组蛋白尾部的特定翻译后修饰促进不同蛋白质向核小体募集，以激活基因表达或浓缩染色质6尽管已知的组蛋白标记种类繁多，但只有少数几个蛋白质结构域能够识别或“读取”精确的尾部修饰。这包括结合组蛋白H4乙酰化赖氨酸残基的溴结构域（参考文献7,8)和色域，其靶向组蛋白H3的甲基化赖氨酸残基（参考文献9——13). 最近的一些报告表明PHD模块参与染色质重塑14,15我们发现肿瘤抑制因子ING2的羧基末端PHD指直接与Lys 4的组蛋白H3尾部三甲基化相关。为了了解这种组蛋白代码识别的分子机制，我们测定了与H3K4me3肽结合的小鼠ING2 PHD手指的2？分辨率晶体结构，并确定了这种相互作用的特异性和功能重要性的决定因素。
复合物的结构表明了ING蛋白的PHD指对甲基赖氨酸的保守识别模式，并揭示了定义结合特异性的关键元素。复合物中ING2 PHD指的整体折叠与之前在无配体PHD模块中发现的折叠相似16该结构由三个环组成，由两个锌结合簇和一个小的双链抗平行β板稳定(). 与H3K4me3肽复合物中ING2 PHD指的结构与相同ING1L蛋白（蛋白质数据库1WES）的游离PHD指结构重叠良好，根-平方偏差为0.8º，因此表明肽的结合不会引起蛋白质的显著构象变化。
与Lys 4三甲基化组蛋白H3肽复合物中ING2 PHD指的结构一PHD手指显示为固体表面，结合部位残留物着色并贴上标签。Lys 4和Arg 2绑定槽分别为棕色和黄色。组蛋白肽显示为一个球棒模型，C、O和N原子分别着色为绿色、红色和蓝色。b条，结构的功能区图。虚线表示分子间氢键。
组蛋白H3K4me3尾部结合在一个深而广泛的结合位点上，该结合位点与近三分之一的PHD指残基结合(). 肽采用扩展的β-股状构象，位于由窄通道连接的两个凹槽中(). Lys 4的完全延伸侧链占据了PHD指状物Y215、S222、M226和W238残留物形成的主凹槽，而Arg 2绑定在相邻凹槽中，并被G228、C229、D230和E237包围。W238和F241的芳香环垂直于蛋白质表面突出，将两个凹槽分开，形成一个狭窄的通道，Thr 3在其中结合。肽与蛋白质的β1链反平行，并与之配对，在三链β片内形成第三链().
H3K4me3肽和PHD指之间形成了许多氢键。肽的残基Arg 2、Lys 4和Thr 6与PHD指的G224、M226和G228残基进行特征性的β-片接触(). 肽-蛋白质相互作用通过涉及结构域残基S222、D230、E237、K249、P250和G252的分子间氢键进一步稳定。因此，Arg 2的胍基部分受到与D230和E237的相互作用的抑制。Thr 3的羟基与K249氢键结合。羰基和主链Ala 1基团与K249、P250和G252形成氢键。Thr 6的羟基部分与G224的酰胺基和S222的羟基相互作用。
除了形成分子间氢键外，互补的表面相互作用还可以稳定络合物。每个肽残基的侧链精确地适合不同的结合囊。Lys 4和Arg 2残留物的定义明确的结合槽很明显。Ala 1和Thr 3的甲基埋在由核心残基W254和I227形成的深疏水囊中。Thr 6侧链位于S222、Y223和G224形成的位置。因此，H3K4me3尾部通过氢结合和互补表面相互作用的广泛网络被PHD指束缚。这些接触涉及甲基化赖氨酸4之前的三个残基和甲基化赖胺酸4之后的Thr 6，负责PHD指特异性和ARTK（me3）QT肽序列的唯一识别。
Lys 4的三甲基铵基团被两个芳香族残基Y215和W238识别(). Y215和W238的芳香侧链相互垂直并与蛋白质表面正交，使阳离子–π与Lys 4的三甲基铵基团接触。最近报道了两个芳香残基对人CHD1双色域的甲基赖氨酸识别模式（参考文献。13). 值得注意的是，CHD1和ING2这两种蛋白质都以甲基化Lys 4为靶点，并使用两个芳香残基，而不是HP1和Polycomb的色域分别用于与甲基化H3K9和H3K27结合的典型三残基芳香笼11,12,17,18此外，尽管ING2 PHD指和CHD1色域在结构上无关，但H3K4me3结合方面的进一步相似性是显而易见的。在这两种情况下，组蛋白肽以延伸构象结合，Lys 4和Arg 2占据由色氨酸残基分隔的相邻凹槽。
PHD手指的氨基酸序列比对如所示补充图1所有人类ING和酵母YNG蛋白中结合位点元素的保存表明，PHD手指识别H3K4me3的模式类似。然而，在许多PHD序列中未发现关键结合位点残基，这表明H3K4me3相互作用可能是PHD模块子集的函数。我们在ING家族外只发现了11个PHD指状蛋白，它们含有对相互作用重要的残基。这些蛋白质是否能够结合H3K4me3，还有待测试。
ING2 PHD指结合在Lys 4处三甲基化和二甲基化的组蛋白H3，但不识别在Lys 9处甲基化的组蛋白H3或在Lys 20处甲基化了的组蛋白H4。为了建立PHD指对自然发生的组蛋白修饰的特异性，通过核磁共振和色氨酸荧光光谱测试了甲基化的H3K4、H3K9和H4K20对应的肽(和补充图2). 当H3K4me3、H3K4me2或H3K6me1肽逐渐添加到H3K4结合位点的残基中时，发现残基中发生了显著的化学位移变化15N标签ING2 PHD手指(和补充图2). 几乎相同的化学位移扰动模式表明，这些肽的结合方式相似；然而，PHD手指对H3K4me3的亲和力比对H3K4me2和H3K4me1的亲和力高一个和两个数量级(). 相应修饰组蛋白尾部的色域和溴代多巴胺表现出1–10μM范围内的相似亲和力8,11,12从而表明PHD手指的H3K4me3相互作用与生理相关。然而，ING2 PHD指似乎对H3K4me3比色域更具特异性，色域对三甲基化组蛋白肽的偏好比二甲基化组肽的偏好小11——13随附论文中的染色质免疫沉淀分析证实了这一点，显示出强烈的体内ING2与H3K4me3的相关性以及与H3K4me2的弱相关性（参考文献。5). 甲基化H3K9肽或未修饰的H3结合较弱，甲基化H4K20未检测到结合(). 因此，与我们的结构分析一致，这些数据表明Lys 4周围的ART/QT序列对结合至关重要，并且用TAR/ST或RHR/VL取代这些残基会破坏相互作用。此外，肽的Thr 3位于连接两个凹槽的狭窄通道中。通道的小尺寸受到W238和F141两个芳香侧链的限制，将排除任何大于苏氨酸的残基，例如TAR/ST或RHR/VL序列中的精氨酸。其他人类ING和酵母YNG PHD手指对H3K4me3表现出相似的亲和力()，表明对该组蛋白代码的识别是ING家族蛋白的一般功能。
ING2 PHD手指识别H3K4me3一，六个叠加1H、，15根据配体浓度（插图）对H3K4me3肽滴定期间收集的PHD（0.2 mM）的N个异核单量子相干（HSQC）光谱进行颜色编码。b条，直方图显示标准化1H、，15在相应的(一)PHD指的光谱。标准化的27使用方程式[（ΔδH）]计算化学位移变化2+（ΔδN/5）2]0.5式中，δ是化学位移，单位为百万分之一（p.p.m.）。彩色条表示显著变化大于平均值加上一半标准偏差。
表1
| PHD蛋白 | 配体 | K（K）d日（微米） |
|---|
| ING2野生型 | H3K4甲基3 | 1.5 ± 1* |
| ING2野生型 | H3K4me2型 | 15 ± 4* |
| ING2野生型 | H3K4me1型 | 208 ± 80* |
| ING2野生型 | H3K9甲基3 | 2,000 ± 60† |
| ING2野生型 | H3K9平方米 | 2,320 ± 300*† |
| ING2野生型 | H3K9me1型 | 2,380 ± 800† |
| ING2野生型 | H3未修改 | 2,240 ± 350*† |
| ING2野生型 | H4K20me3型 | >10,000† |
| ING2野生型 | H4K20平方米 | >10,000*† |
| ING2野生型 | H4K20米1 | >7,000*† |
| ING2 Y215A型 | H3K4甲基3 | >5,000* |
| ING2 S222A型 | H3K4甲基3 | 24 ± 10* |
| ING2 Y223A/E225A | H3K4甲基3 | 326±169*† |
| ING2 D230A型 | H3K4甲基3 | 51 ± 15* |
| ING2 E237A/W238A | H3K4甲基3 | 726 ± 50* |
| ING2 K249A/K251A/K253A | H3K4甲基3 | 1.1 ± 0.6* |
| ING1公司 | H3K4甲基3 | 3.3 ± 1.6* |
| ING3公司 | H3K4甲基3 | 6.9 ± 1.1* |
| ING4公司 | H3K4甲基3 | 7.9 ± 2* |
| ING5公司 | H3K4甲基3 | 2.4 ± 1* |
| YNG1号机组 | H3K4甲基3 | 2.3 ± 0.9* |
| YNG2公司 | H3K4甲基3 | 5.1 ± 1.8* |
| 电话23 | H3K4甲基3 | 4.5 ± 1.3* |
H3K4me3活性位点残基突变会破坏结合。为了确定结合位点残基在H3K4me3配位中的相对贡献，它们被Ala取代。因此，通过下拉实验测试突变蛋白()通过色氨酸荧光和核磁共振测定了它们的结合亲和力(). Y215残基的Ala取代消除了结合，而S222取代降低了结合亲和力，这表明芳香残基在相互作用中起着关键作用，而主沟丝氨酸的作用不太显著(和). 正如预期的那样，分别参与Lys 4和Arg 2识别的W238和E237残基的突变破坏了结合，而D230的替换导致亲和力降低30倍，表明Arg 2的识别对结合能学有重要贡献。Y223A/E225A突变体的活性显著下降。这表明了PHD–H3K4me3界面表面互补性的重要性。
ING2功能需要其H3K4me3结合活性一，通过western blot分析检测GST融合野生型和突变型ING2 PHD手指与生物素化组蛋白肽的相互作用。b条，通过过度表达的全长野生型和突变型ING2刺激细胞凋亡。在转染10μg所示质粒的HT1080细胞中测量细胞死亡。误差条表示至少三个独立实验的平均值±标准偏差。c（c），HAT/HDAC染色质修饰复合物通过ING蛋白的PHD指与H3K4me3结合与核小体结合的模型。
为了阐明H3K4me3结合的功能意义，比较了野生型和突变型ING2蛋白诱导细胞凋亡的能力。已知ING2的过度表达会刺激细胞死亡19我们通过台盼蓝排除法测定了转染全长野生型ING2和Y223A/E225A、D230A和E237A/W238A突变蛋白的HT1080细胞的凋亡水平(). 这些突变体在H3K4me3结合中有缺陷在体外(). 此外，它们显著降低了蛋白诱导凋亡的能力，表明这种相互作用对ING2的功能是必要的。
我们的数据显示，ING2 PHD指直接特异性结合Lys 4处三甲基化的组蛋白H3尾部。ING抑癌基因家族参与染色质重塑、DNA损伤修复，并与p53一起诱导细胞凋亡和衰老20,21ING蛋白与组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）染色质修饰复合物的活性相关并进行调节20,22,23我们的结果表明，ING蛋白可能通过其PHD指与Lys 4多甲基化组蛋白H3的结合，将HAT/HDAC复合物导向染色质(). 许多参与H3K4me3结合的PHD指残基，包括S222、G224和M226，在癌细胞中被发现发生突变(补充图1)表明这种相互作用在肿瘤发生中的重要作用21因此，我们的结果将有助于阐明ING蛋白影响染色质重塑和转录激活的一般原理，并可能有助于理解ING依赖性途径如何在治疗上进行调控以预防和治疗癌症。
