抗氧化剂氧化还原信号。2011年10月15日；15(8): 2185–2195.
高迁移率族1（HMGB1）激活氧化应激的自噬反应
宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学癌症研究所希尔曼癌症中心外科。
通讯作者。通信地址：唐道林博士，匹兹堡大学医学院外科，地址：5117 Centre Avenue，Pittsburgh，PA 15213。电子邮件：ude.cmpu@2dgnat 或者，Michael T.Lotze教授，匹兹堡大学癌症研究所外科，G.27A Hillman癌症中心，5117 Centre Avenue，Pittsburgh，PA 15213。电子邮件：ude.cmpu@tmeztol *这些作者对这篇文章的贡献是一样的。
收到日期：2010年9月22日；2011年3月8日修订；2011年3月10日接受。
摘要
目的
自噬是细胞分解废生化物质和受损成分的过程，在应激后细胞存活中起着重要作用。高迁移率族框1（HMGB1）调节氧化应激反应中的自噬。
结果
外源过氧化氢（H2O（运行）2)通过小干扰RNA（siRNA）处理或击倒主要的超氧化物清除剂酶超氧化物歧化酶1（SOD1）会增加小鼠和人类细胞系的自噬。添加SOD1 siRNA或H2O（运行）2促进细胞溶质HMGB1表达和细胞外释放。重要的是，抑制HMGB1的释放或丢失会减少氧化应激下的自噬小体数量和自噬通量体内和在体外.
创新：
HMGB1的释放可能是对氧化应激反应的常见介质。
结论
HMGB1对氧化应激介导的自噬很重要，是治疗应激相关疾病的新靶点。抗氧化剂。氧化还原信号. 15, 2185–2195.
介绍
O（运行）氧化应激发生当系统中活性氧（ROS）的生成超过其中和和消除活性氧的能力时(19,28). 有许多病理条件与氧化应激有关，包括缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、癌症、肥胖和衰老(19,28). 根据浓度、位置和细胞内条件，活性氧如超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢（H2O（运行）2)可引起毒性或在调节细胞存活和死亡的各种途径中充当信号分子。活性氧的细胞水平由抗氧化酶控制，包括硫氧还蛋白-硫氧还苷还原酶和谷胱甘肽-谷胱甘苷系统。细胞内的非蛋白硫醇，如含有小半胱氨酸的三肽谷胱甘肽和氨基酸半胱氨酸，它们有助于硫醇调节酶，大多被还原为细胞内外形成的二硫化物，作为小分子抗氧化剂。超氧化物歧化酶（SOD）作为主要的抗氧化酶，在清除活性氧中起着至关重要的作用(28). 活性氧可诱导自噬(1)通过涉及自噬相关基因4（ATG4）的几种不同机制(36)，过氧化氢酶(50)和线粒体电子传递链(7). 然而，介导这种形式自噬的确切机制尚不清楚。
自噬是一个严格调控的隔离过程，细胞通过溶酶体机械降解其自身成分(21)或通过胞吐排出。通过维持细胞成分的合成、降解和再循环之间的平衡，自噬在正常细胞生长、发育和体内平衡中发挥着关键作用(22). 在大多数情况下，自噬促进生存以应对饥饿和抗癌药物暴露等压力(25). 自噬缺陷与肿瘤的发生有关，因为在人类乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中，必需的自噬调节因子beclin 1是单等位基因缺失的，beclin 1+/-小鼠易患肿瘤。
创新
氧化应激中介导自噬的确切机制尚不清楚。我们证明HMGB1是氧化应激环境中的自噬传感器。这些发现揭示了HMGB1（一种损伤相关分子模式（DAMP）分子）如何在细胞应激条件下触发自噬作为防御机制。
高迁移率族蛋白盒1（HMGB1）大约40年前首次从细胞核中纯化，因其在电泳凝胶上的快速迁移性而被称为HMG蛋白之一(9). HMGB1是一种高度保守的核蛋白，作为染色质结合因子，通过结合/弯曲DNA促进转录机制进入特定的DNA靶点(30). 除核作用外，HMGB1还在炎症、细胞分化、细胞迁移和肿瘤转移过程中作为细胞外信号分子发挥作用(26,30). HMGB1由坏死细胞被动释放，也由免疫刺激的巨噬细胞、树突状细胞和肠细胞主动分泌(26). 氧化应激，如H2O（运行）2诱导巨噬细胞和单核细胞分泌和释放HMGB1(43). 此外，抗氧化剂如丙酮酸乙酯(47)、槲皮素(40)和绿茶(23)在实验性炎症的情况下具有保护作用，部分通过减弱全身HMGB1的积累。HMGB1在氧化应激相关疾病中起重要作用(42). 最近的研究表明，自噬调节注定死亡的肿瘤细胞中HMGB1的选择性释放(45). 相反，外源性HMGB1诱导的自噬促进肿瘤细胞的化疗耐药性(24,38). 然而，HMGB1在调节氧化应激诱导的自噬中的作用尚不清楚。
在这里，我们证明HMGB1介导氧化应激诱导的自噬。添加外源H2O（运行）2或通过RNA干扰（RNAi）抑制SOD1表达诱导的自噬，这与HMGB1在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中的移位和释放有关。相反，服用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）或敲除HMGB1可抑制MEF中氧化应激诱导的自噬。此外，我们的实验数据表明HMGB1通过调节微管相关蛋白轻链3（LC3）的转换、SQSTM1/固碳体（p62）的降解和自噬体的成熟，在调节自噬流量方面发挥了部分作用。此外，HMGB1的靶向敲除增加了化疗敏感性体内与细胞凋亡增加和自噬减少有关。总的来说，这些数据支持HMGB1作为氧化应激自噬反应激活剂的新作用。
结果
siRNA敲低SOD1诱导自噬
超氧化物歧化酶1（SOD1）是细胞质中发现的一种丰富的铜/锌酶，可将超氧化物转化为过氧化氢和分子氧。为了探讨SOD1在自噬调节中的潜在作用，将针对SOD1的靶向siRNA转染到小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中。转染SOD1-siRNA导致SOD1蛋白在24-48岁时显著降低 小时().
siRNA敲低SOD1诱导自噬。（A）SOD1下调的时间相关效应。用SOD siRNA或对照siRNA转染MEF。转染指定时间后，用总蛋白提取物进行Western blot分析。肌动蛋白被用作加载控制。所示的免疫印迹是具有类似结果的三个实验的代表。（B、C）LC3的共焦显微分析(绿色)和第62页(红色)转染SOD1 siRNA后使用特异性抗体并控制siRNA 48 MEF中的h。图像代表10个随机字段。酒吧=30 微米。（要查看彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertonline.com/ars).
然后我们研究了siRNA敲低SOD1是否对自噬有影响。在自噬的整个过程中，细胞溶质形式的LC3（LC3-I）与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-磷脂酰乙醇酰胺结合物（LC3-II），并补充到自噬体膜(12). LC3检测已成为监测自噬和自噬相关过程的一种广泛使用的方法(29). Western blot分析显示，MEF中SOD1表达减弱增加LC3表达和LC3-II积累(). 此外，SOD1在48 h免疫荧光分析().
检测自噬流量的另一种方法是测量p62的增强降解，p62是一种长寿命的支架蛋白，参与蛋白质体消化的泛素化蛋白质的运输(4,31). p62具有LC3结合域，其靶向该蛋白以并入自噬体，因此作为自噬的选择性底物(31). 与自噬流量增加一致，通过免疫印迹法在SOD1敲低的MEFs中下调p62的水平()和免疫荧光分析(). 总之，这些发现表明SOD1水平与自噬水平密切相关。
抗氧化剂NAC抑制氧化应激诱导的自噬
为了确定ROS生成增加是否与SOD1敲除细胞中观察到的自噬增加有关，我们评估了抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）对MEF自噬的影响。我们发现NAC治疗显著减弱了LC3-II表达的增加()和LC3点状构造()在SOD1击倒MEF中观察到。
抗氧化剂NAC抑制氧化应激诱导的自噬。（A、B）NAC抑制SOD1 siRNA诱导的自噬。MEF转染SOD siRNA或对照siRNA 48 h、 然后用NAC（50 米M（M）)用于12 h.总蛋白提取物用于Western blot分析。数据是具有类似结果的三个实验的代表（A）.平行地，LC3穿孔形成(绿色)和第62页(红色)共聚焦显微镜分析。图像代表10个随机字段。酒吧=30 微米（B） ●●●●。（C、D）NAC抑制H2O（运行）2-诱导自噬。MEF用H治疗2O（运行）2(0.05 米M（M）)用于12 h带或不带NAC（50 米M（M）). 总蛋白提取物用于Western blot分析。数据是具有类似结果的三个实验的代表（C）.平行地，LC3穿孔形成(绿色)和p62(红色)共聚焦显微镜分析。图像代表10个随机字段。酒吧=30 微米（D）（要查看此彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertonline.com/ars).
过氧化氢（H2O（运行）2)是一种由多种酶产生的活性氧，包括SOD1和几种NADPH氧化酶。因此，我们研究了H的影响2O（运行）2NAC存在或不存在时的自噬。与以往研究一致(8)，外源H2O（运行）2导致LC3-II表达增加()和LC3点状构造()在MEF中。相反，NAC预处理抑制H2O（运行）2-诱导LC3-II表达和LC3点形成，提示ROS在自噬调节中可能发挥作用。
H治疗2O（运行）2或SOD1基因敲除增加HMGB1的细胞质转运和释放
HMGB1是一种丰富的核蛋白，其促炎活性依赖于其核外功能(三,26). 为了研究HMGB1在氧化应激条件下的分布，用特异性HMGB1抗体对细胞进行染色。未经处理的MEF主要显示HMGB1的核定位(). 然而，在转染SOD1 siRNA的细胞中，或在接受外源性H处理的细胞中2O（运行）2HMGB1定位于细胞质的百分比增加(). 此外，Western blot分析表明线粒体HMGB1表达在H2O（运行）2处理(). 此外，随后通过Western blot分析测定释放到培养基中的HMGB1水平。在未经处理的培养基中未观察到HMGB1，但在SOD1 siRNA转染或外源性H2O（运行）2无可测量乳酸脱氢酶（LDH）释放的治疗(). 与ROS调节HMGB1定位中这些变化的概念一致，NAC抑制氧化应激诱导的HMGB1释放(). 这些数据表明HMGB1参与氧化应激反应。
SOD1或H的拆卸2O（运行）2增加HMGB1的细胞质转运和释放。（A）HMGB1的共焦显微分析(红色)转染SOD1 siRNA后使用特定抗体或对照siRNA 48 h或h处理2O（运行）2(0.05 米M（M）)用于12 h带或不带NAC（50 米M（M）)在MEF中。酒吧=30 微米。10个随机场的核外HMGB1荧光强度的相对定量分析，显示为平均值±SD(*第页<0.05。单向方差分析，然后是LSD）。AU：任意单位。叠加在差分干涉对比度（DIC）图像上的HMGB1代表性图像如下部面板.（B）含或不含H的线粒体HMGB1水平的Western blot分析2O（运行）2(0.05 米M（M）)用于12 MEF中的h。使用未处理的全细胞裂解物作为非线粒体蛋白的阳性对照（Ctrl）。为了确认这些是合适的组分，对COX IV作为线粒体标记、微管蛋白作为细胞质标记和组蛋白H3作为核标记进行了Western blot检测。（C）条件如所示（A），通过蛋白质印迹分析测定释放到细胞培养基中的HMGB1和LDH的水平。HMGB1谱带密度的相对定量分析，如所示顶部面板（AU：任意单位）。（D）在存在或不存在3-甲基腺嘌呤（“3-MA”，10）的情况下，通过ELISA分析HMGB1的释放 米M（M）)SOD1 siRNA或对照siRNA后48 h或h处理2O（运行）2(0.05 米M（M）)用于12 h.同时，使用CCK-8试剂盒分析细胞活力(n个=3, *第页<0.05).（E）Atg5中HMGB1易位的共焦显微镜分析+/+和附件5−/−H治疗后的MEF2O（运行）2(0.05 米M（M）)用于12 h.HMGB1位置的代表性图像(红色)如所示左侧面板。酒吧=30 微米。同时，通过ELISA评估HMGB1的释放(n个=3, *第页<0.05).（F）MEF用H治疗2O（运行）2(0.25 米M（M）)在存在或不存在PARP抑制剂DHIQ（300 μM（M）). 12点 治疗后h，使用CCK-8试剂盒分析细胞活性(n个=3, *第页<0.05).（G）在存在或不存在HMGB1-中和抗体（10 μg/ml）SOD1 siRNA或对照siRNA 48 h或h处理2O（运行）2（0.05 米M（M）)用于12 小时(n个=10个随机字段*第页<0.05）。（H）RAGE表达缺失增加H2O（运行）2-诱导的氧化细胞毒性。HMGB1标准+/+和HMGB1−/−MEF用H治疗2O（运行）2按规定剂量服用24小时 h，然后分析细胞活力(n个=3, *第页与HMGB1相比<0.05−/−MEF）。（要查看彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertonline.com/ars).
此外，用抑制自噬的PI3K抑制剂预处理MEF和HCT116细胞系[例如.，3-甲基腺嘌呤（3-MA）]阻断SOD1 siRNA或外源性H2O（运行）2处理诱导HMGB1释放(). 此外，敲除Atg5（一种形成自噬体所需的基因产物）可显著抑制H2O（运行）2-诱导HMGB1移位和释放(). 这表明自噬刺激调节HMGB1细胞质移位和释放，以应对氧化应激。
遗传或代谢应激引起的DNA损伤导致HMGB1释放(2,24,38). 氧化介导的DNA损伤激活核酶聚ADP-核糖聚合酶（PARP）是氧化应激条件下细胞功能障碍和组织损伤的重要途径。为了探讨氧化应激引起的DNA损伤是否会导致HMGB1的释放，我们用PARP抑制剂1,5-异喹啉二醇（DHIQ）处理细胞。DHIQ抑制H2O（运行）2(0.25 米M（M）)-诱导HMGB1释放()这表明HMGB1在氧化剂介导的DNA损伤过程中释放是PARP依赖性的。
为了探讨HMGB1释放在氧化应激介导的自噬中的作用，用HMGB1特异性中和抗体处理MEF和HCT116细胞。HMGB1中和抗体显著抑制SOD1 siRNA和H2O（运行）2-与IgG对照组相比，诱导LC3穿孔形成(). 此外，MEF中HMGB1的敲除增加了H2O（运行）2-诱导性氧化损伤(). 这些发现表明，在氧化应激期间HMGB1的释放和自噬之间存在正反馈回路。
HMGB1介导氧化应激诱导的自噬在体外
为了确定HMGB1是否影响氧化应激反应中的自噬水平，我们测定了HMGB1野生型（“+/+”）和HMGB1敲除型（“−/−”）MEF中的自吞噬通量和自噬小体数量。我们发现HMGB1的缺失抑制SOD1敲除和外源性H2O（运行）2-诱导LC3-II表达和LC3点状形成，表明HMGB1在氧化应激诱导的自噬调节中的潜在作用(). 此外，HMGB1的缺失增加了氧化应激条件下p62蛋白的水平()，表明其降解依赖于HMGB1介导的自噬。此外，敲除HCT116结肠癌细胞和Panc02胰腺癌细胞中的HMGB1可抑制SOD1敲除和外源性H2O（运行）2-诱导LC3点形成，表明HMGB1在调节氧化应激诱导的自噬中具有广泛作用().
氧化应激诱导的自噬由HMGB1介导。（A）HMGB1中指示蛋白质水平的Western blot分析+/+和HMGB1−/−转染SOD1 siRNA或对照siRNA 48后的MEF h或h处理2O（运行）2(0.05 米M（M）)用于12 h.所示免疫印迹是具有类似结果的三个实验的代表。（B、C）同时，通过共聚焦显微镜分析MEF或HMGB1敲低HCT116和Panc02中LC3穿孔的形成 单元格(*第页<0.05。单向方差分析，然后是LSD）。KD:HMGB1基因敲除，WT:HMGBI野生型。图像代表10个随机字段。酒吧=30 微米（MEF）；酒吧=15 μm（HCT116和Panc02）。（D）LC3的协同放大(绿色)/灯2(红色)共聚焦显微镜分析(*第页<0.05。单向方差分析，然后是LSD），使用（A）。图像代表10个随机字段。巴氟霉素A：巴氟霉素A1（100 n个M（M）);酒吧=30 微米。同时，通过Western blot分析检测LC3的表达(顶部面板).（E）HMGB1标准−/−将野生型或半胱氨酸突变型HMGB1 cDNA转染MEF，然后用H处理2O（运行）2(0.05 米M（M）)用于12 h.通过共聚焦显微镜分析LC3穿孔形成(*第页<0.05。单因素方差分析后进行LSD，n个=10个随机字段）。（要查看彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为网址：www.liebertonline.com/ars).
为了进一步证实HMGB1调节自噬通量以应对氧化应激，我们分析了溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）和LC3在存在或不存在自噬空泡和溶酶体融合抑制剂巴非霉素A1的情况下的共定位(44). 与在氧化应激条件下用巴非霉素A1处理HMGB1野生型细胞类似，HMGB1表达的缺失降低了MEF中LAMP2/LC3的共定位(). 此外，用巴非霉素A1处理后，Hmgb1中LC3-II的表达进一步增加+/+MEF与Hmgb1的比较−/−MEF公司(). 总之，这些发现表明HMGB1对氧化应激诱导的自噬是必要的。
HMGB1含有三种半胱氨酸，即Cys23、45和106。在轻度氧化条件下，Cys23和Cys45容易形成分子内二硫键桥，而Cys106保持还原状态。Cys106到Ser突变（C106S）损害HMGB1的核定位并增加HMGB1细胞质水平(10). 我们最近的研究表明，HMGB1的半胱氨酸106（而非其邻近半胱氨酸23和45）突变可促进细胞溶质定位和持续饥饿诱导的自噬(39). 此外，HMGB1的分子内二硫键（C23/45）是与Beclin1结合并在饥饿期间维持自噬所必需的(39). 类似地，野生型HMGB1和C106S变异体的转染，而不是突变的C23S或C45S cDNA，恢复了HMGB1的自噬−/−H后面的单元格2O（运行）2处理(). 因此，HMGB1中的半胱氨酸对于调节自噬是必要的。
HMGB1靶向敲除增加化疗敏感性体内与氧化应激环境中细胞凋亡增加和自噬减少相关
众所周知，一些化疗药物和放射疗法的癌症干预会产生活性氧。晚期糖基化终产物受体（RAGE）是HMGB1的主要受体之一。我们以前的研究表明，RAGE能够维持自噬并限制凋亡，促进胰腺癌细胞存活体内和在体外(17). 此外，RAGE是氧化应激期间自噬的重要调节器(14,16). 测试HMGB1的靶向敲除是否也增加了化疗敏感性体内，我们将10只C57/BL6小鼠皮下接种6转染对照或HMGB1特异性shRNA并用吉西他滨治疗的Panc02肿瘤细胞。体内HMGB1敲除的肿瘤细胞的生长明显慢于对照组。HMGB1敲除肿瘤细胞的生长被显著抑制，在某些情况下，服用吉西他滨后肿瘤细胞完全消失，而吉西他宾对控制shRNA-转染的肿瘤临床无效(). 此外，我们观察到HMGB1的敲除降低了肿瘤治疗中的自噬并增加了凋亡体内与对照组相比，吉西他滨(). 4-羟基-2-壬醛（HNE）是一种高活性醛，由多不饱和脂肪酸接触过氧化物和活性氧而产生。它以非酶方式与组氨酸、赖氨酸和半胱氨酸侧链形成稳定的蛋白质加合物，这些侧链已被用作组织中氧化应激的生物标记物(46). 通过监测HNE结合，吉西他滨治疗增加了HMGB1野生型和敲除胰腺肿瘤中ROS的生成(). 这些结果表明HMGB1调节下游事件(例如化疗介导的氧化应激中的细胞凋亡和自噬体内.
HMGB1的表达介导化疗耐药性体内通过减少细胞凋亡和增强氧化应激期间的自噬流量。（A）HMGB1敲除肿瘤细胞对吉西他滨更敏感体内C57/BLl6小鼠接种106转染对照或HMGB1特异性shRNA并用吉西他滨（GEM，15）治疗后的Panc02肿瘤细胞 mg/kg，每周两次）或从第10天开始的PBS。每周测量两次肿瘤，并计算42天的体积(n个=5只小鼠/组，表示为平均值±SD*第页<0.05).（B）第42天，用免疫荧光法检测肿瘤样本中HMGB1的表达、凋亡（TUNEL）、自噬（LC3）和氧化应激（HNE）。（要查看彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertonline.com/ars).
讨论
自噬的主要功能是在营养缺乏期间循环细胞成分以维持新陈代谢，并防止受损的有毒蛋白质和细胞器的积累(22,25). 活性氧（ROS）是氧的部分还原或活化衍生物，具有高度活性和毒性，可通过破坏蛋白质、脂类、碳水化合物和DNA导致细胞死亡(19,37). 活性氧的作用，如超氧物和H2O（运行）2在自噬中已被许多研究证实(6–8,11,27,33,50). 然而，氧化应激诱导自噬的机制尚不清楚。在这项研究中，我们证明HMGB1是激活氧化应激反应中的自噬所必需的，在细胞中充当氧化还原传感器。
HMGB1是最具特色的DAMP之一(三,34). 大量快速增长的文献支持DNA结合蛋白HMGB1作为细胞内转录调节器和细胞外细胞因子/炎症介质的功能(三,34,35,49). 为了发挥DAMP的作用，HMGB1必须从细胞核穿过细胞质进入细胞外环境(三,26). 这一过程可能发生在细胞激活和细胞死亡期间。与这个概念一致，我们发现SOD1 siRNA或外源性H2O（运行）2促进MEF中HMGB1的释放，表明ROS是诱导HMGB1移位和释放的重要信号。我们以前的研究表明，氧化应激可能通过MAPK和染色体区域维护（CRM1）依赖机制诱导HMGB1的释放(43). 在目前的研究中，我们证实PARP信号也参与了氧化损伤期间HMGB1的释放。
SOD是一类催化超氧化物歧化为氧气和过氧化氢的酶(28). 因此，在几乎所有接触氧气的细胞中，它们都是一种重要的抗氧化防御系统。在人类中，三种形式的超氧化物歧化酶存在于不同的隔间中。SOD1、SOD2和SOD3分别位于细胞质、线粒体和细胞外环境中(28). 最近的一项研究表明，SOD2的过度表达抑制了HeLa细胞中饥饿诱导的自噬(6). 此外，其他研究表明，晚期自噬液泡含有较高的SOD1浓度，并且在肝细胞中较大，这表明SOD1对溶酶体降解具有高度抗性(32). 我们发现，RNAi抑制SOD1表达会增加MEF中HMGB1的易位和释放以及自噬。有趣的是，氢气对小鼠多菌败血症的保护作用与SOD活性的增加以及血清和组织中HMGB1水平的降低有关(48). 因此，我们观察到的SOD活性在体外可能与HMGB1发布有关体内.
值得注意的是，我们的实验数据表明HMGB1可能是ROS诱导自噬的调节器，因为：1） HMGB1调节LC3的营业额LC3特异性定位于自噬结构，包括自噬体及其前体结构、分离膜及其衍生物自溶体(20). 在自噬增强的条件下，如暴露于活性氧和饥饿，LC3阳性点刺明显。相反，HMGB1的缺失抑制了ROS诱导的LC3阳性点刺。在新切割的氨基末端甘氨酸残基上，LC3-I被磷脂酰乙醇胺修饰，这被称为LC3-II，这种形式被结合到自噬体膜中。这一步骤涉及由Atg7（类E1激活酶）、Atg3（类E2结合酶）和Atg16L复合物（类E3连接酶）介导的泛素化样反应(20). HMGB1的缺失抑制了氧化应激下LC3-II的形成，表明HMGB1可能调节LC3泛素化样反应。2） HMGB1调节p62的自噬降解由于p62在自噬被抑制时积累，在诱导自噬时观察到水平降低，因此p62可以用作自噬流量的标记(5). 在氧化应激后HMGB1缺陷细胞中观察到p62的积累，表明HMGB1缺乏细胞中存在自噬抑制或自噬降解缺陷。此外，其他人已经证明，抑制ROS或p62积累可以防止自噬缺陷导致的损伤，这表明未能调节p62会导致氧化应激(27). 重要的是，自噬缺陷导致的p62持续表达足以改变NF-κB调节和基因表达，最终促进肿瘤发生(27). 事实上，HMGB1的过度表达与癌症的所有主要特征有关(41).3） HMGB1调节自噬小体的形成巴非霉素A1是H型液泡的特异性抑制剂+-细胞中的ATP酶（V-ATP酶）(44)并抑制含有该酶的细胞器如溶酶体和内体的酸化。与使用巴非霉素A1治疗类似，HMGB1缺失导致自噬体标记LC3和溶酶体标记LAMP-2共定位检测到的成熟自噬小体（自噬溶酶体）数量显著减少。4） 皮下肿瘤中HMGB1的缺失促进化疗反应HMGB1的靶向敲除增加了化疗敏感性体内与细胞凋亡增加和氧化应激自噬减少相关。4-羟基-2-壬醛（HNE）染色作为组织氧化应激的测量方法(46)，表明HMGB1野生型和经化疗的敲除胰腺肿瘤中ROS生成增加，表明HMGB的作用是氧化应激的下游。
我们发现HMGB1的缺失、缺失或抑制可阻断饥饿和雷帕霉素诱导的人类和小鼠细胞自噬，这些细胞受到HMGB1敲除、敲除或药物抑制(39). 此外，HMGB1通过与自噬蛋白Beclin1直接相互作用来调节自噬，而不改变其表达(13). HMGB1可能通过细胞外信号调节激酶（ERK）和MAPK途径参与自噬过程中Bcl-2磷酸化的调节，因为HMGB1的消融减少了饥饿诱导的ERK1/2和Bcl-2的磷酸化(39). 此外，HMGB1的释放和细胞氧化还原状态通过RAGE依赖机制调节癌细胞的自噬和凋亡(15,38). 重要的是，HMGB1的靶向敲除增加了同种移植小鼠胰腺肿瘤模型中吉西他滨的敏感性，并与治疗诱导的氧化应激中自噬减少相关。这些结果为将自噬与HMGB1的癌相关失调联系起来的关键信号通路提供了证据。
总之，我们在这里证明HMGB1是氧化应激自噬反应的激活剂。然而，HMGB1调节的导致自噬的确切下游信号事件尚不清楚，将是未来研究的重点。由于氧化应激与许多人类疾病有关，如动脉粥样硬化、帕金森氏病、心力衰竭、心肌梗死、阿尔茨海默氏病、肥胖和癌症(19,28)，我们对自噬调节的研究可以为开发新药物或通过HMGB1调节这些人类疾病中的自噬控制方法提供有用的见解。
材料和方法
试剂
肌动蛋白和β-微管蛋白抗体来自西格玛（密苏里州圣路易斯）。抗SOD1和4-羟基壬醛（HNE）的抗体来自马萨诸塞州坎布里奇的Abcam。HMGB1、LC3和LAMP2的抗体从Novus（Littleton，CO）获得。p62和LDH的抗体来自Santa Cruz Technology（加州圣克鲁斯）。线粒体细胞色素氧化酶（COX）IV和组蛋白H3的抗体来自细胞信号技术（Danvers，MA）。HMGB1中和抗体是从Novus（目录号H00003146-M08）获得的。H（H）2O（运行）2NAC、DHIQ和3MA来自Sigma。HMGB1全长或突变（C23S、C45S、C106S）cDNA是乔治·霍普博士（俄亥俄州克利夫兰诊所科尔眼科研究所）赠送的礼物(10).
细胞培养和治疗
HMGB1标准+/+和HMGB1−/−永生化小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）是意大利圣拉斐尔研究所（San Raffaele Institute）的Marco E.Bianchi博士赠送的礼物。附件5+/+和附件5−/−MEF是日本东京医学和牙科大学水岛Noboru博士的一份礼物。HCT116结肠癌细胞和Panc02胰腺癌细胞来源于美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）。细胞在添加10%热灭活胎牛血清的培养基中培养，2 米M（M）谷氨酰胺和青霉素-链霉素混合物（Invitrogen，Carlsbad，CA；每个最终浓度为50微克/毫升），置于含有5%CO的加湿培养箱中2和95%的空气。用N-乙酰半胱氨酸（NAC，50 米M（M）)，3-甲基腺嘌呤（3MA，10 米M（M）)或巴非霉素A1（Baf A，100 n个M（M）)对于1 h，然后用h处理2O（运行）2(0.05 米M（M）)用于12 h、 如图图例所示。在氧化损伤模型中，MEF用1,5-异喹啉二醇（DHIQ，300 μM（M）)对于1 h，然后用h处理2O（运行）2(0.25 米M（M）)用于12 h.为了探讨HMGB1对氧化损伤诱导的细胞活力HMGB1的影响+/+和Hmgb1−/−用不同浓度的H处理MEF2O（运行）2范围为0.0005 米M（M）至5 米M（M）24小时 小时。
RNA干扰
根据制造商的说明，使用X-tremeGENE siRNA试剂（瑞士巴塞尔罗氏应用科学公司）或脂质体2000试剂（Invitrogen）将SOD1小干扰RNA（siRNA）、对照siRNA（Santa Cruz Technology）、HMGB1短发夹RNA（shRNA）和对照shRNA（Sigma）转染到细胞中(18).
蛋白质印迹分析
来自细胞裂解物的蛋白质在4%-12%Criterion XT Bis-Tris凝胶（Bio-Rad，Hercules，CA）上溶解，并转移到硝化纤维膜上。封闭后，将膜培养2 在25°C下放置h，或在4°C下过夜，使用各种初级抗体。与过氧化物酶结合二级抗体孵育1 根据制造商的说明，在25°C下h，通过增强化学发光（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）对信号进行可视化。使用凝胶电泳分析仪定量相对带强度®软件（媒体控制论，马里兰州贝塞斯达）。
HMGB1释放试验
根据制造商的说明，通过来自Shino Test Corporation（Sagamihara shi，Kanagawa，Japan）的Western印迹分析或酶联免疫吸附测定试剂盒评估释放到细胞培养上清液中的HMGB1。使用凝胶电泳分析仪定量蛋白质印迹的相对带强度®软件（媒体控制论）。
细胞活力测定
处理后，根据制造商的说明，使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）（Dojindo Laboratories，Tokyo，Japan）评估细胞活力。CCK-8允许利用Dojindo的高水溶性四氮唑盐进行方便的分析。WST-8[2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺苯基）-2H-四氮唑，单钠盐]在电子载体存在下还原后产生水溶性甲氧基氮染料。CCK-8的检测灵敏度高于其他四唑盐，如MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵]。同时，通过台盼蓝排除试验对细胞活力进行了分析，得出了类似的结果。
线粒体的分离和亚细胞分离
根据制造商的说明，使用从皮尔斯获得的线粒体分离试剂盒进行细胞亚细胞分离。
免疫荧光分析
细胞在玻璃盖片上培养，并在3%甲醛中固定30 在室温下用0.1%Triton X-100萃取洗涤剂10分钟之前 25°C时最小值。用2%牛血清白蛋白（BSA）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中饱和盖玻片1 h，然后用Alexa Fluor 488或Cy3-结合IgG（Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥）处理一级抗体进行免疫荧光。用荧光染料Hoechst 33342分析细胞核形态。在所有培养步骤之间，细胞清洗三次，每次3次 使用60x Plan Apo/1.45油浸物镜和Fluoview软件（FV10-ASW 1.6；Olympus），使用激光扫描共聚焦显微镜（Fluovew FV-1000；Olymbus）采集图像。随后通过Image-Pro Plus 5.1软件（Media Cybernetics）分析图像的荧光强度水平和各种污渍的共同定位。
为了进行组织免疫荧光分析，将组织包埋在最佳切割温度的冷冻介质中（荷兰樱花），然后切割成8个 μm截面，如前所述(17). 组织切片用LC3，4-羟基-2-壬醛（HNE）或HMGB1抗体染色，然后用Alexa Fluor 488或Cy3-结合免疫球蛋白染色。用荧光染料Hoechst 33342（Sigma）分析细胞核形态。根据制造商的建议，使用原位细胞死亡检测试剂盒（瑞典罗氏）进行末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析。
自噬分析
通过LC3-I/II的Western blotting评估自噬，并量化带有LC3斑点的细胞百分比(17). 通过Western blotting对p62进行自噬通量分析，量化带有p62点的细胞百分比，并确定LAMP2和LC3的共定位百分比。
皮下肿瘤模型
生成小鼠皮下肿瘤，106在C57/Bl6小鼠背中线右侧皮下注射Panc02野生型或HMGB1敲除细胞。肿瘤每周测量两次，并使用长度×宽度公式计算体积2×π/6 (17). 根据匹兹堡大学动物护理和使用委员会的原则和指南，批准了动物实验的实施程序。
使用的缩写
| 3-MA公司 | 3-甲基腺嘌呤 |
| 自动液位计 | 自噬相关基因 |
| 英国标准协会 | 牛血清白蛋白 |
| 考克斯IV | 线粒体细胞色素氧化酶IV |
| DAMP公司 | 损伤相关分子模式分子 |
| DHIQ公司 | 1,5-异喹啉二醇 |
| HMGB1标准 | 高移动性分组盒1 |
| 海航集团 | 4-羟基-2-壬醛 |
| H（H）2O（运行）2 | 过氧化氢 |
| 灯2 | 溶酶体相关膜蛋白2 |
| 生命周期3 | 微管相关蛋白轻链3 |
| MEF公司 | 小鼠胚胎成纤维细胞 |
| NAC公司 | N-乙酰半胱氨酸 |
| 美国公共广播电视公司 | 磷酸盐缓冲盐水 |
| RNA干扰 | RNA干扰 |
| 玫瑰红 | 活性氧物种 |
| shRNA | 短发夹RNA |
| 小干扰RNA | 小干扰RNA |
| 草地 | 超氧化物歧化酶 |
致谢
该项目由NIH 1 P01 CA 101944-04（Michael T.Lotze）资助，该项目由国家癌症研究所将NK和DC纳入癌症治疗。我们感谢Marco E.Bianchi博士（意大利圣拉斐尔研究所）为Hmgb1+/+和Hmgb1−/−MEF公司。重要的是，与Bennett Van Houten博士、Timothy Billiar博士、Douglas Green博士、Ravi Amaravadi博士和Eileen White博士就自噬和代谢的相关性和联系进行的讨论集中了我们的大部分工作，并为我们的工作提供了信息。
工具书类
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