全基因组表达分析显示慢性精神分裂症患者的髓鞘形成相关基因

摘要

精神分裂症很严重以幻觉、妄想、，思维混乱和各种认知障碍。神经病理学和神经影像学研究报告了一些与疾病相关的解剖学改变(1,2). 手机畸变，如神经元尺寸减小，细胞数量增加堆积密度和神经元取向的畸变在免疫细胞化学和超微结构研究中观察到(1,2).生化和RNA分析显示神经递质途径和突触前成分(2,三). 多基因的遗传和连锁分析研究的模型假设几种基因导致精神分裂症易感性(4). 虽然有些精神分裂症病因学的研究始于这些研究从分子水平上了解了该病仍然难以捉摸。识别相关分子畸变的努力可能会被细微的结构和发生的细胞变化和精神分裂症的多基因性质。

鉴于这些困难，旨在调查全球变化的方法在信使核糖核酸表达中具有的优点是对寻找基因持续失调的基因组精神分裂症。DNA微阵列分析就是这样一种技术允许定量测量转录数千个基因同时表达(5). 这种方法用于分析精神分裂症的基因表达模式和对照样品。我们报告基因的表达水平参与神经元髓鞘形成、发育、突触可塑性，神经传递和信号转导在精神分裂症脑组织背外侧前额叶皮层。从这些基因表达变化中得出的含义提供了精神分裂症病因的见解。

方法

微阵列程序。

基本上如前所述进行了微阵列分析(8). 简单地说，使用8μg总RNA合成cDNA然后作为模板生成生物素化的cRNA碎片并添加到Affymetrix（加州圣克拉拉）HuGeneFL芯片（包含6000多个人类基因的探针）基因芯片表达分析中概述的标准协议技术手册（Affymetrix）。样品杂交后，微阵列用激光扫描仪进行清洗和扫描（安捷伦，加利福尼亚州帕洛阿尔托）。每种样品均一式两份，分别制备cRNARNA质量也通过检测3′人肌动蛋白与3-磷酸甘油醛的5′比值Affymetrix Test 2芯片上的脱氢酶（GAPDH）寡核苷酸。相对定量逆转录（RT）-PCRQuantumRNA 18S内部标准（Ambion，Austin，TX）按照在制造商协议中描述，以验证通过微阵列分析检测基因表达。89个基因中的7个表中列出​表11经过测试确认在表达水平上有类似的变化通过微阵列分析（数据未显示）。

表1

慢性病患者差异表达的基因精神分裂症折叠-ΔGeneAcc。不。P（P）valueFold-Δ通用会计。不。P（P）价值

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 中表达水平改变的基因精神分裂症样本与对照样本的比较。基因是通过生物功能聚集成组。未分类的基因是也列出了。精神分裂症样本中每个基因的平均折叠变化相对于对照样品以及P（P）价值和显示了GenBank的登录号。减少基因表达式级别以红色突出显示

结果

背外侧前额叶皮层（DLPFC）受以下因素的影响精神分裂症病理学的若干研究(12,13). DNA对来自DLPFC的死后组织进行微阵列分析12名慢性精神分裂症患者和12名对照患者的变化与疾病相关的基因转录。组织的选择那些患有慢性顽固性精神分裂症的患者旨在减少与精神分裂症和最大化疾病相关基因表达差异。A类使用基于模型的元分析方法计算基因每个fold-change的表达式值和置信区间轮廓组织中的基因(9). 改变基因的分类与对照组相比，精神分裂症患者的表达水平基于标准数量，包括折叠式变化和统计分析。发现精神分裂症中表达水平改变的基因有通过生物功能聚集成组。的标识功能分组基因可能意味着特定的生物过程、生化途径或细胞类型流行于疾病状态。表​表11列出了89个被发现具有精神分裂症样本中表达水平的改变与对照样品。

一个引人注目的发现是鉴定了五个基因髓鞘形成少突胶质细胞的表达丰富，所有这些细胞在精神分裂症中转录下调。相反，所有其他组的基因在表达式。这五个基因与形成和髓鞘的维持是有效轴突的关键信号传播并提供影响轴突的发育和长期存活(14). MAL、髓磷脂和淋巴细胞蛋白和肌动蛋白凝胶蛋白表达于少突胶质细胞并定位于致密髓鞘(15,16).2′，3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶的表达改变，髓磷脂相关糖蛋白（MAG）和转铁蛋白已被证明导致异常少突胶质细胞介导的髓鞘形成和发育(17–19). MAG还被认为可以调节髓鞘细胞和轴突(20). 这些基因的失调表明正常少突胶质细胞功能的破坏。神经调节蛋白受体Her3（ErbB3），参与雪旺细胞的发育和髓鞘形成(21)，也被发现在精神分裂症。Her3的下调也可能影响少突胶质细胞作为神经调节蛋白促进少突胶质的存活和前体细胞在培养中的增殖(22).

35个可以被微阵列检测到的转录物分类为参与髓鞘形成，其中6例已减少精神分裂症的表达水平。假设有2³⁵−1个髓鞘形成相关基因亚群，存在这样的可能性：一组六个显示为不同的表示为假阳性（即1类错误）。概率通过筛选标准的6个髓鞘形成相关基因因此，使用基于排列的分析来评估机会。通过将24名患者和对照样品分为两组，每组12个样品。The permutation of the分组20万次。这个样本足够大得出0.00021的标准误差P（P）值。对于每个排列，35个髓鞘形成相关基因是根据过滤标准进行分析t吨-过滤集合中的基因统计（-17.60用于原始的六个基因）被用作统计来评估过滤集的重要性。A类P（P）0.00852的值为根据这些结果进行计算，这高度暗示了精神分裂症患者髓鞘形成相关基因的参与。这个分析考虑了髓鞘形成相关的可能性基因可能在特定的途径中共同调控而不是被调控彼此独立。这种方法提供了更多概率的保守估计简单地认为这些基因只是独立调节的。

许多研究的证据表明精神分裂症是一种具有突触病理学的神经发育障碍这一点在成年早期最为明显(23). 几个基因参与神经元发育和可塑性也上调精神分裂症患者与对照组比较。肉豆蔻酰化丙氨酸丰富C激酶底物（MARCKS）、生长相关蛋白-43（GAP-43），累及颈上神经节-10（SCG-10）和神经肽在神经元发育的各个方面。此外，这些基因也可以通过调节突触可塑性(24,25). 结果与之前一致关于大脑额叶皮质GAP-43蛋白水平升高的报告精神分裂症患者(26). 驱动蛋白的轻链也可能是因其在运输各种可能调节神经元可塑性的轴突成分(27).

其他功能性聚集基因组参与神经传递。四个调节γ-氨基丁酸的基因（GABA）神经传递途径在精神分裂症。GABA在不同神经元群体中的定位精神分裂症患者的数量可能会发生差异性改变(28)表明此处检测到的转录变化反映了不同DLPFC细胞GABA能神经递质的破坏组。一些神经肽也被发现发生了改变表达水平。这些神经肽中的每一种都被报告给功能广泛，难以理解他们失调的影响。此外，可能是参与神经肽的加工和释放在表达水平。这些结果支持以前的报告精神分裂症患者各种神经递质系统的紊乱(三,29).

已知多巴胺与G蛋白偶联受体结合，因此激活多种下游蛋白激酶和磷酸酶信号路径(30). 参与这些途径的许多基因精神分裂症患者的失调。这些包括蛋白质中的基因激酶A途径（蛋白激酶A RII亚单位，腺苷酸环化酶相关蛋白2）和蛋白激酶C（β同工酶）。这些途径的各种钙调节成分，如钙调素、钙调素A和钙调素调节器ZAKI-4在精神分裂症患者中也上调，钙调神经磷酸酶也上调底物肌醇1,4,5-三磷酸受体。两种cAMP依赖蛋白激酶A（PKA）和钙调神经磷酸酶相关途径在多巴胺和cAMP调节的磷酸蛋白的调节M（M）_第页32000（DARPP-32）磷酸化，蛋白磷酸酶1的关键调节因子(30). 虽然在上不存在本研究中用于mRNA水平检测的微阵列，DARPP-32蛋白在前额叶表达减少精神分裂症患者的大脑皮层（P.Greengard，个人交流）。多巴胺受体介导信号传导相关基因的失调因此与精神分裂症可能是高多巴胺能活动的功能紊乱(31).

有趣的是，大脑中有几个基因表达不同精神分裂症患者的组织参与调节细胞骨架。NF-L和NF-M是神经丝的成分，而profilin II调节肌动蛋白丝的形成。凝胶素、马克、，GAP-43和SCG10也可能通过引导和调节细胞骨架稳定轴突和树突以及细胞形状、大小和极性。通过调节元件改变细胞结构细胞骨架的变化可以解释一些形态变化不同精神分裂症脑区的报告(2).

每个样本中89个基因的相对表达水平为如图所示。​图1。1.基因聚集根据24例患者样本的相对表达模式它们的相关性在树状图中描述。总的来说，出现了区分对照组和对照组的基因表达模式精神分裂症样本。正如预期的那样，在精神分裂症组织相对于对照组织簇从疾病中发现的上调基因中分离出分支状态。6个髓鞘形成相关基因中的5个在1个附近聚集另一个，表明它们的转录调控相似。其他基因表达关系也从这个集群中明显可见分析。例如，谷氨酸脱羧酶-65（GAD65）和GAD67，如以及生长抑素I和神经肽Y，紧密结合在一起另一个，根据已知的代谢或解剖学关系。89个基因都没有差异表达与所有对照组相比，所有精神分裂症样本的结果一致样品。线性判别分析（LDA；参考。32)已应用于评估精神分裂症患者样本和对照样本之间的差异基于他们的表达谱。该方法寻求线性使组间比率最大化的变量组合方差和组内方差。隐含地，LDA使用的线性权重取决于基因如何在两组中分离，以及该基因与另一组的相关性基因。通过89（探针）将LDA应用于24（样本）的数据矩阵套）。结果表明，精神分裂症患者和对照组的样本可以根据他们的表达模式（图。​（图22A类). 还进行了LDA仅针对6个髓鞘形成相关基因（图。​（图22B类). 控制权和精神分裂症样本与使用全部89个基因。通过使用所有35个可通过微阵列检测到的髓鞘形成相关基因。这个分析采用无偏见的方法，因为用于适应LDA不是根据选择标准得出的，而是根据它们与6个髓鞘形成相关基因的功能关系在屏幕上标识。使用全部35个髓鞘形成相关基因显著提高了分析区分两者的能力患者组（图。​（图22C类). LDA的改进其他髓鞘形成相关基因的加入表明表达水平也与疾病状态相关。LDA使用屏幕上确定的其他功能组导致较差组分离（数据未显示）。这些结果以及基于排列的分析，清楚地提供参与的证据精神分裂症的髓鞘化途径。

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图1

89个差异表达基因的相对表达水平精神分裂症样本相对于对照样本。每列显示单个样本和每行中的基因表达水平对应于单个基因。每个的表达式值将基因归一化为平均值为0，标准偏差为1。表达式级别是相对于平均值进行颜色编码的：值为蓝色小于平均值，红色表示值大于平均值。这个左边的树状图显示了最终的聚类树结果基因表达值的层次聚类。分支机构树的长度反映了基因表达的相似程度24个样本的值。

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图2

精神分裂症和对照样本的线性判别分析。本地设计院通过以下公式应用于24个样本的数据矩阵(A类)89个基因集(B类)六种髓鞘形成相关基因设置，以及(C类)35个髓鞘形成相关基因集。线性的对每个样品测定判别系数并绘制。C类=对照组，S=精神分裂症。对照样品用黑色编码红色的精神分裂症样本。样本标识与图。​图11.

本研究中的精神分裂症患者正在接受直到死亡前服用抗精神病药物。众所周知，抗精神病药能抑制多巴胺的激活受体介导的信号转导。治疗有可能使用抗精神病药物可能会导致观察到的基因变化表达，如参与多巴胺信号传导的表达。收件人地址这种可能性，来自另外四名精神分裂症患者的DLPFC样本对6周或更长时间无药物治疗的患者进行了分析。统计分析(P（P）<0.05，学生的t吨试验）在表中列出的基因上进行​表11到精神分裂症患者停药后与对照组的表达水平比较那些服用药物的人。89个基因中没有一个被发现有表达水平在统计学上存在显著差异精神分裂症患者用药前后的比较。因此，药物治疗可能无法解释观察到的精神分裂症。服用药物的精神分裂症患者样本数量少，然而，可能限制了对这些基因的分析。因此，我们不能排除某些基因可能受到神经抑制剂的调节。

讨论

我们已经确定了一些功能性集群精神分裂症患者表达水平改变的基因。最多这些基因群中值得注意的是与中枢神经系统有关髓鞘形成，并指出少突胶质细胞可能是精神分裂症中功能缺陷的特定细胞类型。髓鞘形成相关基因的失调不太可能是由于抗精神病药物。神经抑制剂作用的动物研究对胶质细胞的治疗报告显示可能是星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖(33). 然而此处确定的髓鞘形成相关基因主要表达少突胶质细胞。此外，其中一些基因的失调基因已被证明可以抑制少突胶质细胞的发育功能，而不是促进细胞增殖(17–19). 在此外，89个基因中没有一个具有统计学意义精神分裂症患者比较中表达水平的差异开药和停药。

当这份手稿还在准备中时，Mirnics等。(34)报道了对6名儿童前额叶皮层的微阵列分析精神分裂症患者。该报告表明突触前调节相关基因的表达水平功能。虽然我们确实观察到了一些基因参与突触前功能，可能有几个原因两份报告结果之间的差异。第一，这里研究的患者队列代表老年人群精神分裂症患者有如此严重的损伤，以至于必须终身住院治疗，而和平号等。队列是居住在社区的精神分裂症患者在年轻或中年时死亡。此外，尽管和平号等。队列是死亡人口的代表验尸官办公室，这里描述的队列代表曾长期住院的个人和世卫组织死于自然原因的老年。此外，微阵列类型Mirnics使用等。仅包含一个本研究中确定了6个髓鞘形成基因，因此不会检测到此处观察到的基因表达变化。因为精神分裂症是一种具有不同临床表现的异质性疾病患者一生中的陈述，在中老年人在决定潜在病因。

少突胶质细胞通过其绝缘特性，并提供外源营养因子促进神经元成熟和轴突存活(35). 鉴于此据报道，髓鞘化胶质细胞调节轴突细胞骨架(35)我们假设少突胶质细胞轴突的改变相互作用可能是在精神分裂症(2). 这个假设与以前的报告一致这表明髓鞘形成可能与精神分裂症有关。前额叶皮层的髓鞘形成被观察到发生在晚期青春期和成年早期，这是典型的发病年龄精神分裂症(36,37). 脑成像研究发现细微的白色精神分裂症患者的物质异常(38,39)，而异染脑白质营养不良是一种脱髓鞘疾病，与精神分裂样精神病(40). 免疫组织化学染色精神分裂症脑组织可能有助于证实神经元的分裂髓鞘形成。对以下方面进行研究也很有意义轻度表型脱髓鞘小鼠模型的研究类似精神分裂症的行为（例如，脉冲前抑制）。此外，精神分裂症患者其他脑区的微阵列分析，以及来自不同精神病患者的组织（例如，抑郁和焦虑），以进一步验证结果。少突胶质细胞相关基因的发现精神分裂症患者DLPFC中有差异表达的功能为未来的研究提供了一个新的领域，并证明了基因组表达谱在病原学发现中的应用神经精神障碍的基础。

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