癌基因EGFR信号激活mTORC2-NF-κB通路，促进化疗耐药

摘要

简介

哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，与包括癌症在内的多种疾病有关。mTOR存在于两种多蛋白复合物中，它们对变构mTOR抑制剂雷帕霉素的调节、功能和反应不同(1). mTORC1包括与猛禽和其他核心监管组件相关的mTOR。在磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）下游，mTORC1被Akt激活，至少部分通过抑制TSC1-TSC2复合物的磷酸化。mTORC1将PI3K信号传导与蛋白质合成、代谢和细胞生长的控制联系起来(2,三).

mTORC2由mTOR与独特的调节蛋白组成，包括Rictor和SIN1(1). 与mTORC1相反，mTORC2在Akt上游起作用，其调节机制尚不清楚(1,4). PI3K催化磷脂酰肌醇的形成(三,4,5)-三磷酸（PIP3），将Akt带到细胞膜上，在T308上被磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）磷酸化，在S473上被mTORC2磷酸化，以促进Akt的最大活性(5–9). 已证明正确的Akt信号需要mTORC2体内在胚胎发育过程中其丢失是致命的(4). Akt激活被认为是mTORC2的关键功能。然而，mTORC2也磷酸化其他与Akt相关的蛋白激酶，包括血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1（SGK1）和PKC家族的一些成员(10–13)，增加了mTORC2可能具有独立于Akt的重要细胞功能的可能性。

mTOR信号传导在癌症中经常失调(7,14). 影响受体酪氨酸激酶的扩增和激活突变、PI3K及其调节亚单位的突变以及PTEN抑癌蛋白的丢失导致PI3K的升高和生长因子依赖性激活，伴随着mTOR信号的下游激活(15). mTORC1促进细胞生长和增殖，激活低氧诱导因子1依赖性糖酵解（HIF1）(16)并刺激多种癌症的血管生成(17,18). 因此，mTORC1已被确定为癌症药物靶点。与mTORC1相比，mTORC2在癌症中的作用尚不清楚。小鼠PTEN缺失诱导的前列腺癌的发生需要mTORC2，提示其在介导PI3K依赖性致癌过程中起着中心作用(19). 然而，目前尚不清楚靶向mTORC2在临床上的影响。与mTORC1的情况不同，变构mTOR抑制剂雷帕霉素不直接结合和抑制mTORC2(1). 这一点至关重要，因为雷帕霉素在治疗多种PI3K过度活化癌症方面已经失败(20)，质疑mTOR2作为药物靶点的有效性。新一代具有抗mTOR复合物活性的mTOR激酶抑制剂可能会为mTORC2信号在癌症中的重要性提供新的见解(21).

胶质母细胞瘤（GBM）是成人最常见的原发性恶性脑癌，是一种重要的肿瘤，研究mTORC2信号在肿瘤发病机制和治疗反应中的作用。PI3K信号在近90%的GBM中过度激活，最常见的与表皮生长因子（EGFR）扩增和突变以及PTEN抑癌蛋白的丢失有关。我们之前已经证明，mTOR是EGFR突变、PTEN缺乏的GBM下游信号传导的关键效应器，介导对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐药性(22). Akt S473磷酸化升高与显著缩短肿瘤进展时间相关，这表明负反馈回路对PI3K信号的重要性在临床试验中是显而易见的(20). 激活mTORC1后S6K介导的负反馈使Rictor磷酸化以抑制mTORC2，而这不是通过胰岛素受体底物1（IRS-1）实现的，并且可能存在其他反馈机制(23,24). 因此，mTORC1的抑制可能不足以抑制肿瘤生长，这可能意味着mTORC2是PI3K信号传导的关键介质。与这一临床观察一致，最近的一项研究发现，mTORC2的苍蝇直系图是生长果蝇属EGFR和PI3K激活的胶质瘤模型(25).

NF-κB，通常是p50-RelA/p65异二聚体，在多种癌症中被激活，并发挥控制与增殖和抑制凋亡相关基因表达的功能(26,27). NF-κB通过与IκB家族蛋白的相互作用负调控，并通过IKK激活，IKK磷酸化IκB，导致其蛋白酶体依赖性降解。NF-κB的激活与癌症治疗抵抗密切相关(26). 有趣的是，大多数EGFR表达的胶质瘤表现出编码IκBα（NF-κB的主要负调控因子）的NFKBIA的单等位缺失(28). 这些结果表明，在EGFR未被扩增或突变的条件下，NF-κB活化在EGFR依赖性信号传导下游的胶质瘤中是重要的(29). 最近的研究表明，肺癌中点突变的EGFR可以导致NF-κB的激活，并且NF-κ的B在这种情况下对癌细胞的生长/存活很重要(30)尽管其激活的潜在机制尚不清楚。

为了解决这些问题，我们对GBM细胞系进行了综合分析，体内以检测mTORC2信号传导在癌症中的重要性。在这里，我们证明EGFRvIII促进mTORC2激活，PTEN抑制其激活。我们证明mTORC1和mTORC2的双重抑制抑制肿瘤生长并导致肿瘤细胞死亡。令人惊讶的是，我们发现mTORC2通过NF-κB促进Akt-非依赖性化疗耐药，顺铂耐药可以逆转体内通过抑制mTORC2。这些结果证明了mTORC2信号在GBM中的重要性，并指出了以前未被认识到的mTORC1在介导癌症化疗耐药中的作用，表明需要单独或与化疗联合抑制mTORC2。

结果

EGFRvIII刺激mTORC2激酶活性和信号传导

mTORC2激活的机制尚不清楚(21). 通过PI3K传递生长因子信号(10,31–34)可能通过增强与核糖体的结合(34)，以及mTORC2调节亚基的上调(19,35,36)被认为是mTORC2激活的机制(21). 为了确定致癌EGFR是否影响mTORC2，我们使用了一组由GBM衍生的等基因细胞系，这些细胞系代表了在存在或不存在EGFR过度表达或激活突变（EGFRvIII）的情况下导致GBM:PTEN丢失的最常见遗传事件(22,37). Akt S473的磷酸化是最具特征的mTORC2活性(10). 然而，mTORC2也激活了SGK1，并且T346上SGK1特异性底物NDRG1的磷酸化已成为mTORC1信号传导的可靠生物标志物(11,38).

EGFRvIII和野生型EGFR在较小程度上增加了Akt S473和NDRG1 T346磷酸化(图1A;补充图S1A). 当EGFRvIII置于不同GBM细胞系LN229的多西环素可调节启动子下时，同样以剂量依赖的方式增加Akt S473和NDRG1 T346的磷酸化(图1B)从而证实了不同细胞系模型中EGFRvIII介导的mTORC2信号，尽管Rictor表达没有改变(图1A和B). 当肿瘤细胞被移植到异种移植模型中时，EGFRvIII的表达与mTORC2信号的升高类似(图1C). 肝细胞生长因子（HGF）刺激表达MET的GBM细胞，MET是GBM中常见的另一种PI3K激活受体酪氨酸激酶，导致Akt S473和NDRG1 T346磷酸化。然而，与EGFRvIII表达的肿瘤细胞中检测到的持续mTORC2信号相反，该信号是短暂的(补充图S1B).

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图1

EGFRvIII刺激mTORC2激活在体外和体内

（A） 使用U87等基因细胞对mTORC2生物标记物上的EGFRvIII/EGFR信号进行生化分析。细胞系在无血清培养基中培养24小时。

（B） 将EGFRvIII置于强力霉素可调节启动子下的LN229 GBM细胞的免疫印迹分析。

（C） 代表性免疫组织化学图像显示p-EGFR（Y1068）、p-Akt（S473）和p-NDRG1（T346），以评估EGFRvIII介导的mTORC2信号。比例尺，20μm。

（D） PTEN重组对EGFRvIII介导的mTORC2信号传导的影响。

（E） 将U87等基因细胞的裂解液与Rictor抗体或对照IgG进行免疫沉淀。以昆虫细胞纯化的Akt1为底物，将蓖麻免疫沉淀物分成等分进行单独的激酶反应。将PP242添加到EGFRvIII细胞的激酶反应中。通过Akt S473磷酸化来评估mTORC2体外激酶活性。

（F） EGFRvIII模拟mTORC2信号的模式。

另请参见补充图S1.

鉴于证实在PTEN缺失依赖性前列腺癌发生中对mTORC2的需求(19)，我们检测了PTEN重组对mTORC2信号的影响。外源性PTEN再表达抑制EGFRvIII介导或EGF刺激的mTORC2信号传导(图1D;补充图S1C). 因此，EGFRvIII促进GBM细胞中的mTORC2信号传导，而PTEN部分抑制了该信号传导。

为了确定上述致癌EGFR信号和PTEN丢失对mTORC2下游靶点的影响是否反映了mTORC1激活的直接增加，我们测量了U87 GBM细胞或表达EGFRvIII的等基因对应物的Rictor免疫沉淀物中的mTORC2kinase基础活性。与野生型和致癌型EGFR之间的差异以及PTEN的抑制作用一致，EGFRvIII的表达促进了mTORC2激酶活性的16倍增加，该活性被PTEN的重组部分抑制，并被mTOR激酶抑制剂PP242完全消除(图1E). 野生型EGFR的过度表达激活了mTORC2激酶活性，但程度较低，PTEN也同样抑制了其活性(图1E). 这些结果表明EGFRvIII刺激mTORC2激活，而PTEN部分抑制了mTORC1激活(图1F). 综上所述，这些结果表明EGFRvIII与GBM细胞中mTORC2活性和下游信号的增加有关在体外和体内.

mTORC2信号促进GBM生长和存活

为了确定mTORC2在GBM中的功能意义，我们检测了Rictor敲除和过度表达的影响。Rictor敲低抑制了所有测试的GBM细胞（U87MG、U87/EGFRvIII、U251、T98G）的增殖，并增强了表达EGFRvIII的肿瘤细胞的抗增殖作用(图2A;补充图S2A). 肿瘤细胞增殖减少与G1细胞周期分数增加有关(补充图S2B). 相反，Rictor过度表达导致肿瘤细胞增殖增加2.5倍（p<0.001；图2B)和外源性myc-Rictor在U87细胞中与mTOR形成复合物。综上所述，这些结果表明mTORC2信号促进GBM增殖。

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图2

mTORC2促进GBM细胞生长，对雷帕霉素治疗耐药，其抑制作用具有抗肿瘤作用

（A） 将Rictor siRNA或干扰对照siRNA构建物转染U87和U87/EGFRvIII细胞48小时，置于96 well平板中。用细胞增殖试验计算相对细胞生长。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM（统计显著，*p<0.05，NS；不显著）。

（B） 将表达myc-Rictor的载体或空载体转染U87细胞48小时，置于96周平板中。用细胞增殖试验计算相对细胞生长。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.001）。IP；免疫沉淀法；免疫印迹分析

（C） 接受雷帕霉素治疗的GBM患者肿瘤标本中p-Akt（S473）、p-NDRG1（T346）和p-S6（S235/236）染色（红棕色）的免疫组织化学图像。组织用苏木精复染。比例尺，50μm。

（D） 用siRNA Rictor和/或雷帕霉素处理U87/EGFRvIII细胞，对p-Akt（S473）、p-NDRG1（T346）和p-S6（S235/236）进行免疫印迹分析。

（E） 免疫印迹分析使用U87/EGFRvIII和U251MG细胞的指示抗体以及针对猛禽、立克次体或扰乱对照的siRNA。

（F） 在6孔板中用针对Raptor、Rictor或打乱对照的siRNA构建物转染U87/EGFRvIII细胞24小时，并改为1%FBS培养基3天。用台盼蓝排斥法测定细胞死亡。数据代表三个独立实验的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.05，**p<0.01）。

（G） U251MG细胞在6孔板中转染抗猛禽、立克次体或干扰对照的siRNA构建物24小时，并换成1%的FBS培养基3天。用台盼蓝排斥法测定细胞死亡。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.05，**p<0.01，#p<0.05,#p<0.01.）。

另请参见补充图S2、3和4.

雷帕霉素是一种高度特异的变构mTOR抑制剂，可阻断mTORC1活性，对mTORC2有不同的影响(39). 已知mTORC1信号通过多种机制对Akt激活产生负反馈效应(23). 我们之前观察到GBM患者临床进展更快，其肿瘤显示S6K1磷酸化受到抑制，同时Akt S473磷酸化增加(20). mTORC2能够支持GBM增殖的发现增加了mTORC1信号可能是雷帕霉素临床耐药性的潜在基础的可能性。为了确定在雷帕霉素治疗期间是否可以检测到mTORC2信号，我们分析了一名GBM患者治疗前后的肿瘤组织。雷帕霉素治疗后，mTORC1活性标记物磷酸化-S6（S235/236）免疫染色降低，而mTORC2活性标记物，包括Akt（S473）和NDRG1（T346）的磷酸化相对于基线水平升高(图2C). 在EGFRvIII表达的GBM细胞中，雷帕霉素处理16小时同样抑制了mTORC1信号，如S6（S235/236）磷酸化降低所测(图2D). 相反，mTORC2信号的标记物同时增加，其作用被Rictor基因敲除而消除(图2D). 这些结果表明，mTORC1和mTORC2的双重抑制可能更有效。

因此，我们分析了Rictor和Raptor单独或联合敲除对信号转导、肿瘤细胞增殖和存活的影响。与雷帕霉素治疗类似，猛禽基因敲除增加了U87/EGFRvIII、U251和A172细胞中的mTORC2信号(图2E;补充图S3). 相反，Rictor基因敲除降低了mTORC2信号(图2E;补充图S3). Raptor和Rictor联合敲除显著降低U87/EGFRvIII和U251模型中的细胞增殖，并增加U251细胞中的细胞死亡(图2F和G). 这些结果表明mTOR激酶结构域抑制剂具有潜在的治疗效用，其靶向两种信号复合物。与该模型一致，mTORC1和mTORC2信号都被mTOR激酶抑制剂PP242抑制(40)以剂量依赖性方式显著抑制GBM细胞增殖(补充图S4A和B).

EGFRvIII通过mTORC2激活NF-κB

鉴于我们的发现，mTORC1抑制不足以阻止GBM生长(20)，我们检测了可能在GBM中激活的其他通路。我们的候选下游通路中包括NF-κB，我们发现其被EGFRvIII突变体强烈激活，如p65和IκBα磷酸化、总IκBα水平降低以及NF-κ子B靶基因Bcl-xL和细胞周期蛋白D1的表达所示(图3A). 在电泳迁移凝胶位移分析（EMSA）中，EGFRvIII显著增加NF-κB DNA结合活性(图3B)NF-κB荧光素酶报告活性增加4倍（p<0.01；图3C)NF-κB靶基因cyclin D1的表达增加（10倍，p<0.01）；Bcl2（10倍，p<0.01）和Bcl-xL（30倍，p<0.001；补充图S5A). 这些活性依赖EGFR激酶(补充图S5A)并且可以通过PTEN在这些细胞中的重新表达而被抑制(图3C). 在肿瘤异种移植模型中，NF-κB的激活也与EGFR信号相关，p65磷酸化的增加表明了这一点（p<0.001；补充图S5B)并且EGF刺激的NF-κB活化被PTEN的重组所抑制(补充图S5C).

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图3

EGFRvIII通过mTORC2激活NF-κB

（A） 对U87等基因细胞全细胞提取物中的p-p65（S536）、p-IκBα（S32/36）和NF-κB靶基因如Bcl-xl和cyclinD1进行免疫印迹分析。

（B） 使用U87等基因细胞在无血清培养基中培养48小时后裂解的核提取物进行EMSA。箭头表示DNA/蛋白质EMSA复合物。p65和TBP的免疫印迹分析，用于使核提取物的蛋白质负荷正常化。

（C） 荧光素酶报告子使用U87等基因细胞（测量为相对荧光素酶/发光单位）分析靶向NF-κB信号转导。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.01，**p<0.05）。

（D） U87/EGFRvIII细胞中Rictor敲低NF-κB信号的生化分析。细胞系在无血清培养基中培养24小时后，转染抗Rictor和Scramb的siRNA。

（E） 使用RT-PCR方法评估敲除Rictor和打乱后U87/EGFRvIII细胞NF-κB靶基因表达mRNA水平的变化。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM。

（F） U87细胞NF-κB信号转导中Rictor过度表达的生化分析。在转染myc-Rictor表达载体或空载体后，细胞系在无血清培养基中培养24小时。

（G） EMSA使用用myc-Rictor表达载体和编码IκB超级阻遏物（IκBα-SR；人类IκBα的显性阴性突变体）的腺病毒转染的U87细胞的核提取物。箭头表示DNA/蛋白EMSA复合物，P；阳性对照，C；控制LacZ。

（H） 荧光素酶报告子检测用myc-Rictor表达载体和编码IκBα-SR的腺病毒转染的U87细胞中NF-κB信号的靶向性。数据表示三个独立实验的平均+/-扫描电镜（统计显著，*p<0.001，**p<0.000），C；控制LacZ

（一） EGFRvIII通过mTORC2刺激NF-κB的模式。

另请参见补充图S5、6、7、8和9.

最近一项淋巴细胞研究表明，NF-κB可以在mTORC2下游激活(41)，我们测试了敲除核心mTORC2组分Rictor对EGFRvIII介导的NF-κB活化的影响。通过减少IκBαS32/36磷酸化检测到，Rictor siRNA敲除抑制mTORC2信号传导并消除NF-κB活性(图3D). Rictor基因敲除也降低了NF-κB DNA结合活性(补充图S6A)并废除依赖EGFRvIII的NF-κB靶基因表达上调，如细胞周期蛋白D1、Bcl-2、Bcl-xL和IL-6(图3E).

Rictor过度表达，已证明在其他情况下激活mTORC2信号(35)导致U87MG细胞中mTORC2信号和IκBαS32/36磷酸化的剂量依赖性增加，IκBα的总表达减少(图3F). mTORC2的激活也导致NF-κB DNA结合活性显著增加(图3G)增加NF-κB荧光素酶报告活性(图3H). NF-κB靶基因表达也上调(补充图S6B)并通过IκBα激活突变体的表达而被抑制（IκB-α-超阻遏物，Iκ-Bα-SR；图3G和H;补充图S6B) (42). 这些发现表明EGFRvIII通过mTORC2激活NF-κB(图3I).

我们之前已经证明Akt可以通过PTEN阴性前列腺癌细胞中的mTORC1激活NF-κB(43)增加NF-κB活性也通过mTORC1介导的可能性。有趣的是，猛禽的敲除适度增加，而Rictor的敲除显著抑制NF-κB报告活性(补充图S7A)和IκBαS32/36磷酸化(补充图S7B). 因此，仅mTORC1抑制不能抑制GBM细胞中NF-κB的激活。此外，对Akt的药物抑制并没有减弱这些细胞中的NF-κB信号(补充图S8A). 因此，我们确定了NF-κB活性是否需要精确描述的mTORC2效应器SGK1。SGK1 siRNA敲低显著减弱NF-κB信号(补充图S8B). 总之，这些数据表明，EGFRvIII通过不需要Akt或mTORC1的SGK1依赖性途径通过mTORC2促进NF-κB活化。

mTORC2通过NF-κB介导EGFRvIII依赖性顺铂耐药，与Akt无关

NF-κB在介导EGFR下游GBM化疗耐药中的新作用(28,29)促使我们研究mTORC2在顺铂耐药中的作用。EGFRvIII使GBM细胞对顺铂（CDDP）产生显著耐药性(图4A)，如前所述(44). 如PARP裂解和TUNEL阳性细胞增加所示，Rictor siRNA敲除显著逆转CDDP抵抗，有效地使U87-EGFRvIII细胞对CDDP介导的细胞死亡敏感(图4B和D). 为了确定mTORC2介导CDDP耐药的下游机制，我们检测了下游靶点的参与，包括Akt和NF-κB。有趣的是，IκBα激活突变体（IκB-α-SR）的表达使GBM细胞对CDDP-介导的凋亡敏感，如裂解的PARP表达所示(图4C)表明凋亡抵抗是通过NF-κB介导的。与Rictor敲除不同，在TUNEL染色分析中，siRNA-介导的所有三种Akt亚型的敲除不会使GBM细胞对CDDP介导的细胞死亡敏感(图4D;补充图S9A和B). 与EGFRvIII一样，通过Rictor过度表达激活mTORC2信号也使CDDP对U87MG细胞产生耐药性，在TUNEL染色分析中通过抑制NF-κB而非Akt来逆转这种耐药性(图4E;补充图S10). 综上所述，这些结果证明了mTORC2在通过NF-κB以Akt非依赖性方式介导顺铂耐药中以前未知的作用。

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图4

mTORC2通过NF-κB介导EGFRvIII依赖性化疗耐药，与Akt无关

（A） 用不同剂量的顺铂（CDDP）处理48小时后，U87、U87/EGFRvIII、U87/EGFRvIII+加扰对照siRNA和U87/EGFR vIII+Rictor siRNA细胞的相对细胞增殖。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM。

（B） 使用转染有抗Rictor siRNA的U87MG和U87/EGFRvIII的指示抗体进行免疫印迹分析，并用CDDP或生理盐水处理打乱对照。

（C） 用CDDP或生理盐水处理的编码IκBα-SR的腺病毒感染U87/EGFRvIII的指示抗体进行免疫印迹分析。

（D） 用抗Akt1-3、Rictor和CDDP（1μg/ml）或生理盐水处理的打乱对照的siRNA转染U87/EGFRvIII细胞的TUNEL染色。凋亡细胞的百分比是使用NIH图像计算各组400个细胞中TUNEL阳性细胞的百分比。数据代表三个独立实验的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.01，NS；不显著）。图像放大100倍。

（E） 用Akt抑制剂（2.5μM）处理myc-Rictor表达的U87细胞或在CDDP处理（1μg/ml）下编码IκBα-SR的转染腺病毒进行TUNEL染色。D类；DMSO。凋亡细胞的百分比是使用NIH图像计算各组400个细胞中TUNEL阳性细胞的百分比。数据表示三个独立实验的平均+/-SEM（统计显著，*p<0.01，NS；不显著）。

另请参见补充图S9、10、11和12.

为了评估mTOR激酶抑制剂的药理抑制可用于使GBM对顺铂和其他潜在的DNA损伤化学疗法敏感的可能性，我们测试了mTOR抑制剂PP242对介导细胞对CDDP反应的作用，以及其他DNA损伤剂（替莫唑胺和足叶乙甙）。PP242显著增强了CDDP介导的U87-EGFRvIII表达的GBM细胞的死亡(补充图S11A和B)和IKK抑制剂BMS-345541一样(补充图S12A和B). PP242还增加了用替莫唑胺或足叶乙甙处理的EGFRvIII表达的GBM细胞的PARP裂解(补充图S11A和C)这表明mTOR激酶抑制剂在通过IKK/NF-κB信号传导使GBM对DNA损伤化疗敏感方面可能发挥更广泛的作用。

mTORC2抑制逆转异种移植瘤对顺铂的耐药性

确定mTORC2抑制是否使EGFRvIII表达的GBM细胞对顺铂敏感体内，我们通过shRNA-介导的Rictor基因敲除产生了稳定的细胞系。我们使用这种与mTOR激酶的药理抑制相反的遗传方法，明确地确定mTORC2信号在化疗耐药中的重要性体内，不直接抑制mTORC1信号。我们证实在U87和U87/EGFRvIII细胞中稳定敲除Rictor并抑制mTORC2和NF-κB信号，这也导致细胞增殖降低(补充图S13A和B). Rictor基因敲除显著抑制异种移植瘤中mTORC2和NF-κB信号转导，肿瘤体积缩小约50%（p<0.05；图5A、B和C)，无明显诱导凋亡。重要的是，Rictor基因敲除逆转了CDDP抵抗，导致约80%的肿瘤缩小（p<0.01；图5A和B). 在免疫组化分析中，Rictor基因敲除导致p-p65（S536）阳性肿瘤细胞减少，凋亡细胞增加5倍（p<0.001；图5D)在顺铂治疗中。因此，mTORC2抑制剂可以逆转化疗耐药性体内与顺铂协同诱导肿瘤细胞死亡。

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图5

mTORC2抑制逆转化疗耐药体内

（A） 每只小鼠皮下注射3×10⁵U87/EGFRvIII shRNA控制细胞（左侧）和3×10⁵U87/EGFRvIII shRNA Rictor细胞（右侧）。用顺铂（CDDP）腹腔注射（3mg/kg体重）治疗荷瘤小鼠。对照组接受等体积（100μl）的生理盐水（NS）。植入10天后开始治疗。在指定的时间点，测量来自6只小鼠的异种移植物的肿瘤体积。按照材料和方法测量肿瘤体积（折叠）。数据代表平均+/-SEM（具有统计学意义，**p<0.01，*p<0.05）。

（B） shRNA Rictor和CDDP或生理盐水治疗的对照组肿瘤的代表性图像。

（C） 使用CDDP或生理盐水治疗的小鼠中U87/EGFRvIII shRNA对照的肿瘤裂解物和shRNA Rictor细胞的指示抗体进行免疫印迹分析。

（D） 典型图像显示p-p65（S536）和TUNEL染色（棕色细胞）以评估凋亡效应。使用NIH图像对TUNEL染色进行量化。数据表示三个独立图像的平均+/-SEM（具有统计学意义，*p<0.001）。比例尺，20μm。另请参见补充图S13.

在大多数临床GBM样本中，mTORC2信号过度激活并与NF-κB和磷酸化-EGFR相关

为了确定上述mTORC2-NF-κB通路在人类GBM中是否活跃，我们在两个组织微阵列上检测了140例患者肿瘤组织样本和邻近正常大脑中mTORC2和NF-κ的替代生物标记物(图6A). 如前所述，在44%和77%的GBM中分别检测到EGFR（Y1068）和Akt（S473）磷酸化升高(37). 这些数字与癌症基因组图谱研究中报道的45%的GBM的EGFR突变和/或扩增以及87%的PI3K通路激活突变的独立发现一致(45). 重要的是，与正常脑组织相比，肿瘤样本中经常检测到Rictor（64%）、磷酸化NDRG1（T346；58%）和p65（S536；59%）水平升高(图6A和B;补充表S1A). Rictor、phospho-Akt、phosphal-NDRG1和phosphalo-EGFR的检测均与磷酸化p65显著相关（p<0.001，Rictor的OR为2.78；p<0.05，p-Akt S473的OR为2.32；p<0.05，p-NDRG1 T346的OR为1.91；p<0.05，p-EGFR Y1068的OR为2.01，Chi-square检验；图6A和C). 磷酸化Akt和磷酸化-NDRG1的检测与Rictor显著相关（p<0.01 OR 3.24，p-Akt S473；p<0.05 OR 1.81，p-NDRG1 T346，卡方检验；补充表S1B). 因此，在对大量临床样本的分析中，近60%的GBM中可以检测到mTORC2信号升高，并与EGFR磷酸化和NF-κB活化相关。最后，GBM尸检裂解物的免疫印迹分析证实，与正常大脑相比，肿瘤组织中mTORC2和NF-κB信号的协同增加(图6D和E). 总之，我们发现EGFRvIII刺激mTORC2活性，而mTORC1活性被PTEN部分抑制，并且mTORC3介导EGFRvIII刺激的NF-κB活化，促进肿瘤生长、生存和化疗抵抗(图7).

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图6

mTORC2信号在大多数临床GBM样本中过度激活，与NF-κB和磷酸化-EGFR相关

（A） 组织芯片（TMA）分析中EGFR/mTORC2/NF-κB信号的每个相关性模式。P（P）-独立性检验采用卡方检验确定值和比值比（OR）。

（B） 140例原发性GBM患者252个肿瘤核心组成的两个TMA中p-EGFR（Y1068）、p-Akt（S473）、Rictor、p-NDRG1（T346）和p-p65（S536）染色的免疫组织化学图像（红棕色）。组织用苏木精复染。比例尺，20μm。

（C） 基于p-p65（S536）与p-Akt（S473）、p-NDRG1（T346）和p-EGFR（Y1068）相关性的TMA免疫组织化学分析。由于缺少岩芯，数字加起来可能不到252。P（P）-该值由独立性检验的Chi-square确定（具有统计学意义，**p<0.001，*p<0.05）。

（D） 尸检时获得的GBM患者脑部肿瘤组织（T）和对侧正常脑组织（N）的典型大体和显微镜照片。比例尺，100μm。

（E） 尸检获得的三名GBM患者肿瘤（T）和对侧正常脑组织（N）中Rictor、p-Akt（S473）、p-NDRG1（T346）和p-p65（S536）染色的免疫印迹分析。另请参见补充表S1.

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图7

EGFRvIII通过mTORC2刺激NF-κB活性

（A） EGFRvIII刺激mTORC2活性；PTEN抑制了它

（B） mTORC2促进NF-κB活性。

（C） mTORC2介导EGFRvIII刺激的NF-κB活化，促进肿瘤生长、生存和化疗抵抗。

讨论

mTORC2激活在包括GBM在内的人类癌症中的相对频率，以及它与EGFR突变的相关性，直到现在还没有得到分析。我们发现mTORC2激活是GBM的常见事件，尤其是在含有EGFR激活病变的肿瘤中(图6). 有趣的是，相对于EGFR磷酸化水平，EGFRvIII在促进mTORC2激酶活性方面明显强于野生型EGFR(图1). 这与先前的研究一致，这些研究表明，尽管受体磷酸化水平较低，但EGFRvIII优先激活PI3K信号，导致下游效应器的差异激活(46). 这些结果也表明PI3K在介导mTORC2激活中起着重要作用(1). 重组PTEN抑制GBM细胞中EGFRvIII依赖的mTORC2活性(图1). 重要的是，这些数据增加了mTORC2在其他PI3K激活突变下游发挥作用的可能性，以促进其他癌症类型的化疗耐药性。

这些结果还表明，至少在一些GBM患者中，雷帕霉素耐药的潜在机制。雷帕霉素是一种有效的mTORC1抑制剂，至少在抑制S6K/S6信号方面是如此，但不是一种通用的mTORC2抑制剂，在一些但不是所有的癌细胞系中显示出mTORC2复合物的形成(39). GBM患者的雷帕霉素治疗与Akt的反馈激活和更快的临床进展密切相关(20). 我们之前也已经表明，mTORC1通过另一个涉及Rictor的S6K-1依赖性磷酸化的负反馈回路负调节mTORC2(24). 这里我们证明了雷帕霉素（或通过猛禽击倒抑制遗传mTORC1）促进Akt S473和NDRG1 T346磷酸化；这种反馈激活可以被mTORC2抑制所抑制(图2). 此外，在使用雷帕霉素治疗前和治疗10天后分析的GBM患者的临床样本中，mTORC2信号升高，同时存在显著的mTORC1抑制，如S6磷酸化降低所测(图2). NF-κB信号在GBM细胞系和雷帕霉素治疗的临床样本中也上调（数据未显示）。这些数据表明，在一些GBM患者中，未能抑制mTORC2信号，包括NF-κB信号，可能是雷帕霉素耐药和与之相关的不良临床结果的基础。Raptor和Rictor基因敲除联合mTORC1和mTORC2基因抑制有效抑制GBM细胞生长并诱导肿瘤细胞死亡(图2)强烈主张使用mTOR激酶抑制剂来阻断信号复合物及其下游效应器，包括NF-κB。

这些结果还揭示了mTORC2作为NF-κB的有效激活剂和癌症化疗耐药的介导者的新功能。最近研究表明，mTORC2可促进淋巴细胞中NF-κB的活化(41)但到目前为止，mTORC2介导的NF-κB在癌症中的调控尚未得到重视。最近证明NF-κB是肺癌中突变EGFR的关键下游效应器(30)结合我们的发现，NF-κB活化是通过mTORC2介导EGFRvIII下游的，这增加了突变EGFR-mTORC2-NFκB信号可能在其他癌症类型中发挥重要作用的可能性。我们研究了mTORC2/NF-kB信号是否参与EGFRvIII介导的顺铂耐药性，因为我们(44)先前的研究表明，EGFRvIII促进了对顺铂的耐药性，其中卡铂仍用于GBM治疗。我们的发现是，mTOR激酶抑制剂PP242使EGFRvIII表达的肿瘤对顺铂介导的细胞死亡敏感，并可能对其他化疗敏感，这对于在临床上将mTOR抑制剂与化疗结合具有重要意义。需要进一步研究，以更好地了解mTORC2/NF-κB信号在介导GBM和其他癌症对一系列化疗的耐药性中的潜在作用。

Akt通常被认为是最重要的mTORC2效应器和化疗耐药的主要介质(47). 令人惊讶的是，mTORC-2介导的化疗耐药并不需要Akt(图4)但依赖于NF-κB。这些结果表明，胶质瘤细胞已经发展出了额外的抗化疗途径，单靠Akt抑制不足以使肿瘤化疗增敏。这些结果表明，EGFRvIII可能通过NF-κB促进mTORC2功能，使化疗耐药，突显出mTORC1下游Akt-非依赖性信号的重要性。我们表明，EGFRvIII下游NF-κB活性需要明确的mTORC2效应器SGK1，这是该途径Akt-独立性的基础。这些数据也与最近在爪蟾中的观察一致，即SGK1在PI3K下游发挥作用，调节NF-κB(48). 未来的研究将需要进一步探索SGK1作为化疗耐药性介质的潜在作用。

在某些癌细胞环境下，NF-κB是Ras诱导和潜在PI3K诱导肿瘤发生所必需的(42,49). 这项研究的结果证实了NF-κB可能是PI3K激活的癌症中的一个重要效应器的概念，使其位于GBM中EGFR突变的下游。最近研究表明，EGFR突变可激活肺癌中的NFκB通路(30). 本文报道的结果提供了突变EGFR-介导的NF-κB在GBM和其他癌症类型中激活的潜在机制。研究结果还表明，靶向mTORC2介导的NF-κB活化也可能消除EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。这些结果也为编码IκBα的NFKBIA的单等位基因缺失与最近在GBM中发现的EGFR扩增和/或突变的互斥性提供了分子解释(28). IκBα与NF-κB结合，促进其细胞质定位，并阻断DNA结合。NFKBIA缺失在24%的临床样本中被删除。值得注意的是，在所研究的790个样本中没有检测到NFKBIA的两个拷贝丢失(28)这表明GBM细胞需要对NF-κB的诱导性保持一定程度的控制才能保持活性(29). 因此，观察到的EGFR突变/扩增和NFKBIA单等位基因缺失的互斥性，以及化疗耐药和生存期短的相似表型，可能是NF-κB激活位于EGFRvIII下游的结果(29).

在GBM中EGFR突变不是孤立发生的；它们是一系列分子病变的一部分，这些病变会失调“核心通路”，如RAS/PI3K、p53和pRB信号传导等(45). 类似地，许多因素可以促进肿瘤中NF-κB的激活。因此，多种因素可能导致化疗耐药性，正如MGMT启动子甲基化在决定GBM对烷化剂反应中的作用所证明的那样(50,51). mTOR在整合多种细胞输入（包括生长因子信号、营养和能量状态）与一系列细胞功能（包括蛋白质翻译、细胞增殖和细胞新陈代谢）方面发挥着关键作用，可能是癌细胞的一个关键信号转导环节，作为调节肿瘤生长存活和化疗抵抗的多个核心通路的潜在汇聚节点。这些结果表明，mTORC2是两个典型信号网络（EGFR/PI3K和NF-κB）的集合体，这两个网络在癌症中通常发生改变。这些结果也证实了mTORC2作为肿瘤靶点的重要性，并为其在介导化疗耐药中的作用提供了新的见解，提出了新的治疗策略。

方法

详细协议见补充实验程序.

补充材料

致谢

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