国际癌症杂志。作者手稿；PMC 2011年5月10日发布。
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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院279630
白藜芦醇是一种多靶向药物，可以增强吉西他滨的抗肿瘤活性在体外人胰腺癌原位小鼠模型
,1 ,1 ,1 ,2 ,1 ,1 ,三 ,2 ,4和1
库朱维尔B.哈里库马尔
1德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，德克萨斯州休斯顿
阿贾库马尔·库努马卡拉
1德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，德克萨斯州休斯顿
高塔姆·塞西
1德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，德克萨斯州休斯顿
Diagaradjane公园
2德克萨斯大学安德森癌症中心放射肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
普雷莎·阿南德
1德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，德克萨斯州休斯顿
马诺伊·潘迪
1德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，德克萨斯州休斯顿
尤里·格洛瓦尼
三德克萨斯州休斯顿德州大学安德森癌症中心实验诊断成像系
苏尼尔·克里希南
2德克萨斯大学安德森癌症中心放射肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
苏肖万·古哈
4德克萨斯州休斯顿德州大学安德森癌症中心胃肠病、肝病和营养系
巴拉特·B·阿加瓦尔
1德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，德克萨斯州休斯顿
1德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，德克萨斯州休斯顿
2德克萨斯大学安德森癌症中心放射肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
三德克萨斯州休斯顿德州大学安德森癌症中心实验诊断成像系
4德克萨斯州休斯顿德州大学安德森癌症中心胃肠病、肝病和营养系
通信地址：美国德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号143号信箱，德克萨斯大学M.D.安德森癌症中心实验治疗学系细胞因子研究实验室Bharat B.Aggarwal，电话：713-794-1817，传真：713-745-6339，gro.nosrednadm@lawragga公司 摘要
吉西他滨虽然是晚期胰腺癌（PaCa）的标准治疗方法，但单独使用并不十分有效。非常需要安全有效的新制剂。白藜芦醇是一种安全、多靶向的药物；并与抑制肿瘤的生存、增殖、侵袭和血管生成有关。白藜芦醇是否能使PaCa对吉西他滨敏感在体外和体内进行了调查。我们在裸鼠体内建立PaCa异种移植物，随机分为4组，并用载体、吉西他滨、白藜芦醇和联合用药进行治疗。采用电泳迁移率变化分析（EMSA）、免疫组织化学和western blot分析确定NF-κB的调节以及增殖、血管生成和侵袭的标记物。白藜芦醇抑制4种不同人PaCa细胞系的增殖，协同吉西他滨的凋亡作用，抑制NF-κB的组成性激活以及bcl-2、bcl-xL、COX-2、cyclin D1 MMP-9和VEGF的表达。在人PaCa原位模型中，我们发现白藜芦醇显著抑制肿瘤生长(第页<0.001），吉西他滨进一步增强了这种作用(第页< 0.001). 吉西他滨和白藜芦醇联合用药后，肿瘤组织中增殖指数Ki-67标记物和微血管密度CD31均显著下调(第页< 0.001与.控制；第页< 0.01与吉西他滨）。与载体对照相比，白藜芦醇还抑制NF-κB的激活和细胞周期蛋白D1、COX-2、ICAM-1、MMP-9和生存素的表达。总的来说，我们的结果表明，白藜芦醇可以通过抑制增殖、侵袭、血管生成和转移标记物来增强吉西他滨的作用。
关键词：凋亡、化疗耐药、化疗药物、NF-κB、胰腺癌
胰腺癌（PaCa）是最致命的癌症之一，估计5年生存率，目前可用的最佳治疗方案约为4%。2007年，近37170名美国人被诊断患有PaCa，33370人死于该病。1吉西他滨是晚期PaCa患者的标准治疗方法，在统计学上没有显著的生存优势。2吉西他滨与埃洛替尼（EGFR抑制剂）、铂类似物、贝伐单抗（抗VEGF抗体）或塞来昔布（COX-2抑制剂）的组合处于不同的临床试验阶段。三
各种证据表明，转录因子NF-κB和NF-κ·B调节的基因产物在PaCa的生长、转移和化疗抵抗中起着重要作用。首先，NF-κB在PaCa中具有组成性活性4,5; 其次，激活NF-κB的AKT/PI3K在PaCa中是活跃的6; 第三，NF-κB调节的COX-2过度表达经常在PaCa中发现7; 第四，细胞周期蛋白D1和血管内皮生长因子的过度表达均受NF-κB调节，已在PaCa中报道7; 第五，NF-κB与增殖、侵袭和血管生成有关8; 第六，已发现PaCa中NF-κB激活可介导化疗耐药性，6抗凋亡，9血管生成10和转移。11因此，能够调节NF-κB和NF-κ）B调节基因产物的药物具有治疗PaCa的潜力。
白藜芦醇（反式-3,5,4′-三羟基二苯乙烯；)葡萄、浆果和花生中的一种成分已成为“年龄延长因素”12并被我们的实验室证明13和其他14成为NF-κB通路的有效阻断剂。除了在培养中抑制多种肿瘤细胞的生长外，15白藜芦醇及其衍生物（KITC）已被证明能增强紫杉醇的细胞毒性作用，16顺铂，17维卡德、沙利度胺18,19和吉西他滨。20在动物研究中，这种二苯乙烯被发现可以预防多种致癌物诱发的癌症，包括乳腺癌、，21肠，22肝脏，23食管24和冒号。25白藜芦醇还抑制转基因诱导的乳腺肿瘤发生，26,27以及前列腺。28白藜芦醇被发现可以抑制啮齿动物体内多种移植性肿瘤的生长，包括肝癌、，29神经母细胞瘤，30胃癌，31乳腺癌，27结肠癌，32和白血病。33此外，白藜芦醇抑制胶质瘤的血管生成和转移，34肺癌，35和乳腺癌。26,27这种二苯乙烯被发现能使小鼠肿瘤对化疗药物如5-氟尿嘧啶敏感。36然而，白藜芦醇对动物体内人类PaCa生长的影响尚不清楚。白藜芦醇是否能增强吉西他滨在PaCa中的作用，目前还不清楚。
白藜芦醇抑制生长和增殖，增强吉西他滨的凋亡作用。(一)白藜芦醇的结构。(b条)MTT检测结果显示白藜芦醇对4种胰腺癌细胞株的细胞增殖有抑制作用。所示数据代表了3组独立的实验。(c（c）)活/死实验结果表明，白藜芦醇（Res，10μM）可增强吉西他滨（Gem，100 nM）诱导的细胞毒性。数据显示凋亡胰腺癌细胞的百分比比例。数据是3个独立实验的代表。数值为独立实验的平均值±SD。照片是以20倍的放大倍数拍摄的。
在本报告中，我们研究了白藜芦醇对培养的人PaCa生长的影响以及对PaCa原位小鼠模型的影响。我们研究了白藜芦醇和吉西他滨对各种胰腺癌代表细胞增殖的影响(例如.，AsPC-1来源于胰腺癌；MIA PaCa-2和Panc-28是胰腺癌，而Panc-1代表胰腺导管细胞癌）。我们还检查了这种二苯乙烯与吉西他滨联合使用的效果在体外和体内本研究将表明，白藜芦醇下调NF-κB和NFκB相关基因产物是抑制PaCa肿瘤生长和血管生成的机制之一。这些研究有可能改善PaCa的治疗。
材料和方法
试剂
白藜芦醇（纯度>98%）由中国无锡高伦杰科技公司提供。抗bcl-2、bcl-xL、COX-2、cyclin D1、ICAM-1、c-myc和procaspase-3的抗体购自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）；抗VEGF和Ki-67（兔单克隆SP6）的抗体来自新标记物（加利福尼亚州弗里蒙特）；针对CXCR4和p65的抗体（用于免疫组织化学分析）来自Abcam，MMP-9来自Cayman化学品。抗survivin和β-肌动蛋白的抗体来自Sigma（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich公司）。小鼠CD31单克隆抗体从加利福尼亚州圣地亚哥的Pharmingen获得。用于免疫组织化学的液体DAB+底物色原系统HRP从Dako Cytomation（加利福尼亚州Carpintia）获得。青霉素、链霉素、RPMI 1640和胎牛血清（FBS）均取自Invitrogen（纽约州格兰德岛）。来自礼来的吉西他滨（Gemzar）在4°C下储存，并在使用当天溶解在无菌PBS中。将D-荧光素钾盐（Xenogen，Hopkinton，MA）溶解在40 mg mL的无菌PBS中−1浓度。
细胞系
胰腺癌细胞系AsPC-1（胰腺癌；ATCC编号：CRL-1682）、MIA-PaCa-2（胰腺癌，ATCC编号为CRL-1420）和Panc-1（胰腺导管细胞癌；ATCC-No:CRL-1469）是从弗吉尼亚州马纳萨斯市的美国型培养物集中获得的。Panc-28（胰腺癌）细胞系由Shrikanth Reddy博士（德克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心，德克萨斯州休斯顿）提供。37所有细胞系均在添加了10%FBS的RPMI 1640中培养，100 U mL−1青霉素和100μg mL−1链霉素。
增殖试验
如前所述，通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）摄取法测定白藜芦醇对PaCa细胞增殖的影响。38简单地说，将细胞（每孔2500个）与白藜芦醇在37°C的96周平板中培养2、4或6天，一式三份。MTT溶液（5 mg mL−1)将其添加到每个孔中，并在37°C下培养板2小时。加入裂解缓冲液（20%SDS和50%二甲基甲酰胺），并将细胞在37°C下进一步孵育过夜。使用MRX Revelation 96-well多扫描仪（Dynex Technologies，Chantilly，VA）在570 nm处测量细胞悬浮液的吸光度。该实验独立重复3次，并进行统计分析以获得最终值。
细胞凋亡测定
为了确定白藜芦醇是否能增强吉西他滨对胰腺癌细胞的凋亡作用，我们使用了一个活/死检测试剂盒（Molecular Probes，Eugene，OR），该试剂盒可测定细胞内酯酶活性和质膜完整性。简单地说，细胞（每孔5000个）在培养皿中培养，用白藜芦醇预处理4小时，然后用吉西他滨处理24小时。然后按照制造商的方案对细胞进行染色。通过计数活细胞（绿色）和死细胞（红色），在荧光显微镜下测定细胞活力。该实验独立重复3次，并进行统计分析。
动物
男性非对称数值/数值小鼠（4周龄）取自德克萨斯大学安德森癌症中心实验放射肿瘤学系繁殖科。每个笼子中的4只动物被安置在标准的小鼠有机玻璃笼子中，在12小时的光照和黑暗循环下保持恒定的温度和湿度，并定期用高压灭菌器喂食水随意。所有小鼠均无任何损伤，均经检测无致病性。我们的实验方案由UTMDACC动物护理和使用机构委员会审查和批准。
MIA-PaCa-2细胞裸鼠原位移植
我们的在体外研究表明，MIA-PaCa-2细胞对吉西他滨和白藜芦醇联合治疗更敏感。因此，我们决定选择这种胰腺癌细胞株体内研究。如前所述，用荧光素酶稳定转染MIA PaCa-2细胞。39将转染荧光素酶的MIA-PaCa-2细胞在短时间暴露于0.25%胰蛋白酶和0.2%EDTA后从亚流培养物中获得。用含有10%FBS的培养基停止胰蛋白酶化。细胞在无血清培养基中清洗一次，然后在PBS中重新悬浮。细胞活力用台盼蓝法测定。仅使用由单个细胞组成的悬浮液进行注射，其活性大于90%。用氯胺酮-甲苯噻嗪溶液（西格玛-阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯）麻醉小鼠，做一个小的左腹侧切口，MIA PaCa-2细胞（2×106)在50μL PBS中，使用一根27号针头和一个校准的按钮控制分配装置（内华达州雷诺市汉密尔顿注射器公司）将PBS注射到胰腺的包膜下区域。腹部伤口用伤口夹（Braintree Scientific，Braintree，MA）封闭成1层。
实验方案
植入1周后，将小鼠随机分为以下治疗组(n个=8）基于首次IVIS成像后测量的生物发光：(我)未经处理的对照品（仅限车辆；乙醇：PBS混合物，1:3）；(ii（ii）)仅白藜芦醇（40 mg kg−1，每天一次p.o.）；(三)单用吉西他滨（25 mg kg−1静脉注射，每周两次）；和(iv（四）)白藜芦醇组合（40 mg/kg−1)，每天一次p.o.，和吉西他滨（25 mg kg−1)每周两次，静脉注射。生物发光IVIS成像系统200每周监测肿瘤体积，使用低温冷却成像系统与运行Living Image软件的数据采集计算机（加利福尼亚州阿拉米达市Xenogen Corp.）耦合。在成像之前，用2.5%异氟醚/空气混合物在丙烯酸室中对动物进行麻醉，并静脉注射40 mg mL−1PBS中150 mg kg剂量的D-荧光素钾盐−1体重。用荧光素孵育10分钟后，将小鼠置于右侧卧位，采集数字灰度动物图像，然后采集并叠加伪彩色图像，该图像表示从动物体内的活动荧光素酶中检测到的光子的空间分布。信号强度被量化为每秒感兴趣区域内检测到的所有光子的总和。在肿瘤植入后7、14、21、28和35天对小鼠进行成像。治疗持续4周，1周后处死动物。切除胰腺中的原发肿瘤，并测量最终肿瘤体积V（V）= 2/3π第页三，其中第页是3个维度（长度、宽度和深度）的平均值。最初对最终肿瘤体积进行单向方差分析，然后使用未配对的Bonferroni多重比较试验对各组之间的肿瘤体积进行比较。一半肿瘤组织用福尔马林固定，石蜡包埋，进行免疫组化和常规H&E染色。另一半在液氮中速冻并储存在−80°C。H&E染色证实每个胰腺中都有肿瘤。
肿瘤样品核提取物的制备
将来自对照和实验小鼠的胰腺肿瘤组织（75-100 mg/小鼠）切碎，并使用Dounce均质器均质，将均质液置于冰上，在0.5 mL冰镇缓冲液a中孵育1小时[10 mmol L−1HEPES（pH 7.9），1.5 mmol L−1氯化钾，10毫摩尔升−1氯化镁2，0.5毫摩尔升−1DTT，0.5 mmol L−1苯甲基磺酰氟（PMSF）]。匀浆在16000下离心克在4°C下保持10分钟。将所得核颗粒悬浮在0.2 mL缓冲液B[20 mmol L中−1HEPES（pH 7.9），25%甘油，1.5 mmol L−1氯化镁2，420毫摩尔升−1氯化钠，0.5毫摩尔L−1DTT，0.2毫摩尔升−1乙二胺四乙酸，0.5 mmol L−1PMSF和2μg mL−1leupeptin]并在冰上孵育2小时，间歇混合。然后在16000下对悬浮液进行离心分离克在4°C下保存15分钟。收集上清液（核提取物）并在−80°C下储存，直至使用。以BSA为标准，采用Bradford法测定蛋白质浓度。
胰腺癌细胞和肿瘤标本中NF-κB活化的检测
为了评估NF-κB的激活，我们从胰腺癌细胞系和肿瘤样本中制备了核提取物，并进行了电泳迁移率分析（EMSA），基本上如前所述。40简单地说，从胰腺癌细胞（1×10）制备的核提取物6/mL），肿瘤样本与32HIV长末端重复序列（5′-TTGTACAA）中P-end标记的45米双链NF-κB寡核苷酸（15μg蛋白质和16 fmol DNA）GGGACTTTC公司CGCT G公司gggacttc公司CAGGGAGGCGTGG-3′；斜体表示NF-κB结合位点）在37°C下持续30分钟。在6.6%天然聚丙烯酰胺凝胶上从游离寡核苷酸中分离得到DNA蛋白复合物。对干燥凝胶进行可视化，并使用荧光成像仪（分子动力学，加利福尼亚州森尼维尔）和Image Quant软件对放射性带进行定量。
肿瘤标本中p65、VEGF和COX-2的免疫组化分析
用上述免疫组织化学方法检测p65的核定位以及COX-2、MMP-9和VEGF的表达。38胰腺癌肿瘤标本用石蜡包埋并用多聚甲醛固定。在DPBS中清洗后，用蛋白块溶液（Dako Cytomation）封闭玻片20分钟，然后用兔多克隆抗人p65、鼠单克隆抗人VEGF和抗COX-2抗体（分别为1:100、1:50和1:75）培养过夜。孵育后，冲洗载玻片，然后用生物素连接通用抗血清孵育，然后用辣根过氧化物酶-链霉亲和素结合物（LSAB+kit）孵育。冲洗载玻片，并使用3,3′-二氨基联苯胺盐酸盐作为显色剂显色。最后，用蒸馏水冲洗切片，用迈尔苏木精复染，并用DPX固定介质固定以进行评估。照片是用测光Cool SNAP CF彩色相机（德克萨斯州路易斯维尔的尼康）和Meta Morph 4.6.5版软件（宾夕法尼亚州唐宁镇的Universal Imaging）拍摄的。
Ki-67免疫组织化学
如前所述，用抗Ki-67抗体对福尔马林固定石蜡包埋切片（5μm）进行染色。38结果以每40倍放大倍数Ki-67阳性细胞±SE的百分比表示。每个治疗组的3个肿瘤共检查了10个40×场。首先对这些值进行单因素方差分析，然后使用非配对Student’st吨测试。
微血管密度CD31染色
如前所述，用大鼠抗鼠CD31单克隆抗体对乙醇固定石蜡包埋切片（5μm）进行染色。38然后在高倍镜（100倍）下检查并计数血管密度最大的区域。CD31阳性染色的任何明显区域均被视为单个血管。结果表示为每个高功率场（100×）的平均血管数±SE。对每个治疗组的3个肿瘤进行了总共20个高功率场的检查和计数。首先对这些值进行单因素方差分析，然后使用未配对Student’st吨测试。
蛋白质提取和蛋白质印迹分析
将来自对照和实验小鼠的胰腺肿瘤组织（75-100 mg/只）切碎，并在0.5 mL冰镇全细胞裂解物缓冲液（10%NP-40，5 mol L−1氯化钠，1 mol L−1HEPES，0.1 mol L−1EGTA，0.5摩尔L−1EDTA，0.1 mol L−1PMSF，0.2摩尔升−1原钒酸钠，1 mol L−1氟化钠，2μg mL−1抑肽酶，2μg mL−1leupeptin）。用Dounce均质机将切碎的组织均质化，并在16000℃下离心克然后用SDS-PAGE对蛋白质进行分离，将其电转移到硝化纤维素膜上，用每个抗体进行印迹，并用增强化学发光法进行检测（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ）。使用Total Lab非线性动态图像分析软件（非线性美国）通过密度分析对Western blot信号进行量化。
结果
本研究的目的是确定白藜芦醇、二苯乙烯（见化学结构，)可能单独或与吉西他滨联合治疗PaCa，如果是，通过何种机制。我们使用了4种来源于不同类型胰腺癌的具有良好特征的人PaCa细胞系例如.，AsPC-1来源于胰腺癌；MIA PaCa-2和Panc-28是胰腺癌，而Panc-1代表胰腺导管细胞癌。为了便于监测动物体内的肿瘤生长，其中一种细胞系MIA-PaCa-2被荧光素酶报告子稳定转染，并用于小鼠原位移植模型。
白藜芦醇抑制生长，协同吉西他滨的作用，下调构成性NF-κB活化和NF-κ的B调节基因产物
我们首先研究了白藜芦醇对4种不同PaCa细胞系增殖的影响。白藜芦醇以剂量和时间依赖性的方式抑制所有4种人类胰腺癌细胞（AsPC-1、MIA-PaCa-2、Panc-1和Panc-28）的生长().
此外，还检测了白藜芦醇是否能增强吉西他滨对这4种细胞株的作用。我们采用酯酶染色试验（活/死试验）来确定白藜芦醇是否能增强吉西他滨诱导的细胞凋亡。如所示白藜芦醇（10μM）或吉西他滨（100 nM）单独对细胞凋亡影响最小的剂量在联合使用时产生协同凋亡。
还研究了白藜芦醇如何增强吉西他滨的作用。NF-κB已被证明在这些细胞系中组成性表达，并导致对凋亡的抵抗。用DNA结合试验检测白藜芦醇是否导致MIA PaCa-2细胞中组成性NF-κB活化的下调。结果表明，白藜芦醇治疗以剂量依赖的方式抑制NF-κB的激活().
(一)EMSA结果显示，白藜芦醇以剂量依赖的方式抑制NF-κB的组成性激活。MIA PaCa-2（1×106)用指示浓度的白藜芦醇处理细胞4小时，制备核提取物并用EMSA检测NF-κB的活化。数据是两个独立实验的代表。(b条)左侧白藜芦醇抑制参与抗凋亡、增殖、转移和血管生成的基因产物的组成性表达；正确的定量蛋白质水平和(c（c）)，白藜芦醇诱导PARP的切割。MIA PaCa-2（1×106)用指示浓度的白藜芦醇处理细胞24小时。实验结束时，制备全细胞裂解物并进行western blot。
还检测了白藜芦醇是否下调NF-κB调节的基因产物。我们发现白藜芦醇以剂量依赖性方式抑制MIA-PaCa-2细胞中抗凋亡（bcl-2，bcl-xL）、增殖（COX-2，cyclin D1）、转移（MMP-9）和血管生成（VEGF）蛋白的组成性表达(). 白藜芦醇还诱导MIA PaCa-2细胞中PARP的分裂().
白藜芦醇抑制裸鼠体内原位种植PaCa的生长
我们检测了白藜芦醇和吉西他滨单独或联合应用对裸鼠原位移植人胰腺细胞生长的治疗潜力。实验协议如所示。我们决定使用MIA-PaCa-2细胞体内因为首先，我们发现MIA-PaCa-2相对其他细胞更敏感，其次，MIA-PaCa-2稳定地转染荧光素酶。将MIA-PaCa-2细胞植入裸鼠的胰腺尾部。一周后，根据最初的IVIS图像，我们将动物随机分为4组，并按照实验方案开始治疗。治疗持续4周，肿瘤细胞注射后6周处死动物。肿瘤植入后每周进行IVIS成像(左侧面板）。
白藜芦醇增强吉西他滨抑制裸鼠胰腺癌生长的作用。(一)材料和方法中描述的实验方案的示意图。第一组给予Vehicle（100μL，p.o.，daily）和PBS（100μL，I.p.，每周两次），第二组给予白藜芦醇（40 mg kg）−1第三组给予吉西他滨（25 mg kg）−1第四组给予白藜芦醇（40 mg kg）−1，p.o.，每日）和吉西他滨（25 mg kg−1静脉注射，每周两次；n个= 8). (b条)左侧面板，活体、麻醉小鼠原位移植胰腺肿瘤的生物发光IVIS图像。右侧面板，在指定时间使用IVIS实时成像描绘不同时间点肿瘤体积的每秒光子测量(n个= 8). (c（c）)原位移植胰腺肿瘤小鼠的尸检照片；(d日)在实验的最后一天，用游标卡尺在尸检时测量小鼠的肿瘤体积，并用公式计算V（V）= 2/3π第页三(n个= 6).
生物发光成像结果显示对照组肿瘤体积逐渐增大(，右侧面板）。白藜芦醇和吉西他滨联合用药组肿瘤体积明显低于白藜芦醇单独用药组(第页<0.01）或单独吉西他滨组(第页< 0.05). 吉西他滨单独治疗与白藜芦醇一样有效(第页与对照组相比<0.001；第页>与单独的白藜芦醇组相比为0.05）(，右侧面板）。
我们发现，当口服40 mg kg白藜芦醇时−1显著抑制肿瘤生长(第页与对照组相比<0.001）(). 单用吉西他滨与白藜芦醇同样有效(第页与对照组相比<0.001；第页>与单纯白藜芦醇组相比为0.05）；两种药物联合使用更能有效降低肿瘤负担。白藜芦醇和吉西他滨联合用药组的肿瘤体积显著低于白藜芦醇单独用药组(第页<0.01）或单独吉西他滨组(第页< 0.01) ().
白藜芦醇抑制CD31和Ki-67的表达
虽然Ki-67-阳性指数被用作细胞增殖的标记，但CD31指数是微血管密度的标记。检测白藜芦醇和吉西他滨是否调节这些标记物。表明两种白藜芦醇(第页<0.05）和吉西他滨(第页<0.05）单独显著下调PaCa组织中Ki-67的表达，二者联合使用最有效(第页< 0.01). 同样，当检测CD31时，我们发现与对照组相比，这两种药物都显著降低了CD31的表达()两个人在一起最有效(第页与单用吉西他滨相比<0.01）().
白藜芦醇增强吉西他滨对胰腺癌肿瘤细胞增殖和血管生成的作用。(一)增殖标记物Ki-67的免疫组织化学分析表明，白藜芦醇单独或与吉西他滨治疗组的动物联合使用均能抑制胰腺癌细胞的增殖。(b条)材料和方法中所述Ki-67阳性细胞的定量。数据表示平均值±SE。第页<0.001与对照组相比；第页与吉西他滨相比<0.01。(c（c）)胰腺癌肿瘤微血管密度CD31的免疫组织化学分析表明，白藜芦醇单独或联合吉西他滨均可抑制血管生成；(d日)CD31+微血管密度的量化如材料和方法所述。数据表示平均值±SE。第页<0.001与对照组相比；第页与吉西他滨相比<0.01。照片是以40倍的放大倍数拍摄的。
白藜芦醇抑制PaCa中构成性NF-κB活化和NF-κ的B调节基因产物
我们评估了白藜芦醇和吉西他滨对胰腺肿瘤组织中NF-κB水平的影响。表明白藜芦醇单独或与吉西他滨合用均能有效抑制胰腺癌组织中NF-κB的组成性表达。吉西他滨单独使用对PaCa组织中NF-κB的构成没有显著影响。
白藜芦醇和吉西他滨对胰腺癌组织样本中NF-κB和NF-kb B调节基因产物表达的影响。(一)通过DNA结合试验（EMSA）检测原位肿瘤组织样本中的NF-κB，表明白藜芦醇对NF-κ的B具有抑制作用。(b、 c（c）)左侧western blot显示，白藜芦醇和吉西他滨联合使用可抑制胰腺癌组织中NF-κB依赖性基因产物的表达。正确的，蛋白质水平的定量。对每组3只动物的样品进行了分析，并显示了代表性数据。
PaCa表现出增殖（c-myc、cyclin D1、COX-2）、存活（bcl-2、bcl-xL、survivin、XIAP）、侵袭（ICAM-1、MMP-9、CXCR4）和血管生成（VEGF）基因产物的过度表达，所有这些都在NF-κB的控制下。通过western blot分析检测白藜芦醇和吉西他滨是否可以调节这些NF-κB调节基因产物的表达。我们发现，单独使用白藜芦醇可显著下调细胞周期蛋白D1、COX-2、ICAM-1、MMP-9和生存素的表达(). 它对CXCR4、bcl-2、bcl-xL或VEGF的表达没有显著影响。需要同时使用白藜芦醇和吉西他滨治疗以下调CXCR4、bcl-2、bcl-xL和VEGF的表达。因此，吉西他滨和白藜芦醇联合使用可有效下调增殖（c-myc、cyclin D1、COX-2）、存活（bcl-2、bcl-xL、survivin、XIAP）、侵袭（ICAM-1、MMP-9、CXCR4）和血管生成（VEGF）基因产物的过表达。
用免疫组织化学方法检测核NF-κB、COX-2、VEGF和MMP-9的调节。如所示这些基因产物在白藜芦醇处理的样品中显著下调。单独使用吉西他滨的下调作用就不那么明显了。免疫组化数据支持从western blot获得的数据。
对细胞核p65、COX-2、MMP-9和VEGF的免疫组织化学分析表明，白藜芦醇单独或与吉西他滨联合使用均可抑制NF-κB、COX-2、MMP9和VEGF。百分比，给定生物标记物的阳性染色。照片是以40倍的放大倍数拍摄的。
这些结果共同表明，白藜芦醇抑制NF-κB的激活，从而抑制增殖、存活、侵袭和血管生成相关基因的表达。
讨论
多年来，许多靶向药物与吉西他滨联合试验，包括厄洛替尼、铂类似物、贝伐单抗和塞来昔布，三但事实证明，它们有毒且无效。因为癌症是一种多基因疾病，大多数靶向治疗本身并没有也不会有太大的前景。事实上，癌症药物开发的最新进展是在多靶向领域，曾被称为“脏药”。另一方面，白藜芦醇是一种源自中药的化合物(虎杖)红葡萄皮、浆果和花生；是一种高度安全的药物，具有调节多种细胞信号通路的能力。15由于白藜芦醇能够激活蛋白去乙酰化酶沉默信息调节器2/sirtuin 1（SIRT1），最近它被认为是一种可以延长寿命的药物，可能是通过延缓包括癌症在内的大多数慢性疾病的发病。41我们实验室的工作首次表明，白藜芦醇是NF-κB通路的有效抑制剂，13它与炎症和癌症密切相关。8这项研究的目的是确定白藜芦醇在治疗胰腺癌（最致命的癌症之一）方面是否具有单独或与吉西他滨联合治疗的潜力。无论是在细胞培养还是动物模型中，白藜芦醇单独抑制PaCa的生长，而吉西他滨的存在增强了其活性。
我们发现所有4细胞系（MIA-PaCa-2、AsPC-1、Panc-1和Panc-28）的增殖K-ras公司和第53页突变，42被白藜芦醇抑制。我们的结果与之前的报告一致，即白藜芦醇可以抑制AsPC-1和Panc-1细胞的增殖。43我们还首次发现，当白藜芦醇与吉西他滨联合使用时，可高效诱导所有4种细胞系的凋亡。我们发现在PaCa中组成性激活的NF-κB下调可能是其机制之一。我们还发现白藜芦醇下调PaCa细胞组成性表达的bcl-xL、bcl-2、COX-2、cyclin D1、VEGF和MMP-9。这些基因产物可能有助于白藜芦醇在PaCa中的作用。专业集团党等结果表明，巨噬细胞抑制因子（MIC-1）是转化生长因子β（TGF-β）超家族的成员，在白藜芦醇处理的PaCa细胞中上调有助于其活性，44因此，白藜芦醇的抗增殖活性可能涉及多种机制。
我们还发现，在原位小鼠模型中，白藜芦醇有效地抑制了PaCa的生长。在这个模型中，发现白藜芦醇在抑制肿瘤体积方面与吉西他滨一样有效。当两种药物一起使用时，可以观察到肿瘤体积的最大消退。虽然我们的研究是第一次报道白藜芦醇单独对小鼠模型中PaCa的影响，但这些结果与之前的报告一致，之前的报告显示，白藜芦》单独对小鼠肝癌具有生长抑制作用，29,36神经母细胞瘤，30,34胃癌，31乳腺癌，26,27结肠癌，32和白血病。33吉西他滨略微但显著地增强了白藜芦醇对动物体内PaCa的作用。这与之前的报告一致，即5-氟尿嘧啶可以增强白藜芦醇对小鼠肿瘤生长的抑制作用36和吉西他滨。20当研究白藜芦醇在动物模型中显示其对抗PaCa作用的机制时，我们发现白藜芦》下调了增殖标记物Ki-67和微血管密度指示剂CD31。进一步的研究也揭示了NF-κB和NF-κ子B调节的细胞周期蛋白D1、COX-2、survivin、ICAM-1、MMP-9和VEGF的下调。
我们的结果还显示CXCR4在肿瘤组织中的过度表达，并且它通过白藜芦醇和吉西他滨的联合方案下调。有证据表明CXCR4的过度表达与胰腺癌的晚期相关。45然而，我们也观察到白藜芦醇对bcl-2和bcl-xL的不同反应在体外和体内这些影响可能是由于不同的生态位。我们的观察结果也与白藜芦醇抑制胶质瘤血管生成和转移的报道一致，30,34肺癌，35和乳腺癌。26,27我们的研究结果总体上表明，白藜芦醇在胰腺癌治疗方面具有显著的潜力，吉西他滨可进一步增强其疗效。虽然白藜芦醇具有抗氧化活性46,47不鼓励将几种具有抗氧化活性的药物与化疗药物结合使用48; 我们没有发现白藜芦醇与吉西他滨合用有拮抗作用的证据。有限的临床试验表明，白藜芦醇对人体相当安全。49基于这些结果，需要进一步研究以充分探索白藜芦醇作为PaCa抗癌剂的潜力。
致谢
阿加瓦尔博士是兰索姆·霍恩（Ransom Horne Jr.），癌症研究教授。作者感谢沃尔特·佩格尔编辑了这份手稿。
资助发起人：克莱顿基金会
工具书类
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