跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
神经元。作者手稿；PMC 2012年10月20日发布。
以最终编辑形式发布为：
神经元。2011年10月20日；72(2): 245–256.
2011年9月21日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.neuron.2011.09.011
预防性维修识别码：项目经理3202986
尼姆斯：美国国家卫生研究院327774
PMID：21944778

非编码区扩增的GGGCCC六核苷酸重复序列C9ORF72型导致9p染色体连锁额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化症

玛丽·德耶苏斯·赫南德斯,1,10 伊恩·麦肯齐,2,10,* 布拉德利·F·波伊夫,三 亚当·博克瑟,4 马特·贝克,1 尼古拉·卢瑟福,1 亚历山德拉·M·尼科尔森,1 尼科尔·芬奇,1 希瑟·弗林·吉尔默,5 詹妮弗·亚当森,1 内奥米·库里,1 亚历克桑德拉·沃伊塔斯,1 菲斯·森迪,6 金月瑞雄,6 安娜·卡里达斯,4 威廉·W·西利,4 基思·A·约瑟夫,三 乔瓦尼·科波拉,7 丹尼尔·盖什温德,7 兹比格尼乌·K·W·索莱克,8 霍华德·费尔德曼,6,9 戴维·克诺普曼,三 罗纳德·彼得森,三 布鲁斯·米勒,4 丹尼斯·迪克森,1 凯文·博伊兰,8 尼尔·格拉夫·拉德福德,8和罗莎雷达制造商1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

据报道，有几个家族患有常染色体显性额颞叶痴呆（FTD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS），与染色体9p21基因相关。这里我们报道了基因中非编码GGGCC六核苷酸重复序列的扩增C9ORF72型这与一个大的FTD/ALS家族的疾病密切相关，此前有报道称其与9p号染色体有决定性联系。在我们大多数FTD/ALS表型和基于TDP-43的病理学相结合的家族中也发现了相同的重复扩增。对扩展临床系列的分析发现C9ORF72型重复扩张是家族性FTD（11.7%）和家族性ALS（22.5%）中最常见的遗传异常。重复膨胀导致一个交替拼接的丢失C9ORF72型转录和形成核RNA焦点，提示多种疾病机制。我们的发现表明C9ORF72型是FTD和ALS的主要原因。

简介

额颞叶痴呆（FTD）和肌萎缩侧索硬化（ALS）都是毁灭性的神经疾病。FTD是学龄前痴呆的第二大常见病因，大脑额叶和颞叶的退化导致人格、行为和语言的渐进性改变，同时相对保留了知觉和记忆(格拉夫·拉德福德和伍德拉夫，2007年). 每10万人中就有2人患有肌萎缩侧索硬化症，传统上认为这是一种上下运动神经元退化导致进行性痉挛、肌肉萎缩和虚弱的疾病。然而，ALS越来越被认为是一种多系统疾病，多达50%的患者的额颞叶功能受损，如认知和行为受损(佐丹娜等人，2011年;Lomen-Hoerth等人，2003年;Phukan等人，2007年). 同样，多达一半的FTD患者出现运动神经元功能障碍的临床症状(Lomen-Hoerth等人，2002年). FTD和ALS代表疾病的临床病理谱这一概念得到了最近发现的与M第页43kD（TDP-43）作为绝大多数ALS病例和最常见的FTD病理亚型中的病理蛋白(Neumann等人，2006年)（现在称为TDP-43病理学下的额颞叶变性，FTLD-TDP）(Mackenzie等人，2009年).

约10%的ALS患者有阳性家族史(Gros-Louis等人，2006年)而多达50%的FTD患者报告其家庭成员患有FTD或相关认知和行为改变(格拉夫·拉德福德和伍德拉夫，2007年)支持遗传因素对这些疾病的重要贡献。目前已知的家族性FTLD-TDP最常见的病因包括分泌生长因子progranulin基因的功能丧失突变(GRN公司) (贝克等人，2006年;Cruts等人，2006年). 虽然GRN缺乏与疾病的神经元培养模型中的TDP-43功能障碍和聚集直接相关GRN公司基因敲除小鼠，GRN不足和TDP-43功能障碍之间的确切关系尚不清楚(Ahmed等人，2010年;郭等，2010;Yin等人，2010年). 在家族性ALS中，约15-20%的患者发现Cu/Zn超氧化物歧化酶基因突变(SOD1标准) (Rosen等人，1993年). 治疗表明对SOD1标准然而，小鼠模型在ALS临床试验中通常无效，并且在患有ALS的病例中缺乏TDP-43病理学SOD1标准突变表明这些病例中的运动神经元变性可能是由不同的机制引起的(Mackenzie等人，2007年). 由于这些原因，最近发现TDP-43（编码为TARDBP公司) (Kabashi等人，2008年;Sreedharan等人，2008年)和相关的RNA-结合蛋白肉瘤融合(保险丝) (Kwiatkowski等人，2009年;Vance等人，2009年)约5%的家族性ALS患者显著改变了ALS研究的重点，并暗示异常RNA处理是ALS发病的关键过程(Lagier-Tourenne等人，2010年).

FTD和ALS是密切相关的疾病这一概念的进一步支持是认识到这两种临床综合征可能发生在同一家族中，通常具有常染色体显性遗传模式。目前公认的遗传缺陷并不能很好地解释这种家族关联；GRN公司突变与明显的运动神经元缺陷无关，而携带突变的患者SOD1标准,TARDBP公司或模糊很少受到FTD的影响。对几个常染色体显性家族的连锁分析表明，在这些家族中，受影响的成员发展为ALS或FTD或两者兼有，并且病理学始终为TDP阳性，FTD/ALS的主要基因座位于染色体9p21上。综合数据确定了最小连锁区域3.7Mb，仅包含五个已知基因(Boxer等人，2011年;Gijselinck等人，2010年;Le Ber等人，2009年;Luty等人，2008年;Morita等人，2006年;Pearson等人，2011年;Valdmanis等人，2007年;Vance等人，2006年). 重要的是，在ALS和FTD的几项大型独立全基因组关联研究（GWAS）中发现了相同的染色体区域，这意味着这两种疾病散发形式的9p染色体的遗传缺陷(Laaksovirta等人，2010年;Shatunov等人，2010年;Van Deerlin等人，2010年;van Es等人，2009年). 此外，相关的“风险”单倍型在所有研究的ALS和FTD人群中都是相同的，最近也被证明存在于几个9p连锁的FTD/ALS家族的所有受影响成员中(Mok等人，2011年).

我们来自不列颠哥伦比亚大学（UBC）、加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）和梅奥诊所罗切斯特分校（MCR）的合作小组此前报道了一个大型常染色体显性FTD/ALS家族，命名为VSM-20，代表“温哥华、旧金山和梅奥家族20”，与第9p号染色体有决定性联系（最高两点LOD评分，3.01）(Boxer等人，2011年). 三名受累成员的尸检结果显示，FTLD-TDP和ALS与TDP免疫反应病理学相结合(图1). 之前对候选区域内所有外显子和基因外显子-内显子边界的广泛测序并未确定该家族中的致病突变。在这里，我们提供了证据表明，VSM-20家族的疾病是由9号染色体开放阅读框72的非编码区中的扩展的六核苷酸重复序列引起的(C9ORF72）这种反复扩张是迄今为止发现的家族性FTD和ALS最常见的病因。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-327774-f0001.jpg
与9p染色体相关的家族性FTD/ALS的神经病理学（家族VSM-20）

(A、 B类)FTLD-TDP以TDP-43免疫反应性神经元胞质内含物和（A）新皮质和（B）海马齿状颗粒细胞层的突起为特征。（C）脊髓下运动神经元中TDP-34免疫反应性神经元胞质内含物，典型的ALS。（D）小脑颗粒层中的大量神经元胞质内含物和神经突起对泛素呈免疫反应，但对TDP-43无免疫反应。比例尺：（A）15微米，（B）30微米，（C）100微米，（D）12微米。

结果

C9ORF72中扩增的GGGGCC六核苷酸重复序列是VSM-20家族染色体9p21连锁FTD/ALS的原因

在对非编码区域进行排序的过程中C9ORF72型，我们检测到一个多态性的GGGGCC六核苷酸重复序列（g.26724GGGCCC（3_23））AL451123.12号机组从nt 1开始），位于非编码之间C9ORF72型外显子1a和1b。VSM-20家族成员样品中该区域的荧光片段长度分析导致异常分离模式。在这项检测中，所有受影响的个体都是纯合子，受影响的儿童似乎没有从受影响的父母那里继承等位基因(图2A-B). 为了确定缺乏分离是否是由于存在不可扩增重复序列扩增而导致的单个等位基因扩增的结果，我们使用了一种专为观察到的GGGCC六核苷酸重复序列设计的重复-定时PCR方法。该方法表明，VSM-20家族所有受影响成员都存在重复扩张，但未受影响的亲属不存在重复扩张(图2C). 随后通过荧光片段长度分析对909名健康对照进行分析，确定315名纯合子，但通过重复计时PCR未观察到重复扩增。对照组重复的最大大小为23个单位。这些发现表明VSM-20家族中存在独特的重复扩增，并促使我们对VSM-20的四个不同受累和一个未受累成员的DNA进行Southern blot分析。除了预期的正常等位基因外，我们还检测到一个大小可变的扩增等位基因，该等位基因太大，无法通过PCR扩增，仅在受影响的个体中发现(图2D). 除一名患者外，所有患者的扩增等位基因均显示为单个离散带；然而，患者20-17(图2D,lane 5）观察到两条离散的高分子量条带，表明重复序列的体细胞不稳定性。基于这一少数患者，我们估计GGGCC重复单位的数量大约在700到1600之间。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-3277774-f0002.jpg
扩增的GGGGCC六核苷酸重复序列C9ORF72型导致VSM-20家族中与9p染色体相连的FTD和ALS

（A）GGGGCC重复序列的分离C9ORF72型VSM-20家族隐性连锁系谱中的侧翼遗传标记。箭头表示先证者。对于GGGGCC重复序列，数字表示六核苷酸重复单位，X表示无法检测到等位基因。黑色符号表示患有额颞叶痴呆（左侧填充）、肌萎缩侧索硬化（右侧填充）或两者兼有的患者。白色符号表示未受影响的个体或表型未知的高危个体。个体20-1、20-2和20-3的单倍型是根据兄弟姐妹和后代的基因型数据推断出来的。（B）含有GGGCC重复序列的PCR片段的荧光片段长度分析C9ORF72型未受影响的父亲（20-9）、受影响的母亲（2-10）及其后代（20-16、20-17和20-18）的PCR产物表明，受影响的父母与受影响的后代之间缺乏传播。峰下的数字表示GGGCC六核苷酸重复数。(C类)重复定时PCR反应的PCR产物在ABI3730 DNA分析仪上分离，并通过GENEMAPPER软件进行可视化。电描记图被放大到2000个相对荧光单位，以显示断续放大。显示了VSM-20系列中的两个扩展重复载波（20-8和20-15）和一个非载波（20-5）。（D）使用从淋巴母细胞系提取的基因组DNA对来自VSM-20家族成员的四个扩增重复载体和一个非载体进行Southern印迹。车道1显示DIG标记的DNA分子量标记II（Roche），其片段为2027、2322、4361、6557、9416、23130 bp，车道2显示DIG标签的DNA分子重量标记VII（Roche），其碎片为1882、1953、2799、3639、4899、6106、7427和8576 bp。扩增重复序列患者（3-6道）显示6-12kb的额外等位基因，而正常亲属（7道）仅显示预期的2.3kb野生型等位基因。

C9ORF72中扩增的GGGGCC六核苷酸重复序列是FTD和ALS患者人群中常见的疾病原因

VSM-20家族先证者（20-6）是在加拿大温哥华UBC确定的26名经过高度挑选的先证者中的一员，已确诊为FTLD-TDP的病理诊断，且有FTD和/或ALS的阳性家族史。我们之前确定GRN公司该系列中7个先证者（26.9%）的突变，均来自临床纯FTD表型的家族；然而，其他家族中该病的遗传基础尚不清楚。使用荧光片段长度和重复启动的PCR分析的组合，我们现在发现该系列中的26个FTLD-TDP家族中有16个（61.5%）携带GGGGCC六核苷酸重复序列的扩增等位基因；9例为FTD/ALS综合表型，7例为临床纯FTD。在其中五个家庭中，可以从多个受影响的成员处获得DNA，在所有情况下，重复扩增被发现与疾病分离(图2和图S1). 这些发现表明，GGGGCC在C9ORF72型是家族性FTLD-TDP最常见的病因。

为了进一步确定GGGGCC六核苷酸扩增的频率C9ORF72型在患有FTLD-TDP病理学的患者中，为了评估这种基因缺陷在临床诊断为FTD和ALS的患者病因中的重要性，我们分析了696名患者（93名病理诊断为FTLD-TDR、374名临床FTD和229名临床ALS）来源于佛罗里达梅奥诊所（MCF）和MCR确定的三个特征鲜明的患者系列(表S1). 这导致发现了另外59名携带GGGCC重复扩增的无关患者，包括22名无已知家族史的患者(表1,图S1). 在这些患者中的一部分患者中，疾病的散发性可能是由于父母一方或双方的早逝（3/22）、收养（1/22）或缺乏足够的信息（8/22）；然而，在10名患者中，临床记录显示该病为真正的散发性疾病。在MCF脑库中，18.3%的FTLD-TDP病理患者中发现了GGGGCC重复序列，并解释了22.5%的家族性病例。然而，应该注意的是，这是一个以痴呆症为重点的系列，ALS的代表性不足。在我们的临床FTD患者系列中，散发病例的频率为3.0%，家族患者的频率为11.7%。在我们的临床ALS系列中，4.1%的散发性和23.5%的阳性家族史患者有重复扩增。重要的是，直接比较C9ORF72型基因突变SOD1标准,TARDBP公司和保险丝在我们的临床系列中，GGGCC扩增是散发性和家族性ALS最常见的遗传原因(表1). 在临床FTD中，GGGGCC重复扩增比任何一种都更常见GRN公司或微管相关蛋白tau(地图）家族性病例的突变频率与GRN公司散发性FTD突变。

表1

FTLD和ALS中染色体9p重复扩增的频率

队列N个突变携带者数量（%）
c9FTD/ALSGRN公司地图SOD1标准TARDBP公司保险丝
UBC FTLD-TDP公司
家庭 2616 (61.5)7（26.9）不适用不适用不适用不适用
MCF FTLD-TDP公司
家庭 409 (22.5)6 (15.0)不适用不适用不适用不适用
零星的 一 538 (15.1)8 (15.1)不适用不适用不适用不适用
MC临床FTD
家庭 17120 (11.7)13 (7.6)12 (6.3)不适用不适用不适用
零星的 2036 (3.0)6（3.0）3 (1.5)不适用不适用不适用
MCF临床ALS
家庭 348 (23.5)不适用不适用4 (11.8)1 (2.9)1 (2.9)
零星的 1958 (4.1)不适用不适用0 (0.0)2 (1.0)3 (1.5)
一包括22名没有家族史信息的个人。

肌萎缩侧索硬化；c9FTD/ALS=（GGGCC）n个本研究确定9p染色体重复扩增；FTD=额颞叶痴呆；FTLD-TDP=额颞叶变性伴TDP-43病理；保险丝=肉瘤基因融合；GRN公司=孕激素基因；地图=微管相关蛋白tau基因；MC=梅奥诊所；MCF=佛罗里达梅奥诊所；n/a=未评估；SOD1标准=超氧化物歧化酶1基因；TARDBP公司=TAR DNA-结合蛋白43基因UBC=不列颠哥伦比亚大学。

扩张型GGGCC重复携带者的临床和病理特征

从临床FTD系列中获得了26名无关扩增重复携带者的临床数据，从ALS系列中获得16名无关携带者。两组患者的平均发病年龄具有可比性（FTD:56.2岁，范围34-72岁；ALS:54.5岁，范围41-72岁），ALS患者的平均病程稍短（FTD:1.1±3.1岁，范围1-12年，N=18；ALS:3.6±1.6岁，范围1-6年，N=7）。FTD表型主要为行为变异型FTD（bvFTD）（25/26）。重要的是，FTD系列中有7名患者（26.9%）伴有ALS，8名患者（30.7%）的亲属患有ALS。相比之下，在我们的FTD人群（那些没有重复扩张的人群）中，ALS家族史的频率仅为5/348（1.4%）。在ALS系列中，所有突变携带者均表现为典型的ALS，只有一名患者被诊断为进行性肌萎缩，但没有上运动神经元症状。三名患者（18.8%）被诊断为ALS/FTD综合表型。在重复扩张的ALS患者中，11/16（68.8%）的亲属患有FTD或痴呆，而在没有重复扩张的ASS患者中只有61/213（28.6%）。最后，随后对临床系列中的11个FTD和3个ALS扩增重复携带者进行了尸检，在所有病例中，基于TDP-43的病理学都得到了证实。

携带扩增GGGGCC重复序列的单倍型与先前报道的9p染色体“危险”单倍型的比较

我们之前描述了9p21染色体上约140kb的风险单倍型，该单倍型由四个9p染色体连锁家族共享，并在至少八个群体中显示出与FTD和ALS的显著相关性(Mok等人，2011年). 为了确定本研究中确定的所有GGGGCC扩增重复携带者是否也携带这种“风险”单倍型，并进一步研究这一发现的意义，我们选择变异体rs3849942作为我们患者和对照人群中基因分型的“风险”单倍型的替代标记。所有75名无关扩增重复携带者至少有一个“风险”单倍型拷贝（100%），而我们的对照人群只有23.1%。为了将重复大小与“风险”单倍型的存在或不存在联系起来，我们进一步关注rs3849942（505 GG和49 AA）的对照纯合子，并确定两组重复大小的分布(图3). 我们发现GGGCC重复数存在显著差异，与等位基因G标记的野生型单倍型相比，等位基因a标记的“风险”单倍型重复数显著更长（中间重复长度：风险单倍型=8，野生型单倍型=2；平均重复长度：风险单倍型=9.5，野生型单倍型=3.0；p<0.0001）。对48个重复长度在两个等位基因上相同的对照组（范围=2-13个重复单位）进行的序列分析进一步表明，GGGCC重复序列在所有个体中都是不间断的。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-327774-f0003.jpg
GGGGCC六核苷酸重复序列长度与rs3849942的相关性，rs384994是先前公布的9p染色体“危险”单倍型的替代标记

505例GGGCC重复次数的直方图控制rs3849942 G等位基因的纯合子，49例控制rs3849 942 A等位基因纯合子。

扩增的GGGCC重复序列以转录特异的方式影响C9ORF72的表达

非编码重复区的扩展可能导致疾病的一个潜在机制是干扰编码蛋白的正常表达。通过复杂的可选拼接过程C9ORF72型转录产物被预测会导致未标记蛋白C9ORF72的两种替代亚型的表达(图4A). 转录变体1和3预计编码481个氨基酸长蛋白，由C9ORF72型外显子2-11(NP_060795.1号; 同种型a），而变体2被预测编码由外显子2-5编码的较短的222个氨基酸的蛋白质(NP_659442.2号; 亚型b）(图4A). RT-PCR分析表明C9ORF72型转录物存在于多种组织中，大脑中的免疫组织化学分析进一步表明，C9ORF72主要是神经元中的细胞质蛋白(图S2).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-327774-f0004.jpg
扩增核苷酸重复序列对C9ORF72表达的影响

（A）基因组结构概述C9ORF72型轨迹（顶部面板）和C9ORF72型通过选择性前mRNA剪接产生的转录物（底部面板）。方框代表编码（白色）和非编码（灰色）外显子，并指示起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA）的位置。GGGGCC重复项用红色菱形表示。rs10757668的位置用绿色星形表示。（B）的序列记录道C9ORF72型从携带扩增GGGGCC重复序列的FTLD-TDP患者的额叶皮层制备的gDNA（上图）和cDNA（下图）中跨越rs10757668的外显子2。箭头表示gDNA中存在rs10757668的野生型（G）和突变型（A）等位基因。使用跨越外显子1b/外显子2边界（变体1）或外显子1a/外显子2边界（变体2和3）的引物扩增转录特异性cDNA。从cDNA转录物中获得的测序痕迹表明缺失了变体1，但没有缺失变体2或3突变RNA。两个不相关的FTLD-TDP突变携带者也获得了类似的结果。底部面板显示rs10757668的非扩展重复载体杂合子，以确认转录变体1的两个等位基因的存在，从而验证该方法。（C）mRNA表达分析C9ORF72型使用定制设计的Taqman表达分析的转录变体1。顶部显示的是从VSM-20家族（n=7）和对照组（n=6）扩增的重复载体中获得的淋巴母细胞系，底部显示的是来自FTLD-TDP患者额叶皮质脑样本的RNA，这些患者分别有（n=8）和（n=9）GGGCC重复扩增。数据表明平均值±标准误差**表示P<0.01。（D） all的mRNA表达分析C9ORF72型使用清单ABI Taqman表达分析Hs_00945132编码C9ORF72亚型a（变体1和3）的转录本。顶部面板显示从来自VSM-20家族（n=7）和对照组（n=6）扩增重复载体的淋巴母细胞系中提取的RNA，底部面板显示从患有GGGCC重复扩增的FTLD-TDP患者的额叶皮质脑样本中提取的RNA。数据显示平均值±标准偏差*表示P<0.05。

GGGGCC六核苷酸重复序列位于两个交替分裂的非编码第一外显子之间，根据它们的用途，扩展重复序列要么位于启动子区域（转录变体1），要么位于内含子1（转录变体2和3）C9ORF72型(图4A). 这种复杂性增加了扩展重复影响的可能性C9ORF72型以转录特异性的方式表达。为了解决这个问题，我们首先确定C9ORF72型携带扩增重复序列的转录物在大脑中产生mRNA表达。为此，我们选择了两个GGGGCC重复载体，它们的冷冻额叶皮层脑组织可用，并且是罕见序列变异rs10757668的杂合基因C9ORF72型外显子2。序列轨迹的比较C9ORF72型从这些患者中扩增出的gDNA外显子2和转录特异性cDNA显示，突变RNA（G-等位基因）转录的变体1缺失，但变体2和3转录正常(图4B). GGGGCC重复载体中变异体1表达缺失通过实时RT-PCR进一步证实，该实时RT-PCR使用定制设计的针对变异体一的Taqman分析。在来自VSM-20家族的患者的淋巴母细胞系和来自携带扩增重复序列的无关FTLD-TDP患者的额叶皮层样本中C9ORF72型与非重复携带者相比，变异体1减少了约50%(图4C). 自C9ORF72型变体1和3分别包含不同的非编码第一外显子，都编码C9ORF72亚型a(NP_060795.1号)接下来，我们使用清单ABI-Taqman分析（Hs_00945132）确定了扩展重复序列对编码该亚型（变异体1和变异体3组合）的转录物总水平的影响。扩增重复载体的淋巴母细胞（减少34%）和额叶皮质样本（减少38%）的mRNA显著减少(图4D). 相反，通过淋巴母细胞裂解物或脑组织的western blot分析，C9ORF72蛋白的总水平没有明显变化(图S2)或通过对来自扩增重复载体的死后大脑或脊髓组织中C9ORF72的免疫组织化学分析(图S2). 然而，这些蛋白质表达数据应被视为初步数据，因为它们基于使用相对无特征的商业获得的C9ORF72抗体的有限数量的样本，而没有进行详细的定量分析。

转录的GGGGCC重复序列在突变携带者受影响的中枢神经系统区域形成核RNA焦点

近年来，在受影响细胞的细胞核和/或细胞质中，作为RNA焦点的扩增核苷酸重复序列的细胞内积累已成为日益严重的非编码重复序列扩增障碍的重要发病机制(托德和保尔森，2010年). 确定GGGCC是否在C9ORF公司72导致RNA灶的形成，我们在FTLD-TDP患者死后额叶皮层和脊髓组织的石蜡包埋切片中进行了RNA荧光原位杂交（FISH）。对于每个神经解剖区域，分析了两名GGGCC重复序列扩增患者和两名重复序列长度正常的受影响患者的切片。使用靶向GGGGCC重复序列的探针[探针（GGCCCC）4]在扩张患者额叶皮质和脊髓25%的细胞核中检测到多个RNA病灶，而在非载体组织切片中仅1%的细胞中观察到信号(图5A-C). 使用靶向无关CCTG重复序列[探针（CAGG）]的探针在任何样本中均未观察到病灶6]与强直性肌营养不良2型（DM2）有关(Liquori等人，2001年)进一步支持了GGGCC组成的RNA病灶在这些患者中的特异性(图5D).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-327774-f0005.jpg
扩增的GGGCCC六核苷酸重复序列在人脑和脊髓中形成核RNA病灶

（A）使用Cy3标记（GGCCCC）在63家族先证者（63-1）额叶皮层神经元的细胞核（DAPI染色，蓝色）中发现多个RNA病灶4寡核苷酸探针（红色）。（B）在FTD/ALS患者（13-7）的两个下部运动神经元的细胞核中观察到RNA病灶，该患者携带使用Cy3标记（GGCCCC）的扩增GGGGCC重复序列4寡核苷酸探针。（C）FTLD-TDP患者（44-1）皮层神经元核内无RNA病灶，且GGGCC重复序列扩增C9ORF72型.（D）患者13-7的脊髓组织切片显示RNA病灶（GGCCCC）4（B）中的寡核苷酸探针没有显示任何带有Cy3标记（CAGG）的病灶6寡核苷酸探针（阴性对照探针）。比例尺：10μm（A和C），20μm（B和D）。

讨论

中扩展的非编码GGGCC重复序列的识别C9ORF72型解决了FTD和ALS领域的一个重要问题，即与染色体9p21相连的FTD/ALS的遗传基础。这一发现将FTD/ALS添加到越来越多的非编码重复扩增障碍中，其中包括强直性肌营养不良（DM1和DM2）(布鲁克等人，1992年;Liquori等人，2001年;Mahadevan等人，1992年)，脆性X相关震颤/共济失调综合征（FXTAS）(加洛韦和纳尔逊，2009年;Tassone等人，2004年)和一些脊髓小脑共济失调（SCA8、SCA10、SCA31、SCA36）(Daughters等人，2009年;小林等，2011年;Moseley等人，2006年;Sato等人，2009年).

我们在722名纳入本研究的患者（10.4%）中发现了75名非相关的GGGGCC扩增重复携带者。患者表现为FTD、ALS或两者兼有。最高频率C9ORF72型在一系列经病理证实的FTLD-TDP先证者中观察到重复扩增，这些先证者具有在UBC确定的FTD和/或ALS的强烈家族史（61.6%）。来自MCF脑库的第二个经病理证实的FTLD-TDP序列显示家族性病例的重复扩张频率较低（22.5%）；这种差异很可能反映了ALS患者的数量要少得多，而且在大多数家庭中，先证者只有一个亲属患有不明类型的痴呆症。扩展的GGGCC重复C9ORF72型在梅奥诊所确定的系列临床患者中，家族性FTD患者占11.7%，家族性ALS患者占23.5%。与我们系列中先前确定的FTD和ALS常见基因的突变频率直接比较表明C9ORF72型重复扩张是家族性FTD和ALS最常见的病因。C9ORF72型也解释了很大一部分散发性FTD和ALS患者的疾病，并且是我们系列中散发性ALS最常见的遗传原因（4%）。因此，GGGGCC重复扩增是第一个被确定为FTD和ALS表型共同原因的遗传异常，预计在大多数FTD/ALS家族中都存在，并且可能是该地区最近报告的FTLD-TDP和ALS GWAS发病相关的大多数风险的原因。

扩展的GGGCCC重复序列位于C9ORF72型，一种编码无特征蛋白质的基因，没有已知的结构域或功能，但在物种间高度保守。我们发现在正常个体中至少有三个交替拼接C9ORF72型转录本（变体1-3）在包括大脑在内的大多数组织中表达。免疫组织化学分析证实C9ORF72在FTD和ALS神经解剖区的神经元中表达，染色模式主要与细胞质和突触定位一致。定量mRNA表达分析表明，GGGGCC重复序列扩增C9ORF72型突变等位基因的转录变体1表达，导致C9ORF72型编码C9ORF72亚型a的转录本。根据不同转录本的相对表达C9ORF72型转录本1可能对选择性组织或细胞类型产生重大影响。虽然培养细胞和全脑组织匀浆中C9ORF72蛋白水平的初步分析没有显示稳态水平的明显变化，但我们不能排除转录水平降低的可能性C9ORF72型在压力条件下影响蛋白质翻译或可能影响蛋白质周转和/或功能。我们也不能保证本研究中使用的商业C9ORF72抗体的特异性，因为尚未对这些抗体进行仔细的鉴定。在未来的实验中，重要的是产生更特异的C9ORF72抗体，并开发更定量的方法来测量C9ORF 72水平，以进一步阐明C9ORF2亚型在不同组织和疾病进展的不同阶段的表达和定位。尽管此时是推测性的，但C9ORF72型在个体患者中，可能导致疾病表型（FTD与ALS）或病程的变异。

近年来越来越受到关注的非编码重复序列扩张障碍的一个共同特征是，由重复核苷酸组成的RNA片段在受影响细胞的细胞核和/或细胞质中积聚成RNA焦点(托德和保尔森，2010年). 在一些疾病中，RNA焦点被证明可以隔离RNA结合蛋白，导致选择性mRNA剪接的失调(Miller等人，2000年;Sofola等人，2007年;Timchenko等人，1996年;怀特等人，2010年). 使用GGGCC重复序列特异性寡核苷酸探针，我们证实了在死后大脑皮层和脊髓组织中存在这种核RNA病灶C9ORF72型扩展重复载波。GGGGCC序列基序预测了几种RNA-结合蛋白的潜在结合，包括丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1（SRSF1）和杂合核核糖核蛋白（hnRNP）A2/B1(Cartegni等人，2003年;Smith等人，2006年;Sofola等人，2007年). 尽管需要进一步研究来阐明这些或其他RNA-结合蛋白是否在疾病发病机制中发挥任何作用，但鉴于ALS和FTD发病机制中RNA错误处理的证据越来越多，异常RNA剪接在染色体9p-连锁FTD/ALS中是一种极有可能的机制(Baumer等人，2010年). hnRNP A2/B1的失调是一种特别有趣的可能性，因为已知该蛋白与另一种神经退行性疾病（FXTAS）中形成RNA焦点的富含C/G的重复序列相互作用，并且已经证明hnRNP A2/B1与TDP-43直接相互作用(Buratti等人，2005年;Sofola等人，2007年). 识别对疾病至关重要的异常剪接RNA靶点可能是未来治疗策略的关键。

健康人的GGGCC重复序列长度范围为2-23个核苷酸单位，而我们根据淋巴母细胞系的DNA估计FTD/ALS患者的重复序列长度为700-1600个单位。重复序列的精确大小具有挑战性，特别是在从外周血和脑组织样本中提取的DNA中，涂抹高分子量条带表明体细胞重复序列不稳定(图S1). 值得注意的是，在我们的患者中观察到的大量重复与其他非编码重复扩张性疾病相似，其中超过1000个重复拷贝是常见的(Liquori等人，2001年;Mahadevan等人，1992年;Moseley等人，2006年;Sato等人，2009年;Timchenko等人，1996年). 然而，引起FTD/ALS所需的最小重复大小仍有待确定，可能要小得多。重要的是，在我们的大多数家庭中，预期并不明显，尽管偶尔在最年轻的一代中观察到明显更早的发病。这可能只是反映了家庭成员或护理人员提高了意识；然而，重复长度仍有可能与发病年龄或临床表现相关。需要进一步研究才能完全解决这个问题。

在以前的研究中，我们和其他人提出，由SNP rs3849942等位基因“a”广泛定义的一个~140kb的“危险”单倍型，由染色体9p连锁家族的所有受影响家族成员共享，并且该单倍型也是ALS和FTLD-TDP GWAS在染色体9p上命中的原因(Mok等人，2011年). 在我们的研究中，所有75名无关扩增重复携带者中都存在“危险”单倍型，这进一步证实了该单倍型与疾病的密切联系。虽然这些发现与先前提出的单一创始者突变假说一致，但将扩大的六核苷酸重复序列作为这些患者疾病的基础，现在表明异常重复序列可能发生在易于扩大的易感单倍型背景上。我们发现，与正常人群中的野生型单倍型（定义为rs3849942等位基因“G”）相比，“风险”单倍型（定义为rs3849942等位基因“A”）的重复明显更长，这一替代假设得到了支持。在携带一系列正常等位基因大小的对照个体中，GGGGCC重复序列是不间断的，这一有点不寻常的观察进一步支持了这一替代假设。D类e（电子）新生代在正常谱的长端不间断GGGCC序列的扩增可能解释我们的一部分患者中该疾病的散发性。

总之，我们在C9ORF72型作为染色体9p连锁的FTD/ALS的病因，并表明该基因缺陷是迄今为止发现的ALS和FTD最常见的病因。我们的研究结果表明，与这种重复扩张相关的多种潜在疾病机制，包括直接影响C9ORF72型通过影响转录（功能丧失机制）和通过产生有毒RNA焦点的RNA介导的功能获得机制来表达。未来的分子研究需要探索每种机制如何导致神经退行性变和病理性TDP-43聚集。此外，对大量与GGGCC六核苷酸重复序列扩增相关的FTD和ALS患者的评估C9ORF72型需要进一步描述这些疾病的表型范围和患病率，并研究重复的潜在特性，如预期和自发突变。最后，我们建议在未来的出版物中，这种遗传缺陷被称为“c9FTD/ALS”。

当我们准备手稿时，我们了解到另一组人独立地识别了C9ORF72型导致FTD和ALS与9p染色体相关（伦顿等. 2011).

实验程序

人体样本

本研究包括四个广泛的FTD和ALS患者队列和一个对照队列。所有同意参与研究的个人和生物样本是在受试者和/或其代理人的知情同意后获得的。每个队列的人口统计学和临床信息总结如下表S19号染色体连锁家族VSM-20的先证者是加拿大温哥华UBC确定的26名先证者中的一员，其特征是FTLD的病理诊断为TDP-43病理学（FTLD-TDP），且FTD和/或ALS家族史阳性(UBC FTLD-TDP队列). 在UCSF、UBC和梅奥诊所对VSM-20进行临床和病理评估(Boxer等人，2011年). 第二组93例经病理证实的FTLD-TDP患者（独立于家族史）是从佛罗里达梅奥诊所（MCF）脑库中挑选出来的(MCF FTLD-TDP队列)主要关注痴呆症。临床FTD队列(MC临床FTD队列)代表了MCF（n=197）和MCR（n=177）行为神经病学部门观察到的一系列患者，其中大多数是梅奥阿尔茨海默病研究中心的参与者。118家人是梅奥阿尔茨海默病患者登记处的参与者。临床FTD患者接受了全面的神经评估，所有可测试的患者都接受了神经心理学评估。所有患者均进行了结构神经成像，许多患者进行了功能成像。根据Neary标准，临床诊断为行为变异型FTD（bvFTD）、语义性痴呆或进行性非流利性失语的患者(Neary等人，1998年)或bvFTD和ALS联合表型的患者被纳入本研究，而被诊断为失语症或皮质基底综合征的患者被排除在外。在MCF FTLD-TDP队列和MC诊所FTD队列阳性家族史被定义为FTD和/或ALS的一级或二级亲属，或记忆问题、行为改变、帕金森综合征、精神分裂症或其他疑似神经退行性疾病的一级亲属。值得注意的是，在MCF-FTLD-TDP队列中，很大一部分（23.7%）缺乏家族史信息，这些信息被包括在“散发”组中。这个MCF临床ALS队列代表MCF ALS中心确定的229名临床ALS患者的序列。这些患者接受了全面的神经系统评估，包括肌电图、临床实验室测试和适当的成像，以确定ALS的临床诊断。积极的家族史MCF ALS系列被定义为ALS的一级或二级亲属。这个对照组（n=909）包括从神经内科采集的820名对照个体的DNA样本和从MCF脑库中提取的89个正常对照大脑的DNA样本。

六核苷酸重复插入的特征C9ORF72型基因组区域

GGGGCC六核苷酸重复序列C9ORF72型是否使用下列基因分型引物在VSM-20家族以及所有患者和对照队列中进行PCR扩增表S2使用一个荧光标记引物，然后在自动ABI3730 DNA分析仪上进行片段长度分析（Applied Biosystems）。PCR反应在含有1M甜菜碱溶液、5%二甲基亚砜和7-脱氧-2-脱氧GTP的混合物中进行，以取代dGTP。使用GeneMapper v4.0软件（Applied Biosystems）进行等位基因鉴定和评分。为了确定GGGGCC单位的数量和重复序列的内部组成，使用PCR引物对48个不同片段长度的纯合子个体进行了测序。

重复引物PCR分析

对扩建（GGGCC）的存在进行定性评估n个六核苷酸重复序列C9ORF72型，我们在1M甜菜碱、5%二甲基亚砜和7-脱氧-2-脱氧GTP完全取代dGTP的情况下，使用先前优化和描述的循环程序进行了重复的PCR反应(Hantash等人，2010年). 引物序列见表S2PCR产物在ABI3730 DNA分析仪上进行分析，并使用GeneMapper软件进行可视化。

探针标记、琼脂糖凝胶电泳、southern转移、杂交和检测

使用下列引物生成241bp地高辛（DIG）标记探针表S2根据DIG系统用户指南（罗氏应用科学）中的建议，使用PCR DIG探针合成试剂盒通过PCR反应从10ng gDNA中扩增出高保真混合酶，并在dNTP标记混合物中加入0.35mM DIG-11-dUTP:0.65mM dTTP（1:6）。按照DIG系统用户指南中的建议，每毫升杂交溶液中总共使用2μl PCR标记探针。共消化5-10μg gDNAXbaI公司在37°C下过夜，在0.8%琼脂糖凝胶中用1X TBE电泳。DNA通过毛细管印迹转移到带正电荷的尼龙膜（罗氏应用科学）上，并通过紫外线辐射交联。在20 ml DIG EasyHyb溶液中于47°C下预混合3小时后，在47°C的摇动水浴中隔夜进行杂交。然后将膜在2X标准柠檬酸钠（SSC）、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）中在室温下各清洗两次，每次5分钟，在0.1x SSC、0.1%SDS（68°C）中各清洗两遍，每次15分钟。按照用户指南中的说明检测杂交探针DNA。采用CDP-星型化学发光底物，5～15h后在X射线胶片上显示信号。

SNP基因分型

在7900HT Fast Real Time PCR系统上，使用定制设计的Taqman SNP基因分型试验对SNP rs3844942进行基因分型。底漆包括在表S2使用SDS v2.2软件（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行基因型调用。

C9ORF72型定量实时PCR

使用RNAeasy Plus Mini试剂盒（Qiagen）从淋巴母细胞系和脑组织样品中提取总RNA，并使用Oligo-dT引物和SuperScript III试剂盒（Invitrogen）逆转录为cDNA。在安捷伦2100生物分析仪上检查RNA完整性。按照标准方案，使用清单中的TaqMan基因表达分析进行实时PCRGAPDH公司（Hs00266705）和C9ORF72型（Hs00945132）和一个针对C9ORF72型变体1转录本(表S3) (应用生物系统公司），并在ABI Prism 7900系统（应用生物系统）上进行分析。所有样品一式三份。使用ΔΔC确定相对定量t吨方法归一化为GAPDH公司.对于定制设计C9ORF72型变体1 Taqman分析，探针效率通过生成标准曲线（斜率：−3.31459，r2: 0.999145).

C9ORF72型gDNA和cDNA测序

为了确定gDNA中rs10757668的基因型，C9ORF72型使用侧翼引物c9orf72-2aF和c9orf 72-2aR扩增外显子2(表S3). PCR产物使用AMPure（Agencourt Biosciences）纯化，然后使用Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequenting kit（Applied Biosystems）用相同的引物在两个方向上进行测序。使用CleanSEQ（Agencourt Biosciences）纯化测序反应，并在ABI3730遗传分析仪（Applied Biosystems）上进行分析。使用Sequencer 4.5软件（Gene Codes）分析序列数据。为了进行cDNA测序，使用RNEasy Plus Mini Kit（Qiagen）从额叶皮层组织中分离出总RNA。使用SuperScript III Kit（Invitrogen）进行逆转录反应。使用三种引物中每一种的特异性引物进行RT-PCRC9ORF72型mRNA转录物；V1:cDNA-V1-F与cDNA-2F，V2:cDNA-V2-1F与cDNA-2F，V3:cDNA-V3-1F与cDNA-2F(表S2). PCR产物按所述进行测序，三个转录本中的每个转录本的序列数据均显示为rs10757668的基因型状态。

C9orf72 Westernblot分析

在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中使人源性淋巴母细胞和额叶皮质组织均匀化，并用BCA分析（Pierce）测定蛋白质含量。分别为淋巴母细胞和脑组织裂解物装载20和50微克蛋白质，并在10%十二烷基硫酸钠凝胶上运行。将蛋白质转移到Immobilon膜（Invitrogen）上，并用C9ORF72抗体进行检测（淋巴母细胞系的Santa Cruz 1:5000，额叶皮层脑样本的GeneTex 1:2000）。用于产生这些抗体的表位是氨基酸1-158（GeneTex）和165-215（Santa Cruz），因此预测这些抗体可以识别C9ORF72亚型a和b。GAPDH抗体（Meridian Life Sciences 1:500000）用作内部对照，以验证样本之间的蛋白质载量相等。

RNA-鱼类

对于原位杂交，从IDT（Coralville，IA）（GGCCCC）中订购了两个标记有Cy3的2′-O-甲基RNA 5′寡核苷酸：4预测与本研究中确定的扩大GGGGCC重复序列杂交（CAGG）6预测只与DM2中观察到的CCTG重复序列杂交，并作为阴性对照纳入本实验。根据AbCam的原位杂交方案，对载玻片进行预处理，并进行微小修改。将冻干探针在无核酸酶水中重新配制为100ng/μl。石蜡样品使用5ng/μl的探针工作溶液，并在LSI/WCP杂交缓冲液（Abbott Molecular）中稀释。过夜杂交后，将载玻片在37°C的1X PBS中清洗3次，每次5分钟。DAPI复染（VectaShield®）应用于每个样本和盖玻片。对于每个患者，每个组织切片中都有100个细胞出现核RNA病灶。

免疫组织化学

对已知携带GGGCC重复扩增（N=4）的FTLD-TDP病理患者、无重复扩增的FTLD-TDP患者（N=四）、无重复扩张的ALS患者（N=四）、其他FTLD分子亚型（N=四）的死后大脑和脊髓组织切片进行C9ORF72免疫组化，阿尔茨海默病（N=2）和神经正常对照组（N=4）。使用Ventana BenchMark®XT自动染色系统（Ventana，Tuscon，AZ）和抗C9ORF72一级抗体（Sigma-Aldrich，抗C9ORF72，使用氨基酸110-199作为表位生成）对福尔马林固定、石蜡包埋的死后大脑和脊髓组织的3μm厚切片进行免疫组化；微波抗原提取后1:50隔夜培养），并用氨基乙基卡比唑（AEC）进行培养。

​

亮点

  • 非编码重复扩展C9ORF72型导致FTD和ALS与染色体9p相连。
  • C9ORF72型重复扩增在大脑和脊髓中形成核RNA病灶。
  • 重复膨胀导致一个交替拼接的丢失C9ORF72型成绩单。
  • 在中重复扩展C9ORF72型是FTD和ALS的主要原因。

补充材料

01

单击此处查看。（340万，文件）

致谢

我们感谢所有参与本研究的患者、家人和护理人员。Pamela Desaro、Amelia Johnston和Thomas Kryston在梅奥诊所佛罗里达ALS中心收集DNA和尸检组织方面的专家技术援助，以及Margaret Luk在UBC进行免疫组织化学方面的专家技术援助也得到了认可。我们还感谢Richard Crook、Jennifer Gass和Ashley Cannon在基因和表达分析方面提供的技术援助。这项研究由国家老龄研究所（P50 AG016574）的梅奥诊所ADRC拨款资助，一个家庭的成员是国家老龄研究院（U01 AG006786）梅奥诊所阿尔茨海默病患者登记处（ADPR）的参与者。研究得到了ALS协会（RR）、梅奥基金会和MCF ALS中心捐赠基金（KB）的进一步资助。RR还由NIH拨款R01 NS065782、R01 AG026251资助。一些TDP-43分析由NIH拨款R01 AG037491（KAJ）资助。ZKW部分得到了NIH/NINDS 1RC2NS070276、NS057567、P50NS072187、佛罗里达梅奥诊所（MCF）研究委员会CR计划（MCF#90052030）、肌张力障碍医学研究基金会以及小卡尔·爱德华·博尔赫和苏珊·巴斯·博尔奇（MCF#90052031/PAU#90052）的捐赠。UBC研究由加拿大卫生研究院（CIHR）运营拨款#179009和#74580以及太平洋阿尔茨海默病研究基金会（PARF）中心拨款C06-01资助。G-YRH得到了CIHR颁发的临床遗传学研究奖的支持。ALB由约翰·道格拉斯法国基金会R01AG038791、R01AGO31278资助；赫尔曼家族基金会和Tau研究联盟。土地管理局由P50AG023501、P01AG019724、拉里·希尔布洛姆基金会和加利福尼亚州以及P50 AG1657303向土地管理局和WWS提供资金。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。在以最终可引用的形式出版之前，手稿将经过文案编辑、排版和校对。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于期刊的所有法律免责声明都适用。

补充信息补充信息包括2张图和3张表。

参考文献

  • Ahmed Z、Sheng H、Xu YF、Lin WL、Innes AE、Gass J、Yu X、Wuertzer CA、Hou H、Chiba S等。颗粒蛋白敲除小鼠的加速脂褐质化和泛素化表明progranulin在成功衰老中起作用。《美国病理学杂志》。2010;177:311–324. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Baker M、Mackenzie IR、Pickering-Brown SM、Gass J、Rademakers R、Lindholm C、Snowden J、Adamson J、Sadovnick AD、Rollinson S等。progranulin突变导致与17号染色体相关的tau阴性额颞叶痴呆。自然。2006;442:916–919.[公共医学][谷歌学者]
  • Baumer D，Ansorge O，Almeida M，Talbot K。RNA加工在运动神经元变性发病机制中的作用。摩尔医学专家评论。2010;12：e21。[公共医学][谷歌学者]
  • Boxer AL、Mackenzie IR、Boeve BF、Baker M、Seeley WW、Crook R、Feldman H、Hsiung GY、Rutherford N、Laluz V等。新染色体9p连锁FTD-ALS家族的临床、神经影像学和神经病理学特征。神经外科精神病学杂志。2011;82：196–203。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Brook JD、McCurrach ME、Harley HG、Buckler AJ、Church D、Aburatani H、Hunter K、Stanton VP、Thirion JP、Hudson T等。强直性肌营养不良的分子基础：编码蛋白激酶家族成员的转录物3′端三核苷酸（CTG）重复序列的扩增。单元格。1992;68:799–808.[公共医学][谷歌学者]
  • Buratti E、Brindisi A、Giombi M、Tisminetzky S、Ayala YM、Baralle FE。TDP-43通过其C末端尾部结合异质核核糖核蛋白A/B：抑制囊性纤维化跨膜电导调节因子外显子9剪接的重要区域。生物化学杂志。2005;280:37572–37584.[公共医学][谷歌学者]
  • Cartegni L，Wang J，Zhu Z，Zhang MQ，Krainer AR。ESFinder:识别外显子剪接增强子的网络资源。核酸研究。2003;31:3568–3571. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cruts M、Gijselinck I、van der Zee J、Engelborghs S、Wils H、Pirici D、Rademakers R、Vandenberghe R、Dermaut B、Martin JJ等。前粒蛋白的空突变导致与染色体17q21相关的泛蛋白阳性额颞叶痴呆。自然。2006;442:920–924.[公共医学][谷歌学者]
  • 女儿RS、Tuttle DL、Gao W、Ikeda Y、Moseley ML、Ebner TJ、Swanson MS、Ranum LP。脊髓小脑共济失调8型的RNA获得功能。公共科学图书馆-遗传学。2009;5：e1000600。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Galloway JN，Nelson DL。脆性X相关震颤/共济失调综合征中RNA介导毒性的证据。未来神经学。2009;4：785。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gijselinck I、Engelborghs S、Maes G、Cuijt I、Peeters K、Mattheijssens M、Joris G、Cras P、Martin JJ、De Deyn PP等，《额颞叶退行性变和肌萎缩侧索硬化症多发性家族9号和14号染色体2个位点的鉴定》。神经系统科学。2010;67:606–616.[公共医学][谷歌学者]
  • Giordana MT、Ferrero P、Grifoni S、Pellerino A、Naldi A、Montuschi A。肌萎缩侧索硬化症中的痴呆和认知障碍：综述。神经科学。2011;32:9–16.[公共医学][谷歌学者]
  • 格拉夫·拉德福德NR，伍德拉夫BK。额颞叶痴呆。Semin Neurol公司。2007;27:48–57.[公共医学][谷歌学者]
  • Gros-Louis F，Gaspar C，Rouleau GA。家族性和散发性肌萎缩侧索硬化症的遗传学。Biochim生物物理学报。2006;1762:956–972.[公共医学][谷歌学者]
  • Guo A，Tapia L，Bamji SX，Cynader MS，Jia W.在原代神经元培养中，孕激素缺乏导致细胞易损性增强和TDP-43易位。大脑研究。2010;1366:1–8.[公共医学][谷歌学者]
  • Hantash FM、Goos DG、Tsao D、Quan F、Buller-Burkle A、Peng M、Jarvis M、Sun W、Strom CM。两性正常、中间、预突变、完全突变和镶嵌型携带者中FMR1（CGG）n三联体重复状态的定性评估：对脆性X综合征携带者和新生儿筛查的影响。基因医学。2010;12:162–173.[公共医学][谷歌学者]
  • Kabashi E、Valdmanis PN、Dion P、Spiegelman D、McConkey BJ、Vande Velde C、Bouchard JP、Lacomblez L、Pochigaeva K、Salachas F等。散发性和家族性肌萎缩侧索硬化患者的TARDBP突变。自然遗传学。2008;40:572–574.[公共医学][谷歌学者]
  • Kobayashi H，Abe K，Matsuura T，Ikeda Y，Hitomi T，Akechi Y，Habu T，Liu W，Okuda H，Koizumi A.NOP56内含子GGCCTG六核苷酸重复序列的扩增导致SCA36，一种伴有运动神经元参与的脊髓小脑共济失调。美国人类遗传学杂志。2011;89:121–130. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kwiatkowski TJ，Jr.、Bosco DA、Leclerc AL、Tamrazian E、Vanderburg CR、Russ C、Davis A、Gilchrist J、Kasarskis EJ、Munsat T等。16号染色体上FUS/TLS基因的突变导致家族性肌萎缩侧索硬化症。科学。2009;323:1205–1208.[公共医学][谷歌学者]
  • Laaksovita H、Peuralina T、Schymick JC、Scholz SW、Lai SL、Myllykangas L、Sulkava R、Jansson L、Hernandez DG、Gibbs JR等。芬兰肌萎缩性侧索硬化症的9p21染色体：全基因组关联研究。柳叶刀神经病学。2010;9:978–985. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 拉盖尔·图伦内C，波利梅尼杜M，克利夫兰DW。TDP-43和FUS/TLS：在RNA加工和神经变性中的新作用。人类分子遗传学。2010;19：R46–64。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Le Ber I、Camuzat A、Berger E、Hannequine D、Laquerriere A、Golfier V、Seilhean D、Viennet G、Couratier P、Verpillat P等。与运动神经元疾病相关的额颞部痴呆的染色体9p连锁家族。神经病学。2009;72:1669–1676.[公共医学][谷歌学者]
  • Liquori CL、Ricker K、Moseley ML、Jacobsen JF、Kress W、Naylor SL、Day JW、Ranum LP。ZNF9内含子1中CCTG扩增引起的2型强直性肌营养不良。科学。2001;293:864–867.[公共医学][谷歌学者]
  • Lomen-Hoerth C、Anderson T、Miller B。肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆的重叠。神经病学。2002;59:1077–1079.[公共医学][谷歌学者]
  • Lomen-Hoerth C、Murphy J、Langmore S、Kramer JH、Olney RK、Miller B。肌萎缩侧索硬化症患者的认知功能是否正常？神经病学。2003;60:1094–1097.[公共医学][谷歌学者]
  • Luty AA、Kwok JB、Thompson EM、Blumbergs P、Brooks WS、Loy CT、Dobson-Stone C、Panegyres PK、Hecker J、Nicholson GA等。额颞叶退行性变谱系——运动神经元病和Tar DNA结合蛋白-43阳性神经病理学：与9号染色体的遗传联系。BMC神经。2008;8:32. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mackenzie IR、Bigio EH、Ince PG、Geser F、Neumann M、Cairns NJ、Kwong LK、Forman MS、Ravits J、Stewart H等。病理性TDP-43通过SOD1突变区分散发性肌萎缩侧索硬化症和肌萎缩侧索硬化症。Ann Neurol公司。2007;61:427–434.[公共医学][谷歌学者]
  • Mackenzie IR、Neumann M、Bigio EH、Cairns NJ、Alafuzoff I、Kril J、Kovacs GG、Ghetti B、Halliday G、Holm IE等。额颞叶退行性变神经病理学亚型的命名：共识建议。神经病理学学报。2009;117:15–18. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mahadevan M、Tsilfidis C、Sabourin L、Shutler G、Amemiya C、Jansen G、Neville C、Narang M、Barcelo J、O’Hoy K等。强直性肌营养不良突变：基因3′非翻译区的不稳定CTG重复。科学。1992;255:1253–1255.[公共医学][谷歌学者]
  • Miller JW、Urbinati CR、Teng-Umnuay P、Stenberg MG、Byrne BJ、Thornton CA、Swanson MS。招募人类肌盲蛋白以（CUG）（n）扩张与强直性肌营养不良相关。EMBO J。2000;19:4439–4448. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mok K、Traynor B、Schymick J、Tienari P、Laaksovirta H、Peuralinna T、Myllykangas L、Chio A、Shatunov A、Boeve B等。9号染色体ALS和FTD位点可能来自一位创始人。神经生物老化。2011新闻界。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Morita M、Al-Chalabi A、Andersen PM、Hosler B、Sapp P、Englund E、Mitchell JE、Habgood JJ、de Belleroche J、Xi J等。染色体9p上的一个基因座导致ALS和额颞叶痴呆的易感性。神经病学。2006;66:839–844.[公共医学][谷歌学者]
  • Moseley ML，Zu T，Ikeda Y，Gao W，Mosemiller AK，Daughters RS，Chen G，Weatherspoon MR，Clark HB，Ebner TJ，et al.脊髓小脑共济失调8型CUG和CAG扩增转录物以及核内聚谷氨酰胺内含物的双向表达。自然遗传学。2006;38:758–769.[公共医学][谷歌学者]
  • Neary D、Snowden JS、Gustafson L、Passant U、Stuss D、Black S、Freedman M、Kertesz A、Robert PH、Albert M等。额颞叶变性：临床诊断标准共识。神经病学。1998;51:1546–1554.[公共医学][谷歌学者]
  • Neumann M、Sampathu DM、Kwong LK、Truax AC、Micsenyi MC、Chou TT、Bruce J、Schuck T、Grossman M、Clark CM等。TDP-43在额颞叶变性和肌萎缩侧索硬化中的泛素化。科学。2006;314:130–133.[公共医学][谷歌学者]
  • Pearson JP、Williams NM、Majounie E、Waite A、Stott J、Newswiy V、Murray A、Hernandez D、Guerreiro R、Singleton AB等。家族性额颞叶痴呆伴肌萎缩性侧索硬化症和9p染色体上的共享单倍型。神经学杂志。2011;258:647–655. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Phukan J，Pender NP，Hardiman O。肌萎缩侧索硬化症的认知障碍。柳叶刀神经病学。2007;6:994–1003.[公共医学][谷歌学者]
  • Rosen DR、Siddique T、Patterson D、Figlewicz DA、Sapp P、Hentati A、Donaldson D、Goto J、O'Regan JP、Deng HX等。Cu/Zn超氧化物歧化酶基因突变与家族性肌萎缩侧索硬化症相关。自然。1993;362:59–62.[公共医学][谷歌学者]
  • Sato N、Amino T、Kobayashi K、Asakawa S、Ishiguro T、Tsunemi T、Takahashi M、Matsuura T、Flanigan KM、Iwasaki S等。脊髓小脑共济失调31型与含有（TGGAA）N的“插入”五核苷酸重复序列有关。美国人类遗传学杂志。2009;85:544–557. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shatunov A、Mok K、Newhouse S、Weale ME、Smith B、Vance C、Johnson L、Veldink JH、van Es MA、van den Berg LH等。英国和其他七个国家散发性肌萎缩侧索硬化症的染色体9p21：全基因组关联研究。柳叶刀神经病学。2010;9:986–994. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Smith PJ，Zhang C，Wang J，Chew SL，ZhangMQ，Krainer AR。预测SF2/ASF特异性外显子剪接增强子的特异性增加评分矩阵。人类分子遗传学。2006;15:2490–2508.[公共医学][谷歌学者]
  • Sofola OA、Jin P、Qin Y、Duan R、Liu H、de Haro M、Nelson DL、Botas J.RNA结合蛋白hnRNP A2/B1和CUGBP1抑制FXTAS果蝇模型中脆弱的X CGG预突变重复诱导的神经变性。神经元。2007;55:565–571. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sreedharan J、Blair IP、Tripathi VB、Hu X、Vance C、Rogelj B、Ackerley S、Durnall JC、Williams KL、Buratti E等。家族性和散发性肌萎缩侧索硬化症的TDP-43突变。科学。2008;319:1668–1672. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tassone F、Iwahashi C、Hagerman PJ。脆性X相关震颤/共济失调综合征（FXTAS）核内包涵体中的FMR1 RNARNA生物学。2004;1：103–105。[公共医学][谷歌学者]
  • Timchenko LT、Miller JW、Timchenko NA、DeVore DR、Datar KV、Lin L、Roberts R、Caskey CT、Swanson MS。（CUG）n三重重复RNA结合蛋白的鉴定及其在强直性肌营养不良症中的表达。核酸研究。1996;24:4407–4414. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Todd PK，Paulson HL。重复扩张障碍中RNA介导的神经变性。Ann Neurol公司。2010;67:291–300. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Valdmanis PN、Dupre N、Bouchard JP、Camu W、Salachas F、Meininger V、Strong M、Rouleau GA。三个肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆家族，有证据表明与9p号染色体相关。神经系统科学。2007;64:240–245.[公共医学][谷歌学者]
  • Van Deerlin VM、Sleiman PM、Martinez-Lage M、Chen-Plotkin A、Wang LS、Graff-Radford NR、Dickson DW、Rademakers R、Boeve BF、Grossman M等。7p21的常见变异与伴有TDP-43内含物的额颞叶变性相关。自然遗传学。2010;42:234–239. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • van Es MA、Veldink JH、Saris CG、Blauw HM、van Vught PW、Birve A、Lemmens R、Schelhaas HJ、Groen EJ、Huisman MH等。基因组关联研究确定19p13.3（UNC13A）和9p21.2为散发性肌萎缩侧索硬化症的易感位点。自然遗传学。2009;41:1083–1087.[公共医学][谷歌学者]
  • Vance C、Al-Chalabi A、Ruddy D、Smith BN、Hu X、Sreedharan J、Siddique T、Schelhaas HJ、Kusters B、Troost D等。患有额颞叶痴呆的家族性肌萎缩侧索硬化症与染色体9p13.2-21.3上的一个位点相关。大脑。2006;129:868–876.[公共医学][谷歌学者]
  • Vance C、Rogelj B、Hortobagyi T、De Vos KJ、Nishimura AL、Sreedharan J、Hu X、Smith B、Ruddy D、Wright P等。FUS（一种RNA处理蛋白）突变导致家族性肌萎缩侧索硬化症6型。科学。2009;323:1208–1211. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • White MC、Gao R、Xu W、Mandal SM、Lim JG、Hazra TK、Wakamiya M、Edwards SF、Raskin S、Teive HA等。在脊髓小脑共济失调10中，通过扩大内含子AUUCU重复序列使hnRNP K失活，通过PKCdelta移位到线粒体诱导凋亡。公共科学图书馆-遗传学。2010;6：e1000984。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yin F，Banerjee R，Thomas B，Zhou P，Qian L，Jia T，Ma X，Ma Y，Iadecola C，Beal MF等。颗粒蛋白缺乏小鼠的炎症加剧、宿主防御受损和神经病理学。《实验医学杂志》。2010;207:117–128. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]