不受控制的增殖是恶性肿瘤的标志,可通过多种方法进行评估,包括计算染色组织切片中的有丝分裂图,将标记的核苷酸并入DNA,以及流式细胞术评估S期细胞的比例(1–三). 最广泛应用的测量包括Ki67抗原(也称为单克隆抗体Ki-67[MKI67]识别的抗原)的免疫组织化学(IHC)评估,Ki67抗原是一种在细胞周期所有阶段表达的核标记物,而非G0相位(4). 尽管Ki67作为早期乳腺癌预后标志物的数据一致,但其在乳腺癌管理中的作用仍不确定(5). 如Urruticoechea等人(6),在包括200多名患者的18项研究中,有17项显示Ki67与预后之间存在统计显著性关联,为生物学关系提供了有力证据,但区分“Ki67高”和“Ki67低”的界限从1%到28.6%不等,从而严重限制了其临床实用性。
2010年3月12日,代表北美和欧洲许多乳腺癌合作组织转化研究工作的研究人员由Dowsett博士和Hayes博士召集,他们分别是国际乳腺癌组织和北美乳腺癌组织生物标记物工作组的两个分会,在突破性乳腺癌研究中心(伦敦)审查Ki67评估的现状及其潜在用途。这些被指定为“乳腺癌国际Ki67工作组”的研究人员一致认为,IHC测量Ki67是目前在标准病理标本中测量和监测肿瘤增殖的首选方法。然而,他们认识到在Ki67的精确临床应用以及评估方法的实质性异质性和可变有效性水平方面的一致性较差。
在这项研究中,国际乳腺癌Ki67工作组提出了Ki67分析、报告和使用指南,该指南应减少实验室间的变异性,提高Ki67结果的研究间可比性。由于提出坚定建议的证据有限,一些问题在现阶段无法完全解决。尽管如此,遵循这一指导应该能够改进数据的比较和汇集,并更快地确定或拒绝Ki67在乳腺癌管理中的作用。
本研究的目标是:1)提供实质性数据的说明,这些数据确定了Ki67测量的潜在临床价值;这是以简洁的方式报告的,因为最近有详细的审查(5); 2) 考虑影响Ki67测量的方法学变量,并经常导致缺乏分析有效性;以及3)根据现有证据提供指南,以实现方法学的统一,我们希望能够定义这一潜在重要标记物的临床实用性。
Ki67测量中的方法学问题:分析有效性
上述场景强调了Ki67测量可能具有临床实用性的领域,提示需要可重复的方法和一致的评分方法;换言之,分析有效性,如基因组在实践和预防中的应用评估(EGAPP)所定义(32),需要标准化。
通过IHC测量Ki67已经被许多群体采用,因为相对于通过IHC测定检测到的其他生物标志物,其特别有利的生物表达模式和分析稳健性。然而,有许多步骤会导致这些分析结果的差异性。我们提供了首选方法的指导,以最大限度地减少变异性,并建议采取具体措施来协调Ki67评分和报告。
分析前有效性
几个预分析问题可能会对Ki67的测量产生不利影响。这些包括活检类型、固定时间、固定剂类型、固定剂中的时间以及标本如何长期保存(). 最近两项研究的数据(33,34)总的来说,Ki67比大多数乳腺癌IHC检测对典型的分析前变异性具有更好的耐受性。例如,在其中一项研究中(33)在新鲜手术切除标本上进行的核心切取活检中,Ki67染色在固定延迟20–80分钟内没有变化,也没有从同一切除标本的整个切片测量中变化。然而,在这些研究中,染色细胞核的外观差异经常是明显的:更快固定的细胞核剪片始终显示出边界良好的均匀染色细胞核,而整个切片中的细胞核通常显示出高度可变的染色区域(). 这张图清楚地显示了两种染色方法之间的核完整性差异。这种差异并没有破坏视觉评估得出的分数,但在数字图像分析过程中可能很难处理。
表1
设置 | 因子 | 变量 | 重要吗? | 评论 |
预分析 | 活检类型 | 核心vs整个截面 | 不 | 两者都适用。一些数据表明,整个切片的得分可能高于核心活检。 |
固定剂类型 | 之前冷冻过,或EtOH或EDTA固定剂,或之前酸脱钙与中性缓冲福尔马林 | 是的 | 避免使用中性缓冲福尔马林。与中性缓冲福尔马林相比,其他药物可减少Ki67染色。 |
固定时间 | 原子核的完整性 | 是的 | 对于视觉分析,除非极端,否则影响不大。 对图像分析很重要。 |
储存方式 | 石蜡块与切片中的组织 | 是的 | 室温下长期保存福尔马林固定石蜡包埋组织块对Ki67几乎没有影响。 避免长时间暴露在玻璃载玻片切割部分的空气中。 |
分析 | 抗原检索 | 是与否 | 是的 | 必修的。建议采用微波处理。 |
特异性抗体 | MIB1与其他抗Ki67抗原抗体的比较 | 是的 | MIB1是最广泛验证的抗体。 针对Ki67的SP6抗体似乎很有希望,但目前没有足够的数据支持常规使用。 |
比色检测系统 | 抗生物素-生物素免疫过氧化物酶与聚合物检测† | 不 | 两者都适用。 |
反染色 | 污渍的完整性和强度 | 是的 | 重要的是所有阴性细胞核都要进行反染色。 |
口译和评分 | 阅读方法 | 细胞成分,染色强度 | 是的 | 1) 计数所有细胞核染色区域内的所有阳性细胞。 2) 评分需要确定阳性细胞的百分比。 3) 没有强度解释。 |
幻灯片读取区域 | 边缘与中心;热点地区vs无热点地区vs所有地区 | 是的 | 有争议:目前推荐整个部分的平均分数。 |
图像 | 可视化与自动化分析 | 未知 | 不知道这两种方法是否更好。 |
数据分析 | 切割点 | 有无染色;任意vs数据衍生切点;或连续变量 | 有争议的 | 这是有争议的,因为目前没有建议的共识切入点。 根据上下文选择切点(预后、特定治疗的预测、试验患者的选择、用作药效学或终点生物标记物)。必须在具有相同端点的类似设计的单独独立研究中验证端点。 |
乳腺癌中Ki67染色的示例。肿瘤活检用中性缓冲福尔马林固定,切片用MIB1抗体染色Ki67(棕色斑点)并用迈尔苏木精复染(蓝色色斑).A类)固定良好的试样。B类)固定不良的试样。这张显微照片是使用徕卡微系统Ariol图像分析仪(英国盖茨海德徕卡微公司)拍摄的。比例尺=50μm。
几项研究,包括对Ki67进行IHC评估的系统实验室间和观察者间再现性研究,发现以下分析前因素降低了Ki67标记指数,因此应避免(35):固定前延迟过夜,固定前冷冻标本进行冷冻切片分析,使用乙醇或Bouin溶液而不是中性缓冲福尔马林固定,以及使用EDTA或酸脱钙方案(35,36).
用中性缓冲福尔马林固定4-48小时已经证明是足够的(37)据报道,即使固定154天,Ki67染色也没有显著减少(38). 因此,当组织在中性缓冲福尔马林中固定时,Ki67的IHC在广泛的固定时间范围内是稳定的。因此,已经为ER制定的组织处理指南(8-72小时中性缓冲福尔马林固定)对Ki67来说绰绰有余(39,40).
一旦组织被正确固定并嵌入石蜡中,抗原性就会得到很好的保存,可能会持续几十年(41,42). 然而,如果切割块并将切片存放在暴露在室内空气中3个月或更长时间的玻璃载玻片上,则记录到Ki67免疫反应性的丧失(43). 载玻片的石蜡涂层和/或在氮气干燥条件下的储存似乎只能在一定程度上防止抗原性的丧失。然而,典型的室温和长达2周的空气储存对Ki67阳性没有明显影响(T.Nielsen,未发表的数据)。
分析有效性
Ki67分析的详细特征对其结果至关重要。原始Ki67抗体仅适用于新鲜冷冻材料中的IHC。后来,随着热诱导表位检索方法的发展,小鼠单克隆抗体被开发出来,在福尔马林固定的石蜡包埋切片中具有稳健和可重复的结果。最常用的小鼠抗人Ki67单克隆抗体MIB1克隆(42)具有检测Ki67特有的表位基序(确保特异性)的特别有利特性,该表位基元在蛋白质中重复16次(提高敏感性)(44). MIB1作为IHC试剂的一个相关优点是其在广泛的抗体稀释和条件下的一致性和更好的性能(45)与其他增殖标记物如增殖细胞核抗原(PCNA)进行比较。虽然Ki67 IHC能够耐受多种表位检索协议,但应避免使用蛋白酶和低pH值方法(46).
鉴于单克隆抗体MIB1的长期和高度验证的跟踪记录,我们建议将其视为“金标准”,与其他抗体或增殖分析方法进行比较。然而,据报道,其他抗Ki67抗体可能会提供额外的优势。例如,兔抗人Ki67单克隆抗体SP6(可识别与MIB1相同的重复Ki67表位)可进一步提高敏感性(47)在定量图像分析中(48),该试剂已在最近的几项研究中成功使用(49,50).
Ki67 IHC的显色剂发育和反染色与其他抗体-抗原系统没有区别。显色染色通常非常清晰,但考虑到阴性细胞核决定了计算Ki67阳性细胞比例的总体数量,因此反染色程度对优化非常重要。弱反染色可能导致Ki67指数过高估计(51).
Ki67染色和评分的解释
Ki67是一种核蛋白。MIB1抗体可引起Ki67的细胞质染色和偶尔的膜染色,尤其是在显示鳞状化生改变的乳腺癌中(52). 注意分析前方案和/或SP6抗体的使用可能会在一定程度上减少这种外来染色,但当出现这些染色时,应在创建Ki67评分时忽略。只有核染色(加上Ki67染色的有丝分裂图)才应纳入Ki67评分,Ki67评分定义为阳性染色细胞占恶性细胞总数的百分比。与其他IHC染色一样,有助于内部阳性对照:有丝分裂像、正常导管和淋巴细胞,以及在较小程度上内皮细胞和基质细胞用于此目的。
如果染色是均匀的,建议对至少三个随机选择的高倍视野(×40物镜)进行计数。然而,Ki67染色的生物异质性可能会在标本中出现,应该评分的癌症区域的位置和范围存在争议。两种类型的异质性是突出的:向肿瘤边缘和热点增加的染色梯度。对于前者,应在肿瘤边缘对三个区域进行评分,因为侵袭边缘被广泛认为是肿瘤最具生物活性的部分,并且最有可能决定疾病的结局。本建议的一个例外是,如果要将整个切片上的Ki67染色与取自核心切割的切片进行比较,例如,在术前研究中取下的核心切割。最好使用手术中取下的核心切口进行此类比较,但如果不可能,则切除的评分应包括整个肿瘤的区域,而不仅仅是边缘区域。
热点,定义为Ki67染色特别普遍的区域,可能出现在其他均匀染色的样品中(). 图中左侧圆圈区域的Ki67分数约为30%,右侧圆圈区域约为90%。各研究的热点评分方法各不相同;一些研究人员特别关注热点分析,其他研究人员将热点纳入了整个路段Ki67的总体评估,而其他研究人员则建议完全避免这些热点。这个问题需要澄清,国际Ki67乳腺癌工作组成立了一个工作组,以评估哪种方法更稳健。同时,为了保持一致性,当存在热点时,建议采用评估整个部分并记录总体平均分数的方法。
乳腺癌中不同水平的Ki67染色。肿瘤活检用中性缓冲福尔马林固定,切片用MIB1抗体染色Ki67(棕色斑点)并用迈尔苏木精复染(蓝色色斑). 这两个领域用红色圈出以更高的放大倍数显示,以说明不同高功率场中可能出现的分数差异。应取整个部分的平均分数。显微照片是使用Aperio ScanScope图像分析仪(Aperio,Vista,CA)拍摄的。比例尺=100μm,插图比例尺=50μm。
大多数情况下,在已发表的研究中,对500到2000个肿瘤细胞进行了评分。目前,取芯活检最常用于诊断(正如ASCO/美国病理学家学会(CAP)对ER和PgR的建议)(39,40)以及Ki67作为动态标记物的研究;所有侵袭性肿瘤细胞都可以在这些样本中进行评分。然而,如果对所有细胞进行评分是不切实际的,为了达到足够的精确度,我们建议解释病理学家对至少1000个细胞进行评分,并将500个细胞作为绝对最小值。这些单元格编号应在整个章节的初始概述中具有代表性的字段中进行评分。
组织微阵列(TMA)是一种越来越流行和有影响力的资源,用于评估生物标记物(包括Ki67)与大型III期临床试验或流行病学研究结果之间的关系。目前还没有公开对乳腺癌TMA和整个切片中Ki67的评估进行系统比较,但有轶事证据表明TMA的得分普遍较低。在评估TMA评分与临床样本之间关系的数据公布之前,不得将TMA中的Ki67研究用于建立定量关系或确定其他类型样本的临床应用截止值。
文献中的大多数数据都来自视觉评分,这可以通过使用网格来辅助。数字成像可能有帮助,但因为所有染色的恶性细胞都被视为阳性,而不管染色的强度如何,对于Ki67,成像对消除主观偏见的作用不如使用一些标记物(如ER、HER2)重要。如上所述,核材料内部完整性的丧失可能使某些图像分析系统更难选择阳性核。
数据处理
Ki67测量值通常遵循对数正态分布[例如,见Jones等人(15)]. 汇总统计和比较分析方法应基于对数转换的Ki67数据,或者基于非参数方法。
文献中广泛讨论了确定切点以区分阳性与阴性或高与低肿瘤标记物结果的方法(53). 对于Ki67的IHC,使用了许多截止值,尽管10%-20%的染色水平是最常见的二分群体(54). 然而,由于没有标准化的方法,这些截止值在其来源的研究和执行它们的中心之外的价值有限。这个问题也与背景有关:适合于确定预后的阈值可能不适用于新佐剂试验合格性或Ki67作为药效学标记物的使用。目前,由于缺乏统一的方法,国际Ki67乳腺癌工作组无法就临床实践中可能使用的理想切点达成共识。
Ki67水平在窗口期试验或新佐剂试验中用作药效学标志物时的变化最常见的表示为基线值的百分比,但几乎没有验证数据(如果有的话)来准确证明什么百分比的变化具有临床重要性。在确定基线值是否非常低时,更改也可能是有问题的。国际乳腺癌Ki67工作组将Ki67有意义变化的更好定义确定为一个重要的研究问题。
结论和建议
总的来说,国际Ki67乳腺癌工作组得出结论认为,扩散测量在标准临床实践中,尤其是在临床试验中都很重要。其中,IHC用单克隆抗体MIB1评估的Ki67具有最大的文献支持。尽管预分析和分析问题影响其测量,Ki67是IHC测量的最可靠的生物标志物之一,在常规固定、组织处理和IHC分析中使用的一系列条件下,在标本中显示出相对一致的测量结果。然而,目前评分程序各不相同,而且对于不同类型的标本(例如,取芯切片与全肿瘤切片与TMA)缺乏标准化是有问题的。也许,同样重要的是,没有既定的质量保证计划,以确保一个实验室的Ki67分析程序能够获得与其他实验室相当的分数。因此,除非分析是在经验丰富的实验室使用自己的参考数据进行的,否则直接应用特定截止值进行决策必须被视为不可靠。同样的问题禁止在临床试验之间比较Ki67数据。
为了推动协调,我们启动了实验室间质量评估计划试点。我们的目标是将这些扩展到所有感兴趣的研究人员,并创建具有共识分数的TMA,可供该领域的新手用于标准化,以标准化其程序。我们还建议,当Ki67分析应用这些标准化和质量保证(即QA)材料并遵循本报告中的建议时,应欢迎从佐剂试验中获取大量组织标本。评分方法的进一步研究也在进行中,这些研究的数据将公布。这些举措的结果可能会导致我们建议中的一些未来澄清,如下所示(方框1).
方框1。
乳腺癌Ki67评估建议
预分析
取芯活检和切除活检的整个切片是可接受的标本;当要进行比较评分时,最好对两个样本使用相同的类型(例如,在术前研究中)。
TMA可用于Ki67的临床试验评估或流行病学研究。
中性缓冲福尔马林固定应遵循与类固醇受体相同的指南(39,40). 组织切片一经制备,不得在室温下储存超过14天。必须谨慎查看较长存储时间后的结果。
分析
口译和评分
在整个切片中,应选择至少三个高倍(×40物镜)场来代表整个切片初始概览中看到的染色光谱。
为了评估预后,应该对肿瘤的侵袭边缘进行评分。
如果药效学比较必须在核心切片和切除切片之间进行,则后者的评估应涵盖整个肿瘤。
如果有明确的热点,则这些数据应包含在总分中。
只有核染色被认为是阳性的。染色强度无关。
评分应包括至少500个恶性侵袭细胞(最好至少1000个细胞)的计数,除非协议明确说明可以接受较少的原因。
Ki67的图像分析方法仍有待临床实践验证。
数据处理
Ki67评分或指数应表示为阳性染色细胞占评分区域内侵袭细胞总数的百分比。
统计分析应考虑对数正态分布,然后通常进行Ki67测量。
在治疗效果或反应的比较研究中,最合适的终点是Ki67阳性细胞的抑制百分比。
评估复发残余风险的最合适终点是Ki67阳性细胞的治疗中比例。
只有当本地实践的结果与已确定Ki67结果预期用途截止值的研究中的结果进行了验证时,才能应用预测、预测和监测的截止值。