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肝病学。作者手稿；可在PMC 2012年8月1日获得。
以最终编辑形式发布为：
肝病学。2011年8月；54(2): 573–585.
2011年6月26日在线发布。 数字对象标识：10.1002/庚24427
预防性维修识别码：项目经理3145033
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院295894
PMID：21567441

补充性血管和基质调节通路是索拉非尼治疗肝纤维化有益机制的基础

多米尼克·塔布特,1,2,* 奇塔兰詹·劳特雷,1,* 格温·隆伯格,1 乌代·谢吉尔,1 凯文·格拉泽,三 罗伯特·休伯特,1 列娜·帕特尔,1 Tetyana Masyuk公司,1 鲍里斯·布莱查兹,1 安德鲁·韦尔科克（Andrew Vercnocke）,三 埃里克·里特曼,三 理查德·埃曼,三 劳尔·乌鲁蒂亚,1和维贾伊·沙阿1,三
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景

肝星状细胞（HSC）和肝内皮细胞（LEC）之间的旁分泌信号调节纤维化、血管生成和门脉高压。然而，调节这些过程的机制尚未完全确定。索拉非尼是一种受体酪氨酸激酶抑制剂，可阻断肿瘤细胞中的生长因子信号传导，但对肝非实质细胞（包括HSC和LEC）也显示出重要且尚未完全表征的作用。本研究的目的是验证索拉非尼影响HSC和LEC之间的旁分泌信号，从而调节与慢性肝损伤相关的基质和血管变化的假设。

结果

补充磁共振弹性成像、显微CT和组织化学分析表明，索拉非尼可以减弱大鼠胆管结扎诱导的肝损伤引起的基质和血管室的变化。细胞生物学研究表明，索拉非尼显著减少了细胞间的并置和连接复合体，从而减少了这些正弦屏障细胞之间通常观察到的邻近性。在分子水平上，索拉非尼下调HSC以依赖于转录因子KLF6的方式释放的血管生成素-1和纤维连接蛋白，表明该途径是慢性肝病相关基质和血管变化的基础。

结论

总之，我们的结果表明索拉非尼抑制慢性肝病伴随的基质重组和血管重塑，并表征了这种作用的细胞和分子机制。这些数据可能有助于完善以大量纤维化和新生血管为特征的晚期胃肠道和肝脏疾病的未来治疗方法。

关键词：门脉高压、KLF6、索拉非尼、肝硬化、血管生成素-1

介绍

肝硬化与正弦树内基质和血管结构的变化有关。基质变化的特征是纤维结合蛋白、I型胶原和其他纤维蛋白沉积增加。伴随的血管变化主要包括窦性血管收缩、血管生成和窦性病变重塑，典型表现为壁细胞覆盖增加和肝星状细胞（HSC）在肝内皮细胞（LEC）周围有力包裹(1–三). 这些血管变化破坏了窦性功能的完整性和稳态，并与基质变化相一致，导致门脉高压及其临床并发症。

索拉非尼是一种多激酶抑制剂化合物，最近被批准用于肝癌患者(4). 它最近被引入临床，推动了大量研究，不仅旨在了解它的治疗潜力，还旨在了解这种药物有益作用的可能机制。除了众所周知的对上皮癌细胞增殖的影响外(5)，索拉非尼还调节邻近基质细胞（包括肌成纤维细胞和内皮细胞）的受体酪氨酸激酶途径(6). 虽然索拉非尼对这些非实质性细胞类型的抑制作用特征较少，但它们可能对该药物的抗肿瘤疗效有显著贡献。此外，由于HSC和LEC是肝纤维化过程中基质和血管变化发展不可或缺的组成部分，因此研究索拉非尼在该疾病过程中的作用和机制具有显著的医学意义。

因此，在目前的研究中，我们证明索拉非尼通过HSC和LEC内触发的一种新机制，至少部分地发挥作用，从而改善肝纤维化。我们的结果报告了血管生成素-1（Ang1）与纤维连接蛋白协同调节肝纤维化伴发窦重构的途径。我们发现Ang1和纤维连接蛋白均受血小板衍生生长因子（PDGF）信号调节，并由一个共享转录因子在功能上相连；锌指蛋白，KLF6。然而，索拉非尼通过分别独立于和依赖于Raf的不同下游分子信号，很容易抑制这些协同的Ang1和纤维连接蛋白途径。互补的体内研究揭示了这些途径在肝僵硬度增加过程中的作用，并提供了证据表明索拉非尼通过限制损伤诱导的基质和血管生成性变化来恢复正弦稳态。总之，这些发现对于建立必要的理论框架，设计新的治疗方法来治疗肝脏和其他易受强烈纤维化反应影响的胃肠道器官的纤维化具有重要意义。

方法

详细方法见补充方法.

细胞培养/转染

原代小鼠LEC、人类LEC（ScienceCell）或来源于转化小鼠肝内皮细胞（TSEC）的细胞系(7)，用含有10%血清和1%内皮生长补充剂的内皮培养基生长。人HSC（ScienceCell）在含有10%血清的DMEM中生长。

小鼠LEC的分离

如前所述，通过反复绞碎、酶消化和基于CD-31的免疫磁珠分离法从整个大鼠肝脏中分离LEC，并进行了修改(8).

HSC衍生条件培养基的制备

人HSC无血清，在无血清DMEM中用载体或索拉非尼治疗，条件培养基（CM）在12-24小时内收获。

体外LEC微管生成-共培养检测和电子显微镜

将人LEC和HSC涂布在基质凝胶涂层的4孔玻璃载玻片上，观察小管生成，以研究LEC与HSC之间的血管生成相互作用在体外如前所述(三). 利用透射电子显微镜（TEM）观察人LEC和Matrigel培养的HSC之间的血管连接。

趋化性测定

如个别实验所示，人类LEC的趋化性是通过Boyden试验测定的，以响应CM和添加到培养基中的其他化合物。

共焦免疫荧光显微镜

如前所述，对小鼠LEC或TSEC进行免疫荧光(9). 小鼠LEC和TSEC细胞在胶原涂层玻片上生长为单层，并进行ZO-1染色。使用共焦激光扫描显微镜拍摄图像。

定量和半定量PCR

从人类HSC中分离出RNA（RNeasy/Qiagen），进行逆转录（Superscript/Invitrogen）并进行实时PCR（Applied Biosystems 7500）。

ChIP分析

用标记的KLF6或对照载体转染人HSC。36小时后，细胞血清饥饿12小时，用/不用PDGF刺激12小时，如前所述进行ChIP（EZ-ChIP试剂盒）(10).

胆管结扎（BDL）和索拉非尼给药体内

如前所述，对Sprague-Dawley大鼠进行BDL诱导纤维化(11). 向大鼠注射载体或索拉非尼(6)（1.5 mg/kg体重）体内实验。按照梅奥诊所IACUC指南进行手术。

显微CT三维重建肝血管

向动物注射不透射线的液体硅化合物（Microfil®，MV-122；Flow Tech.，Inc.，Carver，MA）经门静脉（输液速度：8–10 ml/min，压力：10–12 mmHg）。灌注后，将完好的动物置于4°C的冷藏条件下，以进行聚合。如前所述，对肝脏进行扫描和重建(12). 请参见补充方法了解更多详细信息。

磁共振弹性成像（MRE）

动物在SHAM或BDL手术后四周接受MRE。如前所述，通过气动驱动器产生穿过腹壁的纵向剪切波，然后通过相控磁共振成像系统检测传播的剪切波位移模式，从而测量肝脏硬度(13–15).

肝组织免疫染色

如前所述，在石蜡包埋和冷冻大鼠肝组织切片上进行免疫组织化学(16).

统计分析

除非另有说明，否则数据表示为至少三个独立实验的平均值和标准平均误差（SEM）。各组由双尾学生进行比较-t吨测试。P（P）值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

索拉非尼减轻损伤引起的肝硬度、基质沉积和血管重塑增加体内

MRE提供了最好的体内肝硬度的估计，这是一个与肝损伤引起的基质和血管变化相关的变量(17). 此外，该技术可以评估整个肝脏的硬度，是无创性的，非常适合在单个动物中进行连续成像研究。因此，在目前的研究中，我们利用这项技术评估索拉非尼给药后肝硬度的变化。我们在手术后立即开始给假大鼠或BDL大鼠服用索拉非尼4周。索拉非尼耐受性良好，无明显不良反应（体重减轻、腹泻、出血或死亡）。在BDL大鼠中，与假手术大鼠相比，MRE证明肝硬度随时间增加(图1A显示复合数据，图1B; 顶部面板显示具有代表性的磁共振图像，下部面板显示相应的MRE）。相反，在接受索拉非尼治疗的BDL大鼠中，肝硬度的增加被减弱(图1A). 值得注意的是，索拉非尼还影响了BDL引起的基质沉积。与接受载体的BDL大鼠相比，索拉非尼b治疗的BDL鼠在4周时肝脏切片的天狼星红染色减少，显示出这种减轻的纤维化(图1C; 复合数据和一维图形；代表性图像）。由于MRE除了反映基质变化外，还反映了血管构筑的变化，因此我们随后确定了可能导致肝僵硬的血管成分以及索拉非尼对其的调节。为了研究索拉非尼对血管的影响，我们首先用vWF抗体对治疗动物的肝组织切片进行染色，vWF是血管内皮的一种标记物，尤其在纤维化中积极重塑血管方面表现突出(18). 事实上，如我们和其他人之前所示，与假手术大鼠相比，车用BDL大鼠的vWF增加(16). 然而，当用索拉非尼治疗BDL大鼠时，vWF染色显著减弱(图2A显示复合数据和图2B显示了具有代表性的图像），表明该药物可以减弱肝脏伤口愈合反应期间发生的血管变化。为了补充这些研究，我们使用基于显微CT的方法更详细地评估假手术和BDL大鼠的血管特征。该技术可测量总血管体积（如图2D、左上和中间面板；红色显示选定的血管干和相关的血管体积），以及对大中型肝血管分支的精确分析(图2D; 右面板），从而补充和证实上述组织化学分析。BDL大鼠肝脏血管体积与肝总体积的比值以及分支数（一级/二级/三级总）增加；图2D下部面板显示代表性图像，而图2C描述了复合数据）。然而，接受索拉非尼治疗的BDL大鼠在这些微-CT血管参数方面均表现出衰减，这与vWF组织化学分析一致。因此，索拉非尼有效地减弱了BDL引起的病理生物学血管变化。

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索拉非尼减轻损伤引起的肝硬度/基质沉积增加体内.A&B:SHAM和BDL手术大鼠经载体或索拉非尼治疗后，在4周时接受MRE，并评估肝硬度的变化。与SHAM大鼠相比，载体BDL大鼠的肝脏硬度显著增加。在接受索拉非尼治疗的BDL大鼠中，这种变化显著减弱（N>4，平均值±SEM，*p<0.05，sham-vehicle，**BDL-vehicle）。定量分析用图形A表示；代表性动物的图像显示在B中（上面板：MRI图像，下面板：带有刚性彩色热图的MRE图像）。C&D：索拉非尼或载体治疗的SHAM和BDL大鼠的天狼星红染色；与给药大鼠相比，索拉非尼减轻了BDL大鼠的基质沉积（10X；N>4，平均±SEM，*p<0.05，sham-vehicle，**BDL-vehicle）。定量分析用C表示，代表性图像用D表示。

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索拉非尼减轻损伤诱导的肝血管重塑体内试验。A&B:SHAM和BDL大鼠经载体或索拉非尼治疗后，进行肝脏vWF免疫荧光检测。分析表明，与BDL-vehicle相比，BDL-sorafenib大鼠的新毛细血管形成减弱（20X，n>3，平均值±SEM，*p<0.05，BDL-vehicle）。定量分析如A所示；具有代表性的图像如B.C&D所示：用载体或索拉非尼治疗的SHAM和BDL大鼠被注射Microfil®; 扫描特定的肝叶以测量血管体积（左中上面板；D）。图像也进行了数字重建，以量化血管分支（右上面板；D）。血管体积/肝脏比率和分支数量的定量分析用C表示；代表性动物的图像显示在D.BDL大鼠的下面板上，通过血管体积/肝脏体积比和更高的分支数目测量，经载体证实，肝总血管空间增加。索拉非尼在BDL大鼠中与总血管间隙显著减少（n>4，平均±SEM，*p=0.01，BDL-vehicle）和一级/二级/三级分支减少（*p<0.05，BDL-vehicle）相关。

星状细胞和内皮细胞相互作用的调节是索拉非尼对血管修复有益作用的关键细胞机制

因为索拉非尼可以逆转肝损伤期间引起的血管缺陷体内接下来，我们使用由人源性HSC和LEC组成的重组细胞系统研究了这些作用的细胞机制，这些细胞群负责损伤后基质和血管的变化。由于纤维化窦与LEC衬窦HSC包裹增加有关(2)，我们专门研究了索拉非尼是否逆转了这一过程。为了探索这一概念，我们用索拉非尼或载体培养人HSC 24小时，并将这些细胞转移到基质凝胶上与人LEC共培养。每种细胞类型都用YFP或DS-Red质粒标记，以区分它们并便于监测它们的行为。使用这种优化的细胞培养系统，我们发现HSC和LEC形成了强大的血管网络，两个细胞并置并形成包裹接触；然而，在本试验中，用索拉非尼预处理的HSC与HSC有效建立与LEC包裹相互作用的能力受损形成了鲜明对比(图3A上面板放大10倍，下面板缩放Z堆栈，并量化LEC、HSC和LEC-HSC并列的细胞间连接，右面板图）。这些荧光显微镜实验还辅以延时视频显微镜，以实时观察这些观察的时间动力学(补充图1—电影). 此外，电子显微镜证实，索拉非尼处理的HSC与LEC的并置减少，这表明当HSC与索拉非尼布预孵育时，LEC与HSC之间的间隙增加，并置减少(图3B; 参见虚线箭头）。因此，这些在体外联合使用光镜和电子显微镜以及延时实时成像进行的分析表明，大量内皮-星形细胞包裹和接触的破坏是索拉非尼对血管结构有益作用的细胞机制的一部分。

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索拉非尼抑制内皮细胞-星状细胞相互作用和通讯在体外答：人HSC和LEC分别用DS-Red或YFP标记，并在Matrigel中共培养。HSC之间形成血管网(红色)或LEC(绿色)当HSC在与LEC共培养之前用索拉非尼预处理时，这一现象被显著抑制，这可以通过减少LEC和HSC的并列来证明。（左：索拉非尼组或对照组的代表性图像；上面板为10X，下面板为Z-stack放大，100X。右：LEC之间、HSC之间以及两种细胞类型之间并列的血管连接的复合数据（n=3，平均值±SEM，*p<0.05对照）。B： 人LEC和HSC在Matrigel中与用对照载体或索拉非尼预处理的HSC共培养的TEM（上面板：10000X，下面板：50000X）；实心箭头表示对照车辆观察到的两种细胞类型之间的紧密并列，但在索拉非尼处理的细胞中被破坏，如虚线箭头所示。C： ZO-1染色（红色）显示TSEC之间的连接。ZO-1在用基础培养基处理的TSEC中显示适度染色，而用来自于车用HSC处理的条件培养基（CM）的质膜染色是稳健的；当用索拉非尼处理的HSC衍生的CM处理时，ZO-1染色显著降低（n=3，平均值±SEM，*p<0.05-基础，**p<0.05-CM）。上部表示具有代表性的图像。下部，在复合图中描述数据。D： 用载体或索拉非尼处理的HSC的CM在Matrigel上孵育的人LEC的TEM（上部，10000X，下部，50000X）；左面板中的箭头表示当用来自车用HSC的CM处理时，连接复合体和LEC的紧密并置。虚线箭头表示当CM来自HSC并用索拉非尼预处理时，LEC之间的连接中断。

索拉非尼干扰内皮细胞与内皮细胞的连接作用在体外

除了内皮细胞周围收缩性星状细胞的包裹增加外，肝硬化的血管重构还表现为内皮细胞与内皮细胞连接的组装增加，从而导致细胞运动和血管生成。这与正常肝窦不同，正常肝窦不连续，内皮细胞与内皮细胞的相互作用有限。因此，我们接下来研究索拉非尼治疗HSC是否调节LEC和血管生成之间的连接结构。为了测试这个模型，我们在内皮细胞形成显著连接的条件下电镀和培养内皮细胞（TSEC），并用预先用索拉非尼或对照载体处理的HSC条件培养基培养它们。用ZO-1抗体对细胞进行免疫染色，以标记内皮细胞之间的连接结构。我们发现，ZO-1染色在与来源于载体处理的HSC的条件培养基孵育的TSEC中显著，而在与来源于索拉非尼刺激的HSC的培养基孵育的细胞中显著降低(图3C)这表明该药物调节内皮细胞之间细胞-细胞连接的形成。这些最初在TSEC细胞中观察到的结果也在原代小鼠LEC中得到证实(补充图2). 我们使用了透射电子显微镜，它显示了用来自车用HSC的条件培养基培养的人LEC之间的细胞间连接数量增加(图3D). 相反，当LEC与来自索拉非尼刺激HSC的条件培养基孵育时，这种高分辨率技术显示的连接结构显著减少(图3D). 因此，这些数据表明索拉非尼调节内皮细胞之间形成的连接复合体的结构基础，而内皮细胞是血管重塑的基础，随后我们定义了可以在分子水平上调节这些过程的信号级联。

索拉非尼通过互补信号通路调节血管和基质重塑

先前的研究已经揭示了PDGF对血管功能的关键作用，特别是其通过PDGF受体β（PDGFR-β）调节周细胞和肌纤维母细胞壁细胞（如HSC）的能力(三,19). 作为更好地确定索拉非尼对HSC中PDGFR信号传导的影响的第一步，我们检查了PDGF和/或索拉非尼布刺激的人源性HSC中该信号通路的完整性。索拉非尼与其作为酪氨酸激酶抑制剂的功能一致，它可以消除PDGF诱导的PDGFR-β磷酸化。PDGF诱导的Raf和Akt磷酸化也被该药物抑制，表明索拉非尼抑制PDGF的几个典型下游通路(图4A). 我们下一步确定具体血管的可能位于HSC中这些索拉非尼信号靶点下游的分子。为此，我们使用通路特异性血管生成阵列对人类HSC进行了表达分析，结果表明PDGF诱导HSC中血管生成素-1（Ang1）和纤维连接蛋白的表达，索拉非尼逆转了这种作用(补充图3). 与微阵列结果一致，索拉非尼治疗24小时后，HSC中纤连蛋白水平降低(图4A). 在缺乏可靠抗体的情况下，通过定量逆转录（RT-PCR）证实Ang1的变化，这表明与PDGF孵育后Ang-1 mRNA水平上调，24小时后Ang-1mRNA水平达到最大值(图4B). 相反，索拉非尼和机械连接化合物伊马替尼阻断了PDGF对Ang-1 mRNA水平的诱导作用(图4C). 为了扩展我们对PDGF诱导HSC产生Ang1的信号通路的分析，我们在有或无PDGF的情况下，用U0126（MEK抑制剂）或沃特曼（PI3K/Akt途径抑制剂）治疗HSC，并通过RT-PCR评估Ang1 mRNA水平。虽然沃特曼明显抑制Ang1合成，但U0126没有(图4D). 此外，Raf-silenced HSC中Ang1的合成没有受到影响(图4E). 相反，Western blot分析显示纤维连接蛋白在Raf-silenced HSC中的表达受到抑制(图4A，右下面板）。因此，HSC中Ang1的表达是通过PDGFR和PI3K/Akt依赖但Raf依赖的机制实现的，而HSC中纤维连接蛋白的表达则是通过典型的PDGFR途径和Raf途径实现的。因此，这些结果表明，参与血管重塑的基因的表达受酪氨酸激酶受体下游的关键分子通路（如PDGF）调节，索拉非尼有效地抑制了这些事件。

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索拉非尼抑制HSC中血管生成素-1（Ang1）和纤维连接蛋白的释放。A： HSC用索拉非尼（2μmol/l）处理1h，用PDGF刺激10分钟，然后裂解为Western blot。索拉非尼抑制PDGFRβ和下游分子Akt和Raf-1的磷酸化，以及HSC中纤维连接蛋白的合成。使用siRNA降低HSC中Raf-1的敲除效果。Raf-1沉默HSC中纤维结合蛋白的合成减少。描述了具有代表性的斑点。B： PDGF后HSC中q-PCR合成Ang1的时间进程。Ang1 mRNA水平在PDGF后24小时呈暂时性增加，达到最大值（n=3，平均值±SEM，*p<0.05-basal）。C： 索拉非尼和伊马替尼抑制PDGF诱导的HSC Ang1合成。（n=3，平均值±SEM，*p<0.05-车辆，**PDGF）。D： 当用PI3-K抑制剂沃特曼（wortmannin）而不是MEK抑制剂U012处理HSC时，PDGF刺激后Ang1 mRNA水平降低（n=3，平均值±SEM，*p<0.05-vehicle）。E： 用Raf-1 siRNA转染细胞，用/不用PDGF处理，并在转染后48小时裂解。PDGF处理后Raf-1沉默HSC中Ang1 mRNA的PCR结果显示，与打乱的siRNA/PDGF相比，没有显著变化（n=3，平均值±SEM，相对于打乱的PDGF）。

KLF6介导PDGF诱导的Ang1和纤维连接蛋白表达

接下来我们研究了这种信号级联如何收敛于核转录因子，而核转录因子可能调节这些血管生成因子的表达。由于KLF蛋白家族已成为HSC功能和表型的关键调节因子，因此我们将重点放在KLF蛋白质上(20–23). KLF蛋白的系统和全家族筛选方法显示，在用索拉非尼预处理的细胞中，KLF6、KLF7、KLF8、KLF9和KLF15受到抑制（数据未显示）。其中，KLF6是一种与纤维化密切相关的分子，因此引起了我们对这一特定KLF蛋白的关注。事实上，RT-PCR显示与PDGF孵育后KLF6显著上调，索拉非尼消除了这种作用(图5A). 为了进一步探讨KLF6在HSC纤维连接蛋白和Ang1调控中的作用，我们在HSC中进行了基于RNAi的敲除。事实上，KLF6的下调消除了PDGF诱导的Ang1 mRNA和纤维连接蛋白水平的诱导(图5B/C、 分别）。确证的细胞生物学研究还表明，LEC在与KLF6 siRNA转染的HSC的条件培养基孵育后，小管生成显著降低(图5D)与之前在用索拉非尼处理HSC的条件培养基中观察到的情况类似，这表明该转录因子调节参与活跃内皮小管生成的细胞内事件。最后，通过ChIP分析，KLF6作为血管生成基因的直接调节因子被牢固地确立，这表明该转录因子在培养的HSC中占据Ang1启动子(图5E). 因此，这些实验描述了一种新的途径，其中KLF6介导HSC中的PDGF信号，从而导致血管蛋白（如Ang1）和基质蛋白（如纤维连接蛋白）的产生，后者是伴随纤维化的血管构筑变化中的既定参与者。

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KLF6介导PDGF诱导的血管生成素-1（Ang1）合成。A： PDGF刺激HSC后KLF6 mRNA水平升高。与单独使用PDGF相比，使用索拉非尼刺激PDGF 24小时后KLF6 mRNA水平降低（n=3，平均值±SEM，*p<0.005-对照，**对照-PDGF）。B： 当使用siRNA敲低KLF6时，PDGF对Ang1 mRNA水平的刺激被消除（n=3，平均值±SEM，*p<0.005-craft，**craft-PDGF）。C： 没错，KLF6沉默的HSC中纤维连接蛋白水平降低。左图显示了siRNA对KLF6的有效敲除。D：在缺乏KLF6 siRNA的情况下，来自KLF6沉默、PDGF刺激HSC的CM中的LEC小管生成与来自PDGF模拟HSC的CC相比显著降低（*craft-PDGF）。E： ChIP分析评估KLF6与Ang1启动子的结合。E描述了与对照组相比，血管紧张素-1与过度表达的标记KLF6的PDGF结合增加。

HSC衍生的血管生成素-1破坏血管内稳态

然后我们回到了我们的在体外确定这些分子发现的功能作用的模型。Ang1对血管成熟起重要作用(24). 然而，过量的Ang1可能破坏正常血管，导致血管重构和血管生成，这是肝硬化的特征。因此，我们首先研究了Ang1是否会增加LEC之间的连接结构。因此，我们将TSEC（一种在汇合处形成丰富连接的LEC细胞系）和免疫染色的细胞与ZO-1Ab结合，以确定连接结构。为了明确表明Ang1参与这一过程，在一些实验组中，我们在用含有Ang1中和抗体的HSC条件培养基或补充的重组Ang1培养TSEC后，检查了ZO-1染色。如前所述图3C，条件介质处理组ZO-1染色显著增加；当用来自索拉非尼b处理的HSC的条件培养基处理时，这种作用被消除(图6A). 此外，在HSC衍生培养基中添加重组Ang1后，索拉非尼对细胞间连接形成的抑制被逆转(图6A). 当TSEC与用Ang-1中和抗体预处理的条件培养基孵育时，观察到与索拉非尼相似的模式(图6A). 透射电子显微镜也证实了这些发现，在HSC衍生条件培养基中添加Ang1中和抗体后，LEC中的结合复合物减少(图6B). 这些形态学分析还显示，通过向HSC条件培养基中添加重组Ang1，可以逆转索拉非尼对细胞间连接复合体的抑制作用(图6B). 因此，这些结果表明，HSC衍生的Ang1促进LEC中的细胞间连接，这些事件可能有助于肝窦重塑和血管生成，这是纤维化血管系统的特征。

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HSC释放血管生成素-1（Ang1）促进LEC形成连接的能力在体外.A:ZO-1染色TSEC以评估LEC对CM的反应与分子之间的连接，如前所述图3C将LEC与HSC条件培养基孵育后，对照组的ZO-1染色显著增加。当用索拉非尼b处理的HSC衍生的CM处理LEC时，ZO-1染色增加被消除。索拉非尼的抑制作用通过向CM中添加人重组（rh）-Ang1而部分逆转（ZO-1染色增加4倍）。当LEC在含有Ang1中和抗体的HSC CM中孵育时，ZO-1染色的抑制也以类似于索拉非尼的方式观察到（n=3，平均值±SEM，*p＜0.05-基底培养基，**CM，***CM）。B： 人LEC在Matrigel上培养，其中HSC衍生CM用载体或索拉非尼处理或添加Ang1中和抗体处理，并制备样品用于TEM。与CM孵育的LEC显示出紧密的并置和连接复合物，与含有rh-Ang1和索拉非尼的CM孵育出的细胞一样（之前在图3D). 向CM中添加Ang1中和抗体导致LEC-LEC并置出现缺口和破坏，如箭头所示（上面板：10000X，下面板：50000X；箭头指向LEC-LEC接触部位）。

最后，我们使用需要LEC结合复合体的血管成熟功能分析扩展了这些细胞形态学观察。与形态学研究一致，Ang1中和抗体减弱了LEC的小管生成，这种生成是对PDGF刺激的HSC条件培养基的反应(图7A). 类似地，通过将重组Ang1添加到来源于索拉非尼刺激的HSC的条件培养基中，可以恢复LEC的小管生成，这突出了Ang1的决定性作用以及索拉非尼布对其在三维小管生成过程中的调节(图7B). 这些实验通过需要细胞引导线索和细胞运动机制的趋化分析进行补充。在这方面，与相关对照组相比，索拉非尼刺激HSC的条件培养基或用Ang1中和抗体处理的条件培养液显著降低了LEC的迁移能力(图7C). 此外，与三维微管研究类似，将重组Ang1添加到来源于索拉非尼处理的HSC的条件培养基中可以挽救LEC迁移(图7C). 这些发现为这里描述的通路提供了一个功能层次，表明Ang1对血管重塑的影响是必需的，也是足够的。

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HSC释放血管生成素-1促进LEC小管生成和迁移；A： HSC释放血管生成素-1促进LEC小管生成；与IgG对照组相比，当细胞在PDGF刺激的HSC衍生CM中孵育并添加Ang1中和抗体时，Matrigel上人LEC的管形成减少（*p<0.05-CM，**CM-PDGF）。B： 当细胞与来源于用索拉非尼预处理的HSC的CM孵育时，Matrigel上人LEC的管形成减少（*p<0.05-CM）。在培养基中添加rh-Ang1，部分缓解了索拉非尼的抑制作用。C： 根据CM的趋化反应和所述的干预措施，评估人类LEC的迁移。用索拉非尼b处理的HSC衍生的CM刺激时，LEC迁移减少；向培养基中添加rh-Ang1可逆转这种效应（*p<0.05碱性培养基，**CM）。与Ang1中和抗体处理的CM孵育时，LEC迁移减少（***p<0.05-CM）。

讨论

肝硬化的发展需要基质组成和周转的改变，以及肝内血管系统的显著变化，这些变化需要非实质性肝细胞，尤其是内皮细胞和星状细胞之间协调的相互作用。这些血管变化显著地导致了伴随晚期纤维化的门脉高压症的病态并发症。在当前的研究中，我们着重于确定肝纤维化期间发生的血管基质变化的新的细胞和分子途径，并确定索拉非尼（一种对肝硬化和肝癌患者具有良好临床应用前景的化合物）是如何影响这些途径的。在这方面，目前的研究揭示了几种新的细胞和分子现象，这些现象进一步阐明了伴随纤维化的血管结构变化（见图8这些研究支持的信令原理模型）。首先，我们证明HSC分泌Ang1，Ang1是纤维化相关血管变化的关键因素。我们表明，过度HSC衍生的Ang1通过促进HSC和LEC之间包裹相互作用的增加以及LEC之间连接的增加，破坏了正弦稳态。这些现象在窦性重塑过程中达到顶峰，该过程增强了窦周围HSC的收缩，并增加了血管生成。令人惊讶的是，Ang1的产生需要PI3K/Akt的激活，尽管它独立于Raf，Raf是索拉非尼在肝癌细胞中的经典靶点(4,25)从而证明索拉非尼使用不同的途径在上皮细胞和间充质细胞中发挥其变化。这些血管变化还与基质重塑相协调，如Raf依赖性纤维连接蛋白生成增加所示，与Ang1生成一样，Ang1的生成依赖于KLF6转录通路的完整性，从而揭示了导致肝硬化的血管和基质变化的显著协调。最后，我们提供了明确的证据表明，多激酶抑制剂索拉非尼抑制KLF6-Ang1-fibronectin分子三联体，从而减轻肝硬化典型的血管构筑变化。这些观察结果还表明，索拉非尼在癌症和肝硬化中的作用可能存在明显差异，可以利用这些差异来调整不同的浓度反应，从而在两种情况下取得有益的效果。然而，值得注意的是，针对肝硬化肝内血管生成的治疗尚未以任何系统的方式进行评估，因此目前无法可靠预测此类干预的任何有益甚至有害影响(2).

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示意图描述了1）PDGF调节HSC中Ang1和纤维连接蛋白生成的信号通路，2）通路分别对血管和基质变化的影响，以及3）索拉非尼如何抑制这些通路。

为了确定调节Ang1表达的核事件，我们检测了该基因启动子的顺调控序列，该序列可能与相关转录因子结合。有趣的是，Ang1启动子包含几个符合SP/KLF蛋白共识的序列。这个转录因子家族由24种不同的蛋白质组成，其中许多蛋白质是胃肠道、肝细胞生物学和病理生物学的关键调节因子(26). 事实上，我们进行了全家族筛查，以确定哪种KLF蛋白调节Ang1的表达。使用这种方法，我们证明KLF6占据Ang1的启动子，并且Ang1表达被KLF6的siRNA敲低所抑制。这一点意义重大，因为KLF6是该家族中唯一一个在肝纤维化中功能已被明确确立的成员。例如，KLF6与肝脏伤口愈合有关(22,27). 因此，结合先前的研究，这些发现表明，KLF6可能是伴随纤维化的血管构筑改变的操作者，因为它能够驱动HSC中的膜-核途径，该途径始于PDGFR的激活，最终导致KLF6与Ang1启动子结合。

我们的研究利用最先进的成像技术，如MRE和micro-CT，监测显微镜下发生但影响整个器官的变化。在这方面，我们的研究也可以被视为对这些创新方法的临床前评估，MRE作为一种潜在的有用的肝纤维化无创评估诊断方法正日益受到重视，这一事实强调了其重要性。有趣的是，我们对BDL诱导的纤维化期间大鼠肝脏的MRE评估显示硬度增加。先前的研究表明，刚度的增加反映了基质重塑的变化(28). 然而，越来越多的证据，包括本研究报告的结果表明，僵硬也反映了经常伴随基质沉积的其他过程，包括炎症、水肿，甚至血管结构和门静脉压力的变化(15). 事实上，高分辨率显微CT的互补应用使我们能够确定异常MRE信号确实伴随着显著的血管变化。组织学检查证实BDL后血管密度增加，这一观察结果得到了补充。因此，MRE和micro-CT的强大结合使我们能够解决肝硬化的两个不同的重要组成部分，即基质改变和血管重塑。

一些，尽管不是全部，最近的研究表明，针对肝硬化中异常血管结构的治疗方法可能对门脉高压有有益的影响(18,29–31). 与这一观点一致，最近有人提出，索拉非尼等多激酶受体酪氨酸激酶抑制剂可降低肝硬化动物模型中的门脉高压(18,29,30)尽管导致这种效应的详细分子机制值得进一步研究。我们在这里扩展了我们目前对这种靶向治疗药物如何通过其对以Ang1为中心的正弦细胞串扰的影响，在治疗肝纤维化和门脉高压方面发挥潜在的有益作用的理解(32–34). 事实上，HSC分泌Ang1以促进LEC之间连接复合体的形成，这是机械应激性纤维化微环境中血管生成和血管重建的关键步骤(1,18,35). 重要的是，Ang1调节的病变肝脏毛细血管反应体内似乎与这里描述的分子机制一致。例如，虽然正常肝窦具有不连续表型的特征，但在肝硬化中，这些精细的血管结构经历了通常所称的“毛细血管化”，更持久的星状细胞覆盖着更紧密相连的内皮细胞。这些表型变化与Ang1作为血管稳定剂的已知功能一致(36). 因此，我们的结果也可能有助于解释肝硬化患者的窦性脉管系统如何采用不同的表型变化，并利用这一知识设计未来针对这一途径的治疗干预措施。总之，本研究强调了将血管系统和基质作为旨在改善肝硬化及其并发症的联合治疗靶点的重要性。

补充材料

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致谢

作者感谢Helen Hendrickson在实验室的管理支持和Terri Johnson的秘书协助。

财务支持：DK59615-06（Shah）、P30DK084567（LaRusso）、EB000305（Ritman）

缩写

HSC公司肝星状细胞
LEC公司肝内皮细胞
东京证交所转化的肝内皮细胞
巴西存托凭证胆管结扎术
MRE公司磁共振弹性成像
微型-CT微型计算机断层扫描
透射电镜透射电子显微镜
厘米星状细胞衍生条件培养基

工具书类

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