跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
基因发育。2001年10月15日；15(20): 2675–2686.
数字对象标识：10.1101/加924501
预防性维修识别码：PMC312814型
PMID：11641274

FIH-1：一种与HIF-1α和VHL相互作用以调节HIF-1转录活性抑制的新蛋白

帕特里克·C·马洪,1,三 平田光一,1,2,三和格雷格·塞门扎1,4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

低氧诱导因子1（HIF-1）是氧稳态的主要调节因子，在低氧条件下通过靶基因的转录激活控制血管生成、红细胞生成和糖酵解。O（运行）2-von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制蛋白的依赖性结合靶向HIF-1α亚单位，用于泛素化和蛋白酶体降解。HIF-1α转录激活域的活性也是O2由以前未定义的机制调节。在这里，我们报告了抑制因子HIF-1（FIH-1）的鉴定，这是一种与HIF-1α结合并抑制其反式激活功能的蛋白质。此外，我们证明FIH-1与VHL结合，VHL也作为转录辅抑制因子发挥作用，通过招募组蛋白去乙酰化酶抑制HIF-1α转录激活功能。VHL与FIH-1的结合为调节HIF-1α蛋白稳定和转录激活以响应细胞O的变化提供了一种统一的机制2浓度。

关键词：辅酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶、缺氧、反式激活

低氧诱导因子1（HIF-1）在细胞和全身氧稳态中发挥重要作用(Iyer等人，1998年). HIF-1激活其蛋白产物可增加O的基因转录2通过促进红细胞生成（例如，促红细胞生成素）和血管生成[例如，血管内皮生长因子（VEGF）]或介导细胞内对O的适应性反应2剥夺，如糖酵解代谢增加（如葡萄糖转运蛋白和糖酵酵解酶）（有关综述，请参阅Semenza 1999年). 然而，实验证据表明HIF-1调节的基因产物（如NIP3）在某些条件下也可能介导低氧诱导的细胞凋亡(Carmeliet等人，1998年;布鲁克2000). 目前尚不清楚是什么决定了HIF-1在特定细胞类型的缺氧反应中激活的基因组，以及这种反应是否会导致适应性或凋亡。由于HIF-1的活性是由所有细胞类型的缺氧诱导的，因此HIF-1与其他蛋白质的相互作用可能在决定其生物活性方面发挥重要作用。由于HIF-1在癌症和缺血性心血管疾病中发挥着重要作用（有关综述，请参阅塞门扎2000)相互作用蛋白的鉴定也可能提供新的治疗靶点。

HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亚单位组成的异二聚体(Wang等人，1995年;Wang和Semenza 1995). 虽然HIF-1β是组成性表达的，但HIF-1αmRNA表达、蛋白半衰期和反式激活域功能都受细胞O2体内浓度（综述见Semenza 1999年). HIF-1α的C末端半部分包含几个重要的调控域。首先，氨基酸429–608（图。​（图1A）1A） 包含介导O的序列2-HIF-1α的依赖性泛素化(Huang等人1998年;Sutter等人，2000年)通过结合von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制蛋白，该蛋白是E3泛素蛋白连接酶的识别成分(Cockman等人，2000年;Kamura等人，2000年;Ohh等人，2000年)靶向HIF-1α进行蛋白酶体降解(Salceda和Caro 1997). VHL的结合依赖于HIF-1α中Pro 564通过需要O的酶过程的羟基化2以及铁，并被氯化钴抑制(Ivan等人，2001年;Jaakkola等人，2001年). VHL还与HIF-1α中的其他残基结合(Yu等人，2001年)，但这些相互作用的功能意义仍有待确定。最后，HIF-1α与p53相互作用(An等人，1998年)，它招募MDM2，另一种E3泛素蛋白连接酶，这种相互作用调节缺氧条件下HIF-1α的稳定性(拉维等人，2000年).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f1a_L1TT_rev1.jpg
保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f1b_L1TT.jpg

利用酵母双杂交筛选鉴定FIH-1。(A类)HIF-1α和诱饵和猎物蛋白的结构。HIF-1α包含二聚化和DNA结合所需的基本螺旋-环-螺旋（bHLH）和PAS结构域，一个富含脯氨酸/丝氨酸/苏氨酸的蛋白质稳定域（PSTD），两个反式激活域（TAD-N和TAD-C）和一个抑制域（ID）在非缺氧条件下负调控反式激活域功能。对于双杂交筛选，诱饵载体编码一种嵌合蛋白，该嵌合蛋白由酵母GAL4转录因子（GAL4 DBD）的DNA结合域与HIF-1α的576–826残基融合而成。猎物载体编码GAL4反式激活域（GAL4-TAD），与人脑cDNA编码的残基融合，其中一个cDNA编码FIH-1。(B类)FIH-1的氨基酸序列及相关蛋白序列的鉴定。使用人类FIH-1序列（顶行）对GenBank数据库进行TBLASTN搜索。对于每个GenBank条目，仅显示与FIH-1具有显著相似性的序列。

除了调节蛋白质稳定性的结构域外，HIF-1α还包含两个反式激活结构域(Jiang等人，1997年;Pugh等人1997)TAD-N（残基531–575）和TAD-C（残基786–826），结合辅活化剂，包括CBP、p300、SRC-1和TIF-2(Arany等人，1996年;Ema等人，1999年;Carrero等人，2000年). 残基576–785包含一个抑制结构域，其缺失会增加反式激活结构域的功能，特别是在非缺氧条件下(Jiang等人，1997年). 反激活域功能受O负调控2独立于蛋白质稳定性。细胞暴露于缺氧、氯化钴或铁螯合物去铁胺诱导HIF-1α蛋白稳定和反式激活(Jiang等人，1997年;Pugh等人，1997年)，表明存在一种共同的分子机制。

我们利用酵母双杂交试验筛选与HIF-1α相互作用并调节其生物活性的蛋白质。在这里，我们报告了FIH-1的鉴定和表征(（f）演员我抑制H（H）IF-1）是HIF-1α反式激活域功能的负调控因子。我们证明FIH与HIF-1α以及VHL相互作用，并且FIH-1和VHL都抑制HIF-1β反式激活域功能。VHL的参与为O提供了统一机制2-HIF-1α蛋白稳定性和转录活性的依赖性调节。

结果

HIF-1α相互作用蛋白筛选中FIH-1的鉴定

执行双杂交分析(Fields and Song 1989年),他的−酵母菌株Y190与诱饵载体共转化，编码用HIF-1α残基576–826在框架内表达的GAL4 DNA结合域（包括抑制域和TAD-C），以及允许用GAL4反式激活域在框架内表示人脑cDNA序列的猎物载体（图。​（图1A）。1A） ●●●●。酵母转化子（2×106)筛选组氨酸营养不良和α-半乳糖苷酶（α-gal）表达。对表现出最强α-gal活性的酵母菌落进行额外的阳性和阴性筛选（如材料和方法中所述），发现组氨酸营养不良和α-gal活性都依赖于诱饵和猎物载体的联合存在。

核苷酸序列分析显示，猎物载体包含2.98-kb人类cDNA，编码349-氨基酸蛋白，随后被指定为FIH-1（GenBank登录号：。非洲395830). BLASTN搜索显示与匿名全长cDNA序列FLJ20615（GenBank登录号：。AK000622号)和87个EST（Unigene簇Hs.14595）。与FLJ20615相比，FIH-1 cDNA中存在三个核苷酸差异，改变了编码蛋白在氨基酸残基10、28和157处的序列。在所有三个案例中，GenBank中的人类基因组DNA序列（见下文）与FIH-1 cDNA序列一致。EST数据表明，FIH-1在肾上腺、膀胱、大脑（成人和胎儿）、乳腺、结肠、胚胎、包皮、生殖细胞、心脏、肾脏、肺、淋巴、骨髓、肌肉、神经、卵巢、甲状旁腺、前列腺、皮肤、睾丸、扁桃体和子宫的多种细胞类型中表达。

TBLASTN搜索显示FIH-1与大鼠PASS1蛋白相似（GenBank登录号：。AF168362型.1），人类ESTs FLJ13798编码的蛋白质(邮编：023860.1）和FLJ20656(AK000663（千卡）.1），以及在中打开阅读框线虫(电话084551.1）和黑腹果蝇(AE003469号.2,AE003537号.2）基因组DNA，从而定义了通过无脊椎动物和脊椎动物进化而保守的相关蛋白质家族（图。​（图1B）。1B） ●●●●。无害环境技术(BF102294型.1,BF159006型.1,BB264223型.1）编码假定的小鼠FIH-1同源物也被鉴定。对GenBank中保存的基因组DNA序列的分析表明金融信息1该基因存在于contig NT 008635中，该基因定位于人类染色体10q24，由8个外显子和7个内含子组成，全长14kb。

FIH-1与HIF-1α的体外相互作用

35体外合成S标记的HIF-1α，并测试其与细菌表达的谷胱甘肽的相互作用-S公司-转移酶（GST）或GST与FIH-1融合。GST下拉分析显示HIF-1α与GST–FIH-1结合，但不单独与GST结合（图。​（图2A）。2A） ●●●●。接下来，在体外合成FIH-1，并测试其与GST的相互作用，或与跨越整个蛋白质的HIF-1α序列融合。HIF-1α的氨基酸531-826与FIH-1相互作用，而残基1-329和429-608没有相互作用（图。​（图2B）。2B） ●●●●。对含有HIF-1αC末端序列的GST融合蛋白的进一步分析表明，除了残基757-826之外，消除所有残基的缺失并不影响与FIH-1的结合（图。​（图2C）。2C） ●●●●。HIF-1α残基786–826（TAD-C）与FIH-1没有相互作用，残基531–575（TAD-N）也没有相互作用；而残基576–784（抑制域）与FIH-1相互作用，但与残基531-826相比效率降低（图。​（图2D）。2D） 。这些数据表明，HIF-1α抑制结构域内的序列是与FIH-1相互作用所必需的，但最佳结合也需要TAD-C。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f2_C1TT.jpg

HIF-1α残基与FIH-1相互作用的定位。(A类)GST和GST-FIH-1融合蛋白在大肠杆菌、纯化、培养35在体外翻译的HIF-1α中标记S，用谷胱甘肽-Sepharose珠捕获，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。(B类–D类)在GST融合蛋白的C末端含有指示的HIF-1α残基，用35S-标记在体外翻译的FIH-1中，捕获在谷胱甘肽-Sepharose珠上，并如上所述进行分析。（0）仅GST。

FIH-1抑制HIF-1α介导的人类细胞转录激活

将人胚胎肾293细胞与报告质粒p2.1共转染，报告质粒p2.1在介导HIF-1依赖性基因转录的68bp缺氧反应元件下游含有SV40启动子萤光素酶转录单元(Semenza等人，1996年). 如前所述，暴露于1%O的细胞中，报告基因表达显著增加2相对于暴露于20%O的细胞2（图。​（图3A），三A） ，反映了缺氧诱导的HIF-1α的稳定和反式激活。联合转染编码FIH-1的表达载体导致报告基因表达在1%O时受到剂量依赖性抑制220%O时的转录2未受影响，因为HIF-1α在非缺氧293细胞中未检测到。分析Hep3B人肝母细胞瘤细胞时也获得了类似的结果（图。​（图3B）。三B） ●●●●。用表达载体转染Hep3B细胞，其中FIH-1 cDNA插入反义方向，在1%O时报告基因表达增加2（图。​（图3C）三C） 在293个细胞中观察到类似结果（数据未显示）。联合转染反义FIH-1表达载体对暴露于20%O2因为HIF-1α不存在（图。​（图3D）。三D） 。然而，在20%O时HIF-1α的强制表达2介导的p2.1表达增加，通过反义FIH-1表达载体的共转染显著增强。这些数据表明内源性FIH-1抑制非缺氧细胞中HIF-1α的转录活性。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f3_L1TT.jpg

FIH-1对HIF-1介导的报告基因转录的影响。人类293(A、 D类)或Hep3B(B、 C类)细胞与pSV-Renilla共转染，pSV-Renilla是一种含有SV40启动子和雷尼利亚荧光素酶编码序列，p2.1，一个报告基因，包含SV40启动子和萤火虫荧光素编码序列上游的68-bp低氧反应元件，以及包含FIH-1 cDNA[插入正或反义（AS）方向]、HIF-1αcDNA或空载体（EV）的表达载体的指示量。对于每个表达载体，显示转染质粒DNA的数量（以毫微克为单位）。(E类)Hep3B细胞与pSV-Renilla、报告人pG5ElbLuc共转染，其中包含腺病毒Elb启动子上游的五个GAL4-结合位点和萤火虫荧光素酶编码序列，表达载体单独编码GAL4-DNA-结合域（Gal0）或与HIF-1α残基531-826（GalA）融合，以及EV或编码FIH-1的载体。在每个面板中，细胞暴露于20%（开放栏）或1%（封闭栏）O2持续16小时，萤火虫的比例：雷尼利亚测定荧光素酶活性。将结果归一化为转染EV并暴露于20%O的细胞的结果2（相对荧光素酶活性）。显示了基于3-9个独立转染的平均值和标准偏差。

为了验证这一假设，Hep3B细胞与报告质粒pG5ElbLuc联合转染，该报告质粒包含腺病毒E1b启动子荧光素酶转录单元上游的五个GAL4结合位点，以及单独编码GAL4 DNA结合域（Gal0）或与HIF-1α残基531–826（GalA）结合的表达载体。与HIF-1α相比，GalA是组成性表达的(Jiang等人，1997年)因为它不包含O所需的整个结构域（残基429–608）2-依赖性泛素化和降解(Huang等人，1998;Sutter等人，2000年). 如前所示，GalA中的HIF-1α序列导致报告基因转录激活大大增加，特别是在缺氧条件下（图。​（图3E）。三E） ●●●●。在非缺氧和缺氧条件下，联合转染FIH-1表达载体显著抑制GalA介导的反式激活，而对Gal0介导的基础转录没有影响。

FIH-1在体外与VHL相互作用

因为FIH-1和VHL都是HIF-1α的负调节因子，我们研究了它们是否相互作用。35S标记的VHL与GST–HIF-1α（429–608）融合蛋白结合，该融合蛋白先前与网织红细胞裂解物孵育以诱导脯氨酸羟基化（图。​（图4A）4A） 根据VHL与HIF-1α残基556–574的已知相互作用(Ivan等人，2001年;Jaakkola等人，2001年).35在VHL存在下，S标记的FIH-1与GST–HIF-1α（429–608）结合（图。​（图4A，4A、 车道2）。然而，在没有VHL的情况下，没有观察到FIH-1绑定（车道3），如图所示​图2B。2B.类似地，FIH-1与GST-HIF-1α（757-826）结合，而VHL在FIH-1存在但不存在的情况下结合（车道4-6）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f4a_C1TT.jpg
保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f4c_C1TT_rev1.jpg
保存图片、插图等的外部文件。对象名称为40328-4f4d_C1TT.jpg
保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f4b_C1TT.jpg

体外FIH-1、HIF-1α和VHL的相互作用。(A类)含有HIF-1α残基429–608或757–826的GST融合蛋白在大肠杆菌纯化并与35在体外翻译的FLAG标记的VHL或HA标记的FIH-1中标记S，用谷胱甘肽-Sepharose珠捕获，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。(B类)35用未标记的FLAG–VHL孵育体外翻译的FIH-1残基1–349或126–349中的S标记(顶部)或GST–HIF-1α（531–826）(中间的)将其分别放在含有抗FLAG抗体或谷胱甘肽的珠子上，并与输入的FIH-1多肽等份一起通过SDS-PAGE进行分析(底部). (C类)35如图所示，用未标记的裂解物处理的GST-HIF-1α（429-608）孵育在其C末端截短的经体外翻译的FLAG–VHL中标记的S(顶部)或GST–HA–FIH-1(中间的)将其捕获在谷胱甘肽-Sepharose珠上，并通过SDS-PAGE和输入VHL多肽的等分样品进行分析(底部). (D类)GST或指示的GST–HIF-1α融合蛋白在网织红细胞裂解液（奇数车道）或缓冲液（偶数车道）中预先培养，用35S-标记的FLAG–VHL，捕获在谷胱甘肽–Sepharose珠上，并按照上述方法进行分析。

为了直接证明结合并定位与VHL和HIF-1α相互作用的FIH-1区域，35合成了全长（1–349）或缺乏N末端残基（126–349，S标记的FIH-1），并测试了其与FLAG标记的VHL或GST–HIF-1α（531–826）的相互作用。FIH-1（1–349）与FLAG–VHL或GST–HIF-1α（531–826）结合，而FIH-1。​（图4B）。4B） ●●●●。这些数据表明，VHL和HIF-1α在不同的位点与FIH-1相互作用，VHL结合位点位于HIF-1β结合位点的N末端。

还测试了VHL的C端截断与GST-FIH-1或网织红细胞裂解物处理的GST-HIF-1α（429-608）的相互作用。尽管VHL残基1-155足以与FIH-1结合，但残基1-213则需要与HIF-1α有效结合（图。​（图4C）。4C） ●●●●。这些研究表明，存在不同的结合位点，允许FIH-1、HIF-1α和VHL同时相互作用。

最后，我们分析了VHL与GST融合蛋白的相互作用，这些融合蛋白包含HIF-1α的不同区域，这些区域要么未经处理，要么预先与网织红细胞裂解物孵育。VHL与GST–HIF-1α（531–575）的结合严格依赖于网织红细胞裂解物的预培养（图。​（图4D）。4D） 。在存在或不存在裂解物的情况下，VHL未与GST-HIF-1α（786-826）或GST-HIF1α（757-826）结合。值得注意的是，在没有裂解物的情况下，检测到VHL与GST–HIF-1α（531–826）的显著结合。这些结果表明，VHL可能通过一种不需要依赖于裂解物的羟基化的机制与HIF-1α的其他区域或其他HIF-1β结合蛋白（例如FIH-1）相互作用。

人细胞中FIH-1和HIF-1α的相互作用

GST-下拉和GAL4-反式激活研究的结果表明，FIH-1与人类细胞中的HIF-1α相互作用。为了直接验证这一假设，用编码血凝素（HA）表位、FLAG–VHL和HIF-1α标记的FIH-1的表达载体共转染293个细胞。直接或在HA–FIH-1免疫沉淀后，对全细胞裂解液的等分样品进行蛋白质表达分析。来自过度表达HA–FIH-1和HIF-1α的细胞的抗HA免疫沉淀物中存在HIF-1 a（图。​（图5）。5). 细胞暴露于1%O2没有改变HIF-1α和FIH-1的相互作用，这与过度表达的FIH-1在20%和1%氧浓度下抑制HIF-1β反式激活域功能的能力一致2（图。​（图3）。三). 蛋白酶体抑制剂MG132增加了抗HA免疫沉淀物中HIF-1α的表达和HIF-1β的恢复（图。​（图5）。5). 这些结果证明了FIH-1和HIF-1α在人类细胞中的相互作用。然而，由于这种相互作用是在过度表达这些蛋白的细胞中检测到的，因此对于这种相互作用是否受细胞O2浓度。HIF-1α蛋白表达不受调控，在这些条件下，无法证明VHL与FIH-1或HIF-1β的相互作用（数据未显示），这表明VHL表达可能受到限制。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f5_C1TT.jpg

人类细胞中FIH-1和HIF-1α的相互作用。如图所示，用编码HA–FIH-1、FLAG–VHL和HIF-1α的表达载体共同转染人293细胞。转染细胞未经处理，暴露于MG132或缺氧（1%O2)在裂解之前。用识别HIF-1α的抗体通过免疫印迹（IB）分析全细胞裂解物（WCL）和抗HA免疫沉淀物（IP）的等分样品(顶部)和HA(底部).

VHL和FIH-1对人细胞HIF-1α反式激活域功能的抑制

我们分析了FIH-1、VHL或这两种蛋白对GAL4–HIF-1α融合蛋白介导的反式激活的影响，该融合蛋白包含FIH-1和VHL的结合位点，这两种蛋白质或两者都不包含。Hep3B细胞首先与报告基因pG5ElbLuc和表达载体pGalA共转染，后者编码HIF-1α（531-826），因此包括VHL和FIH-1的结合位点。VHL的强制表达介导了GalA在非缺氧和缺氧细胞中对报告基因反式激活的显著抑制，这与FIH-1表达的作用相似（图。​（图6A）。6A） ●●●●。免疫印迹分析表明GalA蛋白水平不受O变化的影响2或通过FIH-1或VHL的过度表达（图。​（图6B），6B） 证明这些蛋白特异性抑制了GalA反式激活域功能。进行了类似的分析，以分析FIH-1和VHL对GalG介导的转录激活的影响，GalG含有HIF-1α（757-826），包括FIH-1的结合位点，但不包括VHL的结合位点。FIH-1抑制GalG介导的转录激活，而VHL没有（图。​（图6A）。6A） ●●●●。接下来，我们测试了GalL，它含有HIF-1α（531-575），因此包括VHL的结合位点，但不包括FIH-1的结合位点。FIH-1和VHL均不单独抑制GalL介导的转录激活，而FIH-1与VHL的结合导致显著的转录抑制。这些结果表明，VHL介导的FIH-1向HIF-1α的招募是GalL转录抑制所必需的。当靶蛋白也含有FIH-1结合位点时，单独的VHL对GalA的作用可以反映出存在足够的内源性FIH-1用于功能活性，而单独的FIH-1与VHL的较低亲和力（非合作）结合需要通过转染表达载体获得的较高的FIH-1水平。最后，我们测试了编码HIF-1α（786–826）的pGalH，它不包括VHL或FIH-1的结合位点。值得注意的是，GalH介导的转录激活不是O2受管制的(Jiang等人1997; 图。​图6A）。6A） ●●●●。FIH-1、VHL以及FIH-1和VHL的组合均未显著抑制GalH-介导的转录激活。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f6a_L1TT_rev1.jpg
保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f6b_C1TT.jpg

FIH-1和VHL抑制HIF-1α反式激活域功能的功能相互作用。(A类)Hep3B细胞与报告人pSV-Renilla和pG5E1bLuc共转染，表达载体编码GAL4-DNA-结合域（Gal0）或GAL4-HIF-1α融合蛋白，表达载体不编码蛋白、FIH-1或VHL。测试的GAL4融合蛋白（包含指示的HIF-1α残基）为GalA（531-826）、GalG（757-826），GalL（531-575）和GalH（786-826）。相对荧光素酶活性代表萤火虫的比率：雷尼利亚每个构造的荧光素酶归一化为Gal0的结果。(B类)使用针对GAL4 DNA-结合域（DBD）、FLAG和HA的单克隆抗体对转染细胞裂解物进行免疫印迹分析，以检测GalA的表达(顶部)，旗–VHL(中间的)和HA–FIH-1(底部)分别是。

VHL和FIH-1与组蛋白脱乙酰化酶的体外相互作用

共抑制剂的一个一般特性是组蛋白去乙酰化酶（HDAC）向DNA结合转录因子的募集（有关综述，请参阅Semenza 1998年;克雷斯和塞托2000). 体外翻译35S标记的VHL与GST–HDAC-1、GST–HDAC-2和GST-HDAC-3融合蛋白相互作用，但不与GST相互作用（图。​（图7A）。7A） ●●●●。FIH-1与HDAC 1-3的结合较为温和。然而，体外翻译的HDAC-1或HDAC-3与GST–HA–FIH-1的结合，但不单独与GST结合（数据未显示），表明这种相互作用是特定的。VHL残基1–213或1–155与GST–HDAC融合蛋白结合，而VHL（1–58）和VHL（1-57）没有结合（图。​（图7B）。7B） ●●●●。在有VHL存在的情况下，用GST–HDAC融合蛋白非常有效地降低HIF-1α，而在没有VHL的情况下非常无效（图。​（图7C）。7C） ●●●●。结合共转染分析，这些研究表明VHL通过招募HDAC到HIF-1α发挥协同抑制剂的作用。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为40328-4f7a_C1TT.jpg
保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f7b_C1TT.jpg
保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f7c_C1TT.jpg

VHL和FIH-1与组蛋白脱乙酰化酶的相互作用。(A类)GST和GST-HDAC融合蛋白与35S标记FLAG–VHL(顶部)、HA–FIH-1(中间的)，或HIF-1α(底部)用谷胱甘肽-琼脂糖珠捕获，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。(B类)GST–HDAC融合蛋白与35如上所述，S标记的FLAG–VHL在其C末端被截短并进行分析。(C类)GST–HDAC融合蛋白与35S标记的FLAG–VHL和/或35S标记的HIF-1α。

讨论

在本文中，我们报道了FIH-1的鉴定，并证明了它与HIF-1αC末端的757–826残基的相互作用，该残基包含部分抑制结构域和TAD-C。FIH-1是一个蛋白质家族的创始人，其成员从人类、小鼠和大鼠延伸到蠕虫和苍蝇，这与脊椎动物和无脊椎动物中HIF-1α（和VHL）的进化保护一致(Jaakkola等人，2001年). 在缺氧或非缺氧条件下，强制表达FIH-1（或VHL）抑制依赖完整HIF-1异二聚体（p2.1）或分离HIF-1α转录激活域（pG5ElbLuc）的报告基因的转录活性。表达反义FIH-1 RNA的效果（图。​（图3）三)表明FIH-1与VHL一样，起着O的作用2-依赖性HIF-1α负调节因子。在检测FIH-1和HIF-1α联合免疫沉淀所需的蛋白过表达条件下，细胞O对相互作用的调节2浓度无法证明（图。​（图5）。5). 然而，在HIF-1α过度表达的条件下，VHL变得受限(Tanimoto等人，2000年)尽管共转染了VHL表达载体，但这种效应可能发生在共免疫沉淀实验中，因为HIF-1α的表达不是O2-受监管。

除了与HIF-1α相互作用外，FIH-1还与VHL相互作用，从而形成包含HIF-1 a、FIH-1和VHL的三元配合物（图。​（图8）。8). VHL通过其β结构域中的不同残基与HIF-1α和FIH-1相互作用，HIF-1通过TAD-N与VHL相互作用，同时通过抑制结构域和TAD-C中的残基与FIH-1交互作用。由于每个蛋白质通过独立的结合位点与其他两个蛋白质相互作用，三元复合物的形成可能涉及协同性，反式激活研究支持的假设（图。​（图6A）。6A） ●●●●。VHL不能介导GalL的抑制，GalL包含VHL的结合位点，但不包含FIH-1的结合位点。这表明VHL和FIH-1在HIF-1α转录抑制中的功能相互作用是必需的。一个有待回答的关键问题是O2-HIF-1α和VHL的依赖性相互作用是招募FIH-1所必需的。另一种但并非相互排斥的假设是，FIH-1和VHL通过向HIF-1α招募不同的HDAC复合物而在功能上相互作用，如下所述。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为40328-4f8_L1TT.jpg

VHL和FIH-1介导的非缺氧条件下HIF-1α蛋白稳定性和转录活性的负调控。E3泛素蛋白连接酶活性需要伸长素B、C和cullin 2，而HDAC抑制反式激活。

HIF-1介导的基因转录受到细胞O的精确调控2通过调节HIF-1α亚单位的表达和活性实现浓度（综述见Semenza 1999年). O的最新解释2-VHL的依赖性结合为HIF-1α蛋白稳定性的调节提供了分子基础(Ivan等人，2001年;Jaakkola等人，2001年). 肾透明细胞癌（RCC）细胞系中VHL功能的丧失与HIF-1α蛋白和HIF-1靶基因（如GLUT-1型和血管内皮生长因子(Maxwell等人，1999年). 从这些结果来看，尚不清楚HIF-1α蛋白的过度表达是否足以激活RCC细胞系中的靶基因转录，这些细胞中的其他突变是否消除了O2-HIF-1α反式激活的依赖性负调控，或者VHL是否也调节反式激活。从FIH-1的鉴定开始，我们已经证明VHL是HIF-1αTAD功能的一个重要调节器，表明VHL控制HIF-1β翻译后调节的两个主要机制（图。​（图8）。8). 这些结果表明，RCC中VHL功能的丧失可能足以构成HIF-1靶基因的转录。不同的VHL错义突变与不同的疾病表型相关(Clifford等人，2001年;霍夫曼等人，2001年). 虽然已经确定了特定突变对HIF-1α和elongin BC结合的影响，但可以通过分析FIH-1与突变VHL蛋白的结合来建立额外的基因型-表型相关性。

VHL与HDAC-1、HDAC-2和HDAC-3的结合为在非缺氧条件下抑制HIF-1α反式激活域功能提供了分子基础。FIH-1与这些HDAC的相互作用没有那么强烈，这表明它可能与HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6或HDAC-7相互作用。HDAC1–HDAC3和HDAC4–HDAC7代表两组结构和功能不同的蛋白质（有关综述，请参阅克雷斯和塞托2000). 因此，能够与各组相互作用的共抑制因子的存在可能为防止不适当的HIF-1α介导的转录激活提供额外的保障。另一种但并非互斥的可能性是，FIH-1与另一种辅阻遏物结合，如mSin3A、N-CoR或SMRT，后者反过来与HDAC相互作用(Kao等人，2000年). 最后，FIH-1本身可能具有HDAC活性。有趣的是，低氧诱导HDAC1 mRNA和蛋白表达(Kim等人，2001年)，表明HDAC1型可能代表HIF-1靶基因，HDAC活性增加可能导致缺氧细胞中转录速率整体下降。HDAC1的生物学作用是复杂的，因为它与许多转录调节因子相关(克雷斯和塞托2000)HDAC1过度表达的净作用是刺激血管生成(Kim等人，2001年). 相反，VHL和FIH-1与HIF-1α特异性相互作用，并且预测这些蛋白的过度表达会抑制血管生成，因为HIF-1介导的血管生成减少血管内皮生长因子表达式。

蛋白质结合和基因反式激活研究的结果表明，VHL和FIH-1在非缺氧条件下协同抑制HIF-1α介导的反式激活。这种关系意味着VHL或FIH-1活动的损失可能足以取消交易激活。这一发现很重要，因为最近的证据表明，由受体酪氨酸激酶（如HER2）刺激的磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT/FRAP信号通过增加其合成速率而不是降低其降解速率来诱导HIF-1α蛋白表达(Laughner等人，2001年). 然而，PI3K/AKT/FRAP通路的激活并不能解除反式激活结构域的功能。相反，据报道，MAP激酶途径的激活可增加HIF-1转录活性，而不会影响HIF-1α蛋白的表达(Richard等人，1999年;Sodhi等人，2000年)，这将是有趣的，以确定这一影响是否是通过降低FIH-1的结合介导的。

脑肿瘤中一个常见的发现是编码PTEN的基因发生功能丧失突变，PTEN是一种负向调节PI3K信号的磷酸酶（有关综述，请参阅Di Cristofano和Pandolfi 2000). 研究表明，PTEN表达的基因调控可以调节胶质瘤和前列腺癌细胞系中HIF-1α的表达(Zhong等人，2000年;Zundel等人，2000年). 高级别胶质瘤中另一种常见的基因改变是染色体10q23-q26的缺失(Bigner和Vogelstein 1990年)，包括金融信息110q24。因此，FIH-1功能丧失可能导致HIF-1介导的下游靶基因转录激活增加，如血管内皮生长因子在胶质瘤和其他人类癌症中(塞门扎2000;Zagzag等人，2000年).

本研究中记录的HIF-1α、FIH-1和VHL之间的复杂功能关系，以及VHL与完整HIF-1β调节域（残基531-826）的结合不需要HIF-1 a与细胞裂解物的预孵育（作为推测脯氨酰羟化酶活性的来源；图。​图4D），4D） 提示VHL对HIF-1α的负调控可能受除O2-Pro-564的依赖性羟基化(Ivan等人，2001年;Jaakkola等人，2001年)，这一结论得到了其他近期研究的支持(Yu等人，2001年). 最重要的是，本文报道的结果建立了一个统一的机制，用于调节HIF-1α蛋白的稳定和转录激活，以响应细胞O的变化2与FIH-1相关的VHL介导的浓度。

材料和方法

酵母双杂交系统及诱饵载体的构建

利用酵母双杂交分析（MATCHMAKER two hybrid System 2，Clontech）分离出编码FIH-1的cDNA。通过对HIF-1αcDNA序列的PCR扩增（使用含有Nde公司我和巴姆HI限制位点）、限制性内切酶消化和连接到载体pAS2-1。猎物载体（克隆到质粒pACT II中的人脑MATCHMAKER cDNA文库；克隆体）编码的融合蛋白由GAL4反式激活域和人脑cDNA序列编码的氨基酸组成。

图书馆筛选

酵母细胞内诱饵和猎物蛋白质的物理相互作用在功能上重建活性GAL4转录因子，导致含有上游GAL4结合位点的基因表达，并介导组氨酸营养不良(他的+)α-gal的表达。为了筛选这种酵母细胞，酿酒酵母采用LiAc/PEG方法转化Y190菌株。用150 mL过夜酵母培养物接种YPD培养基（850 mL）并生长至OD600 = 0.5. 细胞通过离心（1000分钟离心5分钟克)，再次悬浮在8 mL TE/LiAc溶液中，并暴露于300μg pGAL4-HIF-1α（576-826）、600μg pACT II/人脑cDNA和20 mg鲱鱼睾丸DNA（Clontech）。将细胞在30℃下搅拌30 min，与7 mL二甲基亚砜混合，在30℃热休克15 min，造粒，再悬浮在10 mL TE中，并将（每15 cm皿200μL）镀到缺乏色氨酸、亮氨酸和组氨酸的培养基上，并补充15 mM 3-氨基-1,2,4-三唑（Sigma）。先前已将2 mg/mL X-α-gal溶于二甲基甲酰胺（Clontech）的溶液涂布在每个板的表面。这个他的+α-gal表达菌落的筛选时间为12d。

他的净化+/α-gal表达克隆与假阳性鉴定

他的+α-gal表达菌落经过三轮菌落纯化。然后，从最终的母板中选择单个菌落，并在缺乏亮氨酸的液体培养基中生长，以选择猎物载体的存在。然后将所得细胞悬浮液涂布在缺乏亮氨酸的培养基上，并添加10μg/mL环己酰亚胺，以固化诱饵载体的克隆，以识别包含编码可自主激活α-加仑报告基因（即假阳性）。然后从这些环己酰亚胺平板中挑选单个菌落，并在液体培养物（缺乏亮氨酸）中生长，并通过玻璃珠法分离猎物载体(霍夫曼和温斯顿1987)用于转换大肠杆菌DH5α细胞。将转化细胞接种到添加氨苄西林的琼脂平板上，用单个菌落接种LB培养基，并从产生的细菌培养物中分离出质粒DNA。最后，通过酵母菌株Y190与诱饵载体和纯化的猎物质粒的重传证实了这种双杂交相互作用，以证明所产生的转化子再次他的+并表达α-gal。

体外相互作用（GST下拉）分析

pGEX-5X-1-HIF-1α表达质粒通过插入生态RI–萨尔哺乳动物表达质粒pGalA、pGalG、pGal H或pGal L的I片段(Jiang等人，1997年)到生态RI-和Xho公司I消化的pGEX-5X-1（Amersham Pharmacia Biotech）。表达质粒pGEX-5X-1-FIH-1通过插入Bgl公司II–生态RI片段从pACT II-FIH-1转入巴姆高-和生态RI消化的pGEX-5X-1。通过将PCR扩增的HA–FIH-1 DNA序列插入pCR3.1构建pCR3.1-HA-FIH-1。为了构建pCR3.1-HA–FIH-1（126–349），从模板pCR3.1-HA–FIH-1（引物：5′-CGGACCATGGCTTAC CCATACGTTCCACATTAGCTTACACACACAC CACAA-3′和5′-TACTAGCGCTTGGAGTTCCTGTCC TCATC-3′）生成PCR产物并连接到pCR3.1。pGST–HDAC1、pGST-HDAC2和pGST-HDAC3表达质粒(Yang等人，1997年)由W.-M.Yang和E.Seto（南佛罗里达大学）提供。

为了制备GST融合蛋白，大肠杆菌用pGEX表达载体转化菌株BL21-Gold（DE3）pLysS（Stratagene），并用0.5mM异丙基-D-硫代乳糖苷处理4小时。在含有1%Triton X-100和完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的PBS中，通过超声分解颗粒细胞。离心后，上清液用于谷胱甘肽–Sepharose 4B（Amersham Pharmacia Biotech）。用10 mM还原谷胱甘肽在50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中洗脱GST融合蛋白，并将其保存在−80°C下。用Bradford法和SDS-PAGE测定洗脱液的浓度和纯度。

[35S] 使用TNT T7偶联转录/翻译系统（Promega）在网织红细胞裂解物中生成蛋氨酸标记蛋白。10微升体外翻译35将S标记蛋白与4μg GST或GST融合蛋白混合在最终体积为200μL的结合缓冲液中[Dulbecco’S PBS，pH 7.4（Cellgro），0.1%吐温-20]，并在4°C下旋转培养2 h，然后添加10μL谷胱甘肽-Sepharose 4B珠（Pharmacia），再在4°C下进一步培养1 h。将小球制粒，在结合缓冲液中洗涤三次，制粒，再悬浮在Laemmli样品缓冲液中，并用SDS-PAGE进行分析。

[35S] 用编码HIF-1α、HA–FIH-1或FLAG–VHL序列的质粒编程的网织红细胞裂解物产生蛋氨酸标记蛋白。VHL的C端缺失突变体如下：pcDNA3.1-FLAG–VHL(Feldman等人，1999年; 由加利福尼亚州斯坦福大学J.Frydman亲切提供）不是我，囊二、 或Acc公司I.如有指示，将细菌产生的GST融合蛋白与10μL兔网织红细胞裂解物在30°C下预孵育30分钟。在150μL的NETN缓冲液（150 mM NaCl，0.5 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.5%NP-40）中混合五微升指示的裂解液（HIF-1α为10μL）和/或5μg指示的重组蛋白。在4°C下90分钟后，添加20μL谷胱甘肽–Sepharose 4B或20μL抗FLAG M2单克隆抗体–琼脂糖亲和凝胶（Sigma）。在旋转器上搅拌30分钟后，用NETN缓冲液清洗珠子三次。蛋白质在Laemmli样品缓冲液中洗脱，然后通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。

瞬时表达分析

HEK293和Hep3B细胞以4×10接种于24孔板上4每个孔的细胞数。第二天，根据制造商的方案，使用Fugene-6（Roche）将质粒DNA转染细胞。8小时后，更换每个孔中的培养基，并将细胞暴露于95%空气和5%CO中2或至1%O2，5%一氧化碳2和平衡N2对细胞进行16 h的裂解，并根据制造商的协议使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）测定荧光素素酶活性。

免疫沉淀分析

在200μL裂解缓冲液（pH 7.4的Dulbecco’s PBS、0.1%吐温-20、1 mM原钒酸钠和完全蛋白酶抑制剂）中收集细胞，并通过20G针四次提取。将裂解液在冰上孵育1 h，然后以14000 rpm离心15 min。用裂解缓冲液将清除的裂解液调至1 mL的体积，然后用20μL抗HA亲和矩阵珠（Roche）在旋转器上在4℃孵育2 h。然后用裂解缓冲液清洗珠子三次。通过添加Laemmli样品缓冲液洗脱蛋白质，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。

致谢

我们感谢Kelly Chiles和Shannon Berg-Dixon提供的技术援助。我们感谢爱德华·本茨实验室慷慨提供酵母双杂交试剂和方案。我们感谢朱迪思·弗里德伯格（Judith Frydberg）、爱德华·塞托（Edward Seto）和杨文明（Wen-Ming Yang）慷慨捐赠表达质粒。这项工作得到了国家卫生研究院R01-DK39869的资助，以及奥地利博林格·英格尔海姆（Boehrínger Ingelheim Austria）向G.L.S.K.H.的资助，其中部分资金来自山口代谢障碍研究基金会（Yamanouchi Foundation for Research on Metabolic Disorders）和上原纪念基金会（Uehara Memorial Foundation）的一项研究。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。

脚注

电子邮件ude.imhj@aznemesg; 传真：（410）955-0484。

文章和出版物位于http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.924501。

工具书类

  • An WG、Kanekal M、Simon MC、Maltepe E、Blagosklonny MV、Neckers LM。低氧诱导因子1α对野生型p53的稳定作用自然。1998;392:405–408.[公共医学][谷歌学者]
  • Arany Z，Huang LE，Eckner R，Bhattacharya S，Jiang C，Goldberg MA，Bunn HF，Livingston DM。p300/CBP在细胞缺氧反应中的重要作用。国家科学院院刊。1996;93:12969–12973. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bigner SH，Vogelstein B.恶性胶质瘤和髓母细胞瘤的细胞遗传学和分子遗传学。脑病理学。1990;1:12–18.[公共医学][谷歌学者]
  • Bruick RK。低氧诱导编码促凋亡Nip3蛋白的基因表达。国家科学院院刊。2000;97:9082–9087. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Carmeliet P、Dor Y、Herbert J-M、Fukumura D、Brusselmans K、Dewerchin M、Neeman M、Bono F、Abramovitch R、Maxwell P等。HIF-1α在低氧介导的细胞凋亡、细胞增殖和肿瘤血管生成中的作用。自然。1998;394:485–490.[公共医学][谷歌学者]
  • Carrero P、Okamato K、Coumailleau P、O'Brien S、Tanaka H、Poellinger L.Redox调节转录辅激活物CREB结合蛋白和SRC-1向低氧诱导因子1α的招募分子细胞生物学。2000;20:402–415. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Clifford SC、Cockman ME、Smallwood AC、Mole DR、Woodward ER、Maxwell PH、Ratcliffe PJ、Maher ER。致病性pVHL突变对HIF-1α调节的对比作用与von Hippel-Lindau病的肿瘤发生模式相关。人类分子遗传学。2001;10:1029–1038.[公共医学][谷歌学者]
  • Cockman ME、Masson N、Mole DR、Jaakkola P、Chang GW、Clifford SC、Maher ER、Pugh CW、Ratcliffe PJ、Maxwell PH。缺氧诱导因子-α结合和von Hippel-Lindau抑癌蛋白的泛素化。生物化学杂志。2000;275:25733–25741.[公共医学][谷歌学者]
  • Cress WD、Seto E.组蛋白脱乙酰酶、转录控制和癌症。细胞生理学杂志。2000;184:1–16.[公共医学][谷歌学者]
  • Di Cristofano A，Pandolfi PP。PTEN在肿瘤抑制中的多重作用。单元格。2000;100:387–390.[公共医学][谷歌学者]
  • Ema M，Hirota K，Mimura J，Abe H，Yodoi J，Sogawa K，Poellinger L，Fujii-Kuriyama Y。HLF和HIF1α在缺氧反应中转录激活的分子机制：它们的稳定性和氧化还原信号诱导与CBP/p300的相互作用。EMBO J。1999;18:1905–1914. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Feldman DE、Thuylasiraman V、Ferreyra RG、Frydman J.VHL-elongin BC抑癌复合物的形成由伴侣蛋白TriC介导。分子细胞。1999;4:1051–1061.[公共医学][谷歌学者]
  • Fields S，Song O。检测蛋白质-蛋白质相互作用的新型遗传系统。自然。1989;340:245–246.[公共医学][谷歌学者]
  • Hoffman CS，Winston F.酵母十分钟DNA制备有效释放自主质粒，用于转化大肠杆菌。 基因。1987;57:267–272.[公共医学][谷歌学者]
  • Hoffman MA、Ohh M、Yang H、Klco JM、Ivan M、Kaelin WG.、。，与2C型VHL疾病相关的Jr von Hippel-Lindau蛋白突变体保持下调HIF的能力。人类分子遗传学。2001;10:1019–1027.[公共医学][谷歌学者]
  • Huang LE，Gu J，Schau M，Bunn HF.低氧诱导因子1α的调节是通过O2-依赖性降解域通过泛素蛋白酶体途径。国家科学院院刊。1998;95:7987–7992. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ivan M、Kondo K、Yang H、Kim W、Valiando J、Ohh M、Salic A、Asara JM、Lane WS、Kaelin WG、。，靶向脯氨酸羟基化VHL介导的破坏的Jr HIFα：O的意义2传感。科学。2001;292:464–468.[公共医学][谷歌学者]
  • Iyer NV、Kotch LE、Agani F、Leung SW、Laughner E、Wenger RH、Gassmann M、Gearhart JD、Lawler AM、Yu AY等。O的细胞和发育控制2低氧诱导因子1α的体内稳态基因与发育。1998;12:149–162. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jaakkola P、Mole DR、Tian YM、Wilson MI、Gielbert J、Gaskell SJ、Kriegsheim A、Hebestreit HF、Mukherji M、Schofield CJ等。通过O2-调节脯氨酰羟基化。科学。2001;292:468–472.[公共医学][谷歌学者]
  • Jiang B-H，Zheng JZ，Leung SW，Roe R，Semenza GL.低氧诱导因子1α的反式激活和抑制域：通过氧张力调节转录活性。生物化学杂志。1997;272:19253–19260.[公共医学][谷歌学者]
  • Kamura T、Sato S、Iwai K、Czyzyk-Krzeska M、Conaway RC、Conawy JW。重组von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制复合物激活HIF-1α泛素化。国家科学院院刊。2000;97:10430–10435. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kao H-Y，Downes M，Ordentlich P，Evans RM。一种新型组蛋白脱乙酰酶的分离表明，I类和II类脱乙酰酶促进SMRT介导的抑制。基因与发育。2000;14:55–66. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kim MS、Kwon HJ、Lee YM、Baek JH、Jang J-E、Lee S-W、Moon E-J、Kim H-S、Lee S-K、Chung HY等。组蛋白脱乙酰酶通过负调控肿瘤抑制基因诱导血管生成。自然医学。2001;7:437–443.[公共医学][谷歌学者]
  • Laughner E、Taghavi P、Chiles K、Mahon PC、Semenza GL。Her2（neu）信号转导增加低氧诱导因子1α（HIF-1α）合成速率：HIF-1介导的血管内皮生长因子表达的新机制。分子细胞生物学。2001;21:3995–4004. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Maxwell PH、Wiesener MS、Chang G W、Clifford SC、Vaux EC、Cockman ME、Wykoff CC、Pugh CW、Maher ER、Ratcliffe PJ。肿瘤抑制蛋白VHL针对低氧诱导因子进行氧依赖性蛋白水解。自然。1999;399:271–275.[公共医学][谷歌学者]
  • Ohh M、Park CW、Ivan M、Hoffman MA、Kim TY、Huang LE、Paveletich N、Chau V、Kaelin WG、。，低氧诱导因子的Jr泛素化需要与von Hippel-Lindau蛋白的β结构域直接结合。自然细胞生物学。2000;2:423–427.[公共医学][谷歌学者]
  • Pugh CW、O'Rourke JF、Nagao M、Gleadle JM、Ratcliffe PJ。低氧诱导因子-1的激活：α亚单位内调节域的定义。生物化学杂志。1997;272:11205–11214.[公共医学][谷歌学者]
  • Ravi R、Mookerjee B、Bhujwalla ZM、Sutter CH、Artemov D、Zeng Q、Dillehay LE、Madan A、Semenza GL、Bedi A.通过p53诱导的低氧诱导因子1α降解调节肿瘤血管生成基因与发育。2000;14:34–44. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Richard DE、Berra E、Gothie E、Roux D、Pouyssegur J.p42/p44有丝分裂原活化蛋白激酶磷酸化缺氧诱导因子1α（HIF-1α）并增强HIF-1的转录活性。生物化学杂志。1999;274:32631–32637.[公共医学][谷歌学者]
  • Salceda S，Caro J.缺氧诱导因子1α（HIF-1α）蛋白在常氧条件下被泛素蛋白酶体系统快速降解：其通过缺氧的稳定取决于氧化还原诱导的变化。生物化学杂志。1997;272:22642–22647.[公共医学][谷歌学者]
  • 塞门扎GL。转录因子与人类疾病。纽约州纽约市：牛津大学出版社；1998[谷歌学者]
  • -----哺乳动物O的调节2低氧诱导因子1的体内稳态。年收入细胞开发生物。1999;15:551–578.[公共医学][谷歌学者]
  • -----HIF-1：一个高度相关的因素。基因与发育。2000;14:1983–1991.[公共医学][谷歌学者]
  • Semenza GL、Jiang B-H、Leung SW、Passantino R、Concordet J-P、Maire P、Giallongo A。醛缩酶A、烯醇化酶1和乳酸脱氢酶A基因启动子中的低氧反应元件包含低氧诱导因子1的必要结合位点。生物化学杂志。1996;271:32529–32537.[公共医学][谷歌学者]
  • Sodhi A、Montaner S、Patel V、Zohar M、Bais C、Mesri EA、Gutkind JS。卡波西肉瘤相关疱疹病毒G蛋白偶联受体通过丝裂原活化蛋白激酶和作用于低氧诱导因子1α的p38通路上调血管内皮生长因子的表达和分泌癌症研究。2000;60:4873–4880.[公共医学][谷歌学者]
  • Sutter CH，Laughner E，Semenza GL。HIF-1α蛋白表达受氧调节泛素化控制，泛素化被缺失和错义突变破坏。国家科学院院刊。2000;97:4748–4753. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tanimoto K，Makino Y，Pereira T，Poellinger L.von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白调节缺氧诱导因子1α的机制。EMBO J。2000;19:4298–4309. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wang GL，Semenza GL.低氧诱导因子1的纯化和表征。生物化学杂志。1995;270:1230–1237.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang GL，Jiang B-H，Rue EA，Semenza GL。缺氧诱导因子1是一种由细胞O调节的碱性螺旋-环-螺旋PAS异二聚体2紧张。国家科学院院刊。1995;92:5510–5514. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yang W-M，Yao Y-L，Sun J-M，Davie JR，Seto E.与人类组蛋白脱乙酰酶基因家族另一成员相对应的cDNA的分离和表征。生物化学杂志。1997;272:28001–28007.[公共医学][谷歌学者]
  • Yu F、White SB、Zhao Q、Lee FS。低氧诱导因子1α与von Hippel-Lindau抑癌蛋白的动态、位点特异性相互作用。癌症研究。2001;61:4136–4142.[公共医学][谷歌学者]
  • Zagzag D，Zhong H，Scalzitti JM，Laughner E，Simons JW，Semenza GL.人脑肿瘤中低氧诱导因子1α的表达：与血管生成、侵袭和进展的关系。癌症。2000;88:2606–2618.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhong H，Chiles K，Feldser D，Laughner E，Hanrahan C，Georgescu MM，Simons JW，Semenza GL.人前列腺癌细胞中表皮生长因子/磷脂酰肌醇3-激酶/PTEN/AKT/FRAP通路对低氧诱导因子1α表达的调节：肿瘤血管生成和治疗的意义。癌症研究。2000;60:1541–1545.[公共医学][谷歌学者]
  • Zundel W、Schindler C、Haas-Kogan D、Koong A、Kaper F、Chen E、Gottschalk AR、Ryan HE、Johnson RS、Jefferson AB等。PTEN缺失促进HIF-1介导的基因表达。基因与发育。2000;14:391–396. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社