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公共科学图书馆-遗传学。2011年11月；7（11）：e1002368。
2011年11月17日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pgen.1002368
PMCID公司：PMC3219601型
PMID：22125492

PBX1基因先锋功能驱动ERα信号在乳腺癌进展中的作用

卢卡·马格尼,1,2 伊丽莎白·巴拉滕,1,2 张晓阳,1,2和马修·卢皮恩1,2,*
布鲁斯·克鲁曼，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

改变转录程序是疾病的标志，但如何建立这些程序尚不明确。PBX1是一种参与不同类型癌症发展的TALE同源域蛋白。雌激素受体α（ERα）是三分之二乳腺癌发生的核心。在这里，我们证明PBX1是一种先锋因子，对ERα介导的转录反应驱动乳腺癌侵袭性肿瘤至关重要。事实上，PBX1的表达与原发性乳腺肿瘤中的ERα相关，在雌激素刺激后，PBX1-缺失的乳腺癌细胞不再增殖。通过ChIP-seq和FAIRE-seq对乳腺癌细胞基因组中PBX1的招募和染色质可及性进行分析表明，PBX1通过其读取特定表观遗传特征的能力在特定基因组位置加载并促进染色质开放。因此，PBX1引导ERα招募到特定的位点子集。表达谱研究表明，PBX1控制70%以上的雌激素反应。更重要的是，PBX1依赖性转录程序与乳腺癌患者预后不良相关。相应地，在ERα阳性的乳腺癌患者中，仅PBX1表达就可以先验地判断预后。这些特征与先前特征化的ERα相关先锋因子FoxA1显著不同。事实上，PBX1是迄今为止唯一识别出的区分ERα阳性乳腺癌患者转移等结果的先锋因子。我们的研究结果表明，PBX1是一种新的先锋因子，定义了侵袭性ERα阳性乳腺肿瘤，因为它将ERα基因组活性引导到独特的基因组区域，促进有利于乳腺癌进展的转录程序。

作者摘要

大约三分之二的乳腺癌的生长依赖于雌激素受体α（ERα）。雌激素刺激后，其作为转录因子结合DNA的能力对于促进促肿瘤转录反应至关重要。重要的是，不同类型的ERα阳性乳腺肿瘤可以根据结果进行区分。然而，导致这些差异的潜在机制尚不清楚。在这里，我们证明PBX1是识别特定表观遗传修饰以重塑染色质并指导ERα基因组活性的先锋因子。这转化为与乳腺癌患者预后不佳相关的特定转录程序。更重要的是，仅PBX1表达就足以确定ERα阳性的乳腺癌患者是否有发生转移的风险。总的来说，本研究定义了依赖先驱因子PBX1的机制，该因子在ERα阳性乳腺癌的子集中驱动积极反应。这些特征突出了PBX1的独特性，并证明了其潜在的预后价值。

介绍

转录程序的实施对发育过程中发生的多能干细胞的承诺至关重要[1],[2]同样，疾病通常源于转录程序的改变。这需要以染色质重塑和谱系特异功能基因组元件表观遗传特征改变为特征的主动重编程[2]–[5]雌激素受体α（ERα）是乳腺癌发展的核心核受体。在雌激素刺激下，它在数千个基因组位点上结合，以定义其池蛋白，从而促进促增殖转录程序[6]–[9]其基因组作用部分依赖于先驱因子FoxA1[6],[7],[8],[10],[11],[12],[13],[14]先锋因子是一类新兴的DNA结合蛋白。它们在定义转录程序中起着核心作用，因为它们可以整合和重塑浓缩染色质，使其能够与转录因子结合[6],[15],[16],[17],[18],[19]它们对染色质的补充是序列特异性的，并且可以通过依赖组蛋白甲基化的表观遗传特征来促进[6],[20].

PBX1（前B细胞白血病同源盒1）是三氨基酸环延伸（TALE）类同源域家族的成员，在包括造血在内的多种发育过程中都需要[21]，骨架图案[22]，胰腺[23]和泌尿生殖系统器官发生[24],[25]在前B细胞白血病中，当与E2A融合时，它被称为癌蛋白[26]，它也会导致前列腺癌、卵巢癌和食管癌[27]–[30]在乳腺癌中也高表达[31]PBX1是同源盒（HOX）转录因子的辅因子，因为它增加了它们对染色质的亲和力和特异性[32],[33]然而，最近的相互作用组研究表明，12%的PBX1假定伴侣是非同源域转录因子[34],[35]一致认为，PBX1调节核受体（如甲状腺和糖皮质激素受体）的转录活性，最近被认为是bHLH因子MyoD的先驱因子[36]–[38]然而，PBX1对调节ERα阳性乳腺癌细胞转录的染色质结构和表观遗传特征的作用尚不清楚。在本研究中，我们研究了PBX1对乳腺癌ERα基因组活性的先导作用。

结果

PBX1对ERα阳性乳腺癌细胞的雌激素反应至关重要

浓缩的染色质构成了向DNA招募转录因子的屏障。特定基因组区域的FoxA1结合允许染色质重塑，有利于其池蛋白亚群中ERα的募集[6],[8],[13],[19],[39]然而，ERα被招募到基因组中数千个FoxA1依赖位点[6]为了确定在这些位点引导ERα向染色质募集的候选先导因子，我们使用Cistrome-web应用程序进行了种子基序分析(http://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/). 这表明，超过85%的ERα顺位体含有PBX1识别的DNA基序(图1A和1B). 值得注意的是，ERα结合位点中PBX1基序的存在与另一个类似大小的顺池蛋白（来自LNCaP细胞的雄激素受体（AR）顺池蛋白，p<1e-99）显著不同(图S1A).

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PBX1与ERα相关。

（A） PBX1矩阵的主题/序列标识表示（Transfac:M01017）。（B） 考虑到ERα结合位点与FoxA1结合位点的重叠，给出了含有PBX1基质的ERα结合部位的比例（Transfac:M01017）。根据5782个ERα结合位点计算百分比。（C） PBX1和ERαmRNA转录物在47个根据ERα组织学状态分离的不同乳腺癌细胞系中共同表达。p值显示了ERα组织学状态与ERα和PBX1 mRNA表达之间的显著相关性。（D） 当评估ERα阳性（MCF7）和ERα阴性（MDA-MB231）时，PBX1的mRNA（左侧面板）和蛋白质（分别来自免疫荧光或western blot，右侧和底部面板）水平与ERα表达状态相关乳腺癌细胞（针对PBX1的三个独立探针的平均值用于bioGPS.org提供的mRNA表达分析）。（E） PBX1和ERα在原发性乳腺肿瘤中共同表达。原发性乳腺肿瘤的表达谱显示，PBX1 mRNA水平与ERα组织学状态和ERαmRNA表达相关（使用Oncomine进行的荟萃分析）。（*<0.05，**<0.01***，<0.001 p值）。

分析基于bioGPS编译的NCI60癌细胞面板的表达谱(http://biops.gnf.org)[40],[41]揭示PBX1与ERα显著共表达（使用探针205253_at共表达系数0.7784）(表S1). 通过比较47个不同ERα阳性和阴性乳腺癌细胞中PBX1 mRNA的表达也揭示了这一点（p=8.98e-7）(图1C). ERαmRNA表达也与乳腺癌细胞的ERα组织学状态显著相关（p=1.71e-8）(图1C). 在ERα阳性的MCF7和ERα阴性的MDA-MB231乳腺癌细胞中，RT-qPCR、免疫荧光和western blot分析进一步支持了这些结果，显示ERα和PBX1在mRNA和蛋白水平上共同表达(图1D). PBX1是四个PBX家族成员之一[33]针对其他PBX1基因的RT-qPCR表明，PBX1是ERα阳性乳腺癌细胞中表达的主要家族成员(图S1B). 对41项独立乳腺癌表达谱研究（如van de Vijver研究）的分析表明，PBX1和ERα在原发性乳腺肿瘤中也同时表达（van de Vijver研究的p=2.72e-13，所有其他研究的p≤1e-4）(图1E)[42]van de Vijver研究也报告了ERαmRNA表达与ERα组织学状态之间的相关性（p=2.27e-74）(图1E).

为了解决PBX1和ERα之间的功能关系，我们评估了PBX1在雌激素诱导ERα阳性MCF7乳腺癌细胞生长中的作用。在转染了两个独立的抗PBX1 siRNA之一的MCF7乳腺癌细胞中，PBX1 mRNA和蛋白水平显著降低（～70%）(图2A和2B). 与PBX1在乳腺癌中的作用一致[27]，PBX1缺失完全阻止了雌激素诱导的MCF7乳腺癌细胞增殖(图2C和S2A公司-B） ●●●●。重要的是，MCF7乳腺癌细胞中PBX1的缺失并不影响ERα或FoxA1在mRNA和蛋白水平的表达(图2D). 总的来说，这些结果支持PBX1在调节ERα阳性乳腺癌对雌激素的反应中的功能作用。

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PBX1是MCF7细胞雌激素反应所必需的。

（A） 通过siRNA去除PBX1可有效降低其mRNA和（B）蛋白水平。（C） 与对照组相比，PBX1缺失的MCF7乳腺癌细胞在雌激素/17β-雌二醇（E2）刺激下无法增殖。（D） PBX1沉默不会改变ERα或FoxA1 mRNA（直方图）或蛋白质水平（Western Blot，WB）。（*<0.05，**<0.01***，<0.001 p值）。

PBX1标记功能性ERα结合位点

雌激素信号转导涉及ERα激活和随后对染色质的补充。因此，在雌激素治疗之前，可以通过其在染色质中的作用来识别先锋因子。去雌激素MCF7乳腺癌细胞PBX1的免疫荧光检测显示其定位于细胞核(图3A). 虽然PBX1和FoxA1具有相似的核分布，但FoxA1的共聚焦免疫荧光分析表明，它仅与PBX1部分重叠(图3A和图S3A和S3B). 为了证明PBX1占据MCF7乳腺癌细胞的染色质，我们对保存在全培养基中的细胞进行了ChIP-seq检测。这确定了24254个高置信PBX1位点（p≤1e-5），主要定位于遥远的调控元件(图3B和图S4A和S4B,第5章,S6系列,第7部分,第8节). 对由ChIP-seq鉴定的37个随机选择的PBX1结合位点进行定向ChIP-qPCR分析表明，在没有雌激素的情况下，它被加载到染色质中(图S4B). 大约50%的雌激素诱导的ERα池蛋白与PBX1结合位点重叠(图3B). 对于所有公开获得的ERα顺反子，还观察到ERα和PBX1之间存在显著重叠(图S9)[6],[7],[9],[43],[44],[45],[46],[47],[48],[49],[50],[51].FoxA1已加载到大多数这些站点(图3B). 事实上，在无雌激素培养基中对MCF7乳腺癌细胞进行的ChIP-reChIP检测表明，这两种先驱因子共同定位于染色质上的共享位点(图S11). 重要的是，超过37%的FoxA1依赖性ERα结合位点与PBX1重叠(图3B). 在PBX1缺失的MCF7乳腺癌中的表达谱分析表明，71%的雌激素诱导的靶基因依赖于PBX1(表S2和图S12). 重要的是，通过该表达谱确定的雌激素特征高度富集了ERα阳性原发性乳腺肿瘤的基因（p=5.75e-10）[52].

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PBX1标记功能性ERα结合。

（A） 在无雌激素/17β-雌二醇（E2）培养的MCF7细胞中的共聚焦免疫荧光分析显示，PBX1定位于MCF7乳腺癌细胞的细胞核中，并与先导因子FoxA1部分重叠。（B） PBX1（全培养基）、ERα（雌激素刺激后）和FoxA1（全培养液）池的文氏图显示了它们在染色质上的显著重叠。（C） E2应答基因（全部或PBX1依赖性）与中定义的独特或共享ERα、FoxA1和PBX1结合位点之间的比较图3B通过将在其转录起始位点（TSS）±20kb内具有至少一个独特或共享结合位点（给定因子）的应答基因的数量标准化为在其转录起始位点±20kb内具有来自相同类型位点的至少一个结合位点的无应答基因的数量。所有E2应答基因（蓝线）和PBX1依赖的E2响应基因（红线）的值以雷达格式绘制（1<深灰色区域，1–2浅灰色区域，>2白色区域，刻度为0.5增量）。（**<0.01，**<0.001***，<0.00001 p值）。（D） 与PBX1-FoxA1-ERα、PBX1-ERα或FoxA1-ER a结合位点相关的E2靶基因的RT-qPCR基于图3C在缺失PBX1（siPBX1）或Foxa1（siFoxA1）的MCF7乳腺癌细胞中进行。对照siRNA（siCTRL）用于比较。

为了评估全基因组结合和表达谱之间的关系，我们对照ERα、PBX1和FoxA1的结合谱，交叉检查了MCF7乳腺癌细胞中定义的雌激素反应基因列表（所有雌激素反应基因和PBX1依赖性雌激素反应基因）。这是通过测定雌激素应答基因（全部或PBX1依赖）的数量来实现的，这些基因在其转录起始位点（TSS）±20 kb范围内至少有一个与给定因子共享或唯一的结合位点。对于包含refseq基因列表中未受雌激素刺激的MCF7乳腺癌细胞中所有基因的空列表，重复上述步骤。然后以雷达格式绘制与TSS±20kb内的结合事件相关的雌激素反应基因与TSS±20kb内的结合事件相关的空列表中的基因数量的比率。雌激素靶基因与PBX1-ERα共享位点（占总雌激素反应基因的7%）和PBX1-FoxA1-ERα分享位点（占雌激素反应基因总数的12%）显著相关（蓝线，图3C). FoxA1-ERα共享位点并不优先与雌激素调节基因相关(图3C). 值得注意的是，PBX1依赖性雌激素靶基因与PBX1独特和PBX1-ERα共享位点（红线，图3C). 这是通过RT-qPCR针对依赖于PBX1、FoxA1或两者的雌激素靶基因进行验证的。事实上，PBX1缺失仅干扰MCF7乳腺癌中共享或PBX1依赖性雌激素靶基因的调节(图3D和图S13). 相反，FoxA1沉默仅影响共享和FoxA1依赖性雌激素靶基因的调节(图3D和图S13). 总之，这些数据支持PBX1是调节雌激素应答基因特定亚群所必需的概念。此外，他们认为PBX1是实施与FoxA1不同的雌激素调节转录程序所必需的。

PBX1控制ERα基因组活性

雌激素受体α依赖性转录反应依赖于雌激素刺激后对染色质的补充。为了测试PBX1是否直接影响ERα基因组活性，我们首先通过ChIP-qPCR检测已知ERα结合位点来评估经雌激素治疗或未经雌激素治疗的MCF7乳腺癌细胞中PBX1的占有率。关注与PBX1重叠的FoxA1依赖和独立ERα结合位点(图S4C)，我们的研究结果表明，PBX1在雌激素治疗前预先加载在染色质上，在雌激素治疗后仍保持结合(图4A). 这些位点是从我们的全基因组分析中选择的，因为它们靠近乳腺癌增殖和ERα生物学的基本基因。例如，Myc、CCND1、FOS和EGR3是已被广泛研究的促进乳腺癌生长和进展的ERα靶点[53],[54],[55]TFF1（也称为PS2）是典型的雌激素靶基因[56]在雌激素治疗和未治疗的MCF7乳腺癌细胞中，针对ERα和PBX1的连续ChIP分析（ChIP-reChIP）表明，这两个因子在ERα募集后共同占据相同的位点(图4B).

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PBX1位于细胞核中，介导ERα基因组活性。

（A） 与对照处理细胞（O）相比，在雌激素/17β-雌二醇（E2）刺激后，PBX1在其募集之前占据ERα基因组靶点。同样，根据ChIP-qPCR检测，MCF7乳腺癌细胞经E2处理后，PBX1仍与染色质结合。（B） ChIP-reChIP分析显示，在E2刺激时，PBX1和ERα共占据相同的基因组区域。除了阴性对照位点外，在reChIP试验中还使用匹配的IgG作为阴性对照。（C） 与对照组（siCTRL）相比，PBX1沉默（siPBX1）消除MCF7乳腺癌细胞中调节元件的ERα募集。数值计算为ChIP-qPCR定义的未经处理和E2处理的相对富集倍数之间的比率。（D） 针对PBX1依赖位点ERα的ChIP-qPCR表明，在PBX1沉默后，ERα在这些位点的募集并没有中断。数值计算为未经处理和E2处理的相对富集倍数之比。

针对PBX1缺失的MCF7乳腺癌细胞中ERα的ChIP-qPCR检测表明，雌激素治疗后ERα的募集依赖于PBX1(图4C). 重要的是，ERα招募在预加载PBX1的位点选择性中断，但在PBX1依赖的位点没有中断(图4D和图S4D)从而排除了ERα在PBX1缺失的细胞中结合DNA的能力受到广泛非特异性影响的可能性。总的来说，这些结果表明PBX1可以在ERα募集之前占据染色质，并且是其基因组活性驱动雌激素靶基因表达所必需的。这与PBX1作为乳腺癌新的先锋因子的作用是一致的。

PBX1在调节元件处积极传递开放的染色质结构

染色质结构本身就是转录因子活性的障碍。先驱因子通过整合和开放浓缩染色质的能力，充当其他转录因子的分子信标。使用FAIRE（甲醛辅助分离调节元素）测定[39],[57]为了在雌激素刺激前测量染色质凝集/开放度，我们证明PBX1是一个先导因子。事实上，MCF7乳腺癌细胞的全基因组FAIRE-seq分析[44]显示PBX1占据的染色质已经很容易获得(图5A和图S14). 有趣的是，PBX1和FoxA1的开创性活动在共享站点上具有协同作用(图5A). 只有FoxA1绑定的站点是最难访问的(图5A). 通过siRNA比较雌激素缺乏的MCF7乳腺癌细胞中缺失或不缺失PBX1的FAIRE信号，发现与大多数测试部位的对照细胞相比，PBX1缺失的细胞染色质开放度显著降低(图5B). 一致地，我们证明在mRNA和蛋白水平上MCF7乳腺癌细胞中PBX1缺失(图2A和2B)也显著降低其在染色质上的占有率(图S10B). 这些结果表明，PBX1在增加对转录因子招募至关重要的染色质可及性方面发挥着核心作用，进一步支持了其作为乳腺癌细胞先锋因子的作用。

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PBX1是染色质开放所需的独立先锋因子，其结合受到H3K4me2的青睐。

（A） 在无雌激素培养基中保存的MCF7乳腺癌细胞的全基因组FAIRE图谱（FAIRE-seq）表明，PBX1单独或与FoxA1联合与开放染色质相关。（B） 与FAIRE-qPCR检测的对照siRNA转染细胞（siCTRL）相比，在无雌激素培养基中维持的MCF7乳腺癌细胞中PBX1（siPBX1）的耗竭显著降低了PBX1结合位点的染色质开放度。（C） 与在无雌激素培养基中保存的MCF7乳腺癌细胞中的对照组（siCTRL）相比，FoxA1沉默（siFoxA1）不会改变PBX1与染色质的结合。（D） 与对照组相比，在无雌激素培养基中维持的MCF7乳腺癌细胞中PBX1沉默不会影响FoxA1与染色质的结合。（E） 全培养基中定义的PBX1和FoxA1顺反子体的文氏图以及在无雌激素培养基中保存的MCF7乳腺癌细胞中定义的H3K4me2表观基因组显示了它们的重叠。（F） 与空载体对照（CTRL）相比，在无雌激素培养基中维持的MCF7乳腺癌细胞中H3K4me2脱甲基酶KDM1的过度表达导致PBX1与染色质的结合显著减少。（*<0.05，**<0.01***，<0.001 p值）。

针对PBX1和FoxA1的免疫荧光、ChIP-seq分析和ChIP-reChIP表明，它们在MCF7乳腺癌细胞中共占据基因组区域(图3A和3B,图S3A和S3B,第9部分,第10节和S11）。为了确定它们是否在这些基因组区域相互协作，或者它们是否是共同复合体的一部分，我们分析了雌激素缺乏的MCF7乳腺癌细胞中PBX1缺失后FoxA1的结合情况。与两种独立作用的先驱因子一致，FoxA1缺失并没有改变PBX1与染色质的结合(图5C). 同样，PBX1缺失也不影响FoxA1向染色质的募集(图5D). 总之，这些结果表明，PBX1在乳腺癌中独立于FoxA1，是引导ERα基因组活性的先驱因子。

共价修饰是表观遗传调控的主要内容。以前的报告已经证明组蛋白H3在赖氨酸4（H3K4me）上的甲基化可以定义功能调节元件[58]–[61]此外，单甲基和二甲基H3K4（H3K4me1和me2）表观遗传修饰的细胞类型特异性分布是细胞类型特异转录反应的核心[6],[59],[60]在癌细胞中，H3K4me2的缺失会干扰FoxA1与染色质的结合[6],[39]然而，FoxA1和H3K4me2之间的关系可能不是单向的，最近的证据表明FoxA1有利于H3K4me2沉积[62].全基因组分析显示，约50%的PBX1顺反转录酶上存在H3K4me2(图5E). 在MCF7乳腺癌细胞中，FoxA1池蛋白与H3K4me2分布重叠的比例相似(图5E). 为了测试H3K4me2是否有利于PBX1与染色质结合，我们过度表达了H3K4me2脱甲基酶KDM1（LSD1/BCH110），并通过ChIP-qPCR分析测定了PBX1染色质占有率。KDM1过度表达导致雌激素缺乏的MCF7细胞中结合的PBX1显著减少(图5F). 相反，PBX1缺失对H3K4me2水平没有影响，也不影响KDM1的表达(图S15A和S15B） ●●●●。因此，与FoxA1类似，H3K4me2表观遗传标记支持PBX1结合。

PBX1是一种新的判断ERα乳腺癌预后的因素

ERα促进70%以上乳腺癌的增殖。因此，它既是治疗靶点又是预后因素[63]此外，ERα是迄今为止临床上使用最多的标记物，通常与良好的预后相关[64]与ERα谱分析相比，FoxA1似乎没有提供任何额外的能力来区分乳腺癌亚型[65]–[67]为了评估PBX1在乳腺癌中的预后价值，我们利用Oncomine（密歇根州安娜堡，生物科学简编）提供的随访数据，利用乳腺肿瘤表达研究进行了荟萃分析。我们根据高（前10%）或低（后10%）PBX1 mRNA水平区分乳腺癌患者，然后根据乳腺癌患者的无转移生存状态生成Kaplan-Meier曲线。此外，我们使用KMplot web应用程序独立生成了Kaplan-Meier曲线[68].结果从对FoxA1进行的分析中得出的结果证实了之前的报告限制了其在所有乳腺癌亚型中识别ERα阳性乳腺癌的预后价值。PBX1的表达并不能区分这些患者的预后(图6A和6B有趣的是，虽然FoxA1 mRNA水平预测ERα状态，但PBX1水平在ERα阳性乳腺癌亚组或所有病例中均匀分布(图S17). 通过对ERα阳性乳腺癌患者（根据病理染色定义）的重点分析，我们揭示了PBX1的预后价值。事实上，与低PBX1表达的ERα阳性乳腺肿瘤相比，PBX1高表达的ERβ阳性乳腺肿瘤的无转移生存率降低（p<0.002）(图6C和图S16C和S16D） ●●●●。FoxA1表达不能对ERα阳性乳腺癌患者的无转移生存期进行分层(图6D和图S16C和S16D） 与FoxA1和ERα的冗余预测值一致[67].

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PBX1是ERα阳性乳腺癌的一种新的预后标志物。

（A–B）PBX1和FoxA1对所有乳腺癌亚型无转移生存率的预测价值通过Kaplan-Meier曲线进行了研究，该曲线来源于对Oncomine提供的原发性乳腺癌独立表达谱研究的荟萃分析。（C–D）重复相同的分析，只关注ERα阳性患者。采用Fisher精确检验对mRNA水平高（前10%表达患者）和低（后10%表达患者。（E） 在与PBX1依赖性或FoxA1依赖性雌激素/17β-雌二醇（E2）基因特征显著相关的独立表达谱研究中，原发性乳腺肿瘤中定义的与不良结果相关的表达特征数量（p<0.01，O.R.>2）。结果使用Oncomine概念图分析生成。

通过比较PBX1依赖性雌激素诱导的转录，进一步支持了这些结果(表S2和图S12)使用Oncomine（密歇根州安娜堡生物科学简编）对乳腺肿瘤的表达进行分析。这揭示了PBX1依赖性雌激素靶基因与22个乳腺癌患者预后不良的典型表达特征（例如：转移、死亡率、复发和高分级）之间的强烈相关性（p<0.01，O.R.>2）(图6E). 相反，FoxA1依赖性雌激素靶基因[44]仅与乳腺癌的一个不良结果表达特征（死亡率）显著相关(图6E). 综上所述，这表明PBX1在ERα阳性乳腺癌的进展中驱动非常特异的转录反应，并揭示了PBX1在此乳腺癌亚型中预测预后的潜在预后潜力。

讨论

精确调控复杂的转录程序对正常器官发育至关重要。这取决于几层控制，包括DNA序列、表观遗传学特征和染色质结构。然而，如何整合这些不同的元素以生成谱系特异性转录程序，以及它们在疾病发展过程中如何受到影响，目前尚不明确。特别是，我们仍然误解了表观遗传特征和染色质结构如何影响乳腺癌对雌激素刺激的转录反应。在这里，我们证明PBX1作为引导乳腺癌ERα基因组活性的先锋因子(图7). 事实上，PBX1翻译基于H3K4me2的表观遗传学特征，以重塑特定的基因组结构域，使其可用于ERα。PBX1被证明对组蛋白H4乙酰化至关重要[69]以前的报道分别关注MyoD和PDX1对髓细胞和胰岛细胞染色质的补充，暗示了PBX1的先驱作用[36],[70]考虑到PBX1在不同器官的发育中起着基础性作用[21],[24],[25]并导致各种癌症，即白血病、前列腺癌、卵巢癌和食管癌[26]–[30]，它的开创性功能可能会应用于乳腺癌以外的领域。同样，PBX1促进包括同源域（HOX、MEIS等）和非同源域蛋白（MyoD、GR、TR等）在内的多种转录因子的基因组活性[32],[33],[36],[37],[38],[71],[72]因此，PBX1的先驱功能预计会影响其他转录程序。

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乳腺癌中PBX1活性的示意图。

描述由雌激素/17β-雌二醇（E2）刺激或不刺激的乳腺癌细胞中PBX1、FoxA1和ERα之间关系的示意模型。FoxA1和PBX1都与含有H3K4me2表观遗传特征的染色质结合。它们彼此独立地作用，打开染色质，使特定的基因组区域可被转录因子利用。E2的刺激并不影响其染色质占有率，但允许ERα的募集。重要的是，PBX1结合的ERα募集位点（与FoxA1共享或不共享）与很大比例的雌激素反应基因相关，这些基因导致强烈的雌激素反应。

最后，我们发现PBX1和FoxA1可以在乳腺癌细胞中共占特定的基因组区域。而先前曾报道过PU.1和GATA1等先驱因子对特定基因组区域的共有[73]，我们的结果表明，这转化为更大的染色质可及性。此外，我们发现FoxA1依赖性PBX1结合位点比PBX1依赖性FoxA1位点更容易访问。一致认为，雌激素诱导的转录反应优先与PBX1或PBX1-FoxA1共享位点的ERα结合相关。这也与FoxA1和PBX1的不同预后值有关。事实上，虽然在ERα阳性的原发性乳腺肿瘤中FoxA1的表达不能区分其无转移结果，但PBX1表达升高对转移具有显著的预后潜力。基因签名（如Oncotype DX或MammaPrint）已成功应用于临床，主要根据其识别特定乳腺癌亚型的能力来判断乳腺癌的预后[74],[75]然而，当仅限于ERα阳性患者时，他们的表现并不好[76],[77]我们的研究将PBX1作为一种潜在的临床工具，对ERα具有额外的预后价值。事实上，所有ERα阳性转移性乳腺癌患者和一半或更多ERα阳性早期乳腺癌患者对内分泌治疗产生耐药性，导致不良结果[78]因此，推测PBX1在乳腺癌耐药发展中的作用非常有趣。

综上所述，这些结果揭示了在乳腺癌中实现雌激素特异转录反应所需的不同先锋因子之间的复杂相互作用，并将PBX1作为预后标志物加以区分。

材料和方法

Motif发现

通过从MCF7乳腺癌细胞的FDR1%雌激素诱导ERα顺反子中减去错误发现率（FDR）20%FoxA1顺反子，确定了全基因组中FoxA1依赖性ERα结合位点。这是通过使用床文件完成的，床文件指定了MAT通过cistrome网站调用的FoxA1顺反子体的基因组坐标(http://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/)使用基于FDR 20%的截止值和指定MAT调用的ERα顺反子体基因组坐标的bed文件，使用基于FDR1%的截止值。这些文件加载到Cistrome网站上，并使用“基因组间隔操作-减法”从ERα床文件中减去FoxA1床文件[79]为了确定ERα顺位体与携带PBX1 DNA识别基序的FoxA1重叠或不重叠的比例（Transfac M01017），我们使用了cistrome网站上提供的“综合分析-屏幕基序”功能的默认设置。

相关性分析

基于BioGPS的NCI60癌细胞株ERα和PBX1表达相关性研究(http://biops.gnf.org). 使用Oncomine对ERα和PBX1在乳腺癌细胞或原发性肿瘤中的表达进行了相关性分析(https://www.oncomine.com).

重叠分析和基因组结构校正（GSC）

文氏图是通过使用Cistrome网站“基因组间隔操作”下的功能，定义不同床位文件之间共享和唯一的位点比例而生成的。重叠结合位点是通过至少有一个碱基对共同来定义的。基因组结构校正（GSC）[80]运行以确定数据集之间重叠的重要性。软件以以下设置运行：（区域分数）-R=0.2，（子区域分数）-S=0.4，basepair_overlapp_marginal（-bm）作为统计文本。上显示的结果的P值图S6A和S6B根据12项比较，使用Bonferroni后验进行了修正。

免疫荧光成像

对于免疫荧光，如前所述处理MCF7细胞[81]使用PBX1单克隆抗体（Abnova公司）对PBX1进行染色。使用FoxA1多克隆抗体（Abcam）对FoxA1进行染色。二级抗体Alexa 488和555购自Invitrogen。使用ImageJ分析数字图像(http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

MCF7乳腺癌细胞的siRNA转染

如前所述，将MCF7细胞保存在补充有10%CDT-FBS的无酚红培养基（Invitrogen）中（Lupien等人，2008年）[6]转染前。在雌激素饥饿两天后，用siPBX1#1（Darmachon）或siPBX1#2（Invitrogen）转染细胞。抗荧光素酶的小干扰RNA用作阴性对照[8]根据制造商的说明（Invitrogen），使用Lipofectamine 2000进行转染。对于细胞增殖试验，在添加雌激素（E2）（1×10）后每24小时测定一次细胞数或外径（450 nm）（WST-1试验，Takara Bio Inc）−8M最终）。对于表达测定，在E2刺激后3小时提取RNA。

微阵列

将来自siControl或siPBX1处理的MCF7的RNA样品在有或无雌激素的情况下在HT12人珠阵列上进行杂交（Illumina Inc.）。使用3.8.1版BRB-阵列工具进行分析。对原始强度数据进行log2变换、中值归一化和过滤，以去除Illumina软件确定的未检测斑点。通过计算每个数组和中间（参考）数组之间的基因间差异，并从该数组的对数强度中减去中间差异，从而执行归一化，使归一化数组和参考数组之间的遗传基因间差异为零。通过使用归一化对数密度计算每个基因的t检验，进行两类非成对比较分析。差异表达基因的显著性水平为p小于0.01。还进行了p小于0.01的四级方差分析，以确定四组之间差异表达的基因。

使用欧几里德距离度量采用层次聚类，并使用开源软件Cluster/Treeview生成重要基因子集的热图。数据可以在超级系列GSE28008下的GEO浏览器中访问

FoxA1依赖性基因签名是从先前发布的微阵列数据中获得的[44].

ChIP和ChIP-reChIP-qPCR

如前所述执行ChIP qPCR[82]在这些测定中使用了针对PBX1（Abnova）FoxA1、H3K4me2（Abcam）和ERα（Santa cruz生物技术）的抗体。ChIP–如前所述执行reChIP[83]使用Student t检验对未配对数据与内部阴性对照进行比较，得出统计显著差异。本试验中使用的引物序列见表S3.

ChIP-seq公司

如上所述进行ChIP分析。下一代测序的文库准备工作是根据制造商的指示进行的，从5 ng材料开始（Illumina Inc.）。使用GAIIx（Illumina Inc）对单对库进行测序。通过GAIIx为PBX1 ChIP和Input样本分别生成了2800万次和3100万次读取。其中，88%和96%分别与人类参考基因组对齐。使用ELAND软件校准这些读数。MACS峰值调用算法使用默认设置调用显著富集的峰值（P<10−5)并指定峰值大小=200 bp。数据可在GEO浏览器上访问（登录号：PBX1:GSE28008和H3K4me2:GSE31151）。

费尔

如前所述进行FAIRE分析[39],[84].FAIRE-seq数据已发布[44].

MCF7细胞的转染

如前所述，MCF7细胞保存在补充有10%FBS的DMEM（Invitrogen）中（Lupien等人，2008年）[6]转染前。根据制造商的说明（Invitrogen），使用Lipofectamine 2000 DNA转染试剂，用pCMX-KDM1构建物或对照空载体（6孔板中每孔10µg）转染MCF7细胞。转染48小时后进行针对PBX1的ChIP分析。

Kaplan-Meier曲线

几个表达式配置文件[42],[63],[85],[86],[87],[88],[89],[90],[91]用Oncomine编译(https://www.oncomine.com)用于确定PBX1和FoxA1 mRNA表达水平。ERα分层是基于本分析中使用的每个独立表达研究中提供的蛋白质水平。根据每个独立表达研究（最大值到最小值）提供的处理探针信号对样本进行排序，并将前10%和后10%分别分为高表达和低表达。然后将每个样本与其相关结果进行匹配，并由每个独立研究提供1年、3年和5年的随访（无转移生存期：存活或死亡）。采用Fisher精确检验进行统计分析。

基于转录组的结果分析

PBX1依赖性或FoxA1依赖性雌激素（E2）上调基因签名[44]根据之前显示与使用Oncomine的乳腺癌预后显著相关的几个表达谱进行分析。[86],[87],[88],[90],[92],[93],[94],[95],[96],[97],[98],[99],[100],[101],[102],[103]pValue至少<0.01且比值比>2时建立了显著关联。

支持信息

图S1

PBX1是在MCF7中表达的主要PBX家族成员。（A） 给出了携带PBX1基质（Transfac:M01017）的AR结合位点的比例。根据之前公布的5077个AR结合位点计算百分比，这些位点来自于用DHT处理4小时的LNCaP细胞（Brown lab）B）。通过RT-qPCR评估MCF7中PBX家族成员的表达。数据表示为模拟诱导（O）MCF7细胞中PBX1的百分比。还显示了雌激素/17β-雌二醇（E2）下的表达。（p***<0.001）。

（畅通节能法）

图S2

PBX1抑制雌激素诱导的增殖。（A） 用雌激素/17β-雌二醇（E2）或对照（O）刺激MCF7细胞，通过siRNA或不通过PBX1沉默，2天后对细胞进行计数，并与对照（siCTRL）进行比较（p*<0.05，**<0.01）（B）比较用siPBX1和siCTR处理的MCF7在雌激素分泌介质中的细胞数量（O）。

（畅通节能法）

图S3

PBX1和FoxA1部分共存于MCF7细胞核。（A） 通过数字成像分析PBX1和FoxA1染色后的蛋白质定位。（B） 与A相同，但添加的Z轴表示染色强度。

（畅通节能法）

图S4

ERα募集在PBX1结合位点被特异性阻断。（A） CEAS分析表明PBX1结合在MCF7乳腺癌细胞中的基因组分布（B）针对PBX1进行ChIP-qPCR检测，以验证经雌激素/17β-雌二醇（E2）或对照（O）处理的MCF7乳癌细胞中PBX1-ChIP-seq的结果。（C） 在雌激素缺乏的MCF7细胞中进行的ChIP-qPCR检测表明，其在检测的ERα结合位点不存在，而在阳性对照（pos.CTRL）位点有效检测到。

（畅通节能法）

图S5

ChIP-seq轨道。使用集成基因组查看器（IGV 2.0）获得代表基因组位置MCF7的ERα（雌激素刺激）、PBX1（全培养基）、FoxA1（全培养液）、FAIRE（未经处理）和H3K4me2（未处理）信号的原始大规模平行测序（WIG株）和称为波峰（BED株）衍生信号。方框用于强调本研究中使用的引物。

（畅通节能法）

图S6

ChIP-seq轨道。使用集成基因组查看器（IGV 2.0）获得代表基因组位置MCF7的ERα（雌激素刺激）、PBX1（全培养基）、FoxA1（全培养液）、FAIRE（未经处理）和H3K4me2（未处理）信号的原始大规模平行测序（WIG株）和称为波峰（BED株）衍生信号。方框用于强调本研究中使用的引物。

（TIF）

图S7

ChIP-seq轨道。使用集成基因组查看器（IGV 2.0）获得代表基因组位置MCF7的ERα（雌激素刺激）、PBX1（全培养基）、FoxA1（全培养液）、FAIRE（未经处理）和H3K4me2（未处理）信号的原始大规模平行测序（WIG株）和称为波峰（BED株）衍生信号。方框用于强调本研究中使用的引物。

（畅通节能法）

图S8

ChIP-seq轨道。使用集成基因组查看器（IGV 2.0）获得代表性基因组位置处来自MCF7的ERα（雌激素刺激）、PBX1（全培养基）、FoxA1（全培养基）、FAIRE（未处理）和H3K4me2（未处理）信号的原始大规模平行测序（WIG系）和称峰（BED系）衍生信号。方框用于强调本研究中使用的引物。

（畅通节能法）

图S9

西斯特罗姆斯十字路口。针对PBX1对各种顺反子（ERα、FoxA1和AR）进行GSC分析。

（畅通节能法）

图S10

Cistromes十字路口。PBX1顺反子对ERα、FoxA1和AR顺反子的GSC分析。

（畅通节能法）

图S11

PBX1和FoxA1在染色质上共存。ChIP-reChIP分析表明，在没有雌激素（O）的情况下，PBX1和FoxA1可以在MCF7细胞中共同结合相同的DNA位点。在reChIP中使用匹配的IgG作为阴性对照。

（畅通节能法）

图S12

表达谱定义了MCF7乳腺癌细胞中PBX1依赖性雌激素调节基因。热图显示为雌激素/17β-雌二醇（E2）和对照（O）处理的MCF7乳腺癌细胞中经siRNA耗尽或未耗尽PBX1的细胞之间的比率。黄色与E2诱导有关，蓝色与E2抑制有关。

（畅通节能法）

图S13

PBX1和FoxA1沉默选择性地损害E2反应。数据直方图图3D星号表示通过单向方差分析与siCTRL确定的显著差异（p<0.05）。

（畅通节能法）

图S14

PBX1沉默从染色质中去除PBX1。（A） 与MACS峰值调用算法调用的FAIRE信号峰值重叠的站点数百分比。这表明FAIRE与PBX1-FoxA1共享站点显著相关，而与FoxA1独特站点的PBX1显著相关。（B） MCF7细胞在不含雌激素的培养基中培养，并用siPBX1处理。在siPBX1和siCTRL转染细胞中进行针对PBX1的ChIP-qPCR分析。数值表示为与siCTRL转染细胞相比，siPBX1染色质上PBX1存在减少的百分比（p*<0.05）。

（畅通节能法）

图S15

PBX1沉默不会改变表观遗传特征H3K4me2。（A） 在没有雌激素的情况下，通过siRNA耗尽PBX1的MCF7细胞对ChIP-qPCR测定的H3K4me2水平没有显著影响。相对褶皱富集度表示为对负内部控制的褶皱。（B） 无论雌激素（E2）或对照（O）治疗如何，PBX1沉默都不会改变H3K4me2特异性去甲基化酶KDM1的表达。

（TIF）

图S16

PBX1在乳腺癌中的预后潜力。（A–B）使用KMplotter分裂患者，使用上四分位数生成Kaplan-Meier曲线。ERα和FoxA1可以显著预测乳腺癌亚型的转移发展。蜂群图用于绘制探针分布图。（C–D）如A–B所示，生成Kaplan-Meier曲线，将分析局限于病理染色定义的ERα阳性乳腺癌亚型。PBX1可显著预测ERα阳性乳腺癌亚型的转移发展。

（畅通节能法）

图S17

原发性乳腺肿瘤中FoxA1和PBX1的表达水平。用于生成Kaplan-Meier曲线的原发性乳腺肿瘤中FoxA1（左面板）和PBX1（右面板）mRNA水平的平均水平(图6)显示了。与ERα阳性乳腺癌亚型相比，在所有乳腺癌亚类型中，FoxA1高表达者和低表达者之间的FoxA1 mRNA表达差异最大。当评估所有乳腺癌亚型或ERα阳性乳腺癌亚类型时，高和低PBX1表达者之间PBX1 mRNA表达的差异保持不变。

（畅通节能法）

表S1

NCI60癌细胞系中基因与PBX1共表达。

（XLS）

表S2

基因芯片分析在对照组和雌二醇刺激组之间发生显著变化（p值<0.01）。

（XLS）

表S3

研究中使用的引物列表。

（XLS）

鸣谢

我们感谢Jerome Eeckhoute博士（里尔大学INSERM）和Myles Brown博士（达纳-法伯癌症研究所）的讨论。我们感谢亚历山大·斯托克博士（约翰·霍普金斯医学院）的技术援助。

脚注

PBX1作为乳腺癌生物标志物的用途的专利申请中。

这项工作得到了NCI（2P30CA023108-32）和ACS（IRG-82-003-27）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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文章来自PLOS遗传学由提供多环芳烃