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《皮肤病学杂志》。作者手稿；PMC 2011年7月19日发布。
以最终编辑形式发布为：
《皮肤病学杂志》。2011年1月；131(1): 84–98.
2010年9月2日在线发布。 数字对象标识：10.1038/jid.2010.253
预防性维修识别码：PMC3139177型
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院308714
PMID：20811396

成纤维细胞存活需要纤维连接蛋白生长因子结合域

林福宝,1 向东人,2 Zhi Pan公司,三 劳伦·麦克里,1 宗维兴,4 马西娅·托尼森（Marcia G.Tonnesen）,2,5 米里亚姆·拉斐洛维奇,三 Dafna Bar-Sagi公司,6和理查德·克拉克1,2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

纤连蛋白（FN）是胚胎发生、形态发生和伤口修复所必需的，其含有Arg–Gly–Asp的中央细胞结合结构域（CCBD）对间充质细胞的生存和生长至关重要。在这里，我们证明FN包含三个生长因子结合域（FN-GFBDs），它们结合血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB），PDGF-BB是一种有效的成纤维细胞存活和有丝分裂因子。这些位点以10–100 n的离解常数结合PDGF-BB米FN-n在重组CCBD（FNIII）上培养的完整细胞8–11)在没有FN-GFBD的情况下，即使存在PDGF-BB，24小时时也表现出最小的代谢和自噬，72小时后出现凋亡8–11与FN-GFBD相邻的细胞在没有PDGF-BB的情况下存活，并与之增殖。FNIII上的FN-null细胞存活8–11FN-GFBD的非相邻阵列要求这些结构域被吸附在同一表面，这表明存在间充质细胞-细胞外基质突触。因此，在存在FN-GFBD的情况下，成纤维细胞存活需要GF刺激，以及通过CCBD与FN粘附。成纤维细胞存活依赖于FN-GFBD的研究结果强调了细胞周围基质对细胞存活的关键重要性，并对皮肤伤口愈合和再生具有重要意义。

简介

成纤维细胞负责结缔组织的形成、稳态和修复，从而负责许多器官的整体结构。在皮肤伤口愈合过程中，成纤维细胞长入是新结缔组织生成的速率控制步骤(麦克莱恩等。, 1996). 损伤进展和愈合失败与成纤维细胞功能障碍相关，通常导致细胞凋亡(克拉克，2008a). 更好地了解正常和病理条件下成纤维细胞生存和生长的要求，将有助于设计皮肤伤口愈合的新疗法。纤维结合蛋白（FN）和血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）已被确定为成纤维细胞的两个主要生存因子(张等。, 1995;伊利克等。, 1998;Romashkova和Makarov，1999年)但这些成纤维细胞生存因子之间是否存在相互依赖性尚未得到解决。

FN是一种500-kDa多域、多功能细胞黏附糖蛋白(图1a)在血液中发现，并在伤口中沉积纤维蛋白作为临时基质(山田和克拉克，1996年;潘科夫和山田，2002年). 来自伤口成纤维细胞和其他局部组织细胞的额外FN与再上皮化和肉芽组织形成一致(克拉克等。, 1983). 由于FN消融对胚胎致命(乔治等。, 1993)，尚未进行明确的研究来证明皮肤损伤期间FN的需求。然而，由于大脑缺乏巨噬细胞和成纤维细胞，因此不能产生局部FN，酒井等. (2001)消融小鼠肝脏FN，确定血浆FN支持神经元存活并减少脑损伤。重要的是，慢性不愈合的皮肤创伤和烧伤表明创面床中缺乏FN(Grinnell和Zhu，1994年;赫里克等。, 1996). FN可能是伤口愈合所必需的，这有几条证据：FN促进成纤维细胞存活(张等。, 1995;伊利克等。, 1998)，扩散(伦肖等。, 1997)以及通过三维细胞外基质（ECM）的迁移(格雷林和克拉克，1997年). 这些活动需要成纤维细胞在第十个FN III型重复序列中的Arg–Gly–Asp（RGD）序列连接到FN（参见图1a)通过细胞表面膜整合素受体(Ruoslahti，1991年). 在所有整合素中，α5β1介导与FN的最强结合以及成纤维细胞生存信号(张等。, 1995). 最佳α5β1结合活性需要一个协同位点，该位点包括第九个FN III型重复序列中的Pro-His-Ser-Arg-Asn序列(奥塔等。, 1994;雷迪克等。, 2000)以及第十个FN III型重复序列中的RGD肽(Pierschbacher和Ruoslahti，1987年). 因此，第九和第十个FN III型重复序列共同构成FN中心细胞结合结构域（CCBD）的关键核心(雷迪克等。, 2000;Feng和Mrksich，2004年). 虽然第九和第十个FN III型重复序列在表达为重组蛋白时构象不稳定(利特维诺维奇等。, 1998)，FN第九和第十一型III重复序列位于核心两侧，具有稳定性。

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血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）与完整的纤维连接蛋白（FN）、FN 70-kDa末端片段（FN70）和纤维连连接蛋白III型重复序列的相关性：FNIII1–11和FNIII8–v15

(一)人血浆FN示意图。FN I型重复序列显示为细矩形，FN II型重复序列为椭圆形，FN III型重复序列表示为大矩形。示意图上方和下方的括号显示了为PDGF-BB结合而分析的FN的大功能域。含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）的（箭头）FN中心细胞结合域（CCBD）（FNIII8–11)由FN两条链条之间的支架表示。V表示整个120-kDa FN可变域，也称为IIICS。(b–e类)完整的人血浆FN、FN70或扩展的III型重复结构域（FNIII1–11或FNIII8–v15)吸附在0.125µ的塑料组织培养皿中米，然后与125含1%BSA的DMEM中的I-放射性标记PDGF-BB在室温下保持90分钟。彻底清洗后，用γ计数器测定结合PDGF-BB的放射性。(b条)PDGF-BB与完整人血浆FN的相关性。(c（c）)PDGF-BB与FN70片段缺乏关联。(d日)PDGF-BB与FNIII的关联1–11. (e（电子）)PDGF-BB与FNIII的关联8–v15。数字代表至少三个独立实验。CPM，每分钟计数。

PDGF是包括成纤维细胞在内的多种间充质细胞类型的主要有丝分裂原和生存因子(Romashkova和Makarov，1999年). PDGF有五种亚型：经典PDGF-AA、AB和BB亚型，以及最近描述的PDGF-CC和PDGF-DD亚型(弗雷德里克松等。, 2004). 血小板（PDGF-AB）、巨噬细胞（PDGF-BB）和表皮细胞（PDGF-BB）在损伤反应中分泌最有效的亚型PDGF-AB和-BB。PDGFB基因敲除小鼠在胚胎上总是致命的，而其他亚型的丢失则不是致命的(Betsholtz，2004年).

在成纤维细胞中，FN和生长因子（GF）信号在局部接触水平汇聚(犁头等。, 1995)并且是共刺激的(宫本茂等。, 1996)促进细胞周期的进展(Assoian和Schwartz，2001年). 在这里，我们首次证明成纤维细胞的FN和PDGF-BB生存信号需要FN-GFBDs，并且我们绘制了操作位点。我们相信，这里描述的FN-GFBDs在促进和加速伤口愈合以及可能诱导组织再生的治疗中具有潜在用途。

结果

FN绑定PDGF-BB

当PDGF-BB与附着在SulfoLink珠上的还原FN单体孵育时，与人血浆FN相关（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）(图1b). 为了确定这种关联的位置，对从氨基末端到第十五个III型重复序列的人血浆FN分子的三个大片段进行了测试(图1a). PDGF-BB与FN 70-kDa末端片段（FN70）没有亲和力，FN70包括纤维蛋白和胶原/明胶结合域，对FN纤维生成至关重要(Mao和Schwarzbauer，2005年) (图1c). 相反，PDGF-BB与由FN-CCBD和FN III型重复序列（FNIII）的氨基或羧基末端三分之一组成的FN结构域相关1–11和FNIII8–v15) (图1d和e). 为了证实和扩大这些结果，如前所述，克隆并表达了额外的重组FN结构域(王等。, 2005)并通过等离子体表面共振测定离解常数（KDs）(图2,表1).

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血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）结合的纤维连接蛋白（FN）重组结构域，包括纤维连连接蛋白III型重复序列：FNIII1、FNIII13–14或纤维连接蛋白可变结构域（V）

PDGF-BB与FN结构域的实时相互作用由等离子表面共振（BiaCore 2000）测定。注射FN域（6.25–200 n米，30µl分钟−1)PDGF-BB与生物传感器芯片结合。未使用PDGF-BB的芯片电池作为参考。传感器图代表了三种不同的实验。分离常数（KDs）由动力学分离常数（kd）除以动力学缔合常数（ka）得出。RU，谐振单元。

表1

PDGF-BB与来自ka和kd的FN域相互作用的KDs

PDGF-BB公司
卡(米−1秒−1)		PDGF-BB公司
kd（秒）−1)		PDGF-BB公司
KD（n米)1		表皮生长因子
KD（n米)
第2页70国家广播公司2国家银行国家银行国家银行
rFNIII型1–11三3.0 × 1052.8 × 10−293国家银行
rFNIII型1–75.1 × 1054.2 × 10−282国家银行
rFNIII型1–27.6 × 1058.2 × 10−2108国家银行
rFNIII型13.5 × 1053.6 × 10−2103国家银行
FNIII公司2–114
（FN120）		国家银行国家银行国家银行国家银行
rFNIII型3–6国家广播公司国家银行国家银行国家银行
rFNIII型8–11国家银行国家银行国家银行国家银行
rFNIII型12–V1558.0 × 1052.3 × 10−229国家银行
rFNIII型12–154.5 × 1051.2 × 10−227国家银行
rFNIII型12–145.6 × 1052.7 × 10−248国家银行
rFNIII型13–144.5 × 1044.1 × 10−49国家银行
r伏52.9 × 1054.1 × 10−2141国家银行

缩写：FN，纤维连接蛋白；rFNIII，重组纤维连接蛋白III型重复序列；ka，动力学缔合常数；kd，动力学解离常数；KD，离解常数；血小板衍生生长因子-BB

1KD（n米)源自表面等离子共振测定。
2NBB，根据表面等离子共振测定，未观察到结合。
三rFNIII，如前所述产生的重组FN结构域(王等。, 2005).
4FNIII公司2–11通过QStar脉冲星I四极飞行时间质谱序列鉴定FN120碎片。
5rFNIII型12–V15，重组FN结构域，其中可变结构域（V）包含120个残基。

FN和rFNIII的PDGF-BB绑定8–V15不能被确定为高噪声的次级。

由等离子体表面共振测定，PDGF-BB结合的FN重组结构域包括FNIII1、FNIII13–14，或KD为103、9和141 n的整个FN可变域（V）米分别为(图2,表1). 相反，PDGF-BB没有结合FN120-FN的糜烂片段(金斯伯格等。, 1985)其包含通过QStar脉冲发生器（Applied Biosystems，Foster City，CA）四极飞行时间质谱测序FNIII确定的第二至第十一个FN III型重复3–6或FN-CCBD（FNIII8–11) (图2,表1). 重要的是，PDGF-BB结合在高达2.5米添加NaCl或当pH降至2时，表明静电荷对相互作用并不重要（数据未显示）。

FN-CCBD不足以维持FN-null细胞存活

FN由所有间充质细胞分泌并沉积在细胞周基质中(莫舍，1995年). 因此，有必要对小鼠FN-null成纤维细胞进行生存研究(萨翁切拉等。, 1999). 当这些细胞在没有血清或外源性GFs的情况下被贴在完整的FN上时，它们存活了5天，并在单次剂量为30 ng ml时增殖−1PDGF-BB公司(图3a). 相反，当将FN-null细胞贴在FN中央细胞结合域（FNIII）上时，FN-nul细胞在外源性PDGF-BB的存在下无法增殖甚至存活8–11)如前所述，与谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合以改善表面吸附(王等。, 2005). FNIII公司8–11未与GST融合，也无法支持FN-null细胞存活（数据未显示）。值得注意的是，CCBD的相邻结构及其氨基末端侧的所有III型重复序列（FNIII1–11)或所有III型重复序列位于其羧基末端（FNIII8–V15)支持的FN-null细胞存活和增殖相当于完整的FN(图3a). 增加GST-FNIII8–11在这些研究中，浓度增加到5倍后，3天的存活率略有提高(图3b)5天时不明显（未显示数据）。此外，FN120（FNIII2–11)也无法维持FN-null细胞存活(图3c). PDGF-BB的超生理浓度，高达300 ng ml−1比正常血清水平高10倍以上(Heldin和Westermark，1999年)在GST-FNIII上培养细胞时，未能提高存活率8–11(图3d). 内源性PDGF对这些结果的贡献似乎很小，如果有的话，因为FN-null细胞每10个细胞只产生0.34 ng PDGF-AA6细胞和0.28 ng PDGF-BB/106根据ELISA判断，细胞在48小时内存活。添加30 ng ml−1PDGF-BB在4、8和24小时重复(Jones和Kazlauskas，2001年)也未能提高生存率（数据未显示）。细胞存活率的差异不归因于不同的附着，因为附着在GST-FNIII上的FN-null细胞的数量不同8–11与附着在完整FN、FNIII上的细胞数量无明显区别1–11或FNIII8–v154小时后（数据未显示）。此外，根据共焦光谱判断，在缺乏PDGF-BB的情况下，FN-GFBDs不会与成纤维细胞表面膜相互作用（数据未显示）。

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表面结合完整纤维连接蛋白（FN）或生长因子结合域（GFBDs），与中央细胞结合域（FNIII）相邻排列8–11)支持FN-null成纤维细胞存活和对血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）的反应

将小鼠FN-null细胞以每孔10000个细胞的速度接种在48周的预涂组织培养板中(一)0.125µ米完整的FN、FNIII1–11、FNIII8–V15或谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的FNIII8–11; 或(b条)FN、FNIII完好无损1–11、FNIII8–V15或GST标记的FNIII8–11在指示的浓度下。细胞首先在DMEM中孵育4小时，然后用DMEM加1%BSA孵育30 ng ml或不加30 ng ml−137°C时的PDGF-BB。在所示时间，在三个复制孔中的每一个孔中目测五个×10区域中的活扩散细胞(一)或3天(b条)用于平均值±SD的量化（为清晰起见未显示，但<q平均值的10%，n个=15). 在4小时（基线）时，在以下所示的所有条件下，每个场观察到大约200个细胞一和b条。所有条件下的细胞在4小时和24小时时都能很好地扩散。面板内b条，预涂层浓度为0.125µ米用垂直虚线表示。(c（c）和d日)将FN缺失细胞如上所述接种在预涂0.125µ的孔中米完整的FN或GST标记的FNIII8–11或在给定浓度下使用FN120(c（c）)，在DMEM中培养4小时，然后用30 ng ml的PDGF-BB刺激−1(c（c）)或按指示剂量(d日)在37°C下持续3天。细胞活力c（c）量化为一和b条和中d日采用XTT法通过细胞线粒体代谢测定。外径，光密度。

因此，FN-null细胞在GST-FNIII上无法存活8–11即使在存在外源性PDGF-BB的情况下培养细胞，也可以在任何浓度下预先吸附。

初始传播和FA形成不需要FN-GFBD

此前，我们报告称GST标记的CCBD（FNIII8–11)不同于FNIII8–11使用成人皮肤成纤维细胞和小鼠FN-null细胞，在不含GST的情况下，其支持成纤维细胞扩散、肌动蛋白应激纤维组装和长达2小时的局灶性黏附（FA）形成的能力与完整的FN相似(王等。, 2005). 在此，我们将FN-null细胞对完整FN反应的观察时间从4小时延长到72小时，并将FN反应扩展到包括GST标记的中央细胞结合域（GST-FNIII）的FN域8–11)在FN-GFBD（FNIII）的背景下1–11或FNIII8–v15)对于相同的时间段。FN-GST-FNIII上电镀的全细胞8–11在4小时时，显示出与细胞贴附于FNIII时形成的形态相同的管状蛋白阳性FA和肌动蛋白应激纤维1–11或FNIII8–v15，尽管在完整的FN上传播参数总是最好的(图4a). 24小时时，所有表面上的FN-null细胞继续表现出良好的铺展性、管状蛋白阳性FA和肌动蛋白应激纤维(图4b). 这些细胞属性在GST-FNIII上的细胞中基本相同8–11、FNIII1–11，或FNIII8–v15虽然在完整FN上的细胞似乎比在重组FN结构域上的细胞具有更多更大的FA。48小时后，FN-null细胞在GST-FNIII上培养8–11与其他表面条件相比，其传播较少，并且表现出病毒阳性FA的缺失(图4c). 72小时后，FN-null细胞在GST-FNIII上培养8–11变得稀少了。虽然在许多培养物的显微镜下，FN-null细胞被镀在GST-FNIII上8–1172小时内没有细胞，图中显示的区域图4d选择用于存在多个细胞。这显然是不寻常的。仍附着在GST-FNIII上的少数细胞8–11涂层板呈圆形，含有碎裂的细胞核(图4d). 细胞接种在完整的FN、FNIII上1–11或FNIII8–v15在72小时时，大部分继续传播，并有蜂窝织炎阳性的FA和形成良好的肌动蛋白应激纤维。考虑到FN-null细胞在FNIII上均匀分布，具有良好的维酮阳性FA和肌动蛋白应力纤维至少24小时8–11出现了一个问题，即在FAs和FNIII保持扩散和附着能力丧失之前是否可以确定细胞异常8–11-涂层表面。

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纤维结合蛋白（FN）-空细胞在FN中心细胞结合域（FNIII）上扩散并形成局部接触8–11)类似于完整FN或FN-CCBD和FN-生长因子结合域（GFBDs）相邻阵列（FNIII）上的细胞1–11或FNIII8–v15)至少24小时

FN-null成纤维细胞在预先涂有0.125µ米完整FN或谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的FNIII8–11、FNIII1–11或FNIII8–v15在37°C的DMEM中放置4、24、48或72小时。在适当的培养时间后，按照材料和方法中的描述，固定细胞，使其渗透，并对其进行病毒素和肌动蛋白染色。(一)4小时前，FN全细胞在所有预涂层表面上形成了管状蛋白阳性的焦点接触（绿色）和肌动蛋白应力纤维（红色）。(b条)24小时时，所有细胞中都存在着文丘里阳性的局灶性接触和肌动蛋白应激纤维。(c（c）)48小时后，将FN-null细胞镀在GST-FNIII上8–11分布不太好，只有少数长春花蛋白阳性的局灶性接触，而完整FN、FNIII上的细胞1–11或FNIII8–v15保持良好的分布，有明显的肌动蛋白应力纤维和许多局部接触。(d日)72小时后，在涂有GST-FNIII的培养皿上培养FN-null细胞8–11已经变得稀少，剩下的大多是圆形的，几乎没有肌动蛋白束或局部接触的迹象，而完整FN、FNIII上的细胞1–11或FNIII8–v15继续传播，肌动蛋白应力纤维突出，局部接触。巴=20µm。

在缺乏FN-GFBDs的情况下，成纤维细胞会发生代谢停滞、自噬和凋亡

为了更好地理解FN-null细胞在没有FN-GFBDs的情况下死亡的原因，将细胞接种在GST-FNIII上8–11在存在或不存在外源性PDGF-BB的情况下，检测72小时内的代谢活性、自噬和凋亡。虽然在预涂GST-FNIII的培养板上培养的FN-null细胞在24小时时的细胞数几乎相同8–11以及在完整FN、FNIII上培养的细胞1–11，或FNIII8–V15，在GST-FNIII上培养的细胞8–11在缺乏外源性PDGF的情况下，任何时间点的代谢活性都没有增加，而在其他底物上培养的细胞却有增加(图5a). 尽管在所有条件下，通过添加PDGF-BB、GST-FNIII上的FN-null细胞，细胞的绝对代谢活性都增加了8–11与其他底物相比，代谢活性仍然相对较低。48小时后，PDGF处理的FN-null细胞在GST-FNIII上的代谢8–11在完整的FN上有30%的PDGF处理细胞。尽管大约三分之一的代谢减少可能归因于细胞数量的减少(图3a)，主要缺陷不能。由于PDGF-BB刺激的增殖需要一个初始信号事件，然后在6-8小时后发生第二个信号事件(Jones和Kazlauskas，2001年)，30纳克毫升−1在电镀后4小时添加PDGF-BB，并在电镀后10小时再次添加到GST-FNIII上的细胞中8–11然而，该操作并没有纠正PDGF-BB代谢反应不良，也没有提高FN-null细胞存活率（数据未显示）。重要的是，在任一FNIII上电镀细胞1–11或FNIII8–V15在缺乏和存在外源性PDGF-BB的情况下，其代谢活性与FN上的细胞基本相同(图5a).

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与FN中心细胞结合域（FNIII）相邻的表面结合纤维连接蛋白（FN）-生长因子结合域（GFBDs）8–11)即使在缺乏血小板衍生生长因子（PDGF）的情况下，也能阻止FN-null细胞的代谢停滞、自噬和凋亡

在预涂0.125µ的96孔板中，以每孔4000个细胞的速度培养FN缺失的成纤维细胞米完整FN或谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的FNIII8–11、FNIII1–11或FNIII8–v15在DMEM中培养4小时，然后与DMEM和1%BSA孵育，添加或不添加30 ng ml−1PDGF-BB在37°C下持续指定时间。(一)通过XTT分析判断4小时以上的代谢反应。(b条)采用ELISA法，用兔多克隆抗体检测自噬体的组成成分总细胞轻链3（LC3）(贾格尔等。, 2004). (c（c）)LC3-II是一种与自噬体结合的LC3翻译修饰产物，通过使用对LC3特异性的多克隆抗体进行的蛋白质印迹分析中的尺寸偏移来检测(Zhang等人，2007年). Alpha-actin在所有凝胶中都被检测为看家蛋白，并且在给定凝胶中的样品之间没有实质性差异。(d日)用TUNEL法检测DNA片段，在红色4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色细胞核的背景上出现亮黄色荧光斑点，从而确定细胞凋亡。通过计算DNA片段阳性的细胞数，除以总细胞数，再乘以100来确定凋亡百分比。在三个复制板中，每个板中都计数了50个细胞。数据点表示平均值±SD。在面板中一和b条，每个数据点一式四份，每个面板代表至少三个不同的实验。面板中的西方印记c（c）是两个不同实验的代表。外径，光密度。

GST-FNIII上培养的As FN-null细胞8–11在基础培养基（DMEM）中缺乏代谢活性，对PDGF-BB的代谢反应较差，我们检测了在这些条件下FN-null细胞是否出现自噬增加的迹象，自噬是一种在细胞应激（如营养或GF剥夺）期间增加的稳态自吞噬过程(Gozuacik和Kimchi，2007年). 事实上，在GST-FNIII上培养的FN-null细胞8–11通过ELISA检测细胞总轻链3（LC3-I加LC3-II）（自噬体形成的标志物）判断，即使在PDGF-BB存在的情况下，自噬也会增加4小时(卡贝亚等。, 2000;贾格尔等。, 2004) (图5b). 无论是否在4小时添加PDGF-BB，总LC3在24小时达到峰值。相比之下，FN、FNIII上的细胞1–11或FNIII8–V15在24小时时，LC3的累积量明显减少，在所有时间点的累积量显著减少。在后一种情况下观察到的LC3表达水平相对较低，这是因为自噬是一种促进体内平衡过程（如蛋白质降解和细胞器更新）的生理现象(Gozuacik和Kimchi，2007年). 最后，蛋白质印迹显示LC3-II增加，LC3-I是一种与磷脂酰乙醇胺结合并与吞噬体结合的裂解LC3-I产物(卡贝亚等。, 2000,2004)，在FNIII上的细胞中8–1124小时(图5c).

到48小时，FNIII上大量的FN无效细胞8–11正在发生凋亡（29±3.2%无PDGF，22±2.5%有PDGF）(图5d)根据TUNEL分析判断。显然，在GST-标记的FNIII上培养的细胞8–112天或更长时间对外源性PDGF-BB从细胞凋亡中拯救无效。

FN-null细胞存活需要至少一个FN-GFBD

为了确定FN-null细胞的存活和对PDGF的反应是否需要相邻的FN-CCBD和-GFBDs，将FN-nul细胞镀在预先涂有0.125µ米GST标记的FNIII8–11带或不带0.125µ米GST标记的FN-GFBDs。4小时后将DMEM改为DMEM+1%BSA±PDGF-BB，然后培养3天。当FN-null细胞在GST-标记的FNIII上培养时，在PDGF-BB的存在下存活8–11具有PDGF-BB结合活性的GST标记的FN域，即FNIII1–7、FNIII1–2、FNIII1、FNIII12–V15、FNIII12–15或V，但在FNIII上没有存活8–11单独或在FNIII上8–11和FNIII3–6，一个没有PDGF-binding活动的域(图6a). FNIII的表面密度3–6根据ELISA判断，塑料皿上的吸附量与FN-GFBDs相同或更高（数据未显示）。因此，FNIII的负面结果3–6不是由于表面吸附性差。因此，对PDGF的FN-null细胞存活反应不需要相邻的FN-CCBD和-GFBDs。然而，在缺乏PDGF-BB的情况下，FN-CCBD（FNIII）非相邻阵列上的FN-null细胞8–11)尽管这些细胞在FN-CCBD和-GFBD（FNIII1–11或FNIII8–V15) (图3a). 重要的是，不同FN结构域上的FN-null细胞对外源性PDGF-BB的不同反应并不是次要的，这是根据电镀后4小时的细胞计数判断的细胞附着差异（数据未显示）。

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表面结合纤维连接蛋白（FN）-生长因子结合域（GFBDs）与FN中心细胞结合域（FNIII）呈非连续阵列8–11)支持FN缺失的成纤维细胞对血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）的反应

FN-null成纤维细胞以每孔4000个细胞的速度在预先涂有0.125µ米完整的FN或谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的FN结构域在DMEM中培养4小时，然后与DMEM和1%牛血清白蛋白孵育，添加或不添加30 ng ml−1PDGF-BB在37°C下持续指定时间。(一)通过XTT分析判断存活率。(b条)通过ELISA检测轻链3（LC3）判断自噬。(c（c）)TUNEL分析测定的细胞凋亡。通过计算DNA片段阳性的细胞数，除以总细胞数，再乘以100来确定凋亡百分比。在三个复制板中对50个细胞进行计数。数据点表示平均值±SD。这些面板中显示的数据至少代表了三个不同的实验。所有重组FN结构域都带有GST标记，但为了简洁起见，这里省略了前缀。外径，光密度。

上述发现促使我们调查FN-GFBDs与FNIII的非相邻阵列8–11需要PDGF来防止FN-null细胞的自噬和凋亡。GST-FNIII上的FN-null细胞8–11单独或在GST-FNIII的非相邻阵列上8–11和GST-FNIII3–6，表明自噬标记物LC3的水平增加了4小时，在存在或不存在外源性PDGF-BB的情况下，在24小时时进一步增加，然后在48小时后恢复到4小时的水平(图6b、实线、闭合圆和正方形（分别与开放圆或正方形进行比较）。相反，GST-GFBDs和GST-FNIII非相邻阵列上的细胞8–11在外源性PDGF-BB存在的情况下，在4到72小时内显示很少或没有LC3(图5c，虚线，闭合符号），尽管在没有PDGF-BB的情况下观察到LC3适度增加，在24小时达到峰值(图6b、虚线、开放符号）。与中的数据一致图5b，无论是否存在PDGF-BB，完整FN上的细胞均显示基本水平的自噬(图6b、实线、闭合三角形和开放三角形）。

GST-FNIII上的FN-null细胞8–11仅在3天内细胞凋亡增加（3天时为30%）(图6c，实线，开环）和外源性PDGF-BB对此保护较弱（3天时为25%）(图6c、实线、闭合圆）。在缺乏PDGF-BB的情况下，GST-FNIII非相邻阵列上的FN-null细胞8–11GST和GFBDs显示较少的细胞凋亡(图6c、虚线、开放圆和三角形）。然而，更引人注目的是，GST-FNIII非连续阵列上的FN-null细胞具有抗凋亡的保护作用8–11和带有外源性PDGF-BB（FNIII）的GST-GF-binding结构域1–2, 15%; FNIII公司13–14第3天分别为14%）(图6c、虚线、闭合圆和三角形）。

PDGF-BB预载表面结合FN-GFBD支持FN-null成纤维细胞存活

PDGF-BB在GST-标记FNIII培养基支持的FN-null成纤维细胞存活中的作用8–11和FN-GFBD，即FNIII1–7、FNIII1–2、FNIII1、FNIII12–V15、FNIII12–15，或V，但不在FNIII上8–11单独使用，也不使用FNIII8–11和FNIII3–6，培养3天后(图7a). 重要的是，PDGF-BB在FNIII上预载培养3天后也支持FN-null成纤维细胞存活8–11和FN-GFBDs，但在FNIII上预培养时没有8–11单独使用，也不使用FNIII8–11和FNIII3–6(图7b).

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表面结合纤维连接蛋白（FN）-生长因子结合域（GFBDs）支持FN-成纤维细胞对血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）的完全反应性，无论PDGF-BB是否存在于培养基中或预载于FN-GFBD上

FN-null成纤维细胞以每孔4000个细胞的速度在预先涂有0.125µ米完整的FN或谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的FN结构域在DMEM中培养4小时，然后在以下条件下在37°C的DMEM内培养3天。(一)在培养3天期间，培养基中存在PDGF-BB，然后对细胞进行计数。(b条)PDGF-BB预载于FN域涂层培养皿上2小时，洗涤10次，按上述方法培养细胞，然后计数。在四个孔中的每个孔中对三个×10区域中的细胞进行计数（平均值±SD，n个= 12).

完整的FN和FN GFBD必须表面结合，以支持FN无效细胞存活并促进PDGF-BB反应

为了确定FN-GFBD活性是否需要其存在于表面，我们研究了与FN-CCBD（FNIII）相邻的完整FN或重组FN-GFDD1–11或FNIII8–v15)当添加到溶液中培养物（DMEM）中时，可以支持FN-null细胞存活和/或促进PDGF-BB反应。FN-null细胞接种于GST-FNIII后4小时8–11-包被孔，用完整的FN、FNIII处理细胞1–11或FNIII8–v15在DMEM中加入或不加入30µg ml−1PDGF-BB。所有这些条件都不能促进FNIII培养的FN-null细胞的存活8–11持续3天(图8a). 作为对照，将FN-null细胞接种在完整的FN、FNIII上1–11或FNIII8–v15并且4小时后暴露于DMEM中的外源性PDGF-BB或单独的新鲜DMEM。FN-null细胞在没有PDGF-BB的情况下在这些表面上存活并在其存在下增殖(图8a)与中显示的结果一致图3a和b同样，添加到DMEM（溶液）中的较短的重组GST-GFBDs（含或不含PDGF-BB）未能促进FNIII上FN-null细胞的存活8–11持续3天(图8b).

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纤维连接蛋白（FN）-对血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）无反应的成纤维细胞需要表面结合的FN或FN-生长因子结合域（GFBDs）

(一)FN-null成纤维细胞以每孔10000个细胞的速度在预涂有0.125µ米完整FN或谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的纤维连接蛋白III型重复序列（FNIII8–11)、FNIII1–11或FNIII8–V15，在DMEM中培养4小时，然后与1%的牛血清白蛋白一起在含有或不含30 ng ml的DMEM内培养−1PDGF-BB±0.125µ米溶液中FN或FN区域完整，如37°C所示，持续3天。按照平均值±标准偏差所示的时间，在三个孔中的每个孔中目测五个×10区域中的细胞数(n个=15). (b条)FN-null成纤维细胞以每孔4000个细胞的速度在预先涂有0.125µ米完整的FN或GST-FNIII8–11在DMEM中培养4小时，然后与DMEM和1%BSA孵育，添加或不添加30 ng ml−1PDGF-BB±0.125µ米GST标记的FN结构域在37°C的溶液中显示3天。细胞按上述方法计数。(c（c）)FN-null细胞以每孔4000个细胞的速度在预先涂有0.125µ米完整的FN或GST-FNIII8–11在4小时时将培养基更换为DMEM和1%BSA，添加或不添加30 ng ml−1PDGF-BB±0.125µ米如图所示，GST在微球上标记FN结构域，然后将培养物在37°C下培养3天。通过XTT试验测定存活率。(d日)FN-null细胞以每孔4000个细胞的速度在预先涂有0.125µ米完整的FN或I型胶原。在4小时时将培养基更换为DMEM和1%BSA，添加或不添加30 ng ml−1PDGF-BB±0.125µ米如图所示，GST在微球上标记FN结构域，然后将培养物在37°C下培养3天。通过XTT试验测定存活率。(e（电子）)FN-null细胞以每孔4000个细胞的速度在预先涂有0.125µ米完整的FN或I型胶原。在4小时时将培养基更换为DMEM和1%BSA，添加或不添加30 ng ml−1PDGF-BB±0.125µ米如图所示，GST标记溶液中的FN结构域，然后在37°C下培养3天。通过XTT试验测定存活率。(（f）)FN-null成纤维细胞以每孔4000个细胞的速度在预先涂有0.125µ米完整的FN在DMEM中培养4小时，然后与DMEM和1%BSA孵育，有或没有完整的FN、GST-FNIII1–2或GST-FNIII3–6溶液中，浓度为30 ng ml或不含30 ng ml−1PDGF-BB在37°C下放置3天。用XTT法测定存活率。为清晰起见，此处未显示SD，但小于平均值的10%(n个= 4). 开杆=仅DMEM。闭合棒=DMEM加上30 ng ml−1PDGF-BB.外径，光密度。

接下来，我们研究了添加到培养基中的珠状物表面的FN-GFBDs是否能够支持FNIII上的FN-null细胞的活性8–11对于这些实验，0.125µ米cys标记的FNIII1–2或FNIII12–15有或没有cys-tagged FNIII8–11如材料和方法中所述，与琼脂糖珠相连。令人惊讶的是，在FNIII存在或不存在的情况下，珠结合的重组FN GFBDs8–11尽管与FNIII一起使用时，同样的FN-GFDB未能促进FN-null细胞的活性8–11预涂板确实支持细胞活力(图8c). 然而，可能FN-CCBD（FNIII）的细胞表面受体数量不足8–11)可在FNIII上的细胞上表面获得8–11也就是说，所有这些受体可能已经与FNIII连接8–11在盘子上。为了检验这种可能性是否正确，将FN-null细胞镀在预先涂有I型胶原的组织培养孔中，然后在PDGF的存在下孵育，无论是否有涂有FNIII的微球8–11单独使用，GFBD（FNIII1–2或FNIII12–15)单独或FNIII组合8–11加上FNIII1–2或FNIII12–15(图8d). 当FNIII8–11和FN-GFBD（或FNIII1–2或FNIII12–15)在同一个珠子上，FN-null细胞在外源性PDGF-BB的存在下保持活性。如果珠子只预先包被一个结构域，即使存在PDGF-BB，细胞也会死亡。重要的是，如果两组珠子，一组预先包被FNIII，FN-null细胞也无法在胶原蛋白上存活8–11和另一组预涂FNIII1–2或FNIII12–15，同时添加到单元格(图8d). 给定中的数据图8d，毫不奇怪，FN-null细胞培养在预涂有I型胶原的平板上，当FNIII8–11和GFBD（FNIII1–2或FNIII12–15)在溶液中单独或一起添加到培养基中(图8e). 这些发现不仅仅是流体相FN或FN-GFBDs抑制培养细胞上外源性PDGF-BB活性的次要结果，因为在使用完整FN的超生理浓度之前，无论培养基中是否存在FN或F-GFBDs，表面结合完整FN上的FN-null细胞对PDGF-BB的反应都类似(图8f).

讨论

在这里，首次发现CCBD两侧的FN域与PDGF-BB结合，KDs介于10到100 n之间米FN-CCBD和FN-GFBD一起被证明对于FN无效细胞的存活是必要和充分的，并且当相邻时，对于FN无效细胞的增殖也是必要和充分的。此外，细胞存活活性要求FN-CCBD和FN-GFBD位于同一表面上。

FN和成纤维细胞存活

以前的研究表明，为了生存，一些间充质细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞，需要整合素α5β1与FN结合(张等。, 1995)通过推断，分别在FN的第九和第十个III型重复序列中连接Pro-His–Ser–Arg–Asn和RGD结合位点(潘科夫和山田，2002年). 因此，最初令人惊讶的是，FN-CCBD（FNIII8–11)不支持FN-null细胞存活。更令人惊讶的是，外源性PDGF-BB不能拯救FNIII培养的FN-null细胞8–11PDGF-BB是成纤维细胞的重要生存因子(法兰克等。, 1997;Romashkova和Makarov，1999年). FN-null细胞存活和对外源性PDGF的反应需要表面结合的FN-GFBDs，这表明FN和PDGF-BB与适当的成纤维细胞表面受体的密切相互作用可能是产生适当生存信号的必要条件(图9).

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拟议的间充质细胞-细胞外基质（ECM）突触

跨膜α5β1整合素与纤维连接蛋白（FN）中央细胞结合域（纤维连连接蛋白III型重复序列（FNIII）结合8–11)并且两侧是血小板衍生生长因子（PDGF）受体和假定的生长因子x受体（GFxR），它们结合各自的配体，这些配体又结合到FN的两个GF结合位点，本文中由FNIII的羧基末端部分任意表示1和FNIII13PDGF-BB，血小板衍生生长因子-BB；血小板衍生生长因子受体。

虽然已知整合素和GFs对成纤维细胞具有协同刺激作用(犁头等。, 1995;宫本茂等。, 1996)之前没有报道过成纤维细胞存活需要FN和PDGF-BB或其他GF的协同作用。进一步考虑，间充质细胞存活需要FN与整合素的协同作用，PDGF-BB与PDGF受体的近距离协同作用，这与通过相同纳米空间中的免疫突触和协同刺激对刺激T细胞多维信号网络的概念并无不同(曾和达斯汀，2002年). 由于信号转导途径通常在细胞内受到严格的固态控制(Saltiel和Pessin，2002年)细胞外信号的发起者可能受到同样的空间控制，而不是简单扩散的结果。未来的研究需要使用免疫细胞学技术，如荧光共振能量转移分析，以确定FN-CCBD及其配体α5β1与PDGD-β受体及其配体PDGF-BB的接近程度是否在纳米空间水平。

这里提供的数据清楚地表明，除了FN-CCBD之外，FN-GFBD(伦肖等。, 1997)FN-null细胞存活所需的。然而，FNIII上的FN-null细胞8–11能够并且确实对外源性PDGF-BB产生反应，尽管次优，如代谢增加和自噬减少所示。在本文未显示的初步研究中，当FN-null细胞在FN-CCBD（FNIII）上培养时，PDGF-β受体对PDGF-BB产生低磷酸化反应8–11)无FN-GFBD。FN-GFBD对FN-null细胞存活或PDGF-BB反应性的依赖性进一步受到FN-GFDD表面结合要求的限制。

虽然FN-GFBD在非连续阵列中与FNIII8–11需要外源性PDGF-BB来维持其生存活动，FNIII的连续阵列8–11并且FN GFBDs不需要PDGF-BB的存在来促进存活。然而，在后一种情况下，PDGF-BB诱导了生长反应，而在前一种情况中则没有。PDGF-BB反应性的这些差异水平不仅仅是PDGF-BB信号两个不同阶段需要的一种表现(Jones和Kazlauskas，2001年)，以30纳克毫升计−14小时和10小时向FNIII上的细胞添加PDGF-BB8–11不能纠正PDGF-BB的不良代谢反应，也不能提高FN-null细胞的存活率。因此，FN-null细胞对PDGF-BB的反应是表面结合FN结构域（FNIII）的梯度函数8–11<FNIII的非连续阵列8–11和FN GFBDs<FNIII的连续阵列8–11和FN-GFBD）。外源性PDGF-BB可部分保护FN-CCBD（FNIII）上的FN-null细胞8–11)抗细胞溶解和自噬，促进弱代谢反应；然而，这些细胞最终发生了凋亡。当FN-null细胞培养在非相邻的FNIII阵列上时8–11和FN GFBDs，外源性PDGF-BB对细胞裂解和自噬具有更大的保护作用，并促进更强的代谢反应。更重要的是，可能因此，FNIII非相邻阵列上的FN-null细胞8–11FN-GFBDs对PDGF-BB有反应，生存率增加，凋亡减少。最后，当FN-null细胞在完整的FN或相邻的FNIII阵列上培养时8–11和FN-GFBDs，它们在没有PDGF-BB的情况下存活并在PDGF-BB存在时增殖。这些发现表明，在较大的重组FN多肽中存在GF依赖性生存序列，或者可能装载微小但战略性定位的内源性PDGF，可以发生在FN细胞和GF结合域的相邻阵列上，但不能发生在这些域的非相邻阵列上。

FN和成纤维细胞FA的形成

先前的研究表明，FN-CCBD不足以形成FA，而主要肝素结合域（HepII）促进FA的形成(伍兹等。, 1986;摩根等。, 2007)以依赖RhoA的方式(雷德利和霍尔，1992年;任等。, 1999). 然而，最近我们证明，通过增加CCBD（FNIII）的表面密度，可以克服形成FA的HepII要求8–11) (王等。, 2005). 这是由GST-标记FNIII完成的8–11大大提高了重组蛋白的表面吸附。当在GST-FNIII上电镀时8–11正常人皮肤成纤维细胞和FN-null细胞以与完整人血浆FN上的细胞无法区分的方式附着、扩散并形成FA长达2小时(王等。, 2005). 在这里，我们将这些观察结果扩展到了3天。4小时时，FN-null细胞在GST-FNIII上形成FA8–11与完整的人血浆FN上的细胞仍无法区分。24小时，GST-FNIII上的FA形成8–11很明显，尽管不如完整FN上的坚固。重组FNIII上FA的形成1–11和FNIII8–v15，包括FN GFBD，看起来与GST-FNII上的FA形成相似8–11独自一人。然而，48小时后，GST-FNIII上FN-null细胞FA的形成8–11FN-null细胞中的FA在完整的FN或重组FNIII上沉积1–11或FNIII8–v15，持续。这并不奇怪，因为FA依赖于RhoA的激活(王等。, 2005)与Rac1和Cdc42不同，它对GTP和ATP消耗非常敏感(哈雷特等。, 2003)和培养在GST-FNIII上的FN-null细胞8–11表现出代谢障碍。

FN和成纤维细胞代谢和自噬

细胞需要不断提供可氧化的营养物质才能生存。多细胞生物中的细胞通过两个基本机制满足了这一需求(勒姆等。, 2005). GF刺激诱导葡萄糖和氨基酸的摄取，以支持ATP的生成和生物合成。如果这样做失败，细胞会降低其生物合成需求，但仍需要足够的营养来支持基本功能，如粘附和生存。为了维持自身，这些细胞开始降解细胞内分子。这种分解代谢降解的一种极端形式是自噬，即细胞将大分子和细胞器隔离到酸性液泡中进行大量消化的过程。这些空泡或自噬体是由细胞成分被包裹在其周围形成的双层膜结构中，然后与溶酶体融合而形成的。参与自噬小体形成的分子过程从酵母到人在进化上是保守的，并且需要在双层膜膨胀和吞噬细胞成分时有计划地向双层膜补充特定蛋白质和脂蛋白(谢和克林斯基，2007年). 如果自噬不能满足细胞对营养物质的需要，那么自噬可能会导致细胞凋亡(吉森，2007). 这是第一份证明GF刺激代谢需要表面结合FN的报告。此外，这种活性可归因于FN-GFBDs，它可以阻止自噬诱导和随后的凋亡。

多个FN-GFBD

鉴于FN-GFBDs对成纤维细胞存活的明显重要性，可能存在多个FN-GFDDs是合理的。然而，冗余结合位点的可能性提出了其显式分子定位和序列模式可能相似的问题。事实上，使用生物信息学筛选技术来搜索这种模式，我们在FNIII中发现了两个肽1，FNIII内有一个肽13和V中的一个肽具有类似的序列模式，并将具有类似KD的PDGF-BB与它们的父结构域结合。对这些位点的完整解释、PDGF-BB结合活性及其生物活性是我们实验室当前的重点。

GF与FN和其他ECM分子的结合

PDGF-BB是由FN直接或间接绑定和保留的数量不断增加的GF之一。直接结合FN的GFs包括VEGF(维杰拉茨等。, 2002,2004,2006)，肝细胞生长因子(拉赫曼等。, 2005)，肿瘤坏死因子-α(阿龙等。, 1994)和结缔组织生长因子(Yoshida和Munakata，2007年). 那些通过IGF结合蛋白间接结合的包括IGF(Gui和Murphy，2001年)和通过潜在转化生长因子-β结合蛋白-1转化生长因子β(达拉斯等。, 2005). 因为FN是临时伤口矩阵的关键组成部分(韦尔奇等。, 1990)，其结合和定位GFs的能力有助于其在修复和再生过程中充当生物活性的重要调节剂。尽管这些先前的研究表明，与FN结合的GF保持活性，但GF–FN相互作用以前没有被证明是细胞生存所必需的。

如前所述，GFs还可以与FN以外的ECM分子结合(马克里等。, 2007). 纤维蛋白（原）、硫酸乙酰肝素、decorin、FN和玻璃体凝集素只是位于临时基质和/或ECM中的许多分子中的一小部分，这些分子可以结合和调节各种GFs的活性。然而，任何这些GF与ECM分子的结合以前都没有被证明对细胞生存至关重要(马克里等。, 2007).

结论

在这里，我们首次证明了FN-GFBDs对成纤维细胞存活至关重要，并且是对PDGF-BB的成纤维细胞增殖反应所必需的。此外，我们发现FN-CCBD（FNIII8–11)FN-GFBDs必须贴在同一表面，以促进细胞在外源性PDGF-BB存在下的存活。细胞存活和对PDGF的反应需要与FN-CCBD相邻的表面结合的FN-GFBD，这表明FN和PDGF-BB与适当的细胞表面受体的密切相互作用可能是产生适当生存信号的必要条件(图9). 事实上，FN在无法愈合的慢性伤口和烧伤中的缺失(Grinnell和Zhu，1994年;赫里克等。, 1996)这可能是它们无法治愈和/或显示渐进性组织破坏的原因。虽然FN本身对蛋白水解消化非常敏感，但其功能域对这种降解相对抵抗(山田和克拉克，1996年;潘科夫和山田，2002年). 因此，由成纤维细胞生存和生长所必需和足够的FN结构域以及与其相连的相对蛋白水解抗性基质组成的组织工程构建物可能对慢性不愈合伤口、大到无法闭合的急性伤口或大面积烧伤大有益处(克拉克，2008b). 此外，这些发现对我们进一步了解细胞与基质的相互作用很重要，也就是说，也许FN信号除了由整合素受体结合直接产生外，还通过其将GF定位于基质并同时触发GF介导的信号间接介导。

材料和方法

材料

重组PDGF-BB来自Biosource（加利福尼亚州卡马里洛）125I-PDGF-BB来自Amersham Biosciences（新泽西州皮斯卡塔韦）。通过SDS-PAGE检测，购自Chemicon（Temecula，CA）的人血浆FN纯度为99%且完整。FN片段（70kDa）和DMEM从Sigma（密苏里州圣路易斯）获得。SulfoLink偶联凝胶来自Pierce。无脂肪酸BSA购自ICN Biomedicals（俄亥俄州奥罗拉）。Ni-NTA琼脂糖珠是从奇亚根（加利福尼亚州巴伦西亚）获得的。异丙基-β-d日-硫代吡喃半乳糖苷和L-肉汤购自Fisher Scientific（新泽西州Fair Lawn），胎牛血清购自Hyclone（犹他州Logan）。培养板来自BD Bioscience（Billerica，MA）。细胞增殖试剂盒II（XTT）和现场细胞死亡检测试剂盒（TUNEL反应混合物）来自罗氏诊断公司（印第安纳波利斯）。BIAcore 2000、CM5传感器芯片、N-羟基琥珀酰亚胺、，N个-乙基-N个′-（3-二乙基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和1米乙醇胺（pH 8.5）购自BIAcore（新泽西州皮斯卡塔韦）。在石溪大学蛋白质组学中心使用BIAcore 2000进行了表面等离子体共振实验。小鼠单克隆抗病毒抗体（V9131）购自Sigma。俄勒冈州格林488山羊抗鼠IgG（H+L）(O11033号机组)从Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）的Molecular Probes获得了Alexa Fluor 488阴茎倍体蛋白和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。

FN功能域的表达与纯化

重组人FN结构域的克隆、表达和纯化方法以及FN结构域与GST的融合产物已发表(王等。, 2005). 重组蛋白氨基末端的GST标记促进了FN结构域在组织培养塑料上的吸附，用于细胞功能研究。我们之前还描述了cys标记FN结构域的克隆、表达和纯化(高希等。, 2006). Cys标记的FN结构域允许连接到SulfoLink琼脂糖珠，对蛋白质构象的影响最小。简言之，FN结构域是通过PCR以人类cDNA克隆pFH1、pFH111和pFH154（ATCC）为模板或通过亚克隆上述质粒的限制性内切酶片段而生成的。FN结构域在pETCH中克隆，pETCH是一种改良的pCal-n载体（Stratagene，La Jolla，CA），带有或不带有羧基末端半胱氨酸的羧基末端六组氨酸亲和标记，以及带有或不带氨基末端GST标记。插入件在巴姆HI和后面的III位点，并通过DNA测序确认，以排除PCR期间可能的合成错误。在BL21DE3LysS菌株中诱导蛋白质表达大肠杆菌通过增加0.5 m米异丙基-β-d日-硫代吡喃半乳糖苷和亲和力用Ni-NTA琼脂糖珠纯化。用含有300 m的缓冲液洗脱后米咪唑和200 m米NaCl，蛋白质在磷酸盐缓冲盐（PBS）存在下通过Sephadex G25柱（瑞典乌普萨拉Amersham Pharmacia Biotech AB）脱盐。在含有FN可变结构域的重组构建物中，包含了所有120个残基（V120）。

PDGF-BB与FN或FN结构域的平衡结合

根据制造商的方案（SulfoLink偶联凝胶；Pierce），FN结构域通过-SH基团与琼脂糖珠结合。为了阻止非特异性结合，将带有或不带有FN或FN结构域的琼脂糖珠与2%的BSA在室温下孵育2小时。为了平衡结合，用不同浓度的125在室温下，在100µl结合缓冲液（DMEM+1%BSA）中加入I标记的PDGF-BB，并旋转2小时。然后用PBS将珠子清洗六次，并使用γ计数器对与琼脂糖珠子结合的放射性进行定量。使用Prism 4非线性回归软件（GraphPad，加州圣地亚哥）测定PDGF-BB与FN或FN结构域的结合常数。

PDGF-BB在传感器芯片上的固定化

使用标准胺偶联程序和5µl min的流速将PDGF-BB偶联到CM5传感器芯片表面−1.连续注射包括0.05米 N个-羟基琥珀酰亚胺和0.2米 N个-乙基-N个′-（3-二乙基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐混合物（10µl），然后是PDGF-BB−1)10米米乙酸（pH 4.0），直到达到所需量的偶联PDGF。0.1的溶液米然后使用乙醇胺HCl（35µl，pH8.5）封闭剩余的活化羧基。使用右旋糖酐涂层芯片作为对照。

PDGF-BB与FN结构域的动力学结合分析

在BIAcore 2000系统中，等离子体共振系统确定实时蛋白质-蛋白质相互作用，从而确定k个远离的和k个在其比值为KD。通过将不同浓度的FN功能域（分析物）溶解在20m米Hepes，150米米氯化钠，3.4米米EDTA和0.05%吐温-20，pH 7.4，在与PDGF耦合的芯片表面。所有动力学实验均在20°C下以30µl min的流速进行−1对于质量传输实验，以固定浓度注入每个分析物，并以5至75µl min的流速运行−1将所有分析物注入PDGF偶联表面和对照表面120秒，然后在流动缓冲液中分离300秒。通过0.05%十二烷基硫酸钠的一次脉冲（30秒）完成传感器芯片的再生，以进行后续注射。

动力学结合分析的数据准备和分析

使用BIAcore手册，使用非线性最小二乘分析和微分速率方程的数值积分，编制传感器图并进行全局拟合。简单地说，从相应的实验传感器图中减去使用控制表面生成的每个传感器图，并使用注入物种的分子质量将所得曲线转换为浓度单位，即每1纳克毫米1000个共振单位的当量−2和100 nm的基体厚度。然后使用BIA评估软件（GE Healthcare Bio-Science Biacore，Piscataway，NJ）中提供的动力学模型对每个数据集进行分析，这些数据集由相同表面类型上不同浓度分析物注射的一系列感测图组成。

细胞培养

前面描述了小鼠FN-null成纤维细胞的生成(萨翁切拉等。, 1999). 细胞保存在补充100 Uml的DMEM中−1青霉素，100µg ml−1链霉素和10%胎牛血清（37°C和5%CO）2/95%的空气在加湿的大气中。对于细胞功能分析，FN-null细胞生长到约80%的汇合处，收获并离心，以获得一个用DMEM冲洗一次的颗粒。在DMEM中重新悬浮后，对细胞进行计数，并将适当数量的细胞转移到组织培养板上进行给定的分析。

细胞存活分析

在涂有0.125µ米FN、其他ECM蛋白或PBS中FN结构域在室温下过夜(王等。, 2005). 在室温下用2%的BSA封闭2小时以排除进一步的蛋白质结合后，用PBS清洗平板三次。对于每个48孔或96孔平板，分别在DMEM中接种10000或4000个FN-null细胞，并在37°C下培养4小时。然后，将最终浓度为1%的BSA添加到每个孔中，无论是否有PDGF-BB或FN结构域，并对这些孔进行不同时间段的培养。通过计数细胞和使用XTT分析测定细胞线粒体代谢来测量细胞存活率（Roche Diagnostics）。

FN-全细胞内源性PDGF

为了确定FN-null细胞是否产生和分泌大量PDGF-AA或PDGF-BB，使用抗小鼠PDGF-AA和抗小鼠PDGF-BB抗体（加州圣克鲁斯圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology），通过ELISA测定FN-nul细胞裂解物和细胞培养基中这些GFs的水平。PDGF-AA和PDGF-BB的检测限均为0.1 ng ml−1.测定细胞PDGF-AA和PDGF-BB，1×106将每毫升FN缺失细胞的细胞溶解在含有1%Triton X-100、0.1%SDS、1%BSA和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。通过离心去除微粒后，用ELISA检测上清液。结果表明，在无血清DMEM中培养48小时的细胞裂解液中，每10个细胞含有0.34纳克6PDGF-AA细胞和0.28 ng/106PDGF-BB细胞。在此期间，可忽略的PDGF-AA和PDGF-BB在培养基中积累。

标记法

凋亡细胞通过使用镍标记进行鉴定现场细胞死亡检测试剂盒和TMR红色符合制造商协议。简单地说，八个细胞培养室涂有0.125µ米PBS中FN或FN结构域在室温下过夜。然后用2%BSA封闭室2小时，然后用PBS三次洗涤。对于每个孔，将8000个FN缺失细胞接种在DMEM中，并在37°C下孵育4小时，然后在存在或不存在30ng/ml的情况下将BSA添加到1%的最终浓度−1PDGF-BB，除非另有规定。在各种培养结束时，用4%多聚甲醛固定细胞，用0.1%Triton X-100渗透，用TUNEL反应混合物探测，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚对细胞核进行复染。使用CCD相机和Metamorph软件（加利福尼亚州桑尼维尔MDS分析技术公司分子器件），在倒置的Diaphot-TMD尼康（尼康，梅尔维尔，纽约）荧光显微镜上，用一个20×孔径0.4物镜在PBS中对标本进行成像。

自噬体蛋白LC3的分析

总LC3的检测遵循制造商的Superarray（马里兰州弗雷德里克）细胞激活信号ELISA（CASE）试剂盒协议。所有试剂均来自Superarray CASE试剂盒，但多克隆抗LC3抗体除外，该抗体购自Santa Cruz Biotechnology。

对于LC3I和LC3II的western blot，收集细胞并在10 m米Tris缓冲液，pH 8.0，含1%Triton X-100，0.1%SDS，140 m米氯化钠，1%醋酸钠，10µg ml−1leupeptin，10µg ml−1抑肽酶和0.1 m米苯甲基磺酰氟。通过低速离心去除细胞核。对核后部分蛋白/车道（10µg）进行15%SDS-PAGE。将分离的蛋白质转移到硝化纤维素膜上，用5%（w/v）干乳封闭，并在4°C下与LC3（Novus Biologicals，Littleton，CO）特异性初级多克隆抗体孵育过夜。清洗后，用过氧化物酶标记的二级抗兔IgG抗体孵育斑点。通过化学发光开发印迹，并使用Chemiimager 4400系统（Imgen Technologies，Alexandria，VA）收集图像。

细胞染色和成像

使用0.125µ预涂八个35-mm-well板（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ）表面米FN或FN域，在室温下保持过夜，然后在室温下使用2%（w/v）BSA封闭2小时。用PBS冲洗每个孔三次，然后以每毫升40000个细胞（每个孔在200µl无血清DMEM中培养8000个细胞）接种FN-null成纤维细胞，并在37°C下培养。培养4、24、48或72小时后，用4%多聚甲醛在PBS中固定15分钟，用0.4%Triton X-100在PBS内渗透5分钟，并在室温下用2%BSA在PBS里封闭30分钟。FAs在室温下用抗病毒抗体染色1小时，然后用Oregan Green 488山羊抗鼠IgG染色1小时。肌动蛋白用Alexa Fluor 546阴茎倍体蛋白复染。清洗后，立即用盖玻片覆盖残留PBS中的细胞，并在Leica TCS SP2激光扫描共聚焦显微镜（Leica Microsystems，Wetzlar，德国）上用×40，孔径0.9的油物镜进行荧光成像。所有图像均使用相同分辨率（1024×1024像素）的CCD摄像机进行记录。

致谢

这项工作得到了以下赠款的支持：NA10143功绩奖和武装部队再生医学研究所（RAFC）和NSF MRSEC（MR）。我们感谢Deane F.Mosher的宝贵建议，并提供了本文中使用的FN-null细胞。

缩写

发动机控制模块细胞外基质
第2页纤连蛋白
FN-CCBD公司纤维连接蛋白中央细胞结合域
FN-GFBD公司纤维连接蛋白生长因子结合域
FNIII公司纤维连接蛋白III型重复序列
FNIII公司8–11纤维连接蛋白中央细胞结合域
GF结合生长因子结合
消费税谷胱甘肽S-转移酶
KD（分子量）离解常数
RGD公司精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸
生命周期3轻链3
V（V）纤维连接蛋白可变结构域

脚注

利益冲突

提交人表示没有利益冲突。

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