胞白血病和头颈部鳞状细胞癌中报告了人类同源物的异常表达(50–52).HMGcs1型（3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合成酶1）参与胆固醇生物合成(53).
Wt和RARα之间差异表达的基因−/−细胞主要表达于胎盘、大脑和睾丸(补充数据). 这些是印迹在转录调控中起主要作用的组织(54,55)因此，RARα可能参与调节遗传印迹。
我们验证了微阵列分析中鉴定的差异表达基因子集的转录水平。在RA治疗0、8和24小时后，通过实时PCR评估Slc38a4和Stmn2转录水平(A、 左侧面板）。相对于F9 Wt细胞，RARα−/−细胞在所有三个时间点均显示Slc38a4和Stmn2水平升高。观察到RARα中Ref2L、Rlf、RpL39l和Mobp转录水平的增加−/−通过半定量PCR验证与Wt细胞相关的细胞(B） ●●●●。RARα中Mest和Tex13转录水平降低−/−RA处理0、8和24小时后，通过实时PCR验证相对于F9 Wt细胞的细胞(C） ●●●●。观察到RARα中Bcl11a、Gab1、HMGcs1和Tcfap2a转录水平下降−/−通过半定量PCR验证与Wt细胞相关的细胞(B） ●●●●。与微阵列数据一致，转录水平受RARα基因敲除的影响，但对RA相对不敏感。
添加RA后，12个差异表达基因中11个的转录水平没有改变。这有点出乎意料，因为RARα是RA激活的核受体。相反，微阵列分析确定了几个已知的RA诱导靶基因（Cyp26a1、Hoxa5、Cdx1、Tmtc1、Csn3、Aurkc、MP11、Pdgfrβ、RARβ2、Hoxb5和Hoxb2(补充数据))如图所示，在F9 Wt细胞中加入RA 8小时后，转录水平增加了3倍以上。
我们通过实时PCR验证了四个RA反应基因（Cyp26a1、Hoxa5、Hoxb5和Hoxb2），并证明了这些基因在F9 Wt和RARα中的诱导作用类似−/−将RA添加到F9 Wt细胞8小时和24小时后的细胞(E） ●●●●。这表明RA治疗的功能性转录反应，可能由RARβ和/或RARγ介导。因此，在F9 RARα中−/−细胞中加入RA可诱导几个已知RA反应基因的转录。具体而言，F9 Wt和RARαRA处理24小时后，Cyp26a1、Hoxa5、Hoxb5和Hoxb2的转录水平增加了10倍或更多，而Mest、Tex13、Slc38a4和Stmn2的转录水平则增加了<2倍−/−单元格(A和C）。总的来说，这些结果表明在F9 Wt细胞中，RARα−/−细胞，包括Mest、Tex13、Slc38a4和Stmn2在内的几种转录物的水平以RA独立的方式维持。
RARα基因敲除细胞中Mest、Tex13、Slc38a4和Stmn2启动子的表观遗传特征发生改变
Wt和RARα转录水平的最大差异−/−观察到Slc38a4和Mest细胞（RARα差异>10倍−/−与Wt细胞相比）。这些基因都是父系表达的(36,43)这表明，Slc38a4和Mest的转录，以及可能的Stmn2和Tex13的转录，都受到Wt与RARα中差异CpG启动子甲基化的调节−/−细胞。我们鉴定了富含CpG的启动子区域，并评估了Slc38a4、Mest、Stmn2和Tex13的启动子特异性甲基化状态（扩增的区域在C类(补充数据)). 因为Mest、Tex13、Slc38a4和Stmn2转录水平不受RA治疗的影响(A和C），我们评估了未经治疗的F9 Wt和RARα中每个基因的甲基化状态−/−细胞。
Mest、Tex13、Stmn2和Slc38a4启动子区的表观遗传特征。(A类)Mest和Tex13启动子显示RARα甲基化增加−/−相对于Wt细胞。相反，Slc38a4和Stmn2在RARα中甲基化降低−/−相对于Wt细胞。每条水平线代表一个独立等位基因的甲基化状态。下图中的数字表示CpG相对于转录起始位点的位置（+1）。(B–D类)通过实时PCR对Wt和经载体或RA处理的RARα敲除细胞的染色质IP进行启动子特异性ChIP定量（载体-0h；灰色和RA-24小时；深灰色条）。（B） F9 Wt和RARα中的组蛋白修饰−/−细胞。H3K9/14ac改装（上面板）。在RARα中−/−Mest和Tex13启动子的细胞H3K9/K14ac水平降低，而Stmn2和Slc38a4启动子的水平相对于Wt.（C）H3K9me3修饰增加（中间面板）。在RARα中−/−细胞Mest启动子的H3K9me3水平升高，而Slc38a4启动子的水平降低。在RARα中，Tex13和Stmn2启动子的H3K9me3水平没有显著变化−/−细胞。在Cyp26a1启动子处可以看到H3K9me3的低信号（比IgG高15-30倍）。（D） H3K4me3改装（下面板）。在RARα中−/−Mest和Tex13启动子的细胞H3K4me3水平降低，而Stmn2和Slc38a4启动子的水平相对于Wt增加。每个PCR的IgG IP信号设置为1。数据代表每个抗体的三个独立的IP，为每个IP收获新的染色质。统计显著性由P（P）-所示比较的值低于0.05。（C） 最近端启动子区。对启动子（斜体中的序列除外）进行CpG甲基化评估（粗体）。下划线序列表示推定的元件：RARE（DR1）、NFkB结合位点、TATA盒（TATA）、转录起始位点（TSS）和ChIP引物靶向的确切区域（右侧标签）。
甲基化分析显示F9 RARα中Mest和Tex13启动子区的CpG甲基化增加−/−细胞，从Wt细胞中任一基因的~60%到RARα的80%−/−单元格(A） ●●●●。值得注意的是，Mest启动子区的两个CpG（−32和−149）持续显示低甲基化水平，即使在RARα−/−细胞。启动子甲基化增加与RARα中Mest和Tex13转录水平降低相关−/−单元格(C） ●●●●。RARα启动子甲基化增加−/−细胞通过增加DNA甲基化支持细胞记忆的想法从头开始甲基化是通过随后的细胞分裂来维持的。相反，F9 RARα中Slc38a4和Stmn2启动子的甲基化降低−/−Wt中两个基因的细胞数从约90%增加到RARα中的40%−/−单元格(A） ●●●●。总之，F9 RARα的敲除导致Mest和Tex13启动子甲基化增加，Slc38a4和Stmn2启动子甲基化度降低，每一个都与RARα转录水平的改变有关−/−相对于F9 Wt电池(A、 C和A） ●●●●。相反，Cyp26a1启动子区即使在转录沉默时也未甲基化，即在缺乏RA的情况下[数据未显示和(31)]
我们想通过测量表征Mest、Tex13、Slc38a4和Stmn2启动子区表观遗传特征的关键组蛋白标记来阐明RARα对RA-independent转录调控的潜在机制。具体而言，我们评估了Wt和RARα中Mest、Tex13、Slc38a4和Stmn2启动子上的H3K9/K14ac、H3K9me3和H3K4me3标记−/−染色质免疫沉淀法（ChIP）检测细胞系。此外，RA诱导的Cyp26a1启动子上的组蛋白标记(E） 被评估为对照组（Mest、Tex13、Stmn2、Slc28a4和Cyp26a1-ChIP靶区(补充数据)).
Mest和Tex13启动子的H3K9/K14ac水平下降，而RARα启动子的Stmn2和Slc38a4水平升高−/−相对于Wt(B、 上部面板）。RA处理细胞中Cyp26a1启动子处H3K9/K14ac水平的增加证实了RA在Wt和RARα中的转录激活−/−单元格(D和B） ●●●●。我们还发现Mest启动子的H3K9me3水平升高，而RARα中Slc38a4启动子的水平降低−/−相对于Wt细胞(B、 中间面板）。F9 RARα中Tex13和Stmn2启动子的H3K9me3水平没有变化−/−相对于Wt细胞(B、 中间面板）。在RARα中，Mest和Tex13启动子的H3K4me3水平降低−/−相对于Wt细胞(B、 而Stmn2和Slc38a4启动子的水平相对于Wt细胞增加(B、 下部面板）。RA处理细胞中Cyp26a1启动子处H3K4me3水平的增加进一步证实了RA的转录激活(B、 下面板）。因此，敲除RARα后Mest、Tex13、Slc38a4和Stmn2启动子区域中DNA甲基化的变化与与相应启动子相关的组蛋白标记的变化相关。重要的是，表观遗传特征的这些特定变化也与RARα中Mest、Tex13、Slc38a4和Stmn2转录水平的特定变化相关−/−细胞相对于Wt细胞。
RARα和RXRα与Mest相关，但与Tex13、Slc38a4和Stmn2启动子无关
接下来，我们想确定Mest、Tex13、Slc38a4和Stmn2是否是RARα的直接靶点，我们使用RARα抗体进行了ChIP，并测量了与RARα相比，Wt免疫沉淀染色质中Mest、Tex13、S1c38a4及Stmn2启动子的富集度−/−细胞。为了评估RARα与RXRα的异二聚作用，我们使用RXR抗体进行了平行的ChIP分析(补充数据).
我们在Mest启动子处发现了RARα（在未经治疗和RA-治疗的Wt细胞中，RARα是RARα的2倍以上−/−细胞，P（P） < 0.05），但不在Tex13、Stmn2和Slc38a4启动子区（每个区的富集度<2倍，P（P） > 0.05). 这表明只有Mest启动子是RARα的直接靶点(A） ●●●●。相反，RA处理后Wt细胞Cyp26a1启动子处的RARα水平增加（>2倍，P（P） < 0.05），但不在RARα中−/−单元格(P（P） > 0.05). 然而，Cyp26a1的转录并不依赖于RARα，因为在Wt和RARα中观察到类似的Cyp26al1转录水平−/−添加RA后的单元格(E） ，这也与主要依赖RARγ的Cyp26a1的转录一致(29). 我们得出结论，RARα与Mest启动子相关，但与Tex13、Stmn2和Slc38a4启动子无关。为了支持我们的发现，MCF-7乳腺癌细胞中RARα结合位点的全基因组定位显示，RARα与Mest启动子近端结合，但与Tex13、Stmn2和Slc38a4启动子不结合(12).
RARα和RXRα与靶启动子结合。通过实时PCR对Wt和RARα的染色质IP进行启动子特异性ChIP定量−/−用载体或RA处理细胞（载体–0 h；灰色和RA–24小时；深灰色条）。染色质使用IPed(A类)RARα抗体(B类)RXRαAb或(C类)IgG阴性对照。西方的污点f显示抗体对RARα的特异性。来自IgG IP的平均信号设置为1（以A、B和C中的浅灰色背景标记）。数据代表每个抗体的四个独立的IP，为每个IP收获新的染色质。统计显著性由P（P）< 0.05用于所示比较。
我们仅在Wt细胞的Mest启动子处鉴定出RXRα（相对于RARα>2倍−/−细胞，P（P） < 0.05），但不在Tex13、Stmn2和Slc38a4启动子处（每个启动子的富集度<2倍，P（P） > 0.05). 这表明只有Mest启动子是RXRα的直接靶点(B） ●●●●。相反，我们检测到Wt和RARα中Cyp26a1启动子的RXRα依赖于RA的增加−/−细胞（Wt和RARα中的信号高出2倍以上，这一点很明显−/−RA后的细胞，P（P） = 分别为0.01和0.03）。即使在RARα中，Cyp26a1启动子的RXRα水平也有轻微的RA依赖性增加−/−（~2倍）表明RARβ和/或RARγ是Cyp26a1启动子处RXRα的伴侣，从而证实了RARγ在Cyp26al1调控中的作用(30). 分析表明，RXRα仅在Wt细胞中与Mest启动子相关，例如仅在存在RARα的情况下。已报道的RARα和RXRα异二聚反应(56)证实了RXRα对RARα与Mest启动子关联的要求。我们得出结论，RARα/RXRα异二聚体的直接结合是维持Mest基因RA-依赖性转录所必需的(B） ●●●●。
RARα依赖的表观遗传调控模型。(A类)RARα/RXRα异二聚体与Mest启动子区的配体依赖性结合是维持转录允许的组蛋白修饰（H3K4me3和H3K9/K14ac）和启动子CpG岛相对较低的甲基化水平所必需的。RARα基因敲除导致Mest启动子甲基化水平升高，组蛋白修饰缺失和组蛋白修饰增加（下表）。(B类)活性转录基因显示启动子甲基化水平相对较低，H3K9/K14ac和H3K4me3水平较高（Wt中的Mest和Tex13，RARα中的Stmn2和Slc38a4−/−)，而沉默的基因表现出高水平的启动子甲基化，如果父系表达，则表现出高水平的H3K9me3（Wt中的Slc38a4，RARα中的Mest−/−). 转录起始位点（TSS）和相对转录活性分别由箭头和箭头大小表示。CpG启动子甲基化的相对水平用黑色棒棒糖表示（每个评估的富含CpG的区域跨越TSS，但为了清楚起见，绘制在TSS上游）。
RARα异位表达2F9 RARα中−/−细胞部分恢复Mest转录水平
确认RARα中观察到的转录活性改变−/−与Wt细胞相关的细胞确实是由我们重新导入的RARα的缺失引起的2，在F9细胞中是源自RARα基因的主要表达亚型。我们从F9 RARα中衍生出两个独立的细胞系−/−细胞系（RARα−/−：RARα2，克隆#1和克隆#2），稳定表达小鼠RARα2在RARα空背景中(补充数据)). 然后我们评估了两个RARα中每一个的Mest、Stmn2、Tex13和Slc38a4转录水平2恢复细胞系。
我们观察到两种RARα中Mest转录水平增加2相对于亲本F9 RARα的修复细胞系−/−细胞系(A、 左上角，P（P）< 0.01). RARα2每个RARα的转录水平2修复细胞系低于Wt中的RARα转录水平（分别为67%和50%），但仍显著高于RARα−/−单元格(A、 右上角，P（P）< 0.01). 通过恢复RARα，整个Mest启动子甲基化没有逆转2表达式(A、 但与Wt和RARα敲除细胞相比，特定CpG位点（−155、−124和−32）的甲基化水平极低。两种RARα中Stmn2转录水平均降低2相对于亲本F9 RARα的修复细胞系−/−细胞系(A、 中上部）。两个RARα之间的Tex13和Slc38a4转录水平不一致2恢复细胞系(A、 下部）。
异位RARα表达影响F9细胞中Mest转录水平。(A类)全长RARα2在F9 RARα中稳定表达−/−单元格（右上角）。实时PCR评估的转录水平表明Mest转录水平部分恢复（左上），但启动子整体甲基化没有逆转（左下）。Stmn2转录水平没有受到影响（中间面板）。Tex13和Slc38a4转录水平在两个独立的RARα之间不一致2恢复线（中下部和右侧面板）。这个P（P）-值显示RARα的比较2将细胞系恢复到RARα基因敲除细胞系。这些数据代表三个独立的分析，为每个实验采集新的RNA。(B类)PML–RARα癌基因在F9 Wt细胞中稳定表达。实时PCR评估的转录水平（左上角）表明，Mest的PML–RARα蛋白的显性负功能与启动子甲基化水平增加有关（左下角），而Tex13、Slc38a4和Stmn2转录水平未受影响（Wt，24 h RA设置为1）。RA诱导的Cyp26a1转录在PML–RARα表达细胞中受损（右上图）。RA治疗的持续时间由条形颜色表示（0 h；灰色，8h；浅灰色，24h；深灰色条）。这个P（P）-数值显示PML–RARα细胞系与F9 Wt细胞的比较。这些数据代表三个独立的分析，为每个实验采集新的RNA。
这些数据表明RARα中Mest和Stmn2转录水平的改变−/−细胞株与RARα缺乏有关。此外，我们观察到Mest和Stmn2转录水平仅在RARα后部分恢复2RARα中的恢复−/−单元格(A、 左上角），表明RARα−/−表型不完全可逆。
PML–RARα癌基因的表达改变了直接RARα靶基因Mest的转录水平
APL通常由(15;17)（q22；q12–21）易位，引入致癌PML–RARα融合蛋白的表达(2,57). 一些报告表明，致癌RARα融合蛋白通过作为显性负RAR的功能部分导致APL(4,58,59). 我们假设致癌PML–RARα融合蛋白将作为主要负调控蛋白发挥作用，有效阻止RARα（可能还有RARβ和RARγ）在F9 Wt细胞中发挥作用。如果我们的假设是正确的，在F9 Wt细胞中PML–RARα癌蛋白表达后，诸如Mest等基因（其表达由RARα维持）将沉默。此外，如果F9 Wt细胞中显性阴性PML–RARα过度表达的表型与RARα基因敲除细胞的表型相似，这将验证RARα在RA-依赖性转录调控中的作用。
为了验证这个假设，我们建立了一个F9细胞系，PML–RARα+（Wt），在野生型背景中稳定表达小鼠PML–RARα融合蛋白（PML的562个氨基末端残基与RARα的400个羧基末端残基融合(补充数据)). 然后我们评估了PML–RARα中Mest、Tex13、Slc38a4和Stmn2转录水平+（Wt）电池。由于致癌RARα融合蛋白减弱HL-60和U937细胞的RA反应性(4,59)，RA处理F9 PML–RARα诱导Cyp26a1转录+平行评估（Wt）细胞。
我们观察到F9 PML–RARα中Mest转录物水平降低，启动子甲基化水平升高+（Wt）相对于F9 Wt电池(B） ●●●●。相反，在PML–RARα中，Tex13表达增加了约20%+（Wt）与Wt细胞相比(B） ●●●●。PML–RARα中仅观察到Slc38a4和Stmn2转录水平的微小变化+（Wt）相对于Wt电池(B） ●●●●。因此，PML–RARα融合蛋白在F9 Wt细胞中的表达与RARα−/−表型与Mest有关，但与Tex13、Slc38a4和Stmn2转录水平无关。此外，在PML–RARα中，Cyp26a1 mRNA水平降低至25%+RA 24小时后（Wt）细胞相对于Wt细胞(B） PML–RARα过度表达后，Cyp26a1基因的RA反应性显著减弱。总之，尽管RARα基因敲除与Mest和Tex13转录水平降低以及Slc38a4和Stmn2转录水平升高有关，但在F9 Wt细胞中PML–RARα融合蛋白过度表达后，只有Mest转录水平降低。因此，在F9 Wt细胞中稳定表达PML–RARα蛋白，就Mest转录水平和启动子甲基化而言，重现了RARα敲除表型。
讨论
通过DNA甲基化的转录沉默已被广泛研究，但通过DNA去甲基化的逆转录激活过程仅在最近几年才开始受到关注。我们已经证明，RARα的敲除伴随着Mest和Tex13启动子区域甲基化的增加，以及Slc38a4和Stmn2启动子区域的甲基化的降低，这一效应在恢复RARα转录水平时部分恢复2RARα的表达−/−细胞。此外，关于Mest，RARα−/−F9 Wt细胞中PML–RARα的过度表达再现了表型。
在RARα中−/−Mest和Tex13细胞总启动子甲基化从60%增加到80%。然而，尽管Mest转录水平和H3K9/K14ac水平严重降低（分别降至13%和15%，−/+RA），但Tex13转录水平和H3K9/K4ac含量仅适度降低（分别至49%和48%，−/+RA）。因此，启动子甲基化仅部分反映了转录活性。H3K9me3抑制性组蛋白标记与Mest启动子区的相关性比Tex13启动子区强得多，这可能解释了在RARα−/−细胞。总的来说，启动子甲基化水平的改变与组蛋白修饰的特定变化（H3K9me3、H3K9/K14ac和H3K4me3）相关。RARα和RXRα与Mest启动子区的RA非依赖性结合与RXRα在Cyp26a1启动子区的RA依赖性富集形成对比，并指出RARα/RXRα异二聚体在防止Wt细胞Mest启动子区的DNA甲基化中的直接作用。我们的数据还表明，F9 Wt细胞中的RARα间接维持了Tex13启动子区较低水平的DNA甲基化以及Slc38a4和Stmn2启动子区的高度甲基化状态(B） ●●●●。然而，我们不能排除远程RARα结合位点调节Tex13、Stmn2和Slc38a4表达的可能性，因为这些在启动子特异性ChIP分析中无法检测到。
一种新的RARα配体诱导依赖函数
据报道，维甲酸受体和其他核激素受体主要通过在有配体和无配体的情况下可逆地激活和抑制转录活性来调节转录(30,31,60–62). 我们鉴定了几个转录本，包括Mest、Tex13、Slc38a4和Stmn2，它们在F9 Wt和RARα之间差异表达−/−细胞以RA-依赖的方式，例如外源性添加RA对转录水平测量的转录活性没有影响()启动子甲基化和组蛋白修饰(). 我们不能排除这些差异是由内源性配体引起的，但许多研究结果证明RARα具有非连锁功能。首先，几个已知的RA反应基因，包括Hoxb5、Hoxa5、Cyp26a1和Hoxb2，在F9 Wt和RARα中被有效诱导−/−添加RA后的单元格(E） 从而证明RA在RARα中的正转录作用−/−细胞。其次，我们和其他人已经证明RARα可以介导报告质粒的RA-依赖性转录(63,64)，从而具有介导配体依赖性转录激活的能力。第三，使用无偏见的全基因组方法，已确定RARα结合位点接近RA反应基因和RA非反应基因(11,12)有人建议RA响应性可能由RARE的特定配置决定。在这方面，特别有趣的是，Mest启动子在ChIP靶区的下游含有一个简并的RARE(C） ●●●●。我们的研究结果表明，在F9细胞中，Mest启动子区的RARα和RXRα水平不受RA的影响，因为RA处理Wt细胞后，IP信号没有显示出统计上显著的变化[p（RARα） = 0.28和p（RXRα） = 分别为0.72，]. 这表明RARα/RXRα异二聚体可以独立于RA维持Mest的转录。相反，RA处理Wt细胞后，Cyp26a1启动子区的RARα和RXRα水平增加【p（RARα） = 0.04和p（RXRα） = 分别为0.01，]. 这些结果表明，RA治疗导致RA反应元件的RARα（和RXRα）水平增加（正如Cyp26a1的启动子近端RARE所观察到的那样），而其转录活性独立于配体结合的RAR靶点（例如Mest）没有显示RARα水平的变化（和RXα）RA治疗后(A） ●●●●。有趣的是，即使在没有配体的情况下，RARs和RXRs与RARE组成性关联的模型最近也受到了一项研究的挑战，该研究表明RARs、RXRs+RARE与内源性RARE之间存在高度动态和依赖RAR的关联(65). 值得注意的是，Mest启动子包含一个退化的假定RARE（DR1），而Cyp26a1启动子包含两个近端RARE（DR5），因此可能解释了RA诱导Cyp26al1转录而非Mest转录的原因。或者，顺式-结合转录因子可能调节RARα的功能。在这方面，Mest启动子中两个CpG的甲基化水平相对较低，即使在RARα−/−细胞，可能表明存在组成结合的转录因子。位于CpG（−149）附近的假定NFkB-结合位点（GGRNNYCC）和位于CpG-（−32）附近的潜在TATA-盒可能表明几个转录因子的协同作用。RARα恢复后2有趣的是，CpG（−32）未甲基化。相反，CpG（−149）高度甲基化，但CpG的两个相邻位点（−148）的DNA甲基化水平较低。总之，恢复的RARα部分挽救了Mest转录水平2表达式。然而，启动子甲基化只在特定位点发生逆转。这表明这些位点可能是调节Mest转录活性的关键。
PML–RARα在F9 Wt细胞中的表达模拟RARα基因敲除细胞中异常的Mest转录
F9 Wt细胞中PML–RARα的表达对Mest和Cyp26a1转录水平有不同的影响(B） ●●●●。RA对Cyp26a1的转录诱导在PML–RARα中减弱+（Wt）但不在RARα中−/−细胞。相反，PML–RARα中Mest表达均减少+（Wt）和RARα−/−相对于Wt细胞的细胞(B） ●●●●。而Cyp26a1的转录受配体结合RARβ和/或RARγ的调节(29)，Mest的转录与启动子甲基化和近端启动子区RARα/RXRα二聚体的存在密切相关。因此，PML–RARα的表达和RARα基因敲除对Mest表达的影响相似，但对Cyp26a1表达的影响不同。RARα仅与Mest启动子的配体依赖性关联()可以解释为什么PML–RARα的引入仅对Mest基因模拟了RARα的损失，而对Tex13、Slc38a4和Stmn2不模拟。我们认为，如前所述，PML–RARα表达减弱了RA-诱导启动子（如Cyp26a1）的转录，但在功能上模拟了RARα靶启动子缺乏RARα，而RARα无RA反应性（如Mest）。
与RARα的关联保持高转录活性和低启动子甲基化水平
当比较RARα基因敲除细胞中异常转录水平的基因集与评估MCF-7细胞中RARαDNA结合的全基因组研究中确定的基因组RARα靶点时(12)一个有趣的模式出现了。Hua等人鉴定的RARα结合位点专门定位于F9 RARα敲除细胞（Mest、Tcfap2a、Cux1、HMGcs1和Gab1，A和B(补充数据)). 没有发现7000多个RARα结合位点(12)映射到F9 RARα敲除细胞中转录水平升高的基因（相对于F9 Wt细胞），这表明RARα直接调控的靶基因在缺乏RARα的情况下表达降低。我们在Wt细胞中观察到RARα与Mest启动子的直接关联，并在RARα敲除细胞中增加了Mest的启动子甲基化，这表明RARα通过直接关联可以阻止特定启动子的CpG甲基化。混合型白血病（MLL）是Trithorise家族的H3K4甲基转移酶，通过阻止小鼠胚胎成纤维细胞Hoxa9启动子区的CpG甲基化来维持转录(66). RARα中与Mest启动子区相关的H3K4me3减少−/−单元格(B、 下部小组）认为MLL的H3K4甲基转移酶活性在Mest和可能在RARα中表达减少的其他基因的表观遗传调控中起着重要作用−/−细胞。有趣的是，有报道称RARα与MLL5直接相互作用，MLL5是造血中的关键MLL(67,68). 这为RARα的甲基化抑制功能提供了一种生物学相关的潜在机制。
RARα的功能可通过TIF1β进行调节
Mest转录活性由RARα/RXRα异二聚体维持的概念提出了一个有趣的问题，即为什么RA治疗不会诱导Mest。有人认为RAR/RXR异二聚体的结合是必需的，但不足以实现RA反应性(11). 事实上，该模型与观察到的RARα与缺乏RA反应基因的基因组元件结合一致(12). 或者，RA反应性的缺乏可能是由调节RARα活性的辅阻遏物（例如Sin3a、N-CoR2或TIF1β）的活性引起的。在TIF1β杂合的F9细胞中，Mest的表达是RA诱导的(69)表明TIF1β可以调节RARα的活性。另一个候选物是PRAME联合阻遏物，它可以在RA存在时与RAR结合并阻止配体诱导的转录激活(70)，可能通过抑制RARα。然而，体外表达的PRAME和RARα均对HDAC抑制剂诱导的生长停滞和凋亡产生抵抗(71)这表明外源性表达的PRAME和RARα具有相似而非相反的功能。
或者，建议采用RARE配置来确定RA响应性(11)，但可能由启动子特异的表观遗传特征进一步调控。事实上，RA诱导的Cyp26a1启动子中RARα水平的增加与RA非应答性Mest启动子中的RARα的不变水平相比()表明启动子表观遗传特征在决定RAR关联性以及RA反应性方面发挥作用。组蛋白修饰和转录水平支持了这一点，这表明Mest基因在缺乏RA的情况下具有转录活性(C） 而Cyp26a1在没有RA的情况下是沉默的(E） ●●●●。
RARα调节印迹的生物学相关性
Wt和RARα转录水平不同的大多数基因−/−细胞系在胎盘、睾丸和大脑中表达(补充数据). 这些组织都是印迹在转录调控中发挥主要作用的部位(54,55)重要的是，RARα在这些特定组织中表达(72–74). 我们预测RARα在调节动物的遗传印记中起着关键作用，但这一点尚待研究。
最近的研究表明，生长板是长骨骨骺和干骺之间的软骨结构，从干样软骨细胞分化为肥大的软骨细胞与Mest表达减少和Slc38a4表达增加有关(75). 这种反向相关性证实了我们的发现，并为这里确定的分子机制提供了一个生理学框架。基于RARα在造血中的关键作用(1)RARα与MLL5的相互作用(67)我们推测，在造血干细胞分化过程中，Mest和Slc38a4表达也发生了类似的变化，这些转录活性的变化与此处报道的DNA和组蛋白的表观遗传变化有关。本文确定的RARα的配体依赖性机制为RA受体的作用机制提供了新的线索，并建议在研究RA受体的表观遗传行为时，除了配体诱导的转录调控外，还应考虑配体依赖的调控。
