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乳腺癌研究。2011; 13（3）：R59。
2011年6月10日在线发布。 数字对象标识：1896年10月186日
预防性维修识别码：项目经理3218948
PMID：21663619

早期和转移性乳腺癌患者循环肿瘤细胞中表达的上皮-间充质转换标记物

加拉泰·卡尔勒吉,通讯作者#1 玛丽亚·帕帕达基,#1 埃利尼·波利塔基,1 迪米特里斯·马夫卢迪斯,1,2 瓦西里斯·乔治亚斯,1,2和索菲亚·阿格拉基1,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

介绍

上皮-间充质转化（EMT）被认为是转移级联过程中的一个基本过程。EMT的特点是vimentin、Twist、Snail、Slug和Sip1等的上调。转移还与乳腺癌患者血液和骨髓中分别存在循环肿瘤细胞（CTC）和播散肿瘤细胞有关，但迄今为止尚未报道这些细胞中EMT标记物的表达。

方法

采用抗细胞角蛋白（anti-CK）抗小鼠抗体（A45-B/B3）和抗Twist或抗vimentin抗兔抗体，在分离的外周血单个核细胞胞浆中进行双重免疫荧光实验，研究了25例转移性和25例早期乳腺癌患者CTC中Twist和vimentin的表达。

结果

在早期乳腺癌患者中，波形蛋白和扭曲表达CK+在77%和73%的患者中分别检测到CTC，在100%的转移性乳腺癌患者中检测到这两种标记物(对=0.004和对分别为0.037）。在早期疾病患者中，CK的56%和53%+CTC用波形蛋白和Twist双重染色，转移患者的相应值分别为74%和97%(对=0.005和对分别=0.0001）。CK的中位表达+波形蛋白+和CK+扭曲+转移患者中每例患者的细胞数分别为98%和100%，在辅助化疗组中相应的细胞数则分别为56%和40.6%。三组训练实验表明，所有CK+扭曲+或CK+波形蛋白+细胞也是CD45-确认其上皮起源。CTC的免疫磁性分离和抗CK/抗扭曲/抗波形蛋白抗体的三重免疫荧光显示，两种间充质标记物可以在同一CK中共存+细胞，因为64%的已鉴定CTC是三色的。存在显著相关性(对=0.005）在相同设置内表达Twist和vimentin的CTC数量之间。

结论

乳腺癌患者中发现表达Twist和vimentin的CTC，提示EMT。与早期乳腺癌相比，转移性疾病患者中这些细胞的高发病率强烈支持EMT参与CTC转移潜能的观点。

介绍

转移与乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞（CTC）和骨髓播散肿瘤细胞（DTC）的存在有关[1,2]. 事实上，在辅助化疗开始前和完成后CTC的存在与不良的临床结果有关[三-5]. 在转移性乳腺癌中，化疗开始前后不久对CTC的评估也可以预测无进展生存率和总生存率[6,7]而预后似乎取决于CTC的检测而非DTC[8]. 染色体改变证实了CTC的恶性性质[9,10]. 然而，只有一部分能够促进转移[11]. 因此，进一步研究CTC的分子特征对于了解其转移潜能以及识别与患者预后相关的其他标记物至关重要。

转移过程由不同的步骤组成，包括肿瘤生长、血管生成、肿瘤细胞分离、上皮-间充质转移（EMT）、血管内浸润、血管和淋巴管内存活以及栓塞、外渗、间充质-上皮转移、微转移的形成，最后，大转移瘤生长[12]. 上皮细胞失去其上皮特性并获得间充质表型的过程。EMT增加这些细胞的转移和侵袭潜能[13]. 上皮标记物（如细胞角蛋白和E-钙粘蛋白）的下调和间充质标记物（例如波形蛋白、N-钙粘蛋白和钙粘蛋白11）的上调是EMT过程的特征。通常，抑制E-钙粘蛋白表达会诱导N-钙粘蛋白的表达，这与肿瘤侵袭性有关[14-16]. 转化生长因子β以及转录因子如Twist、Snail、Slug和Sip1在EMT中起调节作用。

Twist是E-cadherin基因的转录抑制因子[12,17]. Twist在多种肿瘤细胞中的表达增加，如黑色素瘤、骨肉瘤、T细胞（塞萨里综合征）以及胃癌、前列腺癌和乳腺癌[12,18-23]. 免疫磁珠分离DTC的基因表达谱显示，与健康志愿者相比，富集片段中Twist的表达升高[24,25]. 乳腺癌细胞中的扭曲表达通过与Akt启动子结合并增强其转录活性而导致对紫杉醇的耐药性[26]以及对其他微管靶向剂如长春新碱的耐药性[27,28]. 肿瘤细胞中Twist上调增加血管内皮生长因子（VEGF）基因表达[21,29]而低氧诱导因子1α（HIF-1α）通过直接结合Twist近端启动子中的低氧反应元件来调节Twist的表达[30,31]. 我们最近发现VEGF和HIF-1α以及磷酸化Akt在大多数转移性乳腺癌患者的CTC中表达[32,33]; 因此，进一步研究Twist在乳腺癌患者CTC中的表达是很有意义的。

波形蛋白是一种中间丝，通常在间充质细胞中表达，参与上皮细胞在发育过程中的迁移[34]. 波形蛋白在癌细胞中的表达被认为可以增强迁移和侵袭性[35]. 波形蛋白的表达是经历EMT过程的上皮细胞的特征，与E-cadherin表达减少和N-cadherin上调有关[16,36]而波形蛋白在乳腺癌中的表达增加与预后不良相关[37]. 此外，肿瘤细胞中同时表达波形蛋白和细胞角蛋白与乳腺癌患者的生存率较低有关[38]. 最近的研究表明，波形蛋白在乳腺癌患者和肿瘤细胞系的DTC中表达[39,40]; 然而，还没有研究评估CTC中两种EMT标记物（Twist和vimentin）的表达。因此，本研究的目的是研究这些分子在早期和转移性乳腺癌患者CTC中的表达。

材料和方法

患者样本和胞浆制备

自1996年以来，我们研究所一直在进行乳腺癌微转移疾病的纵向试验。在辅助治疗开始之前和结束时，以及转移性疾病患者的每条化疗路线完成之前和之后，从提供书面知情同意书的患者处获取外周血样本，作为常规评估的一部分。同时制备冷冻RNA样品和外周血单个核细胞（PBMC）胞浆，并在-80°C下保存，直至使用。在目前的试验中，对来自辅助性或转移性乳腺癌患者的样本进行细胞角蛋白（CK）-19 mRNA表达筛查[41,42]通过RT-PCR。50名CK-19 mRNA阳性患者（25名早期乳腺癌患者和25名转移性乳腺癌患者）被纳入本研究。我们使用这些患者的存档载玻片，因为我们希望获得相同的血液样本用于实时RT-PCR和免疫细胞化学。10名健康女性献血者也被纳入作为对照组。丢弃前5 mL血液后，在静脉穿刺中间采集所有血样。采取这些预防措施是为了避免血液样本在样本采集期间受到皮肤上皮细胞的污染。所有患者和健康志愿者均书面同意参与本研究，并已获得本机构伦理和科学委员会的批准。

免疫荧光和RT-PCR实验中，每个患者的血液量为20 mL，免疫磁分离时为20 mL。通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离PBMC(d日＝1077g/mol）在1800rpm下搅拌30分钟。PBMC用PBS清洗三次，并以1500 rpm离心10分钟。将250000个细胞的等分样品以2000 rpm的速度在玻璃载玻片上进行细胞离心2分钟。将细胞质干燥并储存在-80°C。每个患者取4-5张幻灯片进行染色实验，因此1×106扫描每位患者的PBMC。

细胞培养

在对照实验中，我们使用人宫颈腺癌细胞系HeLa。HeLa细胞表达Twist和vimentin，并被抗体数据表建议作为阳性对照。HeLa腺癌细胞（美国弗吉尼亚州马纳萨斯美国型培养收集中心）在1:1（vol/vol）DMEM（Gibco-BRL，纽约州格兰德岛）中培养，DMEM补充10%胎牛血清（FBS）（Gibco BRL）、2 mmol L-谷氨酰胺（Gibco-BRL）和50 mg/mL青霉素/链霉素（Gibco-BRL）。细胞保持在5%CO的增湿环境中2和95%的室内空气。使用0.25%胰蛋白酶和5 mmol乙二胺四乙酸（EDTA）（Gibco-BRL）对所有细胞系进行继代培养。所有实验均在实验前15至20小时的对数生长期进行。在健康志愿者的血液中加入HeLa细胞，然后根据患者的样本，用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法制备胞浆。

双免疫荧光共焦激光扫描和ARIOL扫描显微镜

使用小鼠A45-B/B3抗体（检测CK8、CK18和CK19）（德国慕尼黑Micromet）研究PBMC胞浆制剂中是否存在CK阳性细胞。该抗体的敏感性和特异性的对照实验以前已有报道[32,33,43]. 孟提出的细胞形态学标准等人。[44]（例如，高核质比、比白细胞大的细胞）用于将CK阳性细胞表征为CTC。

在双染色实验中，对来自相同患者的细胞质进行Twist/CK（英国剑桥Abcam）和vimentin/CK（美国加州圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology）双重染色[43]. 正如Fehm报告的那样，由于被检分子的细胞内分布与非特异性染色不同，特异性染色很容易通过双重免疫荧光进行区分等人。[45]. 在双染色实验中，PBMC胞浆用3%多聚甲醛固定。用0.5%Triton进行细胞膜的渗透10分钟，并用PBS/1%BSA封闭过夜。随后，用A45-B/B3抗鼠抗体和相应的次级异硫氰酸荧光素（FITC）荧光色素对载玻片进行细胞角蛋白染色。然后用Twist或vimentin抗兔抗体对载玻片进行染色，然后用相应的抗兔二级抗体染色45分钟。通过省略相应的一级抗体并添加二级免疫球蛋白G（IgG）同型抗体，对所有一级抗体进行阴性对照。最后，将4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）防褪色试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）添加到每个样品中进行核染色。使用共焦激光扫描显微镜（德国海德堡莱卡激光技术公司）和ARIOL CTC自动图像分析系统（英国汉普郡纽米尔顿Genetix）对载玻片进行分析。

三重免疫荧光

在通过免疫磁性分离处理以富集CTC的样品中，还对CK/Twist/CD45、CK/vimentin/CD45和CK/Twist/vimentin进行了三重免疫荧光检测。细胞最初在室温下用4%甲醛固定15分钟。在室温下用0.1%的Triton X-100进行5分钟的渗透。在用添加10%（vol/vol）FBS的PBS封闭30分钟后，将细胞与相应抗体孵育45分钟。Zenon技术（FITC-结合IgG1抗体）（分子探针/Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）用于A45-B/B3抗体的CK检测。Zenon抗体在使用后30分钟内制备。

使用标记有Alexa Fluor 633（分子探针/Invitrogen）的抗鼠抗体（Abcam）或标记有Alexa Fluoro 555（分子探针，加利福尼亚州卡尔斯巴德，美国）的Twist抗兔（细胞信号技术，马萨诸塞州波士顿，美国）检测Twist。图中显示了Twist anti-rabbit的阳性和阴性对照​图1A，1安培，而Twist抗鼠抗体的阳性和阴性对照见附加文件1使用标记有Alexa Fluor 555的抗兔抗体（Santa Cruz Biotechnology）检测到了波形蛋白，阳性和阴性对照见附加文件1CD45是用Alexa Fluor 633标记的抗鼠抗体（Dako，Carpindia，CA，USA）检测的。用不同抗体孵育的细胞在室温下用4%（vol/vol）甲醛在PBS中固定15分钟。最后，用DAPI结合抗褪色试剂对细胞进行染色。

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正常志愿者血液中HeLa细胞的扭曲和波形蛋白表达ARIOL系统显示正常志愿者血液中出现HeLa细胞尖峰。（A）第一行：扭转的正向控制。用pan-CK A45-B/B3抗体/次级FITC抗鼠抗体（绿色）/扭体抗兔抗体/Alexa Fluor 555抗兔抗体（橙色）对HeLa细胞进行染色。第二行：扭转负控制。用pan-CK A45-B/B3抗体/FITC抗小鼠（绿色）和Alexa Fluor 555 IgG同型抗体对细胞进行染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。原始放大倍数，x400。（B）第一行：波形蛋白阳性对照。细胞用pan-CK A45-B/B3抗体/FITC抗鼠抗体（绿色）/波形蛋白抗兔抗体/Alexa Fluor 555抗兔抗体（橙色）染色。第二行：波形蛋白阴性对照。用pan-CK A45-B/B3抗体/FITC抗鼠抗体（绿色）和Alexa Fluor 555 IgG同型抗体对细胞进行染色。第三行：pan-CK阴性对照。用FITC IgG同种抗体/波形蛋白抗兔抗体/Alexa Fluor 555抗兔抗体（橙色）对细胞进行染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。原始放大倍数，x400。ARIOL系统=自动图像分析系统；CK=细胞角蛋白；FITC=异硫氰酸荧光素；HeLa=衍生细胞系的宫颈腺癌患者；IgG=免疫球蛋白G；DAPI=4'，6-二氨基-2-苯基吲哚。

CTC的免疫磁性分离

根据Naume描述的方法，阴性选择程序用于CTC的分离等人。[46]. 将100μL涂有抗CD45单克隆抗体的Dynal CELLection珠粒（Invitrogen）加入1×107便士/PBS/0.1%BSA/2 mM EDTA中的mL PBMC。在4°C下培养30分钟后，将上清液转移到FBS涂层管中，并在玻片上以2000 rpm对细胞进行细胞离心2分钟。将相同数量的细胞以1500 rpm离心5分钟，并将颗粒储存在-80°C下以提取RNA。该方法的特异性和敏感性已在前面描述过[33]. 进行CD45免疫磁性去除的目的是为了进行三重训练实验，仅用CTC富集样品。

结果

正常献血者HeLa细胞和PBMC中扭曲蛋白和波形蛋白的表达

将健康志愿者血液中掺入并按照患者样本处理的HeLa细胞胞浆用作阳性对照，以检测Twist和vimentin。Twist、vimentin和CK的阳性和阴性对照如图所示​图11.

随后研究了10名健康献血者PBMC胞浆中Twist和vimentin的表达。两种分子均在PBMC中自发表达，但没有双阳性细胞（CK+扭曲+或CK+波形蛋白+)在健康志愿者中。

Twist和vimentin在早期和转移性乳腺癌患者CTC上的表达

25名转移性乳腺癌患者和25名通过RT-PCR检测到CK-19 mRNA阳性细胞的早期乳腺癌患者被纳入本研究。转移性乳腺癌患者RT-PCR与免疫细胞化学的一致性为100%，早期乳腺癌患者为88%。这些患者的临床病理特征如表所示​表11.

表1

患者特征一

早期乳腺癌转移性乳腺癌
登记的患者数量=25登记的患者数量=25
年龄，年年龄，年
中位数（范围），59（26至76）中位数（范围），59（36至83）
ECOG性能状态，n个(%)ECOG性能状态，n个(%)
0 24 (96%)0 8（32%）
1 1 (4%)1 13 (52%)
2 0 (0%)2 4 (16%)
组织学，n个(%)组织学，n个(%)
管道22（88%）管道20（80%）
小叶3（12%）小叶1（4%）
其他0（0%）未知4（16%）
更年期状态，n个(%)更年期状态，n个(%)
绝经前8例（32%）绝经前4（16%）
围绝经期1（4%）围绝经期1（4）
绝经后16岁（64%）绝经后20（80%）
激素受体状态，n个(%)激素受体状态，n个(%)
ER阳性/PR阳性11例（44%）ER阳性/PR阳性11例（44%）
ER阳性/PR阴性6（24%）ER阳性/PR阴性3（12%）
ER阴性/PR阳性1（4%）ER阴性/PR阳性2（8%）
ER-阴性/PR-阴性7（28%）ER阴性/PR阴性9（36%）
肿瘤大小，n个(%)疾病部位数量，n个(%)
1至1.9厘米（T1）6（24%）1 7 (28%)
2至5厘米（T2）16（64%）2 9 (36%)
>5厘米（T3）1（4%）3 4（16%）
未知2（8%）≥4 5 (20%)
肿瘤等级，n个(%)治疗线，n个(%)
I 2（8%）前11名（44%）
II 9（36%）第二名（28%）
III 13（52%）≥第三名（28%）
未知1（4%）
原发性乳腺癌，n个(%)
9月初（36%）
阳性节点，n个(%)转移性16例（64%）
0（N0）11（44%）
1至3（N1）9（36%）内脏疾病，n个(%)
4至9（N2）2（8%）是13（52%）
≥10（N3）2（8%）第12位（48%）

一ECOG=东方合作肿瘤组；ER=雌激素受体；PR=孕酮受体。

我们使用这些患者的PBMC胞浆制剂研究了CTC上Twist和vimentin的表达。CK的存在+所有转移性疾病患者和25例早期疾病患者中的22例经免疫荧光证实为细胞。用pan-CK和Twist抗体进行的双重试验表明，所有转移性疾病患者都有可检测到的双染色细胞，而CK+/扭曲+22例早期乳腺癌患者中16例（72.7%）可检测到细胞(对=0.037）（图​（图2A，2安培、图I和表​表2）。2). 此外，早期乳腺癌患者双阳性CTC的比例低于转移性乳腺癌患者（分别为53%和97%；对=0.0001）（图​（图2A，2安培，图II）。共聚焦激光扫描显微镜和ARIOL系统显微镜显示Twist位于CTC的细胞质和细胞核中（图​（图2B，2B型，图I；数字​图3三和​和4；4；和其他文件2). 表示Twist的每位患者的CTC中位数+/确认+转移性疾病患者为100%（范围为33%至100%），早期乳腺癌患者为40.6%（范围为12%至100%）（图​（图2A，2安培，图III）。19名转移性乳腺癌患者（76%）仅有双阳性细胞（Twist+CK公司+)而在早期乳腺癌患者中，22例CK中只有6例（27%）+患者只接受了Twist+CK公司+单元格(对=0.0001）（表​（表22).

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Twist和vimentin在早期和转移性乳腺癌患者CTC中的表达.（A）图一：对25名早期乳腺癌患者和25名转移性乳腺癌患者进行量化，在这些患者中采集了每种检测分子的双阳性细胞。图二：每个检测分子的双阳性CTC/总CTC的定量。图三：每名患者每种检测分子的中位数表达量化。（B）PBMC胞浆CTC的典型ARIOL系统图像。第一行：用单克隆pan-CK A45-B/B3（绿色）/多克隆Twist抗兔（红色）抗体和DAPI核染色进行细胞分裂素双重染色。原始放大倍数，x400。第二行：用单克隆A45-B/B3（绿色）/多克隆波形蛋白抗兔（红色）抗体和DAPI核染色进行细胞分裂素双重染色。原始放大倍数，x400。ARIOL系统=自动图像分析系统；CK=细胞角蛋白；CTCs=循环肿瘤细胞；PBMCs=外周血单个核细胞；DAPI=4'，6-二氨基-2-苯基吲哚。

表2

早期和转移性乳腺癌患者中双染色CTC/250000 PBMC的数量一

早期乳腺癌转移性乳腺癌
病人维姆+CK公司+维姆-CK公司+扭曲+CK公司+扭曲-CK公司+病人维姆+CK公司+维姆-CK公司+扭曲+CK公司+扭曲-CK公司+
164518310015040
2256329142245080
三3111157868三21070
43528538542040
51351991813457420450
610015828170677三6
7170254894237724200
8007448216920
901719591090三0
10140401102020
112200011三1510336
1217074881267三91
130480134000
14000三14三三420
157104151010
1610三120161010
17000017102550
18281200183259757
190001019171130
20012020三000
2120130212020
222009222120
233060380023906580
241002241924440
252401025400800

一CTCs=循环肿瘤细胞；PBMCs=外周血单个核细胞；Vim=波形蛋白；CK=细胞角蛋白。

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CTC中的三重免疫荧光（CK/扭曲/CD45，CK/波形蛋白/CD45）转移性乳腺癌患者负免疫磁珠分离后CTC胞浆的典型ARIOL系统显微照片。（A）用pan-CK A45-B/B3抗体/Zenon Alexa Fluor 488（绿色）/Twist抗兔抗体/Alexa Fluor 555抗兔抗体（橙色）和CD45抗鼠/Alexa Flu 633抗鼠抗体（蓝色）对细胞进行三重染色。原始放大倍数，x400。（B）用pan-CK A45-B/B3抗体/Zenon-Alexa Fluor 488（绿色）/vimentin抗兔抗体/Alexa Fluor 555抗兔抗体（橙色）和CD45抗鼠/Alexa Flu 633抗鼠抗体（蓝色）对细胞进行三重染色。原始放大倍数，x400。ARIOL系统=自动图像分析系统；CK=细胞角蛋白；CTCs=循环肿瘤细胞。

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CK、Twist和vimentin在同一细胞中的共表达转移性乳腺癌患者负免疫磁珠分离后CTC胞浆的典型共焦激光扫描显微照片。用pan-CK A45-B/B3抗体/Zenon Alexa Fluor 488（绿色）/Twist anti-mouse/Alexa Fluor 633 anti-mouse抗体/vimentin anti-rabbit/Alexa-Fluor 555 anti-raby抗体（橙色）对细胞进行三重染色。原始放大倍数，x600。（A）表达CK、Twist和vimentin的CTC。（B）CTC表达CK和Twist，但不表达vimentin。CK=细胞角蛋白；CTCs=循环肿瘤细胞。

我们随后评估了同一队列患者CTC中波形蛋白的表达。波形蛋白也分别在100%和77%的转移性和早期疾病患者的CTC中表达(对=0.004）（图​（图2A，2安培、图I和表​表2）。2). 此外，早期癌症患者双阳性CTC的比例低于转移性疾病患者（56%对74%；对=0.005）（图​（图2A，2安培，图II）。此外，早期和转移性疾病患者的双阳性CTC的中位数比例分别为56%（范围21.8%至100%）和98%（范围16.7%至100%）（图​（图2A，2安培，图III）。在25例转移性疾病患者中，12例（48%）的CTC均为双阳性（波形蛋白+CK公司+)相比之下，22例早期疾病患者中仅有6例（27%）只服用波形蛋白+CK公司+CTC公司(对=0.048）（表​（表2）。2). 共聚焦激光扫描显微镜和ARIOL系统显微镜显示，在CTC中波形蛋白的细胞内分布与细胞角蛋白丝几乎相同（图​（图2B，2B型，图II；数字​图3三和​和4；4；和其他文件2).

早期表达Twist和波形蛋白的CTC数量之间也存在统计学显著相关性（Spearmanρ分析）(对=0.027）和转移(对=0.009）乳腺癌患者。即使将所有患者分组在一起，这种相关性仍然显著(对= 0.005).

三重免疫荧光实验显示CTC中Twist和vimentin的特异性表达

如上所述，在PBMC中也观察到Twist和vimentin的表达。为了证实乳腺癌患者中以CTC为特征的细胞是表现异位细胞角蛋白表达的非造血细胞，我们使用CKs和CD45抗体以及Twist或vimentin抗体进行了三重免疫荧光实验。这些实验在5名转移性乳腺癌患者和8名早期乳腺癌患者中进行。我们的结果显示没有CK+波形蛋白+CD45型+或CK+扭曲+CD45型+可以在患者样本中识别细胞（图​（图3三).

乳腺癌患者CTC中波形蛋白和Twist共存

随后，我们研究了在同一个CTC中检测到的间充质标志物的可能共表达。执行CD45后-从24例转移性疾病患者分离的PBMC中进行免疫磁性分离，每个患者的CTC富集部分在一张玻片上进行细胞离心。使用抗pan-CK、抗Twist和抗vimentin抗体进行的三重免疫荧光实验表明，25个CTC中有16个（64%）是CK+扭曲+波形蛋白+25个CTC中有9个（36%）为CK+扭曲+波形蛋白-.检测到的CTC中没有CK+扭曲-波形蛋白+表型。这些结果表明，Twist和波形蛋白在转移性乳腺癌患者的CTC亚群中共表达（图​（图44).

讨论

越来越多的证据表明，CTC和DTC的存在与乳腺癌患者的最小残留疾病或疾病进展相关。然而，与显性转移发展相关的微转移细胞的潜在分子特征在很大程度上仍不清楚。EMT是一个多步骤的过程，已被认为在癌症进展和转移中发挥关键作用[12]. 因此，具有EMT表型特征的CTC应积极参与肿瘤的播散、增殖和转移。Twist是一种转录因子，除其他外，它参与EMT并在许多肿瘤细胞中上调[18-22,47]. 在沃森最近的一份报告中等人。[24]Twist的表达在新辅助化疗后乳腺癌患者的上皮细胞粘附分子富集骨髓样本中获得的基因签名中得到了特异性增强。Twist还可增加VEGF的表达，同时受HIF-1α的直接调节[30,31]. 自从我们最近发现62%和76%的乳腺癌患者在其CTC中分别表达VEGF和HIF-1α[33]，有兴趣确定该转录因子在CTC中的潜在表达。

在目前的细胞形态学研究中，我们首次比较了早期乳腺癌患者与转移性乳腺癌患者单个CTC中Twist和vimentin的表达。为此，我们对25例早期乳腺癌患者和25例转移性乳腺癌患者的PBMC胞浆制剂中的相应抗体进行了双重染色实验。为了证实我们的结果的特异性，我们还对pan-CK/Twist/CD45和pan-CK/vimentin/CD45抗体进行了三组试验，结果表明造血抗原CD45在CK中不表达+/扭曲+或CK+/波形蛋白+细胞。这些发现清楚地表明，观察到的Twist和vimentin的表达并不局限于造血细胞。

双重训练实验显示Twist在所有CK-19 mRNA中表达+转移患者，而其中大多数（76%）只具有双阳性细胞（CK+扭曲+). CTC中每个Twist患者的中位数表达也高达100%。Aktas最近的两项研究也报告了类似的结果等人。[48]和梅戈等人。[49]. 在这些研究中，包括Twist在内的EMT标记物在乳腺癌患者的CTC中检测到的百分比较低，分别为42%和57.7%。这种低水平表达可能与鉴定方法的差异或肿瘤细胞的免疫磁性富集有关。

有趣的是，当在同一组患者中研究波形蛋白表达时，观察到与Twist相似，波形蛋白在所有转移性疾病评估患者的CTC中表达，并且具有完全双阳性细胞（CK）的患者比例+波形蛋白+)也很高。每个患者表达波形蛋白的CTC的中位百分比为98%。波形蛋白是间充质细胞的中间丝，通常用于识别癌症中经历EMT的细胞。此外，其表达与乳腺癌患者转移风险增加和预后不良有关[37,38]. 以前只有两份报告证实了波形蛋白在DTC细胞系和CTC中的表达[38,50]. 与这些数据一致，在我们的研究中观察到的CTC中Twist和vimentin的高表达率意味着间充质标记物在转移性乳腺癌患者的CTC高表达，并表明大多数这些细胞正在经历EMT过程。

此外，我们的实验表明CK+扭曲+和CK+波形蛋白+在早期乳腺癌患者中也观察到CTC。这一观察结果表明，循环上皮细胞（CK+)具有EMT表型的细胞可能参与临床上无法检测到的转移瘤患者的肿瘤持续扩散。然而，EMT表型表达显著降低(对=0.037，对于扭曲和对波形蛋白=0.004）在早期癌症患者中比在转移性乳腺癌患者中。在早期癌症患者中，Twist和vimentin的中位数表达也显著降低（分别为40.6%和55.6%），但不同患者的表达差异极大（分别为11%至100%和21%至100%）。Twist和vimentin在早期癌症患者中的双阳性CTC比例分别为53%和56%，这与转移性乳腺癌患者也有显著差异(对=0.0001和对分别为0.05）。这些发现清楚地表明，EMT标志物可能在早期疾病患者的CTC中表达，但表达程度低于转移性疾病患者。此外，上述结果表明，表达EMT标记的CTC群体在疾病进展过程中占主导地位，或者，由于对治疗的耐药性，该细胞群体被选为非表达EMT的CTC。然而，这一发现应该谨慎解释，因为与晚期疾病相比，早期患者中检测到的CTC数量较少，这可能会影响发现EMT-like CTC的机会。

在早期和转移性疾病患者中，表达Twist和vimentin的CTC数量之间具有统计学显著相关性(对=0.005和对=0.027），表明这两种生物标记物在CTC中同时表达。在来自24名患者的免疫磁性分离的CTC中使用针对CK、Twist和波形蛋白的抗体进行的三重染色实验证实了这一假设，这表明大多数（64%）CTC具有CK+扭曲+波形蛋白+表型。然而，36%的CTC是CK+扭曲+波形蛋白-，而没有CK细胞+扭黄嘌呤+表型（图​（图4）。4). 这些发现表明了CTC的异质性。也有可能，Twist表达是EMT中更常见的现象，因此提示Twist是EMT的更特异标记。

最后，在CTC中观察到波形蛋白和Twist在细胞内的不同分布。波形蛋白主要位于细胞质中，类似于CK的细胞内分布（图​（图2，2,​,3,三,​,4).4). 这一观察结果与先前报告的结果一致，该报告显示，在EMT进展过程中，波形蛋白细丝遵循先前存在的CK网络[51]. 考虑到其作为转录因子的功能，Twist显示了预期的细胞质和核定位（图​（图2，2,​,3,三,​,44).

结论

本研究结果明确表明，早期转移性乳腺癌患者的CTC中表达了Twist和vimentin等EMT标记物。这些分子在疾病不同阶段的CTC中的可变表达暗示了疾病进化过程中EMT表型的优势。CK的观察进一步支持了这一假设+早期乳腺癌患者的CTC在EMT标记物的表达方面更具异质性，因此需要进一步研究以阐明其独特的生物学作用。

缩写

ARIOL系统：自动图像分析系统；BSA：牛血清白蛋白；CTCs：循环肿瘤细胞；DMEM：Dulbecco改良的Eagle介质；DTC：播散性肿瘤细胞；ECOG：东方合作肿瘤小组；EMT：上皮-间充质转化；FITC：异硫氰酸荧光素；HeLa：来源于宫颈腺癌细胞系的患者；PBMCs：外周血单个核细胞；PBS：磷酸盐缓冲盐水；RT-PCR：逆转录聚合酶链反应。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

GK参与了研究的设计和协调，进行了免疫磁珠分离和细胞培养，并起草了手稿。MP和EP进行了免疫荧光实验，并参与了手稿的起草。SA帮助起草了手稿，并收集了患者的所有临床病理特征。DM帮助起草手稿并参与研究设计。VG提供了一般支持，参与了研究设计，并参与了手稿的起草。所有作者都最终批准了即将出版的版本。

补充材料

附加文件1：

HeLa细胞中的三种控制实验使用共焦激光扫描显微镜分析HeLa细胞的三组对照实验。（一） Twist抗鼠抗体阳性对照的典型共焦激光扫描显微照片。HeLa细胞用pan-CK A45-B/B3抗体/Zenon Alexa Fluor 488（绿色）/Twist anti-mouse/Alexa Fluor 633 anti-mouse IgG（蓝色）/vimentin anti-rabbit抗体/Alexa-Fluor 555 anti-raby抗体（红色）染色。原始放大倍数，x500。（二） 扭转负控制。用pan-CK A45-B/B3抗体/Zenon Alexa Fluor 488（绿色）/Alexa Fluor 633抗鼠IgG（蓝色）/vimentin抗兔抗体/Alexa-Fluor 555抗兔抗体（红色）染色的HeLa细胞。原始放大倍数，x500。（二） 波形蛋白阴性对照。HeLa细胞用pan-CK A45-B/B3抗体/Zenon Alexa Fluor 488（绿色）/Twist抗鼠抗体/Alexa Fluor 633抗鼠抗体（蓝色）/Alexa-Fluor 555 IgG同种抗体（红色）染色。原始放大倍数，x500。CK=细胞角蛋白；HeLa=宫颈腺癌患者，细胞系来源于此；IgG，免疫球蛋白G。

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附加文件2：

乳腺癌患者CTC中Twist和vimentin的表达乳腺癌患者表达Twist-or vimentin的CTC的典型共焦激光扫描显微图像。（一） 用单克隆pan-CK（A45-B/B3）/Alexa-Fluro 488抗鼠抗体（绿色）/多克隆Twist抗兔抗体和Alexa-Fluor 555抗兔抗体（红色）双重染色的乳腺癌患者细胞胞浆的典型共焦激光扫描显微图像。原始放大倍数，x600。（二） 单克隆pan-CK（A45-B/B3）/Alexa-Fluor 488抗鼠抗体（绿色）/多克隆波形蛋白抗兔抗体和Alexa-Fluro 555抗兔抗体双重染色的胞浆代表性图像（红色）。原始放大倍数，x600。CK=细胞角蛋白；CTCs=循环肿瘤细胞；FITC=异硫氰酸荧光素。

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致谢

这项工作得到了克里坦生物医学研究协会（CABR）的研究拨款的支持。

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文章来自乳腺癌研究：BCR由以下人员提供BMC公司