芽殖酵母中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂Far1p的磷酸化和泛素依赖性降解

Far1-22p的半衰期延长，在整个细胞周期中保持稳定

野生型Far1p的存在仅限于G₁细胞周期的阶段。这种模式是由调控转录的FAR1公司通过蛋白质水解(麦金尼和克罗斯1995). 因为我们发现Far1-22p的稳态水平高于野生型Far1p（数据未显示），我们比较了野生型Far1p和Far1-22p的稳定性。这两种蛋白都是从加仑1启动子，此时通过添加葡萄糖关闭合成。我们观察到野生型Far1p的快速降解，半衰期为～30分钟（图。​（图3A、B）。三A、 B）。相反，Far1-22p在整个时间过程中（半衰期～120分钟）保持稳定，表明Far1-22具有稳定体内蛋白质的特定变化。

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图3

 Far1-22p的半衰期增加，并在整个细胞周期中存在。(A类)携带野生型Far1–GFPp或Far1-22p–GFP质粒编码的细胞（K699）女孩启动子在棉子糖中生长，并通过添加半乳糖诱导表达5小时。然后添加葡萄糖以关闭女孩启动子，每30分钟取样一次，并进行免疫印迹以检测Far1–GFP融合蛋白（lanes1–8). GFP抗体的特异性通过包括表达HA标记的Far1p（lane1). (B)定量女孩关闭实验。用磷成像仪定量野生型Far1p-GFP和Far1-22-GFP蛋白的降解，并绘制抑制后的时间曲线女孩发起人。(C)Far1-22p，但不是野生型Far1p，存在于整个细胞周期中。EY957细胞产生野生型Far1p–GFP（车道9–11)或Far1–22p-GFP（车道12–14)从诱导型女孩启动子在含有棉子糖的培养基中生长(女孩启动子关闭），用羟基脲（HU）阻止S期或用诺卡唑（Noc）阻止有丝分裂，然后通过添加半乳糖诱导表达。对照细胞的治疗方法相同，只是它们没有接触药物（expo）。5小时后，用GFP特异性抗体免疫印迹法分析细胞是否存在Far1p–GFP(顶部面板）。用肌动蛋白抗体对样品进行免疫印迹，证实了等负荷(底部面板）。

接下来，我们检查Far1p是否以细胞周期依赖的方式降解。要驾驶FAR1公司通过细胞周期的转录，我们从诱导物中表达Far1p加仑1发起人。用羟基脲（HU）将细胞阻滞在S期，或用微管解聚药物诺可达唑（Noc）将细胞阻滞在有丝分裂中。然后通过添加半乳糖诱导合成野生型Far1p或Far1-22p，并通过免疫印迹分析。在停滞于S期或有丝分裂期的细胞中可以检测到少量野生型Far1p（图。​（图3C）。三C） ●●●●。剩余的低水平Far1p很可能是不完全细胞周期阻滞的结果（两种情况下均为90%的阻滞）。相反，Far1-22p在细胞周期的S期和M期均呈高水平表达（图。​（图3C）。三C） ●●●●。Far1-22p以与细胞周期无关的方式存在的发现也表明FAR1公司当RNA从加仑1发起人。因此，我们得出结论，野生型Far1p，而非Far1-22p，在细胞周期阶段（G期除外）迅速降解₁因此，一旦细胞通过Start，Far1p的降解系统就会激活，并在整个细胞周期中保持活性，直到细胞退出有丝分裂。

我们还利用野生型Far1p或Far1-22p与绿色荧光蛋白（GFP）的融合研究了Far1p在细胞周期中的存在。Far1p–GFP融合蛋白具有功能，能够恢复缺乏Far1p的细胞的细胞周期阻滞和交配能力（数据未显示）。如图所示​图4，4，野生型Far1–GFP蛋白很容易在未添加G的细胞核中被观察到₁细胞，但在通过Start（图。​（图4，4，顶行）。这些结果证实了野生型Far1p在启动后被降解，即使是从加仑1发起人。Far1-22p–GFP的长期诱导导致细胞在开始时积聚。Far1-22p–GFP在细胞核中可见，表明影响Far1-22的稳定突变不会干扰蛋白质的亚细胞定位。然而，有趣的是，Far1-22p–GFP在细胞周期的所有阶段都存在于细胞核中（图。​（图4，4，底行），确认Far1-22p在细胞通过Start后未降解。

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图4

 野生型Far1p，而非Far1-22p，以细胞周期相关的方式表达。野生型Far1p或Far1-22p在其羧基末端与GFP融合，并在酵母（EY957）中从诱导物中产生女孩发起人。请注意，野生型Far1p–GFP(顶部行）在未叠置细胞（G₁)但在小芽细胞（G₁/S） ，大的出芽细胞（G₂/M） 和有丝分裂细胞（M）。相反，Far1-22p–GFP(底部row）在细胞周期的各个阶段都可以在细胞核中检测到。

Far1p的降解需要在α因子阻滞后有效地重新进入细胞周期

为了说明Far1p降解的生理意义，我们询问细胞在被α-因子阻遏后是否需要Far1p降解才能重新进入细胞周期。删除的单元格FAR1，但从其自身的启动子产生Far1-22p，能够正常生长，因为α-因子是诱导FAR1公司(Chang和Herskowitz 1990年；Oehlen等人，1996年). 这些细胞对α-因子过敏，形成一个比表达野生型Far1p的细胞更大的晕圈（图。​（图5A，5A、 顶部面板），显示Far1-22p功能正常。有趣的是，表达Far1-22p的细胞形成的晕未能填充（图。​（图5A，5A、 底部面板），表明这些细胞无法有效恢复细胞分裂。为了进一步检查α因子阻滞的恢复情况，far1Δ显微镜下监测产生野生型Far1p或Far1-22p的细胞同步重新进入细胞周期。如图所示​图55（B，开环），产生野生型Far1p的细胞在初始延迟期后开始萌发，表明它们恢复了细胞分裂并进入S期。相反，产生不可降解Far1-22p的细胞未能重新进入细胞周期，并保持未添加状态（图。​（图5B，5B、 填充方块）。免疫印迹法测定Far1p水平表明，野生型Far1p在芽萌发时迅速消失（图。​（图5B），5B） 而Far1-22p保持不变，并以缓慢的迁移形式累积（图。​（图5C）。5C） ●●●●。Far1p流动性的这种变化是磷酸化的结果，因为用碱性磷酸酶（CIP）孵育可以消除缓慢的迁移形式（数据未显示）。综上所述，这些结果证实了Far1p在细胞通过Start时被降解，并进一步表明Far1p的降解是细胞在α-因子阻滞后有效重新进入细胞周期所必需的。

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图5

 Far1p的降解是细胞从α因子诱导的细胞周期阻滞中有效恢复所必需的。(A类)细胞周期阻滞通过光晕形成进行分析远1携带野生型单拷贝质粒转化Δ细胞FAR1、FAR1-22、FAR1-60F3(Peter等人，1993年)，或没有插入。(顶部两排）巴1Δ电池（K2180）(底部行）BAR1⁺单元格（YMP1054）。过滤盘含有0.1μg(顶部两行）和10μg的α-因子(底部行）。请注意，产生Far1-22p的细胞对信息素过敏，光晕填充效率低下。(B、 C类)产生Far1-22p的细胞无法重新进入细胞周期。删除的单元格FAR1公司（K2180）产生野生型Far1p或Far1-22p女孩启动子在棉子糖培养基中培养至OD₆₀₀0.4，此时通过同时添加α-因子和半乳糖阻止细胞生长。3小时后，将细胞清洗并重新接种在新鲜培养基中，不含α-因子，但含有半乳糖。每30分钟采集一次样本。通过分析未添加细胞的百分比，显微镜下监测细胞周期的再注入(B)野生型Far1p水平(底部面板）和Far1-22p(顶部用Far1p抗体免疫印迹提取物测定(C、，车道1–7). 注意，与产生野生型Far1p的细胞相比，Far1-22p在G中积累₁细胞无法形成芽。

Far1p在G组分中含有温度敏感等位基因的细胞中稳定₁–S泛素化系统

接下来，我们研究了Far1p降解是否需要G₁–S降解系统。由于不能降解的Far1-22p的过度表达会导致细胞周期停滞，我们推断野生型Far1p在降解Far1p能力降低的细胞中的过度表达可能类似地导致G₁与此假设一致，我们发现Far1p在cdc34型突变体在半许可温度下导致不可见（图。​（图6A）。6A） ●●●●。这种效应是特定的，因为野生型细胞或含有温度敏感等位基因的细胞CDC16，这是降解有丝分裂细胞周期蛋白所必需的(Irniger等人，1995年)Far1p过表达时生长正常。检查cdc34Far1p过度表达的细胞显示，它们被捕获为大的未添加细胞（通过添加半乳糖诱导Far1p 6小时后约90%）。相反，cdc34含有控制结构的突变细胞在DNA复制之前积累，具有大的细长芽（图。​（图6B，6B、 顶行）。罗丹明-phal染色肌动蛋白细胞骨架

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图6

 野生型Far1p的过度表达在cdc34由于Far1蛋白的稳定，细胞处于半许可温度。(A类)温度敏感型cdc16（K4102）和cdc34（YMT670）突变体和等基因野生型细胞（K699）用携带野生型的质粒进行转化FAR1公司在诱导物的控制下女孩启动子或空载体（vec）进行控制。将转化物置于含有半乳糖的培养基上，并在30°C下培养。野生型和cdc16突变株耐受Far1p的过度表达，而cdc34变种人没有。所有菌株在含有葡萄糖的培养基上生长正常（数据未显示）。(B)cdc34细胞（YMT670）携带表达来自诱导型女孩启动子（pFar1；左边panels）或不含插入物的对照质粒（vec；正确的面板）在30°C的棉子糖中生长，此时通过添加半乳糖诱导Far1p的表达。5小时后，用相差显微镜（phase，顶部面板）或用罗丹明阴茎肽（肌动蛋白，底部面板）。cdc34产生Far1p的细胞停止生长，其形态与产生Far1-22p的野生型细胞无明显区别（图。​（图1C）。1C） ●●●●。(C)野生型Far1p的半衰期是在cdc34 far1Δ(顶部面板；YMP1056）和远1Δ电池(底部面板；YMP1054），表示Far1p加仑发起人。在镇压之后女孩启动子在指定的时间（分钟）取出等分样品，并按所述进行免疫印迹检查。通过对携带空载体（vec；lane）的细胞进行分析，确认Far1p抗体的特异性1). Far1p的位置用箭头标记；星号表示Far1p抗血清识别的一种非特异性蛋白质。

洛伊丁证明了cdc34产生Far1p的细胞未极化，表明它们在开始时被阻止（图。​（图6B，6B、 底行）。因此，这些细胞的形态与被稳定的Far1-22p阻止的野生型细胞没有区别（图。​（图1C），1C） ，表明Far1p被Cdc34p依赖机制降解。

除了Cdc34p之外CDC53、CDC4、，和SKP1系列基因产物也与泛素依赖性降解靶蛋白有关(纳斯迈思1996；Deshaies 1997年). 在这些背景中，在半许可温度下，Far1p的过度表达是致命的，这表明这些成分是Far1p降解所必需的（图。​（图7A；7A；数据未显示）。特定温度敏感等位基因SKP1系列在G中DNA复制之前阻止细胞₁或G细胞有丝分裂前₂(Bai等人，1996年；Connelly和Hieter，1996年)已确定。有趣的是，Far1p的过度表达能够阻止携带G₁-特定等位基因SKP1系列但对含有G的细胞没有影响₂-特定等位基因SKP1系列（图。​（图7A）。7A） ●●●●。综上所述，这些结果表明Far1p被G₁–S泛素化系统，涉及泛素结合酶Cdc34p和蛋白质Cdc53p、Cdc4p和Skp1p。

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图7

 Far1p的过度表达在skp1型等位基因特异性突变和Far1p在cdc34与细胞周期阶段无关的突变体。(A类)Far1p过表达的影响在以下特定的温度敏感等位基因中进行了测试SKP1系列要么导致G被捕₁(skp1-11，Y552）或G₂(skp1-12，Y554），如图所示。​图6。6.只有含有G的细胞₁-特定等位基因SKP1系列因野生型Far1p的过度表达而被阻止。(B)Far1p累计cdc34型（YMT670）和cdc34Δsic1型细胞（ES464）。所示菌株在37°C下被截留，Far1–LacZ融合蛋白的积累被量化并绘制为三个独立实验得出的Miller单位。请注意，Far1–LacZp在cdc34与细胞周期阻滞点无关的突变体；在cdc16型为删除的单元格SIC1。(C)Far1-22–LacZp以野生型（K699）和cdc16（K4102）突变细胞，但其产生水平与野生型Far1–LacZp相似cdc34（YMT670）和cdc34Δ硅橡胶1（ES464）细胞。

与Cdc34p在Far1p降解中的拟议作用一致，野生型Far1p的半衰期在cdc34和cdc53电池处于非允许温度（图。​（图6C；6C类；数据未显示）。为了确定是否是细胞周期阶段而不是缺乏Cdc34p功能导致了Far1p的积累，我们分析了cdc34同时删除的单元格SIC1。这些细胞能够正常复制，但随后在G细胞中停滞₂可能是因为它们无法降解未知目标(Schwob等人，1994年). 我们表达了Far1p在其羧基末端融合到LacZ的诱导物女孩启动子，通过颜色分析促进Far1p水平的量化(Barral等人，1995年). Far1–LacZ融合蛋白与野生型Far1p一样，以细胞周期依赖的方式降解（图。​（图7B，C；7B、 C类；B.Catarin和M.Peter，未解释）。不出所料，Far1p累积在cdc34细胞，其水平约为同基因野生型细胞或缺乏野生型细胞的三到四倍SIC1公司（图。​（图7B；7B类；McKinney等人，1993年). 重要的是，Far1p水平在cdc34 sic1Δ细胞，而在cdc16细胞在有丝分裂中停滞。相反，Far1-22–LacZ融合蛋白在野生型和cdc16电池（图。​（图7C）7C） 而Far1-LacZp和Far1-22-LacZp的水平在cdc34型或cdc34 sic1Δ电池（图。​（图7C）。7C） ●●●●。综上所述，这些结果表明，缺乏Cdc34p本身，而不是在细胞周期的特定阶段停止，是Far1p积累的原因。

Far1p的体外泛素化依赖于Cdc34p、Cdc4p和细胞周期蛋白

确定Far1p是否被G泛素化₁–S泛素化系统，我们在兔网织红细胞裂解物中的玻璃体翻译Far1p中（图。​（图8A）8A） 或小麦胚芽提取物（图。​（图8B）8B） 在以下人员在场的情况下[³⁵S] 蛋氨酸和添加DEAE分馏酵母提取物(Verma等人，1997年a). 这些提取物中没有G₁细胞周期蛋白Cln1p、Cln2p和Cln3p被Cdc34p耗尽（图。​（图8A）8A） 或缺乏功能性Cdc4p（图。​（图8B）。8B） ●●●●。添加Far1p、纯化GST–Cln2p、泛素（Ub）和Cdc34p导致Far1p缓慢迁移形式的积累（图。​（图8A，8A、 车道2）。甲基化泛素（meUb），通过阻止Ub-Ub结扎阻止多泛素链的形成(赫什科和海勒1985)，阻止了这些高分子量形式的Far1p的积累（图。​（图8，8，第3条车道），表明他们无处不在。体外泛素化依赖于Cdc34p（图。​（图8A，8A、 车道4）和Cdc4p（图。​（图8B）。8B） ●●●●。DEAE分级提取物制备自cdc4-ts型突变体未能泛素化野生型Far1p（图。​（图8B，8B、 车道1）。添加纯化的Cdc34p（图。​（图8，8或含有Cdc4p的杆状病毒感染昆虫细胞裂解液（图。​（图8A，8A、 车道2）本身并不能恢复提取物的活性。然而，添加Cdc34p和Cdc4p一起恢复了Far1p的泛素化（图。​（图8A，8A、 车道3）。作为对照，含有Cdc28p和Cdc34p的昆虫裂解物不会导致Far1p的泛素化（图。​（图8A，8A、 车道4）。Far1p的泛素化也依赖于G的添加₁cyclin Cln2p（图。​（图8A，8A、 通道5），表明Far1p可能需要被Cdc28p–Cln2p磷酸化才能被Cdc34p泛素化系统识别。或者，可能需要Cdc28p–Cln2p来激活泛素化机制的组件。重要的是，Far1-22p上没有检测到泛素化（图。​（图8A，8A、 巷7），表明Far1-22p在体内半衰期的增加是由于其未能泛素化所致。这些结果表明，野生型Far1p（而非Far1-22p）在体外以Cdc34p和Cdc4p依赖的方式泛素化，进一步表明Far1p的泛素化可能需要由Cdc28p–Cln2p激酶控制的磷酸化事件。

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图8

 野生型Far1p而非Far1-22p在体外是泛素化的。野生型Far1p(A、，车道1–5; B、，车道1–4)或Far1-22p(A、，车道6–10)在存在下体外合成[³⁵S] 蛋氨酸在由缺乏蛋氨酸的细胞制备的分馏提取物中培养CLN1、2和3(A类)或删除的单元格CLN1、2和3，也对温度敏感cdc4(B). 这些提取物不含Cdc34p，并且含有低水平的泛素(Verma等人，1997年a). (A类)如果提取物中添加了Cdc34p、GST–Cln2p和泛素（lane2). 如果在区块链延伸（lane）中添加甲基-泛素，则观察到高分子量泛素结合物的积累减少三). Far1-22p（lanes）未观察到泛素化6–10). (B)野生型Far1p的泛化依赖于Cdc4p（车道1和4). 泛化cdc4-只有同时添加纯化的Cdc34p和含有Cdc4p（lane）的杆状病毒感染昆虫裂解物才能恢复提取物三). 添加含有Cdc28p的昆虫裂解物作为特异性控制（车道4).

G对Far1p的降解₁–S泛素化系统需要Ser-87的磷酸化

两个泛素依赖的降解系统在真核细胞周期中触发关键的转变。S期的开始是由p40的蛋白水解引起的^{Sic1号机组}涉及G₁–S泛素化系统，而后期的开始需要后期合成物（APC），APC降解姐妹染色单体分离抑制剂(纳斯迈思1996). APC基板通常包含一个称为破坏盒的短序列，这对于降解来说既是必要的也是充分的(King等人，1996年). G的基板₁–S泛素化系统不包含这样的破坏盒，目前尚不清楚这些蛋白质是如何识别的。Far1p的氨基末端50个氨基酸残基是其在体内降解所必需的(麦金尼和克罗斯1995). 然而，这50个氨基酸残基本身不太可能构成破坏信号，但它们包含一个功能性核定位信号和一个截短的Far1蛋白，缺少这50个主要存在于细胞质中的氨基酸（M.Peter，未解释）。因为Cdc34p定位于细胞核(Goebl等人，1994年)细胞质定位可能导致Far1p的稳定。相反，Far1-22p降解失败并不是由于定位错误造成的，因为Far1-22仍定位于细胞核。最近的证据表明磷酸化可能为G蛋白的泛素化和降解提供信号₁–S销毁系统(Deshaies 1997年). 使G的磷酸化位点失活的突变₁酵母或哺乳动物细胞周期蛋白E中的细胞周期蛋白Cln2p在体内稳定这些蛋白质(Clurmann等人，1996年；Lanker等人，1996年；1996年获胜并获得里德奖). 此外，磷酸化但非非磷酸化的Cln2p与Cdc53p特异性相互作用(Willems等人，1996年). 一些证据表明，Far1p的降解也需要磷酸化，这可能是通过Cdc28p–Clnp激酶实现的。首先，Far1p的降解发生在细胞通过Start时，伴随着Cdc28p–Clnp激酶的激活。其次，Far1p在体外和体内被Cdc28p–Clnp激酶磷酸化(Peter等人，1993年；Tyers和Futcher 1993年). 第三，Far1p在携带温度敏感突变的细胞中是稳定的川东北28(Oehlen and Cross 1994年; M.Peter和S.Henchoz，未出版）。第四，我们已经证明Far1p在体外的泛素化需要活性的Cdc28p–Clnp激酶。最后，Cdc28p–Cln2p激酶磷酸化位点的突变在体内稳定Far1p并阻止其泛素化。综上所述，我们提出了以下Far1p降解模型（图。​（图10）。10). Far1p与Cdc28p–Clnp激酶结合，后者反过来磷酸化Ser-87和可能的其他残基上的Far1p。磷酸化Far1p随后被G识别₁–由Cdc34p、Skp1p、Cdc53p和Cdc4p组成的泛素化系统，泛素化Far1p。泛素化Far1p随后被26S蛋白酶体降解。Far1p在体内是否泛素化尚待证实。尽管使用了一种突变的泛素（UbK48R，G76A），但它不能被泛素解偶联酶裂解(Hodgins等人，1992年；Willems等人，1996年)到目前为止，我们还无法令人信服地显示体内Far1p上共价连接的泛素。因此，我们不能严格排除体内Far1p降解不需要Far1p本身的泛素化，而是可能涉及靶向蛋白体的泛素化蛋白的可能性。

已经提出了一种类似的途径来控制CKI p40的降解^{Sic1号机组}(Deshaies 1997年). 类似于Far1p，是p40泛素化和降解的基本要求^{Sic1号机组}似乎是由Cdc28p–Clnp激酶磷酸化，从而确保S期不能在G期之前启动₁-特异性激酶Cdc28p–Cln1p（或Cln2p）已被激活(Tyers 1996年；Schneider等人，1996年；Verma等人，1997年b). 虽然现有的结果强烈支持Cdc28p–Clnp激酶在底物识别中的功能，但它们并不排除Cdc28p-Clnp酶也可能直接调节G₁–S泛素系统。然而，至少有两条证据反对后一种解释。首先，不太可能需要Cdc28–Cln2p来激活提取物中除底物以外的成分，因为p40^{Sic1号机组}在没有Cln2p的情况下在体外泛素化，前提是p40^{Sic1号机组}在添加到提取物之前，被Cdc28p–Cln2p磷酸化（R.Verma和R.J.Deshares，unpubl.）。其次，阻止Cdc28p–Cln2p激酶磷酸化的Far1p突变也破坏了泛素化，表明底物的磷酸化对泛素化至关重要。

Cdc28p–Cln1（2）p激酶的活性仅限于启动和S期开始之间的一段时间，因此与Far1p和p40的突然消失相关^Sic1公司(纳斯迈思1993). Far1p和p40的降解机制^Sic1公司然而，在整个G集团内保持全面活跃₂和细胞周期的M期，如G所示₁-由组成型启动子表达的Far1p的特异性存在（图。​（图3C三C和​和4）。4). 在Cdc28p–Cln1（2）p激酶活性低的阶段，降解是如何维持的？Far1-22p在整个细胞周期中的稳定性表明Far1p在G₂仍然依赖于Ser-87的磷酸化。我们建议在G中₂，一种除Cdc28p–Cln1（2）p-可能与Cln3p或Clbp cyclins-can磷酸化Far1p络合的Cdc28p以外的激酶。

Far1p和Cdc28p–Clnp激酶相互拮抗

确认Far1p是因为它能够抑制Cdc28p–Clnp激酶的活性(Chang和Herskowitz 1990年；Peter和Herskowitz 1994a). 我们的研究结果表明，Cdc28p–Cln2p反过来通过触发其降解来抑制Far1p，从而在Far1p和Cdc28p–Clnp激酶之间建立负反馈回路(跨1995年；彼得1997). 这种负反馈回路可能有助于放大Far1p和Cdc28p–Clnp激酶活性之间的微小差异。因此，似乎G的活动之间的平衡₁激酶Cdc28p–Clnp及其抑制剂Far1p决定细胞是分裂还是停滞。G的活动₁激酶Cdc28p–Clnp设置了一个阈值，Far1p等抑制剂必须克服该阈值才能在启动时阻止细胞。在没有信息素的情况下，Far1p通过泛素依赖性蛋白水解迅速转化，从而阻止Far1p的积累达到足以抑制Cdc28p–Clnp的水平，并允许细胞周期进展。Far1p相对于Cdc28p–Cln1（2）p的平衡可以通过产生稳定的Far1p或通过激活信息素反应途径来实现。信息素反应途径降低G水平₁-细胞周期蛋白Cln1p和Cln2p(Wittenberg等人，1990年)并增加Far1p水平(Chang和Herskowitz 1990年；Oehlen等人，1996年). G的过度表达₁-细胞周期蛋白Cln2p通过强启动子或蛋白质的稳定，增加了G设定的阈值水平₁激酶，导致细胞对信息素反应迟钝(Lanker等人，1996年). Far1p的同时过表达可以完全恢复细胞周期阻滞（S.Henchoz和M.Peter，未解释）。

Far1p水平通过对交配信息素的转录激活而增加远1基因(Chang和Herskowitz 1990年)并且可能通过防止Far1p降解。初步结果表明，用α-因子处理细胞后，Far1p的半衰期增加，其机制依赖于MAP激酶Fus3p（S.Henchoz和M.Peter，未解释）。值得注意的是，其他MAP激酶信号转导途径也可能类似地调节泛素依赖性蛋白水解。例如，激活MAP激酶信号级联爪蟾卵子阻止B型细胞周期蛋白的降解，从而导致减数分裂II中期的细胞周期停滞(Minshull等人，1994年). 同样，纺锤体检查点通过阻止有丝分裂细胞周期蛋白和可能的其他破坏盒底物的预定降解，激活MAP激酶级联，导致细胞周期阻滞(Hardwick等人，1996年). 最后，原癌基因c-Jun在MAP激酶磷酸化后免受泛素依赖性降解的保护(Musti等人，1997年). 因此，一些信号通路可能通过阻止泛素依赖性降解来控制下游调节器的稳定性。

DNA操作

标准程序用于重组DNA操作(Ausubel等人，1991年；Sambrook等人，1989年). 使用Vent聚合酶（新英格兰生物实验室）进行PCR。根据制造商（Promega）的说明，使用Wizard PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。根据制造商（Amersham）的建议，使用M13诱变进行定点诱变。用测序试剂盒（美国生物化学公司）对两条链进行DNA测序。

FAR1-22（pTP63）的分离

一种的氨基末端片段FAR1公司被PCR诱变(Leung等人，1989年)以引物oTP52（5′-GCGCTCGAGAGAGAGACACACAAGAGTTTCG-3′）和oTP55（5′-CCGCACGATAACATGTCACCACC-3′）和质粒pTP62（pGAL–FAR1）为模板。PCR产物用Xho公司我和千磅一、 连接到载体pTP62中Xho公司我和千磅一、 并转化为DH5α。将转化子混合，将分离的质粒DNA转化到酵母菌株K699中。将单个酵母转化子贴在SD-URA平板上，然后复制到GAL-URA培养基上。分离出无法在GAL–URA上生长的转化子的质粒FAR1公司亚克隆到Bluescript KS中的编码序列⁺用于测序的载体。这个Xho公司I–速度I片段FAR1-22号机组被结扎到Xho公司I–速度I位点pTP62产生质粒pTP63。

Far1p和Far1-22p整合质粒的构建

用于集成野生型FAR1公司和FAR1-22号机组从女孩发起人，整个FAR1公司使用编码序列加仑1分别从pTP62和pTP63中分离出启动子，用Pvu公司二、。然后将碎片连接到Pvu公司II型切割pRS304(Sikorski和Hieter 1989年)产生质粒pTP69（野生型远1)或pTP70(FAR1-22号机组). 质粒用Bsu36I消化以靶向整合到TRP1号机组轨迹。

Far1p表位标记版本的构建

安生态RI位点通过PCR引入FAR1公司以pTP62为模板，引物oTP322（5′-TGTTTAATTTCGCATGCTGATGGG-3′）和oTP323（5′-CGAGAATTCAGGTTGGGAACTTCCATTGCTG-3’）。PCR片段用生态RI和速度我被隔离了。一段FAR1、，其中包括加仑1将pTP62或pTP63与不是我和速度I.携带S65T突变的GFP编码序列(Heim等人，1995年)被隔离为生态RI–巴姆HI碎片。然后将三个片段连接到不是我和巴姆pRS316的HI位点(Sikorski和Hieter 1989年)生成pTP68（GAL–FAR1–GFP）和pTP91（GAL-FAR1-2-GFP）。pTP68补充了远1Δ电池（K2180）。

这个FAR1–lacZ融合表达自镀锌10启动子是在连接Xho公司I–速度将pTP62或pTP63的I片段插入融合子质粒（pSJ101，Barral等人，1995年)，它被消化了Xho公司我和速度I分别生成pBC1和pBC2。pBC1补充了远1Δ电池（K2180）。

抗体和蛋白质印迹

如前所述制备细胞提取物(Peter等人，1993年). 蛋白质通过SDS-PAGE分离，并使用Minigel系统（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）电印迹至硝化纤维素（Schleicher&Schuell）。用抗GFP的单克隆抗体或亲和纯化的抗Far1p抗体检测印迹(Peter等人，1993年)并利用表观化学发光技术开发（美国伊利诺伊州阿灵顿高地Amersham公司）。

激酶测定和GST-Far1p的表达

在激酶反应中用作底物的GST-Far1融合蛋白表达于大肠杆菌并按所述进行净化(Peter和Herskowitz 1994a). 组蛋白H1购自Boehringer Mannheim（编号1004 875）。如前所述，从提取物中免疫沉淀Cdc28p–Cln2p。对于体外磷酸化分析，从过表达Cln2–HAp或未标记Cln2p的细胞中分离出Cdc28p–Cln2p激酶，作为组成成分的对照ADH1（ADH1）发起人(Peter和Herskowitz 1994年a). 如前所述进行激酶测定(Peter和Herskowitz 1994a).

磷酸分析根据Peter等人（1990年）简单地说，磷酸化蛋白质从SDS凝胶中洗脱出来，在110°C下6小时水解1小时米HCl和所得混合物在TLC板上进行二维分离。

半衰期的测定和定量

含有编码质粒的细胞FAR1-GFP（pTP68）或FAR1-22-GFP（pTP91）在30°C下在棉籽糖-URA培养基（2%棉籽糖）中生长至早期对数期，此时通过添加半乳糖（2%最终浓度）诱导表达4小时。在通过添加最终浓度为2%的葡萄糖来关闭表达之前，去除第一等分样品。每30分钟收集一次等分样品，并通过免疫印迹法分析Far1p水平。Western blot用Image Quant定量^TM（TM）软件（Molecular Dynamics，Inc.）。Far1p的半衰期cdc34Δfar1（YMP1056），cdc53Δfar1（YMP1057）或Δfar1细胞（YMP1054）携带编码FAR1公司（pTP62）来自加仑启动子测定如下：细胞在25°C的棉子糖-URA培养基（2%棉子糖）中生长，此时通过添加半乳糖（2%最终）诱导Far1p的表达。30分钟后，将培养物移至37°C下2小时，此时女孩通过添加葡萄糖（最终2%）抑制启动子。按上述方法收集和分析等分样品。

Far1–LacZ水平的测定

含有pBC1（GAL–FAR1–lacZ）或pBC2（GAL-FAR1-22–lacZ）的转化子在25°C的棉籽糖–LEU培养基中生长到早期对数期，此时温度转移到37°C以诱导cdc突变体的细胞周期阻滞。90分钟后女孩启动子是通过添加最终浓度为2%的半乳糖诱导的。2小时后采集细胞，并按规定测定β-半乳糖苷酶水平(Stern等人，1984年)，除了由于不同的阻滞形态，米勒单位被归一化为细胞数量而不是OD₆₀₀米勒单位是从三个独立的实验中确定的。

显微和流式细胞术

细胞按指示生长、超声处理、用甲醛固定至最终浓度3.7%，并通过差示干涉对比显微镜观察。如前所述，酵母肌动蛋白与罗丹明阴茎肽（Molecular Probes Inc.，Eugene，OR）一起可视化(Peter等人，1996年).

携带编码Far1p–GFP（pTP68）或Far1-22p–GFP（pTP91）的质粒的细胞从女孩启动子在30°C的棉籽糖-URA培养基（2%棉籽糖）中生长。将半乳糖添加到最终浓度的2%，诱导表达4小时。GFP荧光用氩激光在488 nm处用蔡司Axiovert 100显微镜（蔡司激光扫描显微镜410）和63×平面彩色物镜（1.4油）进行可视化。图像采集使用针孔大小、增益和偏移（亮度和对比度）的标准化条件。每个图像是八次扫描的平均值。为了进行直接比较，进行了图像采集和背景减影。

流式细胞术按照爱泼斯坦和克罗斯（1992）简单地说，将细胞固定在70%乙醇中，用核糖核酸酶A洗涤和消化5小时。然后用碘伏对DNA进行染色，并在FACScan（Becton-Dickinson）上进行分析。

泛素化分析

之前已经描述了芽殖酵母中的无细胞体外泛素化检测系统(Verma等人，1997年a,c（c）). 总之，野生型和突变型FAR1公司（图。​（图8A）8A） 利用含有T7 RNA聚合酶启动子的5′寡核苷酸通过PCR分别从pTP62和pTP63生成转录模板(Verma等人，1997年a). 5′寡核苷酸是（CCCGAATTCTCTAATACGACTCACTATAGGATCTCTTAACTCAAGGAG），3′寡核苷酸是（GCGGGATCCCTAGAGGTTGAACTTCCAG）。或者，携带T7-定向野生型的线性化pET24b质粒FAR1公司使用带有羧基末端的HIS标签（由F.Cross提供）（图。​（图8B）。8B） ●●●●。然后根据制造商说明（Promega）在体外转录和翻译模板，以生成[³⁵S] 蛋氨酸标记的Far1p底物。两种野生型（图。​（图8A）8A） 和cdc4（图。​（图8B）8B） 粗提取物是从G₁细胞周期素耗尽细胞，然后在DEAE-Sepharose柱上分离。0.25米在这些测定中使用了缺乏内源性Cdc34p的NaCl洗脱液。Cdc34p从大肠杆菌如前所述（Banerjee等人，1993年）。Cdc4p和Cdc28p在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达(Verma等人，1997年c). 将放射性标记底物培养在10μl反应混合物中(Verma等人，1997年a)含有酵母提取物（100μg）、含有蛋白酶抑制剂的反应缓冲液、ATP混合物、泛素（10μg）和Cdc34p（100 ng）。对于与cdc4使用含有Cdc4p或Cdc28p的0.5μl昆虫裂解物（～5 mg/ml）提取物。反应在24°C下培养60分钟，通过添加SDS-PAGE样品缓冲液终止，煮沸，并通过SDS-PACE和放射自显影术进行评估。

我们感谢Peter和Herskowitz实验室的成员和B.Amati的讨论，感谢M.Tyers、S.Elledge、G.Ammerer、E.Elion、D.Finley、J.Li、K.Nasmessy、F.Cross、C.Mann、S.O'Rourke、M.Jaquenoud和I.Davis赠送质粒、菌株和抗体。感谢R.Feldmann提供杆状病毒表达的Cdc4p和G.Reynards提供杆状毒表达的Cdc28p。蒂里·拉罗什（Tierry Laroche）因在共焦显微镜方面的帮助而获得认可。我们感谢B.Amati、V.Simanis和J.Philips对手稿的批判性阅读。这项工作得到了瑞士癌症联盟、瑞士国家科学基金会和罗氏基金会对M.P.的资助，美国国家科学基金对I.H.的研究资助，以及美国国立卫生研究院对R.J.D.的资助（GM 52466-01）。R.J.D.是露西尔·马基慈善信托和塞尔/芝加哥社区信托的学者。

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