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.2004年12月；24(24):10529-41.
doi:10.1128/MCB.24.24.10529-10541.2004。

Daxx对雄激素受体转录活性的负调控

丁彦琳 1, 新一方, 艾洪玛, Yen-Sung Huang先生, 杨秀浦, 吉多·詹斯特, 新街功, 萧明世
附属公司

Daxx对雄激素受体转录活性的负调控

丁燕林等。 分子细胞生物学. 2004年12月.

摘要

雄激素受体（AR）的转录活性受阳性或阴性调节物调节，在控制前列腺癌细胞的生长和生存中起着关键作用。虽然已经确定了许多积极的调节器，但对AR的消极调节器了解较少。我们在这里报道，Daxx通过直接的蛋白质相互作用发挥负AR协调剂的作用。Daxx的过度表达抑制了COS-1和LNCaP细胞中AR介导的启动子活性和LNCa P细胞中AR-介导的前列腺特异性抗原表达。相反，RNA干扰下调内源性Daxx表达可增强雄激素诱导的LNCaP细胞前列腺特异性抗原表达。体外和体内相互作用研究表明，Daxx结合到AR的氨基末端和DNA结合域。Daxx蛋白在体内外干扰AR DNA结合活性。此外，AR氨基末端结构域的sumoylation参与Daxx相互作用和转表达。总之，这些发现不仅提供了Daxx在控制AR转录激活活性中的新作用，而且揭示了AR的sumoylation依赖性转录抑制的机制。

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数字

图1。
图1。
Daxx在体内和体外都与AR结合。（A） 将分别编码AR和HA-tagged Daxx的表达结构的指定组合瞬时转染COS-1细胞。转染48小时后，对细胞裂解物进行免疫沉淀（IP），然后用所示抗体进行Western blot分析（顶部面板）。底部面板显示了转染细胞裂解物中AR和Daxx的表达水平。（B） 使用或不使用10 nM R1881处理24 h的LNCaP细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀实验，然后使用所示抗体进行Western blot分析。底部面板显示了用于联合免疫沉淀实验的细胞裂解液中AR和Daxx的表达水平。（C） 用10nM R1881或不用10nM R1881处理与诱饵（LexA融合蛋白）和猎物（Gal4-AD融合蛋白）共转化的酵母，随后进行定量β-Gal测定。条形图显示了从三个独立实验中观察到的平均活动。（D） GST下拉分析。体外翻译35S标记AR蛋白与GST或GST-Daxx蛋白孵育。输入代表20%的金额35经GST下拉测定的S标记AR。用GST抗体对GST和GST-Daxx蛋白进行免疫印迹分析，以显示蛋白水平（底部面板）。
图2。
图2。
Daxx抑制AR介导的基因激活。如图所示，用600 ng pMMTV-Luc（A）、Probasin-Luc（B）或PSA（−630/+12）-Ruc（C）报告基因瞬时转染COS-1细胞，同时转染200 ng pSG5-AR和增加数量的HA-Daxx表达质粒或pCMV-Flag-ARIP3。将转染细胞在完全培养基中培养18 h，然后用或不用10 nM R1881清洗并处理24 h。（D）相对荧光素酶活性表示为平均值±标准偏差（即荧光素酶光单位/β-半乳糖苷酶）。如图所示，用pMMTV-Luc报告子瞬时转染LNCaP细胞，并增加HA-Daxx表达质粒的数量。用或不用R1881处理转基因细胞，然后进行上述相对荧光素酶活性分析。（E） 如图所示，用900 ng TK-MH-Luc报告基因构建物转染COS-1细胞，并增加HA-Daxx表达质粒的数量。如上所述，测定每个样品的相对荧光素酶活性。
图3。
图3。
Daxx抑制雄激素诱导的PSA表达。（A） 对Daxx稳定转染的LNCaP细胞进行10 nM R1881处理或不处理48 h。对细胞总RNA进行逆转录，然后进行PSA表达的定量SYBR Green PCR分析。左侧面板表示三个独立实验中PSA的相对表达。右侧面板显示Daxx和AR在这些稳定细胞系中的表达水平。（B） 在48或72小时时收集转染pSUPER或pSUPER-Daxx构建物的LNCaP细胞，用于内源性Daxx、AR和肌动蛋白的Western blot分析。箭头和星号分别表示Daxx蛋白和非特异性带。（C） 用pSUPER或pSUPER-Daxx转染LNCaP细胞48小时，然后再刺激R1881 48小时。如A组所述，分析这些转染细胞的PSA表达。
图4。
图4。
Daxx不会改变R1881诱导的AR的核穿梭。用HA-Daxx表达质粒瞬时转染LNCaP细胞。24小时后，用或不用R1881处理细胞2小时，然后用抗HA单克隆抗体和抗AR兔抗体进行免疫染色分析。这些研究的二级抗体是异硫氰酸荧光素结合的抗小鼠免疫球蛋白G和德克萨斯红结合的抗兔免疫球蛋白G.经过免疫染色和洗涤程序后，用共焦免疫荧光显微镜对样品进行分析。DAPI染色显示细胞核的位置。开放箭头表示HA-Daxx转染的细胞。
图5：。
图5：。
NH2AR的结构域和DNA-结合结构域介导Daxx相互作用。（A） 哺乳动物转染和酵母双杂交试验中测试的AR野生型和不同缺失突变体的示意图。N、 DBD和LBD分别代表AR的氨基末端结构域、DNA-结合结构域和配体结合结构域的亚结构域。（B） 将转染HA-Daxx和AR表达结构全长或各种缺失突变体的COS-1细胞用抗HA抗体进行免疫沉淀，然后用抗AR抗体PG-21和C-19进行免疫印迹，这些抗体与AR的N末端和C末端结构域特异性结合，分别是。右上角和右下角显示了全细胞裂解物的免疫印迹，以指示来自用于共免疫沉淀实验的转染细胞的AR野生型和突变体以及HA-Daxx的表达水平。星号表示AR蛋白的全长和缺失形式。开放箭头指示AR的位置L（左）蛋白质，如果它被HA-Daxx沉淀。（C） 通过定量β-Gal分析，对诱饵和猎物共转化的酵母进行了分析。数据表示三个单独实验的平均值±标准偏差。
图6。
图6。
Daxx抑制AR DNA结合活性。A、 重组GST-ARD类融合蛋白与32P-标记的ARE寡核苷酸（第2道），以及越来越多的纯化GST（第6道至第8道）或GST-Daxx（第9道至第11道），并按照材料和方法中的描述由EMSA进行进一步分析。过量的未标记ARE寡核苷酸（特定竞争对手）或无关寡核苷酸（对照竞争对手）和抗GST抗体分别添加到竞争性分析（第3和第4道）和超位移分析（第5道）的结合反应中。超移位的DNA-蛋白复合物用星号表示。箭头表示特定蛋白-DNA复合物和自由探针的位置。EMSA中使用的GST和GST-Daxx蛋白的指示量通过抗GST抗体的免疫印迹显示（底部面板）。（B） 用10 nM DHT处理LNCaP亲代和HA-Daxx稳定细胞30 min或2 h，并用材料和方法中描述的抗AR抗体进行ChIP分析。使用包含ARE（顶面板）的PSA启动子区域的引物扩增免疫沉淀染色质。免疫沉淀前从不同样品中提取的输入染色质DNA也通过PCR（底部面板）进行分析。
图7。
图7。
AR的SUMO修改介导Daxx相互作用。（A） 酵母双杂交和哺乳动物报告基因分析中使用的人类AR及其sumoylation突变体的示意图。显示了两个sumoylation受体赖氨酸残基（386和520）或hAR的Lys到Arg变化的突变体。（B） 用所示质粒构建物共转化的酵母进行定量β-Gal分析。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。（C） Myc标记ARN个pCMV-AR制备的蛋白质N个将转染的COS-1细胞进行材料和方法中所述的体外sumoylation试验。SUMO-1修改和未修改AR的一半N个用抗Myc抗体通过免疫印迹分析蛋白质（左图）。琼脂糖珠上的另一部分改性和未改性蛋白质与表达HA-Daxx的细胞裂解物孵育。在广泛清洗后，结合蛋白通过SDS-PAGE和抗HA抗体的Western blotting进行分析（右表）。
图8。
图8。
AR的SUMO修饰介导Daxx转运抑制。（A） 将转染有TK-MH-Luc报告子的COS-1细胞和所示质粒构建物在完整培养基中培养48 h，然后收获用于荧光素酶分析。如图2所示，测定相对荧光素酶活性。条形图表示三个独立实验的平均值±标准偏差。底部面板显示了Gal4-DBD和融合构建物的表达水平，以及每个样本中的HA-Daxx，方法是用抗Gal4-DB和抗HA抗体对转染细胞提取物进行免疫印迹。（B） 用所示质粒构建物转染LNCaP细胞，并增加pSUPER或pSUPER-Daxx的数量，在完全培养基中培养48 h，然后收获用于荧光素酶分析。如上所述测定相对荧光素酶活性。显示了转染细胞中内源性Daxx的蛋白质水平（底部面板）。（C） 转染表达Gal4、Gal-AR的构建物的LNCaP细胞N个，或Gal-ARN个-ΔSUMO和TK-MH-Luc在完全培养基中培养48小时，然后按照材料和方法中的规定，使用抗Gal4抗体进行ChIP和Re-ChIP程序，然后使用抗SUMO-1或抗Daxx抗体。用包含Gal4结合位点的启动子区域的引物在PCR中扩增免疫沉淀DNA。
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