组织胺脱乙酰酶4通过受体糖化抑制雄激素受体活性

AR和HDAC4形成复合物体内和在体外

为了确定HDAC4和AR是否相互作用，在293细胞中进行体外表达，并进行联合免疫沉淀。如所示图3、A组、AR和标记的HDAC4在表达这两种蛋白的细胞中共同沉淀。在用控制载体pcDNA3-Flag表达AR或HDAC4的细胞中，未检测到共沉淀，表明抗Flag和抗AR抗体没有交叉反应，且共沉淀不是由于AR和Flag标签之间的相互作用所致。

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图3

HDAC4和AR之间的相互作用体内和在体外

（A） ●●●●。将3μg pCMVhAR和Flag-HD4或pcDNA3-Flag作为对照载体转染293细胞。用多克隆抗AR抗体进行免疫沉淀（IP），然后用单克隆抗AR（PG-21）和抗Flag（M2）抗体进行IB。（B） ●●●●。AR和HD4之间的相互作用在体外.AR和His-HD4的相互作用在体外转录/翻译通过方法中描述的下拉分析进行分析。沉淀（上面板）中的AR和HDAC4分别由IB和PG-21和抗HD4检测。pET-30a-他的被包括在在体外转录/翻译反应作为His-HD4的对照。还显示了输入中的AR和His-HD4的水平（下部面板）。（C） ●●●●。LNCaP细胞内源性AR与HD4的相互作用。用10 nM R1881（+）或载体（-）处理细胞24小时，用兔IgG或抗HD4抗体进行IP。IB用抗AR和抗HD4抗体检测沉淀物和细胞提取物中的AR和HD4。β-肌动蛋白印迹显示负载均匀。

接下来，我们测试了复合地层是否发生在体外.AR、His-HDAC4和His标签由试管中的转录偶联翻译反应产生。使用Ni-NTA树脂通过下拉试验分析复合物的形成。如所示图3B组，免疫印迹分析检测到沉淀物中除HDAC4外，还有AR蛋白。在不含His-HDAC4但含His标签的反应中，Ni-NTA树脂没有沉淀AR，表明下拉分析检测到AR和His-HDAC之间存在特定的相互作用。在含有载体或R1881的反应中检测到共沉淀，这表明本构相互作用与AR配体结合无关。

为了使复合物形成有意义，它应该发生在内源性AR和HDAC4之间。LNCaP细胞提取物与抗HDAC4抗体以及兔IgG作为阴性对照进行共沉淀分析。如所示图3在C组中，AR通过抗HDAC4抗体而不是通过IgG与HDAC4共沉淀，表明内源性AR与HDAC4.之间存在特定的相互作用。正如预期的那样，合成雄激素R1881增加了AR蛋白的表达，但不增加HDAC4蛋白的表达以及抗HDAC4抗体沉淀的AR量。β-肌动蛋白免疫印迹显示，沉淀使用了相当数量的蛋白质。

总的来说，这些结合分析表明AR和HDAC4相互作用在体外和体内293细胞中的异位AR在R1881的存在下似乎更有效地结合HDAC4，而在LNCaP细胞中内源性AR没有发生这种情况。293细胞中观察到的配体效应可能只是蛋白质过度表达的伪影。或者，它可以反映两个分子之间的细胞类型特定关系。

HDAC4对AR的抑制主要通过AR SUMO化介导

由于HDAC4是一种脱乙酰酶，我们随后研究了HDAC4的抑制可能是由于AR脱乙酰作用。我们将HDAC4和HDAC1转染到293细胞中，并测试其对K632A/K633A突变AR转录活性的影响，其中两个已知的乙酰化赖氨酸突变为丙氨酸(托马斯等人。, 2004). 与我们的预期相反，乙酰化突变体AR被HDAC4显著抑制(图4A)HDAC1抑制野生型AR的活性，但不抑制乙酰化突变体的活性。两种HDAC均未显著降低AR蛋白水平。

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图4

HDAC4对乙酰化和氨酰化缺陷突变体AR转录活性的影响

（A） 用指示数量的野生型（W）或K632A/K633A突变型（M）AR、Flag-HD4、Flag-HD1或pcDNA3-Flag控制载体以及0.3μg ARR转染293细胞_三TKLuc和0.01μg pCMVβGal。用10 nM R1881（+）或载体（-）处理转基因细胞24小时。在平行分析中测定AR的活性及其表达。对于报告分析，进行了三项独立的实验，并显示了具有代表性的数据。每个数据点是三份分析样本的平均值，误差条表示标准偏差。（B） 除Flag-AR（W）或Flag-K386R/K520R（M）AR在K632A/K633A的位置转染外，293个细胞转染并用R1881处理，与A组相同。测定AR活性和AR、HD4和β-肌动蛋白水平。

然后，我们使用相同的检测系统检测AR SUMO化在阻遏中的参与。如所示图4，图B，HDAC4以剂量依赖的方式抑制野生型AR的活性，但抑制作用因两个已知的AR SUMO化位点K386和K520的突变而显著受损(波卡等人。, 2000). 免疫印迹分析表明，HDAC4的异位表达并没有降低野生型和突变型AR蛋白的水平。总的来说，这些数据表明，抑制作用主要通过AR SUMO化而不是去乙酰化介导。

HDAC4是AR SUMO化的正调节因子

由于HDAC4与AR活性结合并抑制AR活性，并且这种抑制被已知AR SUMO化位点的突变所破坏，可以想象HDAC4可能作为AR SUMO1化的E3连接酶发挥作用。因此，我们接下来在联合转染实验中测试异位HDAC4对AR SUMO化的影响。293细胞中异位HDAC4表达以剂量依赖性的方式增加AR SUMO化，抗SUMO1抗体识别的两种慢迁移AR形式的出现证明了这一点(图5A). 在转染SUMOylation突变体AR的细胞中未检测到这两种较慢的迁移形式，证实它们代表在K386和K520处SUMOylated的AR蛋白(图5B). 抗HA抗体免疫印迹检测到SUMO化AR和HA-SUMO1的存在，表明SUMO酸化AR是异位HA-SUMO3修饰的主要蛋白(图5B). 尽管成熟SUMO1蛋白的分子量约为11 kD，但它在SDS-PAGE中的迁移速度比预期慢得多，通常会向底物添加约20 kD，这解释了为什么AR的两种SUMO化形式的大小约为120和180 kD。免疫印迹显示，HDAC4载体表达HDAC4蛋白，并略微增强AR表达水平，明显低于AR SUMO化水平的增加。SUMO1免疫印迹显示HDAC4对SUMO1表达水平无影响。随后在变性条件下用NI-NTA树脂进行的下拉试验证实了HDAC4对AR SUMO化的积极作用(图5C).

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图5

HDAC4增强完整细胞中AR SUMO化

（A） HD4增强异位AR与内源性SUMO1的结合。用1μg pCMVhAR和指示量的HD4转染293细胞，并用10 nM R1881处理24小时。AR SUMO化通过IP和抗SUMO1测定，然后通过IB和抗AR抗体测定（顶面板）。通过具有同源抗体的提取物的IB测定AR、HD4、SUMO1和β-肌动蛋白水平。（B） ●●●●。HD4增强AR与HA-SUMO1的共轭。用指示量的Flag-AR（WT）或Flag-K386R/K520R（MT）AR、HA-SUMO1和HD4转染293细胞，并用10 nM R1881处理24小时。AR SUMO化通过IP和抗AR测定，然后通过IB和抗HA抗体测定（顶部面板）。用带有同源抗体的提取物的IB测定AR、HD4、HA-SUMO1、SUMO1和β-肌动蛋白水平。（C） ●●●●。HD4增强AR与His-SUMO1的结合。除转染中包含His-SUMO1外，其他细胞均按A组进行转染和处理。AR SUMO化通过Ni-NTA树脂下拉试验测定，然后通过IB和抗AR测定，如方法所述。通过IB（D）测定AR、HD4和β-肌动蛋白水平。体外通过HDAC4实现AR的SUMO化。HD4和Flag-AR（WT）或Flag-K386R/K520R（MT）AR由在体外兔网织红细胞裂解物的转录偶联翻译。我体外试验在重组SUMO1、E1和E2存在的情况下进行SUMO酸化试验。用抗AR抗体IB检测AR和SUMO相关的AR。

测试在体外产生HDAC4以刺激AR SUMO化，将重组AR蛋白添加到包含E1、E2和SUMO1的SUMO反应中。在对照兔网织红细胞裂解物或含有转录偶联翻译产生的HDAC4的裂解物存在下测定AR SUMO化。如所示图5，图D，在含有HDAC4和野生型AR的反应中检测到SUMO化AR，但在与SUMO化突变体的反应中未检测到。AR SUMO化的程度取决于反应中HDAC4的含量。在缺乏HDAC4的情况下，氨酰化AR较弱(图5D).

瞬时转染和报告分析

对于报告者分析，细胞被放置在6孔板中（2×10⁵根据Gibco/BRL提供的方案，将细胞转染给Lipofectamine Plus或Lipofeectamine 2000（LNCaP细胞），转染时间为5小时。转染细胞在含有5%sFBS的培养基中培养，并用雄激素或载体处理24小时。通过将裂解缓冲液（25mM磷酸三钠，pH 7.8，2mM DTT，2mM 1,2-二氨基环己烷-N′，N′，N′，N′-四乙酸，10%甘油，0.2%Triton X-100）直接加入冰上细胞中制备细胞提取物。根据该公司的方案，使用Promega公司（威斯康星州麦迪逊市）的荧光素酶检测系统或双荧光素酶检测系统来测定荧光素素酶活性。如前所述测定β-半乳糖苷酶（β-gal）活性(Bai和Weigel，1996年). 对每个报告活性的重复或三份样品进行检测，并用联合转染的β-gal表达载体的β-ga活性进行标准化，以最小化转染效率变化引起的伪影。

免疫分析

免疫沉淀，2×10⁶将100 mm培养皿中的细胞转染和/或按上述方法处理以进行报告分析。按照说明制备细胞提取物并进行沉淀(锂等人。2003年). 为了进行免疫印迹，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离细胞提取物或沉淀物，转移到硝化纤维素膜上，用同源抗体进行探测，并用所述的增强化学发光进行可视化(李等人。, 2000).

Ni-NTA下拉分析

要分析在体外AR和HDAC4之间的相互作用产生了这两种蛋白在体外使用TNT^®-耦合网织红细胞裂解系统（普罗米加，麦迪逊，威斯康星州）遵循公司的协议。将6μl表达HDAC4和12μl表达AR添加到100μl缓冲液1（50 mM NaH）中₂人事军官₄，300 mM NaCl，10 mM咪唑，pH 7.2），并在4°C下培养3小时。然后将反应与50μl Ni-NTA树脂（缓冲液：树脂，4:1）混合，并摇晃培养过夜。用缓冲液2（50 mM NaH）清洗后₂人事军官₄，300 mM NaCl，20 mM咪唑，pH 7.2）3次，用缓冲液3（50 mM NaH）洗脱蛋白质₂人事军官₄，300 mM NaCl，250 mM咪唑，pH 7.2），并在SDS-PAGE凝胶上分离用于免疫印迹分析。

体外SUMO酸化分析

测定HDAC4对AR SUMO化的影响在体外生产了Flag-AR、Flag-K386R/K520R AR和HDAC4在体外使用任一TNT^®-耦合网织红细胞裂解物系统（普罗米加，威斯康星州麦迪逊）。Flag-AR通过M2微球及其SUMO化纯化，但HDAC4在在体外氨酰化系统（LAE Biotech International）。将1μg纯化的野生型或SUMO突变体AR加入含有SUMO1、E1、缀合物E2和对照网织红细胞裂解物或含有HDAC4的裂解物的20μl反应中。反应在30°C下进行2.5小时，在SDS样品缓冲液中煮沸，并在5%的SDS-PAGE中分析，以更好地分离SUMOylated和非SUMOyleted AR。AR和修饰AR用PG-21抗AR抗体进行免疫印迹检测。

测定PSA的ELISA分析

将LNCaP细胞接种在含有10%FBS的RPMI 1640中。细胞附着后，将其在含有1%炭化物的FBS的RPC 1640中饥饿48小时以耗尽雄激素，转染HDAC4并用DHT处理24小时。收集培养基，并使用Tandem-E PSA免疫酶测定试剂盒（Hybritech Inc.，San Diego，CA）按照制造商的协议测定PSA水平。使用紫外分光光度计测量405nm处的吸光度。PSA浓度（ng/ml）是根据试剂盒提供的已知浓度的PSA对照物生成的标准曲线测定的。

作者感谢X.J.Yang博士提供HDAC4载体，R.J.Matusik提供基于先证素的AR报告基因，P.R.Rennie提供基于PSA的报告基因，G.Jenster提供GST-AR-NT构建，J.J.Palvimo提供AR SUMO化突变体，A.P.Lieberman提供AR乙酰化突变体。这项工作得到了公共卫生服务拨款CA93666和CA111334（W.B）、DOD前列腺癌拨款DAMD17-02-1-0140（W.B）以及佛罗里达州卫生部拨款09KT-03和06BCBG1（W.B.）的支持。