人类三阴性乳腺癌亚型的鉴定靶向治疗选择的临床前模型

k-means和共识聚类揭示了6种TNBC亚型。

为了确定TNBC亚型之间GE的全球差异，我们进行了k-means差异表达最多的基因聚类（SD＞0.8）。使用轮廓宽度（s[i]）作为单个样本与他们的聚类，k-means聚类将386例TNBC肿瘤中的337例分为6类稳定簇（s[i]>0）和49个肿瘤合并成1个不稳定簇（s[i]>0）（图​（图2A）。2A） ●●●●。群集导致独立于每个数据集的所有7个簇中的样本分布，n个=14，表示批次效应等混杂因素，RNA扩增和样品质量不影响簇分布（补充图1）。样本分类稳健性分析一致聚类，包括通过重采样进行k-means聚类（1000次迭代）随机选择肿瘤轮廓。共识矩阵是两个样本在重采样迭代（图​（图2B）。2B） 。组经常相互聚集的样本用图形表示较深的红色阴影。为了确定数据中存在的簇数，我们检查了一致性分布函数（CDF）图曲线下的面积（图​（图2C）。2C） ●●●●。区域下方的点随着簇数（k）的增加，曲线不再显示出显著增加表示理想的簇数（图​（图2D2D和参考。19). 因此最佳聚类数为7，由一致性图定义，一致性图与k-means聚类（6个稳定，1个不稳定）。无监督尺寸缩减主成分分析显示肿瘤间GE的基本差异通过k-means和一致性聚类确定的亚型（图​（图2E）。2E） ●●●●。

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图2

TNBC亚型的鉴定。

(A类)显示构图的剪影图(n个=肿瘤数量）和TNBC上k均值聚类的稳定性（平均宽度）训练套件。s（I）>0的簇被认为是稳定的。(B类)一致性聚类显示样本的稳健性基于k均值多次迭代（×1000）的分类聚类(C类)CDF描述了给定簇数（k）的一致性矩阵。(D类)最佳面积相对变化点的簇数为7CDF图下的（Δ）不随k的增加而变化。(E类)用图形描述基本原理的主成分分析TNBC集群之间的GE差异。集群（子类型）命名为展示。

评估是否可以从独立的TNBC中产生类似的TNBC亚型队列中，201个TNBC样本由双峰滤波法汇编而成（补充表1）7个额外的公共可用数据集（表​（表2）。2). GE签名来源于差异最大的在TNBC训练集中发现并使用的基因（见方法和补充表3）预测哪种TNBC亚型最适合验证中的每种肿瘤（补充表4）。验证集中的每个样本被分配给TNBC亚型来源于基于最高Pearson的训练数据集相关性和最低P（P）值（补充表4）。样品相关性不同于P（P）考虑了<0.05无法分类。验证集产生了与这些相似的比例亚型训练集的初始k-means聚类。在分析之后完成后，我们结合培训和验证进行了一项特别分析数据集（587个肿瘤），共鉴定出7种亚型聚类（补充图2），在基因本体中具有类似的丰富性。这个进一步验证了亚型的稳定性，并表明增加样本量不会改变最佳簇数。获得的RNA的GE图谱评估来自2个数据集的肿瘤细胞激光捕获显微切割（GSE-22513；GSE-28821；GES-28796，表​表1；1; GSE-5847，表​表2）2)显示出类似的分布模式在所有7个亚型中，表明这些亚型确实具有代表性主要是由上皮肿瘤细胞而非基质成分引起的GE肿瘤周围（即炎症细胞、肌成纤维细胞等）（补充图3）。

不同的基因本体与每个TNBC亚型相关。

作为分析TNBC亚型的独立方法，基因集富集分析（GSE-A）(20)对来自培训（补充表5）和验证集（补充表6）确定与每个TNBC亚型相关的顶级典型途径。顶部富集基因(P（P）<0.05），从培训集中确定用于预测验证集，显示在图中的热图中​图3。三.顶级标准路径每个子类型的训练集和验证集重叠，表明亚型在独特的途径中可重复富集（补充表7）。我们的7个TNBC亚型根据基因本体论和差异GE，随后标记如下：类碱性1（BL1）；类基底2（BL2）；免疫调节；间充质（M）；间充质干样（MSL）；腔雄激素受体；和不稳定（UNS）（图​（图3）。三). 5个数据集的独立分析基于通过IHC染色鉴定TNBC(n个=183）形成4个集群GE与基底样、IM、间充质样和LAR亚型相似（补充图4和5）。

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图3

TNBC亚型中的GE模式是可复制的。

显示相对GE（log）的热图₂，–3至3）顶级差异表达基因(P（P）<0.05）训练集中的亚型（左）和相同的差异表达基因用于预测验证集（右）中最适合的TNBC子类型。重叠的基因本体论（GO）术语，用于GSE-A确定的培训和验证集显示在热图。

BL1和BL2亚型。

BL1亚型的顶级基因本体在细胞周期和细胞分裂成分和途径（细胞周期、DNA复制反应、，G公司₂细胞周期途径、RNA聚合酶和G₁至S电池循环）（图​（图3）。三). 支持注释通过与增殖相关的基因的表达，例如奥卡,AURKB公司,CENPA公司,中央应急电源,BUB1（业务单元1）,TTK公司,CCNA2号机组,PRC1,MYC公司,国家可再生能源管理局,PLK1、和BIRC5公司（补充图6）。伴随着DNA损伤反应（ATR/BRCA）通路的升高BL1亚型的增殖途径（图​（图3）。三). 细胞增殖增加和细胞周期检查点丢失是一致的DNA损伤反应基因的高表达(CHEK1（检查1）,FANCA公司,FANCG公司,雷达54bp,RAD51系列,国家广播公司,EXO1公司,MSH2型,MCM10型,RAD21型、和MDC1型)（补充图6）。

该发现进一步支持了该亚型的高度增殖性Ki-67 mRNA高表达(MKI67型)（补充图6）和通过IHC分析评估核Ki-67染色（BL1+BL2=70%，与其他亚型=42%；P（P）<0.05）（补充图7）。富集基底样TNBC肿瘤中增殖基因和Ki-67表达增加表明该亚型优先对抗有丝分裂剂产生反应，如紫杉烷（紫杉醇或多西紫杉醇）(21,22). 在比较42例TNBC患者达到病理完全缓解（pCR）的百分比2项研究中使用新佐剂紫杉烷治疗的患者(22,23). 在这些组合中研究，肿瘤与基底样（BL1和BL2）相关的TNBC患者亚型具有显著较高的pCR（63%；P（P）=0.042）处理时与间质样（31%）或LAR（14%）相比，以紫杉醇为基础的治疗子类型（补充图8）。

BL2亚型显示了涉及生长因子信号传导的独特基因本体（EGF途径、NGF途径、MET途径、Wnt/β-catenin和IGF1R途径）以及糖酵解和糖异生（图​（图3）。三). 同样，BL2亚型也富含生长因子受体GE，如表皮生长因子受体,遇见、和EPHA2型（补充图6）。此子类型具有功能高表达水平提示基底/肌上皮起源属于TP63型和多金属元素（CD10）（补充图6）。

IM子类型。

IM亚型丰富了免疫细胞过程中的基因本体。这些这些过程包括免疫细胞信号传导（TH1/TH2途径、NK细胞途径、B细胞受体[BCR]信号通路、DC通路和T细胞受体信号通路），细胞因子信号传导（细胞因子途径、IL-12途径和IL-7途径），抗原处理和呈现，以及通过核心免疫信号转导的信号传递通路（NFKB、TNF和JAK/STAT信号）（图​（图3）。三). 免疫信号转导GE证实了IM信号（补充图6），除免疫细胞表面抗原外，细胞因子信号转导、补体级联、趋化因子受体和配体以及抗原演示文稿（补充图9）。由于显微解剖属于IM亚型，IM特征可能是肿瘤细胞本身特有，而不是免疫细胞浸润的反映（补充图3）。IM亚型中的免疫信号基因髓质乳腺癌的基因特征重叠，这是一种罕见的组织学特征TNBC的独特形式，尽管其组织学分级与预后良好(24).

M和MSL亚型。

M亚型显示了大量丰富的各种独特的基因本体参与细胞运动的成分和途径（Rho对肌动蛋白的调节），ECM受体相互作用和细胞分化途径（Wnt途径，间变性淋巴瘤激酶[ALK]通路和TGF-β信号传导）（图​（图3）。三). MSL亚型共有丰富的基因M亚型的类似生物学过程，包括细胞运动（Rho途径）、细胞分化和生长途径（ALK途径，TGF-β信号转导和Wnt/β-catenin途径）。然而，独特的MSL的基因代表与生长因子相关的成分和过程信号通路包括肌醇磷酸代谢、EGFR、PDGF、钙信号转导、G蛋白偶联受体、ERK1/2信号转导和ABC转运体和脂肪细胞因子信号（图​（图3）。三).

细胞分化和生长因子信号通路的流行是TGF-β信号通路成分的表达说明(TGFB1L1型,BGN SMAD6系列,SMAD7系列,槽口1,TGFB1型,TGFB2型,TGFB3型,TGFBR1型,TGFBR2型、和TGFBR3型)，上皮-间充质转化-相关（EMT-相关）基因(基质金属蛋白酶2,ACTA2公司,SNAI2公司,SPARC公司,TAGLN公司,TCF4类,扭转1,ZEB1号机组,COL3A1系列,COL5A2系列,GNG11号机组,ZEB2型和E-钙粘蛋白减少[CDH1型]表达）、生长因子（FGF、IGF和PDGF途径），以及Wnt/β-catenin信号(CTNNB1公司,丹麦克朗,丹麦克朗3,SFRP4系统,TCF4类,TCF7L2型,FZD4型,CAV1型,空腔2、和CCND2号机组)（补充图6）。这个MSL亚型还富含参与血管生成的基因，包括血管内皮生长因子2(韩国存托凭证),TEK公司,TIE1（轮胎1）、和EPAS1系统以及免疫信号IM亚型特有的GE重叠证明了这一点（补充图9）。

M亚型和MSL亚型之间的一个有趣的区别是MSL亚类型表达低水平的增殖基因（补充图6）。这减少了增殖伴随着与干细胞(澳大利亚广播公司8,程序,发动机,ALDHA1型,性能1,澳大利亚广播公司1,接口2ip BCL2级,宝马2、和1泰铢)，数量众多HOX基因(HOXA5型,HOXA10型,中小企业1,中小企业2,MEOX1（墨西哥）,MEOX2公司、和MSX1系列)和间充质干细胞特异性标记物(宝马2,发动机,ITGAV公司,韩国存托凭证,NGFR公司,NT5E公司,PDGFRB公司,1泰铢、和VCAM1公司)（补充图6和数据未显示）。信号通路成分M组和MSL组差异表达具有相似的特征去分化型乳腺癌称为化生型乳腺癌以间充质/肉瘤样或鳞状特征为特征，并且具有化疗耐药性(25).

MSL亚型也显示出claudins 3、4和7的低表达，与最近发现的一种克劳丁-罗乳腺癌亚型（补充图6和10，以及参考。26). 分层聚类使用claudin-low基因预测集的TNBC GE图谱(n个=770）分离出一部分低克劳丁（3、4和7）的M和MSL亚型，细胞角蛋白(韩元7,韩元8,吉尔吉斯斯坦共和国18,和19韩元)、和CD24型表达式（补充图10和参考。26). 这个人口claudin-low表达的肿瘤也有高表达的基因与EMT相关(FBN1型,基质金属蛋白酶2,PDGFRB公司,1泰铢,火花塞,TGFBR2型,PDGFRA公司,扭转,CAV1型,CAV2型、和SERPINE1系列).

LAR亚型。

LAR组的GE在TNBC亚型中差异最大。此子类型为ER阴性，但基因本体论在激素调节途径中大量丰富包括类固醇合成、卟啉代谢和雄激素/雌激素代谢（图​（图3）。三). 因此，我们调查了以前的其他激素调节途径，如雄激素受体（AR）信号在ER阴性乳腺癌中报告(27),可能负责此LAR亚型中的GE模式。事实上，我们发现AR mRNA高表达，平均为所有其他亚型的9倍（补充图6）。LAR组中的肿瘤也表达大量下游AR目标和辅激活因子(DHCR24型,阿尔卡姆,FASN公司,FKBP5型,APOD公司,项目实施计划,SPDEF公司、和CLDN8号机组)（补充图6）。除了AR mRNA表达，我们通过IHC研究了所有TNBC肿瘤中AR蛋白的表达范德比尔特队列(n个= 20). 肿瘤细胞得分百分比与核AR染色相比，染色强度在LAR亚型（>10倍；P（P）<0.004）与所有其他TNBC亚型（补充图11）。我们执行分级利用AR激活的基因特征进行聚类(28)TNBC肿瘤数据集的训练和验证。分层的利用该特征进行聚类，将大多数LAR肿瘤特征从其他亚型（补充图12）。LAR亚型肿瘤显示管腔GE图案，具有FOXA1公司,吉尔吉斯斯坦共和国18、和XBP1型在表达量最高的基因中（补充图13A）。其他人先前描述了一种表达AR的乳腺癌亚群，称为分子顶分泌(29).虽然我们没有关于所有LAR肿瘤的详细病理报告研究中，我们使用TNBC亚组GE质心来关联来自GSE-1561（参考。29和表​表1）。1). 所有6种顶泌肿瘤的GE图谱({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSM26883”，“term_id”：“26883”}}GSM26883标准,{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSM26878”，“term_id”：“26878”}}GSM26878标准,{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSM26886”，“term_id”：“26886”}}GSM26886标准,{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSM26887”，“term_id”：“26887”}}6887克,{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSM26903”，“term_id”：“26903”}}GSM26903标准、和{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSM26910”，“term_id”：“26910”}}GSM26910标准)中描述的该研究与LAR密切相关，表明LAR TNBC亚型由包括分子顶分泌亚型的AR驱动肿瘤（补充表8).

TNBC的内在分子乳腺癌亚型分类。

乳腺癌可分为管腔型或基底样，这取决于其不同细胞角蛋白的表达。TNBC肿瘤亚型显示差异两种碱性细胞角蛋白的表达(韩元5,KRT6A公司,韩国T6B,14韩元,KRT16型,17韩元,KRT23公司、和81韩元)和管腔细胞角蛋白(韩元7,韩元8,吉尔吉斯斯坦共和国18、和19韩元)横跨子类型（补充图13）。UNS、BL1、BL2和M亚型表达基础细胞角蛋白表达水平较高，而LAR亚型中的肿瘤基底细胞角蛋白表达不足，管腔细胞角蛋白高表达和其他管腔标记(FOXA1公司和XBP1型)（补充图13A）。

除了细胞角蛋白表达外，乳腺癌还可以通过“固有/UNC”306基因分为5个主要亚型（基底样、HER2样、正常乳腺样、管腔A和管腔B）(30). 由于跨国公司在很大程度上被考虑我们将386个TNBC肿瘤特征与内在基因进行了关联如前所述，设置5个分子亚型的质心(30). 肿瘤被分配给1个分子基于每个TNBC表达之间最高相关系数的亚型剖面图和5个分子亚型质心。该分析结果为49%(n个=188）我们的TNBC训练集归类为基础类，14%(n个=54）作为管腔A，11%(n个=42）正常乳房状，8%(n个=31）灯具B，5%(n个=19）作为HER2，13%(n个=52）作为不可分类（补充图13B和补充表9）。这证实了大多数TNBC属于类基底分子亚型。不稳定肿瘤和BL1肿瘤与基底样固有分子分类密切相关（分别为76%和85%）。然而，BL2、IM和M亚型仅为中度与类基底分子类相关（分别为31%、58%和47%）部分肿瘤未分类（分别为22%、17%和18%）（补充图13B）。M亚型和MSL亚型的肿瘤比例最大分类为正常乳房样（分别为25%和46%）。BL2，M、 和MSL亚型是一种混合分类，表明其内在的分类系统可能不适合表征这些TNBC亚型。这个LAR亚型中的大多数TNBC肿瘤被归类为管腔A或管腔B（82%），无基底样，进一步支持了LAR亚型的管腔起源（补充图13）。虽然只有49%的根据内在基因集IHC将肿瘤分类为基底样范德比尔特肿瘤亚群染色(n个= 25)显示大多数（88%）TNBCs基底细胞角蛋白染色阳性CK5/6（补充表10）。此外，56%的范德比尔特肿瘤染色EGFR阳性，类似于先前的研究发现56%的n个=929项来自34项EGFR或CK5/6阳性研究(31). 没有统计学差异在TNBC亚型中CK5/6和EGFR染色之间。因此，大多数跨国公司IHC显示基础样表型，而只有大约一半与类基底固有基因集。

患者无复发生存率和无远处转移生存率TNBC亚型之间存在差异。

TNBC亚型之间的无复发生存率（RFS）存在显著差异（对数秩检验；P（P）=0.0083）（补充图14A），尽管治疗的可变性和治疗持续时间。RFS在LAR亚型与BL1（危险比[Hr]=2.9）、IM（Hr=3.2）和MSL（Hr=10.5）亚型(P（P）<0.05）（补充图14B）。与BL1相比，M亚型的RFS显著降低（Hr=2.6）和IM（Hr=2.9），而MSL亚型的RFS高于M亚型（补充图14B）。无远处转移生存（DMFS）TNBC亚型之间无差异（log-rank检验；P（P）=0.2176），但M亚型的Hr显著高于BL1（Hr=2.4，P（P）<0.05）和IM（Hr=1.9，P（P）<0.06）亚型（补充图14，C和D）。在没有LAR亚型患者DMFS增加表明复发是由于局部复发。肿瘤大小和分级在TNBC之间没有显著差异亚型，但LAR亚型的诊断年龄更大(P（P）<0.0001），可能导致该亚型的RFS降低其他子类型（补充图15和数据未显示）。

TNBC亚型的TNBC细胞系模型。

细胞系模型将有助于临床前实验来定义差异药物这种异质性疾病中不同亚型的敏感性。使用两个独立乳腺ER、PR和HER2 GE水平的双峰滤波方法癌症细胞系数据集（GSE-10890和ETABM-157），我们确定了24个和25个GSE-10890和ETABM-157 GE数据集中的三阴性细胞系（补充表1）。在这两个数据集中的细胞系中，几乎所有的细胞系都有通过双模滤波对三重负状态的类似预测一些细胞系（例如HCC1500和HCC1937）可能是由于培养方法和/或培养过程中激素受体随着时间的推移而表达缺失。对这两个数据集的分析确定了30个非重叠的TNBC细胞系。

细胞系的GE图谱与质心相关（补充表3） 针对6种TNBC亚型中的每一种（补充表11）。大多数细胞将品系（30个中的27个）分为TNBC亚型（表​（表3），三)，除了BT20、HCC1395和SW527，它们具有低多个亚型之间的相关性（<0.1）或相似(P（P）> 0.05). 在含有已知巴西航空公司1和巴西航空公司2突变，5个与BL1或BL2亚型（HCC1937、HCC1599、HCC2157、HCC3153和SUM149PT），一致这种亚型包含DNA修复途径缺陷的肿瘤（表​（表3）三)和基因本体论丰富的GE参与细胞周期和DNA修复功能（补充图6）。此外，cellBL1和BL2亚型中的株系基因组更不稳定，显示染色体重排明显多于间充质亚型（M和MSL）（平均易位、反转、缺失=34对14，分别；P（P）<0.01），由SKY-FISH确定(网址：http://www.path.cam.ac.uk/~pawefish/index.html)（补充图16). 与碱性固有分子亚型相关的所有细胞系属于BL1、BL2或IM亚型（表​（表3）。三). 只有2个细胞株（HCC1187和DU4475）被放入IM亚型，这表明IM亚型在细胞培养中代表性不足。

表3

TNBC细胞系的亚型分配

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M和MSL亚型的细胞系是由高度去分化的源自独特病理学的肿瘤（例如HS578T、癌肉瘤和SUM159PT，间变性癌），并表达上皮和间充质成分。全部属于M和MSL亚型的细胞株在2D上具有纺锤状形态培养基（CAL-120、CAL-51、MDA-MB-157、MDA-MB-231、MDA-MB-436、SUM159PT、HS578T和BT549）或3D中的星状形态(32).五种与LAR亚型匹配的细胞系（MDA-MB-453、SUM185PE、HCC2185、CAL-148、，和MFM-223）。

通过对乳房的GE分析，确定了两个不同的基础组（A和B）癌细胞系(33). 碱性A细胞系显示上皮特征并与巴西航空公司1基因特征，而基底B细胞系侵袭性更强，显示间充质细胞以及干细胞/祖细胞样特征。我们的GE分析显示，大多数的基底A细胞系属于BL1和BL2亚型，而B细胞系分为M和MSL亚型（表​（表3）。三). 我们对所有TNBC细胞系使用层次聚类分析肿瘤中差异表达最明显的基因，以确定GETNBC亚型中细胞系的模式相似（补充图17）。鉴定出三个簇：LAR，包含所有4个LAR系；类基底，包含BL1和BL2亚型的品系；和间充质样，包含线条在M和MSL亚型中。聚类分析表明TNBC细胞系可分为三大类：类基底（BL1和BL2）；间充质样（M和MSL）；和LAR。该分类将在后续章节中使用。

TNBC细胞系对治疗药物有不同的敏感性。

有多种靶向治疗正在进行临床研究TNBC患者，包括以PARP为靶点的患者(9)、AR(34)，高级(13)和PI3K/mTOR(35)发出信号。我们使用TNBC细胞系小组来评估对几种靶向这些途径的药物的不同反应。为了进行比较，我们还分析了原始人类乳腺上皮细胞（HMECs）在我们的细胞活力中的作用化验。我们测定了半最大抑制浓度（IC₅₀)以下药物的值[靶点]：veliparib（ABT-888）[PARP1/2]；奥拉帕林（AZD2281）【第1/2部分】；顺铂[DNA]；比卡鲁胺；17-DMAG[Hsp90]；达沙替尼[高级/高级]；和NVP-BEZ235[PI3K和mTOR]。

细胞周期和DNA损伤反应基因在BL1和BL2亚型中升高（补充图6），以及单元格行面板中的7行中的5行巴西1/2-突变存在于这些亚型中（表​（表3）。三). 鉴于之前的临床试验PARP抑制剂和顺铂的观察(36–38)，我们预测这些药剂会优先降低具有DNA的细胞系的活力修复代表BL1和BL2亚型的缺陷。我们治疗了TNBC细胞系小组使用PARP抑制剂veliparib和olaparib，但未发现所有代表基底样TNBC亚型的细胞株对PARP敏感抑制（图​（图4，4，A–D）。这个巴西航空公司1-空白细胞株HCC1937对绒毛膜脂敏感（集成电路₅₀=4μM），但不包括奥拉帕林（IC₅₀>100μM），而BRCA1突变MDA-MB-436对两种PARP均敏感抑制剂（veliparib IC₅₀=18μM和olaparib集成电路₅₀=14μM）。这个巴西航空公司2-突变细胞系HCC1599对PARP抑制剂（veliparib IC）缺乏敏感性₅₀>30μM和olaparib IC₅₀>100μM）。因此，除了巴西1/2肿瘤的状态和其他特性可能指示对给定PARP抑制剂的敏感性。与PARP抑制剂敏感性不同，基底样细胞系对顺铂的敏感性明显高于间质样细胞系线路（平均IC₅₀=8μM与IC₅₀= 16微米，P（P）=0.032）或LAR线（平均IC₅₀=8μM与IC₅₀=15μM，P（P）= 0.017)（图​（图4，4、E和F）。这个巴西航空公司1-突变细胞（SUM149PT、HCC1937和MDA-MB-436）和巴西航空公司2-突变细胞（HCC1599）对顺铂治疗（图​（图4E）。4E） ●●●●。

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图4

碱性TNBC亚型对DNA损伤有不同的敏感性代理人。

集成电路₅₀用PARP抑制剂处理的TNBC细胞系的值(A类)veliparib(C类)奥拉帕林，或(E类)顺铂72小时。误差条反映了3个独立实验的SEM。图中各条横线上方的黑色水平线表示未能实现IC₅₀在最高剂量的veliparib（30μM）、olaparib（100μM）或顺铂（30μM）。携带BRCA1或BRCA2突变的细胞系（粉红色）显示在图表。点图显示了PARP抑制剂药物敏感性的对数分布(B类)绒毛膜(D类)奥拉帕林，或(F类)顺铂在基底样亚型（BL=BL1+BL2）、间质样亚型（ML=M+MSL）和LAR亚型。点中的黑色水平条图中显示了平均IC₅₀对于每个子类型*从统计角度来看IC的显著差异₅₀BL值与ML值的比较(P（P）=0.017）和LAR(P（P）=0.032），如由Mann-Whitney确定U型测试。

由于LAR亚型（MDA-MB-453、SUM185PE、CAL-148、，和MFM-223）表达高水平AR mRNA和蛋白质（补充图18A），我们比较了TNBC细胞株对AR拮抗剂比卡鲁胺的敏感性（图​（图5，5、A和B）。集成电路₅₀的值大多数TNBC细胞系在使用最高剂量500微米。然而，所有接受测试的LAR细胞系（SUM185PE、CAL-148、MDA-MB-453、，和MFM-223）和表达低水平AR（HS578T、BT549、CAL-51和MDA-MB-231）对比卡鲁胺的敏感性高于基底样细胞系（平均IC₅₀=227μM与。集成电路₅₀>600微米，P（P）= 0.007; 和平均IC₅₀=361μM与IC₅₀>600微米，P（P）分别=0.038）（图​（图5A）。5A） ●●●●。

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图5

LAR TNBC亚型对AR和Hsp90的敏感性差异抑制剂。

集成电路₅₀用(A类)比卡鲁胺或(C类)Hsp90抑制剂17-DMAG持续72小时。比卡鲁胺上方的黑色条表示未能实现IC₅₀。热图显示相对AR表达式（日志₂)跨TNBC细胞系。点图显示的是药物敏感性(B类)比卡鲁胺或(D类)17-DMAG英寸基底样（BL=BL1+BL2）、间质样（ML=M+MSL）和LAR子类型。点图中的黑色水平条表示平均IC₅₀对于每个子类型*统计上的显著差异集成电路₅₀LAR值与BL值(P（P）=0.007）或毫升(P（P）=0.038）比卡鲁胺和LAR对BL和ML后(P（P）=0.05）17-DMAG处理后，根据曼·希特尼U型测试。

因为AR需要Hsp90伴侣来实现适当的蛋白质折叠和稳定性(39)，我们测定了细胞的灵敏度连接至Hsp90抑制剂的线路板，17-二甲基氨基乙基氨基-17-脱甲氧基-台达那霉素（17-DMAG）。同样，LAR细胞与大多数类基底细胞相比，线对17-DMAG更敏感（平均IC₅₀=16 nM与IC₅₀=81毫微米；P（P）=0.004）和间质样（平均IC₅₀=16 nM相对于IC₅₀=117毫微米；P（P）=0.05）细胞系（图​（图5，5尽管17-DMAG还有许多其他目标。这些数据非常强大表明LAR肿瘤由AR信号驱动，AR代表治疗此子类型的目标。重要的是，TNBC患者的AR状态代表抗雄激素治疗患者预选的分子标记物。

为了确定LAR细胞系的生长是否依赖AR，我们转染MFM-223、MDA-MB-453和SUM185PE细胞系AR靶向siRNA。我们在蛋白质水平（补充图18B），进行菌落生长分析，并进行分析siRNA转染14天后形成的菌落数量。所有人的能力AR基因敲除后，形成集落的LAR细胞系显著减少与对照样品相比的表达（MFM-223=55%，P（P）=0.031; MDA-MB-453=51%，P（P）= 0.004; SUM185PE＝42.3%，P（P）=0.002）（补充图18C），表示AR表达在一定程度上负责肿瘤细胞的生存能力。

间充质样亚型的GE分析表明构成EMT相关成分和通路的基因表达（TGFβ、ECM受体相互作用、ALK、Wnt/β-catenin和Rac1）和与细胞运动相关的细胞（局部粘附、整合素信号、，Rac1、横纹肌收缩和Rho GTPase对肌动蛋白的调节（图​（图3）。三). 由于非受体酪氨酸激酶Src在细胞迁移中起关键作用，间充质样亚型丰富在细胞运动途径中，我们分析了Src抑制剂达沙替尼对TNBC线路面板。属于间充质样亚型（M和MSL）对达沙替尼的敏感性高于LAR细胞系（平均集成电路₅₀=22μM与IC₅₀=88微米，P（P）=0.024）（图​（图6，6、A和B） ●●●●。

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图6

间充质样TNBC亚型对达沙替尼和NVP-BEZ235。

集成电路₅₀经处理的每个TNBC细胞的值(A类)达沙替尼或(C类)NVP-BEZ235 72小时。具有PIK3CA公司PTEN突变（红色）或缺失（蓝色，圆形指示突变）显示在NVP-BEZ235图形下方。点图显示药物敏感性对数分布(B类)达沙替尼或(D类)类基底亚型中的NVP-BEZ235（BL=BL1+BL2），间充质样亚型（ML=M+MSL）和LAR。中的黑色水平条点图表示平均IC₅₀对于每个子类型。*IC的统计显著差异₅₀BL值与ML值(P（P）=0.020），当用达沙替尼和ML与BL治疗时(P（P）=0.001）和LAR与BL(P（P）=0.01）当根据Mann-Whitney的测定，用NVP-BEZ235处理U型测试。

自从激活了PIK3CA公司是最常见的基因乳腺癌事件(40)，我们治疗了含有双PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235的TNBC细胞系(41). 激活PI3K/AKT信号传导的TNBC细胞系到皮克3卡突变或PTEN缺乏（表​（表3）三)对NVP-BEZ235高度敏感（图​（图6C）。6C） ●●●●。此外，间充质样TNBC细胞系与基底样细胞系相比，对NVP-BEZ235更敏感（平均集成电路₅₀=44 nM与IC₅₀=201纳米；P（P）= 0.001)（图​（图6，6C和D），这可能表明PI3K通路的放松调控对该亚型很重要。LAR细胞系与基底样细胞系相比，对NVP-BEZ235更敏感（平均集成电路₅₀=37nM对116nM；P（P）=0.01）（图​（图6，6、C和D）。这种敏感性可以用以下公式来解释PIK3CA公司突变，LAR亚型中常见，所有LAR细胞行包含PIK3CA公司-激活突变（HCC2185，MDA-MB-453CAL-148、MFM-223和SUM185PE）（表​（表3）。三).While期间PIK3CA公司突变预测NVP-BEZ235敏感性，PTEN缺陷（突变或蛋白表达缺失）与敏感。

通过双模滤波进行数据集采集和TNBC识别。

我们从14个公开获得的乳腺中汇编了2353份人类乳腺癌基因图谱癌症微阵列数据集（GEO，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds; 阵列Express，http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae/)包括112个初乳我们机构（范德比尔特大学医学中心）的癌症通用电气简介。全部范德比尔特组织样本取自范德比特治疗的个体大学获得了机构审查委员会的批准，所有患者都签署了协议特定同意。所有GE图谱均在Affymetrix微阵列上生成并收集用于识别训练数据集的TNBC（表​（表1）。1). 另外894份乳腺癌GE资料从7个数据集中收集了用于验证TNBC的识别数据数据集（表​（表2）。2). 每个的原始GE值数据集(n个=21）使用RMA程序独立归一化。Affymetrix探针205225_at、208305_at和216836_s_at被选为代表急诊室,公共关系、和HER2型表达式，分别(64). 对于每个数据集，ER、PR和HER2的经验表达分布使用2组分高斯混合分布模型和参数估计如下最大似然优化，使用最佳功能（R统计软件，http://www.r-project.org). 然后我们估计了后验概率ER、PR和HER2的阴性表达状态。样本被分类为如果后验概率小于0.5，则为阴性表达。初始时分层聚类表明一些样本来自相同的肿瘤，但在不同的数据集中。在主成分分析后，去除了这些异常值和其他异常值。收件人确保所有ER/PR/HER2阳性肿瘤均被切除，并进行二次过滤在通过双峰滤波识别的合并样本上。TNBC肿瘤对每个参数（ER、PR和HER2）进行重新规范化，并进行5个阳性对照来自4个IHC阳性的数据集，在肿瘤中心附近表达mRNA正双峰（图​（图1B）。1B） 。只有肿瘤表达量比阳性表达量减少了10倍以上对照组被认为表达阴性，并用于进一步分析，产生386个TNBC肿瘤（训练集）和201个TNBC瘤（验证集）。

规范化、数据缩减和跨平台批量效应消除。

培训(n个=386）和验证(n个=201）TNBC由2分量高斯分布模型识别的数据集是RMA标准化、汇总和日志转换，使用来自每个数据集。对于包含多个探针的基因选择样本的四分位间距来表示基因。批次通过将每个基因拟合到一个固定14和7的线性模型来消除影响对每个数据集的影响。该模型的剩余基因(n个=13060）用于随后的聚类分析。

基于基因工程的TNBC亚型鉴定。

使用k-means聚类和一致性聚类确定最佳数量稳定的TNBC亚型。通过一致性聚类评估聚类稳健性使用凝聚k-means聚类（1000次迭代），平均链接为使用差异表达最多的基因的386个TNBC图谱（SD>0.8；n个＝1510个基因）（基因模式3.2.1版、GSE-A，http://www.broadinstitute.org/gsea/) (19). 根据CDF确定最佳簇数绘制在范围内定义的相应经验累积分布[0,1]，根据CDF下面积增加比例的计算曲线。集群数量在集群数量进一步增加时决定（k） 不会导致CDF面积的相应显著增加。PCA和加热地图是使用Genespring GX ver.10软件（Agilent）生成的。

功能注释。

与所有其他样本相比，对每个TNBC亚型进行基因富集测试使用GSE-A软件(20). 基因测试用于富集典型路径的C2策划基因集。使用GSE-A算法（1000个排列），最丰富的标准路径根据标准化富集分数（NES）大于0.4和错误选择发现率（FDR）q值小于0.60。选择了0.60的FDR截止值由于跨21项研究的数据集收集缺乏一致性，以及更严格的FDR截止值导致更少的结果，可能会被忽视重要路径。

TNBC亚型基因特征衍生。

在至少50%的为每种亚型选择样本进行进一步分析。在每个集群内每个选定的基因，我们应用非参数Kruskal-Wallis检验来确定在所有6组中，基因与中位数GE显著不同。重大Bonferroni's基因调整P（P）值小于0.05包含在组合基因签名中(n个=2188）TNBC亚型，用于预测独立验证集以及对TNBC细胞系进行分类。验证集中的每个样本都分配给一个TNBC基于最高皮尔逊相关性和最低相关性的亚型P（P）值到来自训练数据集的一种亚型（补充表4）。相关性不同于P（P）小于0.05的值被认为是不可分类的。

TNBC细胞系分类。

TNBC细胞系（GSE-10890和E-TABM-157）的GE数据与每个TNBC亚型的GE特征的质心。来自TNBC的GE数据将肿瘤和细胞系结合起来，使每个基因标准化为平均值=0和SD＝1。细胞系的GE图谱与质心相关6种TNBC亚型中的每一种（补充表11）。删除6的尺寸效果基因签名，我们估计P（P）的值使用重采样（bootstrap，n个=1000）方法和估计每个重采样的相关系数。细胞系被分配给相关性最高的TNBC亚型（表​（表3），三)和那些相关性低（<0.1）或相似的在多个子类型之间(P（P）>0.05）考虑未分类。

细胞增殖/活力测定和IC₅₀决定。

所有使用的细胞系和培养条件均可在补充方法中找到（补充表12）。我们进行了短串联重复序列（STR）DNA指纹分析对本研究中使用的所有TNBC细胞系进行分析（细胞系遗传学）。所有单元格行匹配STR数据库（ATCC、DSMZ和Asterand），它们的身份是由Cell Line Genetics的认证流程确认。乳腺癌细胞系和将HMEC（3000–10000个细胞）接种在96周的四个孔中板材。细胞在阿拉马蓝（Invitrogen）的存在下培养，基线检查（药物前）荧光（Ex/Em:560/590 nm）测量结果如下隔夜连接。然后用新鲜培养基（对照）或含有以下药物的半对数系列稀释液的培养基：0.3–30μM olaparib（化学科技），0.3-30μMveliparib（ChemieTek），1–100μM比卡鲁胺（IPR制药），0.3–30μM顺铂（APP制药），3–300 nM NVP-BEZ235（Chemdea），10–1000 nM 17-DMAG（ChemieTek）和0.1–10μM达沙替尼（LC实验室）。通过测量代谢后的荧光强度来确定活性在药物存在/不存在的情况下，72小时后alamarBlue的还原。可行性试验分为三次，重复试验标准化为未处理试验油井。抑制浓度（IC₅₀)值在以下时间后确定如前所述剂量-反应曲线的双对数变换(65). 对于细胞系药物分析，数据对代表TNBC亚型的不同细胞系产生的细胞进行了比较使用非参数Mann-WhitneyU型测试。所有分析和使用Prism软件（4.0c版；GraphPad）进行图形表示软件），数值表示为平均值±SEM。

Kaplan-Meier生存分析和Hr。

采用对数秩和检验确定TNBC亚型的生存意义Kaplan-Meier生存曲线、RFS和DMFS。使用Cox比例风险模型计算Hr，通过两两比较显示生存率的差异TNBC亚型(P（P）< 0.05).

异种移植肿瘤研究。

五周大雌性无胸腺nude-Foxn1^努老鼠（Harlan Sprague-Dawley）注射（皮下注射）约5×10⁶（CAL-51、HCC1806、MDA-MB-468和SUM185PE）或约10×10⁶悬浮在培养基（200）中的（CAL-148和SUM159PT）细胞μl）用22号针头注入每个侧面。描述无胸腺小鼠异种移植瘤的形成过程由范德比尔特机构审查委员会。一旦肿瘤体积达到25–50毫米^三，小鼠被随机分配到治疗或车辆臂。治疗包括口服比卡鲁胺（100 mg/kg/d），静脉注射顺铂。（8 mg/kg/wk）或NVP-BEZ235/口服（50 mg/kg/d）于1:9 N-甲基吡咯烷酮：PEG300中。在指定时间用数字卡尺连续测量肿瘤直径，肿瘤体积计算为宽度²×长度/2。数据点反映了每次治疗16个肿瘤的平均值和SEM。

我们感谢Carlos Arteaga和Harold Moses以及Pieterpol实验室的成员对手稿进行批判性审查。这项研究得到了NIH拨款的支持，具体如下：乳腺癌卓越研究专项（CA95131）；CA148375；CA105436和CA070856（致J.A.Pietenpol）；CA68485（核心业务）；CA009385（致J.A。鲍尔）；美国癌症协会拨款#PF-10-226-01-TBG（致B.D.Lehmann）；和科门基金会拨款SAC110030（给J.A.Pietenpol）。