跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
细胞干细胞。作者手稿；PMC 2012年4月8日提供。
以最终编辑形式发布为：
细胞干细胞。2011年4月8日；8(4): 376–388.
数字对象标识：2016年10月10日至2011年11月3日
预防性维修识别码：PMC3090650型
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院283273
PMID：21474102

小鼠和人体细胞高效miRNA介导的多能性重编程

弗雷德里克·阿诺基·丹索,1 Chinmay M.Trivedi公司,2 丹尼斯·朱尔,5 穆迪特·古普塔,2 郑翠,1 应天,1 张玉珍,1 杨威利,1中，4 彼得·J·格鲁伯,三，4中，5 乔纳森·爱泼斯坦,1中，2,三，4和爱德华·E·莫里斯1中，2,三，4中，*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

基于转录因子的细胞重编程开辟了将体细胞转化为多能状态的途径，但由于对转录因子的需求和该过程的相对低效性，使其面临限制。我们在这里显示302/367英里集群快速高效地将小鼠和人类体细胞重新编程为iPS状态，无需外源转录因子。这种基于miRNA的重编程方法比标准的Oct4/Sox2/Klf4/Myc-mediated方法效率高两个数量级。老鼠和人类302/367英里iPS细胞显示出与Oct4/Sox2/Klf4/Myc-iPS细胞相似的特征，包括多能性标记表达、畸胎瘤形成，对于小鼠细胞，嵌合贡献和生殖系贡献。我们发现了百万兰特表达式是必需的miR302/367基因-介导的重新编程和激活10月4日基因表达，也需要抑制Hdac2。因此，我们的数据表明，miRNA和Hdac介导的途径可以以一种强有力的方式合作，重新编程体细胞达到多能性。

简介

分化细胞向诱导多能干细胞（iPS）的转化为再生治疗提供了一种更易处理的多能干电池来源，从而彻底改变了干细胞生物学。尽管功能强大，但目前iPS细胞生成存在一些限制，包括该过程的效率相当低（0.2-1.0%），以及必须强制表达至少一种多能干细胞转录因子，包括Oct4、Nanog、Sox2、Klf4和/或Myc。这些限制阻碍了iPS技术在高通量格式中的使用，例如从大量患者中生成人类iPS克隆。

目前iPS生成的标准策略依赖Oct4、Sox2、Klf4和Myc（OSKM）的异位表达(高桥和山中，2006年)。尽管有几种替代这些因子的方法，包括使用其他转录因子、信号因子和药理分子，但至少需要一种多能干细胞转录因子，通常是Oct4，才能有效地进行iPS重编程(皇甫等人，2008a;Huangfu等人，2008b;Judson等人，2009年;Melton等人，2010年;Yoshida等人，2009年)。最近，一些microRNA（miRNAs）与OSKM因子联合表达时，被证明可以增强iPS重编程(Judson等人，2009年)。这些miRNA属于在胚胎干细胞中优先表达的miRNA家族，被认为有助于维持ES细胞表型(Babiarz等人，2008年;Wang等人，2008;Wang和Blelloch，2009年;Wang等人，2007年)。这些miRNAs如何增强iPS重编程尚不清楚，但可能与它们调节细胞周期的能力有关(Judson等人，2009年).

在ES和iPS细胞中高水平表达的miRNAs中302/367英里该集群已被证明是10月4日和Sox2的直接目标(Card等人，2008年)这是iPS重新编程所需的两个关键因素。的级别302/367英里与ES细胞中Oct4转录物和早期胚胎发育相关，表明在ES细胞内环境稳定和维持多能性中起重要作用(Card等人，2008年)。尽管他们有能力在存在几种OSKM因素的情况下增强iPS重新编程(Judson等人，2009年)这些miRNAs直接将体细胞重编程为iPS表型的能力尚不清楚。我们展示了302/367英里cluster可以在不存在任何先前描述的多能干细胞转录因子的情况下，直接将小鼠和人类体细胞重新编程为多能干电池状态。重新编程人302/367英里比OSKM因子的效率高出两个数量级。我们还表明，丙戊酸钠（VPA）是通过特异性降解Hdac2蛋白而对小鼠成纤维细胞进行重编程所必需的，这一发现得到了高效重编程的支持Hdac2型在没有VPA的情况下，成纤维细胞为−/−。因此302/367英里与Hdac2抑制一起，可以实现高效的iPS重编程，而无需表达已知的重编程因子。

结果

302/367英里将成纤维细胞重编程为iPS细胞表型

以往的研究表明302/367英里该簇由五个miRNA组成，其中四个，米302a/b/c/d，具有相同的种子序列(Card等人，2008年)和图1A)。这个302/367英里该簇位于Larp7型3号染色体上的基因，转录为单个多顺反子初级转录本(Card等人，2008年)。的顺序302/367英里miRNAs在物种间高度保守(Card等人，2008年;Rosa等人，2009年)。要确定302/367英里为了对体细胞进行重新编程，我们生成了一个慢病毒载体，该载体表达了编码小鼠的690bp区域302/367英里序列，并用其转染来源于10月4日-GFP鼠标线((Lengner等人，2007年)和图1B)。我们在这些实验中加入了Hdac抑制剂VPA，因为这已被证明可以增强iPS重新编程(皇甫等人，2008a)。令人惊讶的是，我们观察到克隆来自302/367英里在病毒感染开始后6-8天内转导的MEF已经呈现出ES细胞样形态(图1C和​和3A）。3A级)。大多数克隆都是10月4日-GFP阳性和碱性磷酸酶阳性(图1C和D)。这些克隆还表达Nanog、Sox2和SSEA1(图1E)。相比之下，除了VPA外，表达OSKM的病毒的平行表达直到开始病毒转导后至少8-10天才产生任何可见的克隆(图3和数据未显示）。使用多顺反子病毒不会改变OSKM表达产生菌落的时间或总数（未显示数据和(Sommer等人，2009年)。此外，在没有VPA的情况下，302/367英里无法有效地重新编程MEF（见下文，未显示数据）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms283273f1.jpg
miR302/367基因可以将小鼠成纤维细胞重新编程为多能干细胞表型

（A） miR302/367基因显示成员之间相似性的集群米302a/b/c/d亚科。百万兰特与具有不同的种子序列米302a/b/c/d（B）病毒表达协议示意图302/367英里使用VPA重新编程iPS。第0天是病毒转导的开始。（C）10月4日-GFP积极的302/367英里在开始病毒转导7天后克隆。（D） 初级诱导板的AP染色302/367英里在开始病毒转导后8天，iPS克隆。（E） Nanog、Oct4、Sox2和SSEA1在小鼠ES和302/367英里第10天的iPS细胞显示多潜能基因表达。另请参见图S1和S2比例尺=100μm。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms283273f3.jpg
302/367英里与OSKM相比，VPA在小鼠成纤维细胞iPS重编程中的效率高出两个数量级

（A）302/367英里iPS克隆在开始病毒转导后6-7天很容易观察到，并且表达高水平的10月4日-GFP虽然OSKM诱导的克隆要到8-10天才能观察到，但这种克隆非常罕见，并且从中不表达显著水平的GFP10月4日轨迹。（B） 1.75×10转导的类ES克隆数4 10月4日-GFP等值OSKM或302/367英里病毒转导后第8天和第10天。数据是三次分析的平均值±S.E.M.（C）百分比10月4日绿色荧光蛋白用OSKM或302/367英里数据是三次测定的平均值±指示多能因子的S.E.M.（D）Q-PCR，比较OSKM与302/367英里在病毒转导后的前8天。（E） FACS分析302/367英里重新编程10月4日-GFPMEF与OSKM在病毒转导后6天和8天重新编程的MEF进行比较。比例尺=50μm。

我们进一步描述了302/367英里通过微阵列分析生成的iPS克隆在全球基因表达水平上与小鼠ES细胞系R1的相似性。我们在第15代使用克隆进行这些分析。这些数据表明，R1 ES细胞系中的全球基因表达具有高度相关性(图2A和B)。这些克隆缺乏我们用作对照的任何OSKM因子的整合，但确实包含病毒整合302/367英里慢病毒进入基因组(补充图1).302/367英里连续传代的iPS克隆保持其ES样形态，Q-PCR显示其多能基因表达与小鼠ES细胞相同(图2C和数据未显示）。此外302/367英里慢病毒在后期传代时被沉默(补充图2)。这些结果表明302/367英里除VPA外，它还能够将小鼠MEF重新编程为iPS细胞状态，而不表达其他先前描述的多功能因子。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms283273f2.jpg
302/367英里iPSC克隆与小鼠ES细胞具有相似的表达谱

（A） 使用微阵列实验显示302/367英里iPS细胞克隆C6、C7和C10在第15代和小鼠ES细胞系R1。（B） 小鼠ES细胞系R1和302/367英里在A（C）Q-PCR实验中获得的iPS细胞克隆C6、C7和C10302/367英里iPS细胞克隆C6、C7和C10以及小鼠ES细胞系R1。另请参见图S1和S2.

302/367英里重新编程比OSKM重新编程更有效

快速出现的302/367英里重新编程的iPS细胞表明，这些miRNAs的表达改善了重新编程的时间动力学。为了验证这个假设，我们平行地表示302/367英里以及使用相同数量的起始MEF和病毒滴度的OSKM基因。VPA包括在OSKM和302/367英里重新编程实验。以前的研究表明，使用OSKM因子，可以观察到0.2–0.8%的平均克隆形成重编程效率(皇甫等人，2008a)。使用302/367英里，我们一直在观察10月4日-GFP开始病毒转导7天后，阳性克隆比与OSKM因子平行转导的细胞更早(图3A)。在开始病毒转导后的第八天和第十天，通过计算具有ES样形态的克隆数，我们发现302/367英里与使用OSKM因子时相比，产生的iPS克隆数量多出两个数量级(图3B)。第10天，79.8%的miR302/367基因iPS克隆显示了10月4日-GFP这比表达OSKM因子的克隆大，其中只有大约50%表达10月4日-GFP(图3C).

为了更好地量化iPS重编程效率的增加，我们在重编程过程的前八天在初级感应板上对多能性标记基因进行了定量实时PCR（Q-PCR）。该实验使用相同数量的初始MEF和病毒滴度进行感染。这些数据表明，虽然用OSKM因子转导的细胞在此期间只表达极低水平的多能性标记基因，302/367英里在第8天，转基因细胞表达了所有检测到的稳健水平的基因(图3D)。克隆的数量是这样的，在8-10天后，含有302/367英里iPS克隆变得过于拥挤，导致细胞活力下降，除非将其分离和扩增。我们还通过以下方式评估了重新编程的效率miR302/367基因使用荧光激活细胞分选（FACS）技术检测来自Oct4基因座的GFP的表达10月4日-GFPMEF公司(Lengner等人，2007年)。OSKM重新编程的MEF确实显示10月4日-GFP在重编程过程的第六天和第八天都有表达，到第八天，高达17%的细胞表达GFP，与之前报道的范围相同(图3E和(皇甫等人，2008a)). 然而，302/367英里能够激活10月4日-GFP重编程8天后，高达80%的MEF表达(图3E)。这些数据支持以下结论：302/367英里能够比OSKM因子更有效地将成纤维细胞重新编程为多功能状态，其效率高达两个数量级。

302/367英里iPS细胞可以在畸胎瘤中生成中胚层、内胚层和外胚层的衍生物，生成成人嵌合体，并对小鼠生殖系有贡献

为了更全面地描述302/367英里iPS细胞，我们在免疫缺陷小鼠中产生了畸胎瘤302/367英里iPS克隆。302/367英里iPS衍生的畸胎瘤很容易形成，并显示出代表所有三个胚层的组织，如类似肌肉纤维的结构、角化的表皮细胞和内胆样上皮的管腔结构所示(图4A)。支持这些形态学发现的是，神经上皮样结构对βIII微管蛋白表达呈阳性，肌肉样结构对肌球蛋白重链表达呈阳性，肠样上皮对E-钙粘蛋白表达呈阳性(图4B)。一项更严格的多能性检测是确定302/367英里iPS细胞可以通过嵌合胚胎分析在发育中的胚胎内生成组织。因此，我们生成了302/367英里来自MEF的iPS克隆Rosa26lacZ公司广泛表达β-半乳糖苷酶的小鼠系(弗里德里希和索里亚诺，1991年)。注入这些302/367英里iPS克隆在50%以上的注射胚胎中产生了高百分比的嵌合体(图4C和数据未显示）。大多数嵌合体表现出80-95%的贡献来自miR302/367基因所有检查组织的iPS细胞(图4C和补充图3).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms283273f4.jpg
302/367英里iPS细胞可以产生中胚层、内胚层和外胚层的衍生物，并有助于小鼠的生殖系

（A） 鼻咽癌畸胎瘤的苏木精和伊红染色302/367英里iPS细胞克隆显示皮肤表皮样结构、肌肉和肠样上皮。这些数据代表了五种不同的302/367英里注射的iPS细胞克隆均产生畸胎瘤。（B） 免疫染色302/367英里iPS衍生的畸胎瘤组织显示βIII-管蛋白阳性神经上皮、MF20阳性横纹肌和E-cadherin阳性内胚层细胞的表达。（C）302/367英里从Rosa26获得的高百分比嵌合胚胎的lacZ组织化学染色显示，iPS克隆可以在发育中的胚胎内生成所有组织-302/367英里E9.5和E13.5的iPS克隆。（D） 全山荧光（D）和免疫染色10月4日-GFP蛋白表达（E–J）表明302/367英里iPS细胞克隆到受体小鼠性腺内的生殖系。这些数据代表了三个克隆（C6、C7、C10），它们被注射到胚泡中，并且这三个克隆都对种系有贡献。（K）302/367英里从C57BL/6 MEF产生的多能干细胞产生高百分比的出生后嵌合体，如毛色所示。另请参见图S3.比例尺：A=100微米，B、D、G、H、J=150微米，F和I=100微米。

测试是否302/367英里iPS细胞可以促进小鼠的生殖系，我们注射了三种不同的小鼠302/367英里iPS克隆源于10月4日-GFPMEF公司。在E13.5和E15.5处收集小鼠性腺，并用全山荧光显示，然后固定并切片，以进行GFP表达的免疫染色。所有三个克隆都有效地促进了嵌合体小鼠性腺中的生殖细胞(图4D–J)。此外，302/367英里从C57BL/6 MEFs产生的iPS克隆可以产生高百分比的出生后嵌合体，尽管种系传播尚未得到检查(图4K)。因此，302/367英里iPS克隆是多能的，能够产生所有三个胚层，并有效地促进小鼠的种系。多能性小鼠克隆测试摘要见补充表1.

302/367英里能比OSKM因子更有效地将人类成纤维细胞重新编程为多功能状态

评估是否302/367英里可以重新编程人类成纤维细胞，我们用302/367英里慢病毒。在12-14天内，我们观察到克隆具有典型的人类ES细胞形态(图5A)。这些克隆的免疫染色显示它们表达OCT4、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81(图5B–E)。使用三种不同的Q-PCR302/367英里hiPS细胞克隆显示，它们都在与hES细胞系HUES13相当的水平上表达多潜能标记(图5F)。我们对人包皮成纤维细胞系BJ进行了重新编程，并进行了DNA指纹分析，以显示302/367英里重编程源于原始亲本BJ系(补充图4)。此外，这些人类克隆不包含任何OSKM病毒和miR302/367基因病毒在以后的传代中被沉默(补充图1和2)。有趣的是，对人类成纤维细胞进行重新编程并不需要VPA，并且添加VPA不会影响重新编程的效率（见下文，数据未显示）。畸胎瘤是由七种不同的302/367英里hiPS克隆和均表现出中胚层、内胚层和外胚层的形成(图5G–L)。对人类克隆进行多能性测试的摘要见补充表1.

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms283273f5.jpg
302/367英里比OSKM因子更有效地将人成纤维细胞重编程为多功能状态

（A–E）菌落形态和OCT4、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81免疫染色302/367英里重新编程的人类成纤维细胞。（F） 三种不同类型多能干细胞标记基因的Q-PCR302/367英里与人ES系HUES13相比，重编程的人成纤维细胞系。来源于302/367英里人类iPS细胞克隆显示内胚层（肠道）、中胚层（肌肉）和外胚层（神经上皮）样结构。这些数据代表了七个人的结果302/367英里iPS细胞克隆。（J–L）免疫染色302/367英里人类iPS细胞衍生的畸胎瘤组织显示E-cadherin阳性内胚层细胞、MF20阳性横纹肌和βIII-管蛋白阳性神经上皮的表达。（M） 的效率302/367英里在病毒转导后18天和26天，通过人类ES样形态克隆的菌落计数对人包皮成纤维细胞进行重新编程。数据是三次检测的平均值±S.E.M.（N）Q-PCR302/367英里在病毒转导后18天和26天对人包皮成纤维细胞进行重新编程。数据是三次分析的平均值±S.E.M.另见图S1、S2和S4.比例尺：A–E=50μm，G–L=150μm。

接下来，我们评估了人类重编程效率是否与我们在MEF中观察到的情况类似。从相同数量的人包皮成纤维细胞和OSKM开始miR302/367基因病毒滴度，在开始病毒转导后18天和26天形成的具有ES样形态的菌落数量比302/367英里比使用OSKM表达式时(图5M)。根据细胞计数，用于病毒转导的大约10%的人类成纤维细胞产生iPS细胞克隆(图5K)。初级诱导板的Q-PCR也显示多能性基因表达显著增加302/367英里表达与表达OSKM的人包皮成纤维细胞(图5N)。这些数据表明302/367英里可以将人类和小鼠成纤维细胞重新编程为iPS细胞状态，效率大大提高。

百万兰特表达式是必需的302/367英里iPS重新编程

这个302/367英里该簇包含五种不同的miRNAs，miR302a/b/c/d基因和百万兰特所有基因都是由位于基因内含子8的一个共同启动子表达的拉普7基因(Card等人，2008年).米302a/b/c/d它们都有一个共同的种子序列，这表明它们以一组相似的mRNA为靶点，因此可能具有冗余作用(图1A)。然而，百万兰特具有不同的种子序列，因此可能针对不同的mRNA(图1A)。因此，我们测试了百万兰特表达式是必需的302/367英里iPS细胞重新编程。使用缺乏百万兰特序列，我们感染了10月4日-GFPMEF与302/367英里慢病毒，并通过菌落计数、Q-PCR和FACS分析评估多功能重编程。这个miR302a/b/c/d基因病毒缺乏百万兰特在MEF中以高水平表达(图6A)。然而，米302a/b/c/d在重新编程的第10天，在MEF中表达时，没有生成任何iPS细胞集落(图6B)。持续培养三周后，未形成任何iPS细胞集落米302a/b/c/d转换的MEF（未显示数据）。此外百万兰特仅此一项并未对成纤维细胞进行重新编程（数据未显示）。病毒转导后8天对初级诱导板的Q-PCR显示，几个重要的多能干基因在米302a/b/c/d转导MEF与miR302/367基因转导MEF(图6C)。重要的是，10月4日在可检测的水平上未观察到对米302a/b/c/d表达式(图6C，箭头）。使用FACS分析和10月4日-GFPMEF，我们证明没有归纳10月4日表达时的基因表达米302a/b/c/d没有百万兰特虽然302/367英里表达诱导健壮10月4日-GFP第八天表达(图6D)。这些数据表明，没有百万兰特表达式，米302a/b/c/d表达无法对小鼠MEF进行重新编程，这与Oct4基因表达缺乏诱导有关。因此米302a/b/c/d家庭以及百万兰特iPS单元重新编程需要。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms283273f6.jpg
百万兰特表达式是必需的302/367英里iPS细胞重新编程

（A） 米302a/b/c/d前miRNA在转导的MEF中高水平表达。（B） 10天后产生的菌落数米302a/b/c/d或miR302/367基因表达式。数据是病毒诱导后第八天，初级诱导板中四次检测的平均值±S.E.M.（C）多能基因表达米302a/b/c/d或miR302/367基因病毒。注意，Oct4基因在米302a/b/c/d表达细胞（红色箭头）。数据是三次分析的平均值±S.E.M.（D）FACS分析10月4日-GFPMEF转导后8天米302a/b/c/d或302/367英里病毒。

Hdac2许可水平低302/367英里重新编程

最近的证据表明染色质重塑因子在调节ES细胞多能性状态中起着重要作用(Lagarkova等人，2010年;马里等，2010年)。先前的数据表明，VPA是一种已知的Hdac抑制剂，可以增强OSKM重编程，这表明Hdac介导的染色质重塑在iPS重编程中起着重要作用(皇甫等人，2008a)。我们最初发现，在没有VPA的情况下，302/367英里无法有效地将MEFs重新编程为iPS细胞，在少数发育的克隆中，没有一个能在克隆复制中存活下来(图7D和F和数据未显示）。有趣的是，VPA对人类包皮或皮肤成纤维细胞的重新编程是不必要的(图5)。据报道，VPA可特异性降解Hdac2蛋白(Kramer等人，2003年)。因此，我们评估了I类Hdacs的表达是否被302/367英里或通过对Hdac1、2和3的表达进行Western blot的VPA治疗302/367英里介导的重新编程。虽然Hdac1和Hdac3的表达水平在所有条件下都保持不变，但VPA会导致MEF中Hdac2蛋白的降解(图7A)。的表达式302/367英里在MEF中存在或不存在VPA时，不影响Hdac1、2或3的水平(图7A)。相比之下，人包皮成纤维细胞表达的Hdac2蛋白水平低得多，并且这些细胞中的Hdap2蛋白水平不受VPA的影响(图7B)。这些数据表明，低水平的Hdac2可能会显著增强甚至需要302/367英里人类成纤维细胞表达的Hdac2水平远低于MEF。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms283273f7.jpg
VPA特异性降解Hdac2蛋白，通过以下途径抑制iPS重编程302/367英里

（A） VPA特异性降解Hdac2，但不降解Hdac1或Hdac3蛋白。的表达式302/367英里单独使用对Hdac1、−2或−3蛋白水平没有任何影响。（B） 人包皮成纤维细胞表达的Hdac2水平远低于MEF。（C）Hdac2型病毒转导后6至7天，−/−MEF开始重新编程，这与VPA处理的野生型MEF相似。（D） 使用生成的克隆数Hdac2型在没有VPA的情况下，−/−MEF类似于Hdac2型+/+病毒转导后第八天出现的带有VPA的MEF。Hdac2型+/+未经VPA处理的MEF未产生任何活的克隆和添加VPAHdac2型−/−MEF没有增加生成的克隆数。（E） 百分比10月4日-GFP阳性克隆与Hdac2型+/+经VPA处理的MEF和Hdac2型病毒转导后8天，未经VPA治疗的−/−MEF。（F） 多能性干细胞标记基因的Q-PCR显示，在重编程的第八天，多能性标记的表达增强302/367英里野生型和Hdac2型−/−MEF与Hdac2型+/+未经VPA治疗的MEF。数据为三次测定的平均值±S.E.M.另见图S5和S6.

通过以下方式测试是否需要抑制Hdac2才能进行有效的重新编程miR302/367基因，我们生成了Hdac2型−/−MEF来自Hdac2型flox/flox公司腺病毒介导的cre切除小鼠Hdac2型并确定Hdac2的损失是否改变了302/367英里在没有VPA的情况下对MEF进行重新编程(补充图5)。我们在Hdac2型−/−MEF与302/367英里病毒，10月4日-GFP病毒感染后6天即观察到阳性克隆(图7C)。病毒转导8天后，Hdac2型在没有VPA的情况下，−/−MEF已经形成了大量的iPS细胞克隆，而在缺乏VPA的条件下，野生型MEF没有生成任何可行的克隆(图7D)。VPA添加到Hdac2型−/−MEF没有改变获得的iPS细胞克隆的数量(图7D)。生成的iPS细胞克隆数和10月4日-GFP积极的，有302/367英里转导的野生型MEF加上VPA和302/367英里转导的Hdac2型缺少VPA的−/−MEF相似(图7D和E)。Hdac2表达缺失或添加VPA不会影响MEF中的增殖率(补充图6)。评估多能性相关基因表达的Q-PCR也显示通过302/367英里在里面Hdac2型−/−MEF与无VPA的野生型MEF相比(图7F)。因此，需要低水平的Hdac2或抑制Hdac1，才能通过以下途径进行有效的多能干细胞重编程米302/367。

讨论

目前产生iPS细胞的策略依赖于多能干细胞相关转录因子的表达。我们发现单个miRNA簇，302/367英里，可以比标准的OSKM方法更有效地重新编程成纤维细胞。随着miRNA生物学的不断进步，这些发现可能会导致一种非病毒、非转录因子介导的程序，用于生成iPS细胞，不仅用于基础干细胞生物学研究，还用于从大量患者群体中高通量生成人类iPS克隆。

先前的研究表明，iPS细胞不仅在基础干细胞生物学研究中有用，而且在生成患者特异性iPS克隆的能力方面也有用，这些克隆可以进一步分化为可选择的细胞系，包括造血细胞系、心肌细胞系和肝细胞系(Moretti等人，2010a;Moretti等人，2010b;Raya等人，2010年;Si-Tayeb等人，2010年)。然而，在这一点上，iPS重新编程的低效率阻碍了该过程适应高通量方法。这些方法将允许从全基因组关联研究获得的大量患者群体中生成iPS克隆，用于在细胞生物学水平表征已确定的基因组差异。我们发现重新编程302/367英里比OSKM因子高效高达两个数量级，这表明该方法可能被证明适用于大规模iPS细胞生成。其他一些报告表明，使用包括仙台病毒表达以及直接转染OSKM因子合成mRNA的技术可以提高iPS重编程的效率(Seki等人，2010年;Warren等人，2010年)。根据我们的数据，我们获得的效率高于上述任何一种技术，并且使用人类成纤维细胞，生成iPS细胞克隆的细胞百分比接近10%。因此，302/367英里iPS细胞重编程比之前描述的方法更有效，包括转染OSKM因子的合成mRNA(Warren等人，2010年).

提高效率的机制302/367英里iPS重编程可能部分围绕着miRNA生物学的性质。首先，miRNA的表达不需要蛋白质翻译，因此在抑制mRNA翻译和稳定性的基础上导致蛋白质表达的快速反应。第二，miRNAs通常以分数或数百个mRNAs为靶点，这些mRNAs协调许多不同蛋白质的表达，这些蛋白质可以迅速引起细胞特性的显性表型变化。这种同时靶向多种不同mRNA的能力也增加了miR302/367基因功能。302/367英里共同靶向数百种不同的信使核糖核酸靶点，包括那些基于生物信息学预测算法调节染色质重塑和细胞增殖的靶点(Betel等人，2008年;Grimson等人，2007年;Krek等人，2005年)。我们的数据表明百万兰特表达对于iPS细胞重新编程至关重要302/367英里集群。作为百万兰特具有不同的种子序列暗示着不同的mRNA靶点集，分析米302a/b/c/d和百万兰特靶点可以提供有关多能干基因网络和高效iPS细胞重编程需要抑制其表达的因子的重要信息。

我们的研究强调了Hdac2在iPS细胞重编程中的作用。VPA对Hdac2蛋白的特异性降解可能是这种小分子在增强iPS重编程方面比其他Hdac酶抑制剂更有效的原因(皇甫等人，2008a)。最近的几项研究证明了其他染色质重塑过程在iPS细胞重编程中的重要性(不丹等，2010年;Lagarkova等人，2010年;马里等，2010年)。Hdac2还被发现通过与Oct4和Myc相互作用而成为ES细胞多能性扩展调控网络的一部分(Kim等人，2008年)。由于诱导多能干细胞重编程涉及将分化细胞的表观遗传状态重置为多能干的“基态”，因此对染色质重塑必要性的进一步研究可能有助于更好地了解细胞系转分化事件。我们的发现是，表达Hdac2蛋白水平低得多的人类细胞不需要VPA302/367英里介导的重编程表明，Hdac2的不同水平可能至少部分解释了不同细胞系表现出的不同iPS细胞重编程效率。此外，Hdac2表达在发育过程中可能会下降，因此成年细胞几乎没有Hdac2-蛋白，从而不会受到VPA的影响。进一步研究这些相关性是否更广泛地存在于其他细胞系中，可能有助于通过包括OSKM因子在内的其他方法优化重编程。

我们的研究表明，miRNAs可以成为介导iPS细胞重新编程的强大工具，而不需要包括OSKM因子在内的多功能因子。目前对开发用于治疗的miRNAs的关注可能导致一种非病毒介导的改变302/367英里表达，这可能反过来为iPS细胞重新编程提供一种快速的miRNA/小分子方法。

材料和方法

慢病毒载体构建

一种小鼠基因组DNA片段，包括302/367英里或miR302a/b/c/d基因miRNA家族通过PCR扩增，所用引物列于补充表1将扩增片段克隆到pENTR1A进入载体（Invitrogen）的Acc65I和XhoI限制性内切酶位点，并通过测序进行验证。从进入载体上切下该片段，并连接到pLOVE目的载体的BsrGI位点(Blelloch等人，2007年)产生pLOVE-302/367英里矢量。pLOVE公司-米302a/b/c/d以相同的方式生成载体，但使用不同的3′引物，排除了百万兰特序列。

多能干细胞的细胞培养、病毒生产和诱导

小鼠成纤维细胞分离自10月4日GFP，Rosa26-LacZ和Hdac2型flox/flox公司胚胎在E13.5，并在所述的成纤维细胞培养基中培养(Takahashi等人，2007年)。Hdac2被感染Hdac2型flox/flox公司带有腺核病毒的MEF。人皮肤成纤维细胞在DMEM/F12、15%FBS、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺中培养。用编码pLOVE的载体转染电镀293T细胞产生病毒颗粒302/367英里、Oct4、Sox2、Klf4或N-myc以及pMD。G和psPAX2矢量，如所述(Blelloch等人，2007年)。每24小时收集一次转染细胞的上清液，持续48小时，并进行滴度测定。将滴度较高的病毒悬浮液与每毫升病毒悬浮液中0.5μl的10μg/mL聚brene（美国生物分析公司，MA）混合，用于感染成纤维细胞。病毒感染后，小鼠成纤维细胞在添加或不添加最终浓度为2mM丙戊酸的小鼠ES培养基中培养指定的时间长度。感染的人成纤维细胞在所述的人ES培养基中培养(皇甫等人，2008a;Takahashi等人，2007年).

免疫染色

克隆在PBS中洗涤两次（用Mg2+和钙2+)并固定在3.7%甲醛中。细胞在0.2%Nonide P40（Roche）中渗透，并在10%山羊血清中封闭。细胞在4°C的温度下在以下主要抗体中培养过夜：Oct3/4（Santa Cruz Biotechnology）、Sox2（R&D Systems）、Nanog（Abcam）、SSEA1和SSEA4（Developmental Studies Hybridoma Bank）、TRA-1-60和TRA-1-81（Millipore，Inc.）以及GFP（Clontech）。次要抗体为Alexa Fluor 488和568（Invitrogen）。所使用的安装介质是Vectorshield with DAPI（Vector Laboratories）。按照制造商的说明（Sigma-Aldrich），使用SIGMAFAST Fast Red TR/Naphtol AS-MX片剂进行碱性磷酸酶组织化学染色。

RNA分离、定量RT-PCR和微阵列实验

使用Trizol（Invitrogen）分离总RNA。使用上标First Stand Synthesis Kit（Invitrogen），使用2微克RNA合成cDNA。通过7900HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems）使用SYBR Green（AppliedBiosystes）进行实时PCR。实时引物序列列于补充表1对于微阵列实验，使用Affymetrix小鼠基因1.0 ST阵列。使用稳健多芯片分析（RMA）和主成分分析（PCA）以及Partek Genomics Suite v6.5分析微阵列数据。

畸胎瘤形成与DNA指纹分析

302/367英里iPS细胞在0.1%明胶涂层板上传代两次，持续一小时，以取出喂料器。5 × 105将细胞与Matrigel混合并注射到NOD-SCID小鼠的每个侧面。注射后4周采集肿瘤，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。切片肿瘤进行苏木精和伊红染色。对于免疫荧光染色，主要抗体为β-III微管蛋白（Abcam）、MF-20（发育研究杂交瘤库）和E-cadherin（细胞信号）。人类基因组DNA302/367英里iPS细胞克隆用于DNA指纹分析（cell Line Genetics，LLC，Madison，Wisc.）。

小鼠嵌合体的生成302/367英里iPS细胞克隆

302/367英里iPS细胞是使用Rosa26-LacZ公司小鼠胚胎成纤维细胞(弗里德里希和索里亚诺，1991年)。将细胞在0.1%明胶涂层板上传代两次，持续一小时，以取出喂料器，并注入E3.5 C57BL/6囊胚。在E9.5和E13.5收获胚胎，并使用之前描述的方法对LacZ活性进行染色(Shu等人，2002年)。对于生殖系贡献实验，302/367英里iPS细胞克隆C6、C7和C10，由10月4日-GFPMEF用于胚泡注射。从E13.5和E15.5胚胎中采集性腺，用荧光显微镜观察，然后固定并切片进行GFP免疫染色。胚胎和组织用石蜡包埋，并按说明切片(Cohen等人，2009年;Shu等人，2002年)。所有三个克隆都有助于形成生殖系。

西方斑点

如前所述，制备总细胞裂解物用于蛋白质印迹(Trivedi等人，2008年)。等量的蛋白质通过SDS-PAGE溶解并转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜与Hdac1抗体（1:1000稀释，细胞信号）、Hdac2抗体（1:11000稀释，Invitrogen）或Hdac3抗体（1:100稀释，Sigma）孵育。一级抗体结合通过HRP结合二级抗体显示，并通过增强化学发光（LumiGlo，Cell Signaling）检测。为了进行负荷控制，用抗GAPDH的一级抗体（1:2500稀释，Abcam）重制膜。

增殖试验

使用CellTiter 96水溶液细胞增殖试剂盒（Promega，Inc.）对MEF进行增殖分析。将20μl CellTiter试剂添加到100μl培养基中，在37°C下培养1.5小时、2.5小时和4.5小时，在490nm下测量吸光度，该试剂通过活细胞并入可在490nm.下测量的比色产物发挥作用。

条件的生成Hdac2型flox/flox公司老鼠

这个Hdac2型flox/flox公司等位基因由外显子2两侧的液氧使用中描述的靶向载体的P重组位点补充图5A在cre-mediated重组后，外显子2被删除，由此产生的mRNA与多个早期终止密码子不在框架内，导致Hdac2蛋白过早终止和丢失。该结构被电穿孔成R1 ES细胞；使用Southern blot分析鉴定了正确靶向的ES克隆(补充图5B)并用于产生高百分比的嵌合体和生殖系传播Hdac2型弗洛克斯//+等位基因。无处不在的巨细胞病毒-Cre公司转基因小鼠被用来删除Hdac2，并通过Western blot分析证明Hdac1蛋白的丢失(补充图4C).Hdac2型flox/flox公司小鼠与10月4日-GFP敲除小鼠(Lengner等人，2007年)生成Hdac2型flox/flox公司:10月4日-GFP用表达cre重组酶的腺病毒处理以删除Hdac2用于重编程实验的小鼠胚胎成纤维细胞。

补充材料

01

补充图1。这个302/367英里病毒被整合到基因组中302/367英里iPS细胞克隆不包含Oct4、Sox2、Klf4或Myc表达病毒。PCR用于302/367英里小鼠克隆C6、C7和C10（A）以及K1、K2和K5人类克隆（B）以显示302/367英里慢病毒和没有任何其他重编程病毒。补充表1中列出了使用的底漆。与相关图1,​,2,2、和​和55.

补充图2。的表达式302/367英里前miRNA在传代后期消失302/367英里iPS细胞克隆。前miRNA的Q-PCR302/367英里MEF、小鼠ES株R1和302/367英里克隆C6、C7和C10位于第3代和第15代（A），人类克隆K2、K5和K7位于第3和第12代（B）。补充表1中列出了使用的底漆。与相关图1,​,2,2、和​和55.

补充图3。的贡献miR302/367基因iPS细胞到小鼠组织。 302/367英里将iPS克隆注射到囊胚中，在E9.5（A）或E13.5（B）处收获胚胎，并进行组织化学染色以检测β-半乳糖苷酶的表达。在E9.5（A）时观察到整个发育中的胚胎都有表达。E13.5处大脑（B）、肠道（C）、肝脏（D）、胡须滤泡（E）和眼睛（F）的典型lacZ染色。与相关图4比例尺=150μm。

补充图4。人类DNA指纹302/367英里人包皮细胞系BJ产生的iPS细胞克隆。由Cell Line Genetics LLC进行指纹识别图5.

补充图5。条件的生成Hdac2型flox/flox公司等位基因。（A） 确定构造的目标以生成条件Hdac2型flox/flox公司LoxP位点被引入外显子2的上游和下游。（B） Southern blot证实3个ES克隆中的Hdac2等位基因的正确靶向性。（C） Western blot分析显示P0中Hdac2完全缺失Hdac2型flox/flox公司：CMV-cre公司红心。Alpha-tubulin表达被用作负荷控制。与相关图7.

补充图6。MEF的细胞增殖不受Hdac2表达或VPA缺失的影响。对野生型进行细胞滴度增殖分析(10月4日-GFP)和Hdac2型有或无VPA时的−/−MEF。如方法部分所述，测量细胞增殖变化。与相关图7.

补充表1。多能性克隆测试摘要

K克隆来自人BJ包皮成纤维细胞。D克隆来自皮肤成纤维细胞。

单击此处查看。（13M，文档）

致谢

这些研究得到了NIH向E.E.M.（HL064632、HL087825和HL100405）、J.A.E.（HL071546和HL100455）、C.M.T.（HL098366）、，美国心脏协会Jon Holden DeHaan肌肉发生中心奖授予E.E.M.和J.A.E.。作者感谢Ken Zaret的Rosa26-lacZ MEF，并感谢宾夕法尼亚再生医学研究所在这些研究中的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

参考文献

  • Babiarz JE、Ruby JG、Wang Y、Bartel DP、Blelloch R.小鼠ES细胞表达内源性shRNAs、siRNAs和其他微处理器依赖、Dicer-dependent的小RNA。基因发育。2008;22:2773–2785. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Betel D、Wilson M、Gabow A、Marks DS、Sander C。microRNA.org资源：靶点和表达。核酸研究。2008;36：D149–153。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 不丹N、Brady JJ、Damian M、Sacco A、Corbel SY、Blau HM。对多能性进行重新编程需要AID依赖的DNA去甲基化。自然。2010年；463:1042–1047. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Blelloch R，Venere M，Yen J，Ramalho-Santos M。在缺乏药物选择的情况下诱导多能干细胞的生成。细胞干细胞。2007;1:245–247. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Card DA，Hebbar PB，Li L，Trotter KW，Komatsu Y，Mishina Y，Archer TK.Oct4/Sox2调节的miR-302靶向人类胚胎干细胞中的细胞周期蛋白D1。摩尔细胞生物学。2008;28:6426–6438. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cohen ED、Ihida-Stansbury K、Lu MM、Panettieri RA、Jones PL、Morrisey EE。Wnt信号通过tenascin C/PDGFR途径调节小鼠肺平滑肌前体的发育。临床投资杂志。2009;119:2538–2549. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 弗里德里希·G，索里亚诺·P。胚胎干细胞中的启动子陷阱：一种识别和突变小鼠发育基因的基因筛选。基因发育。1991;5:1513–1523.[公共医学][谷歌学者]
  • Grimson A、Farh KK、Johnston WK、Garrett-Engele P、Lim LP、Bartel DP。哺乳动物微小RNA靶向特异性：种子配对之外的决定因素。分子细胞。2007;27:91–105. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Huangfu D，Maehr R，Guo W，Eijkelenboom A，Snitow M，Chen AE，Melton DA。小分子化合物大大提高了特定因子诱导多能干细胞的能力。国家生物技术。2008年a；26:795–797. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Huangfu D，Osafune K，Maehr R，Guo W，Eijkelenboom A，Chen S，Muhlestein W，Melton DA。仅使用Oct4和Sox2从人原代成纤维细胞诱导多能干细胞。国家生物技术。2008年b；26:1269–1275.[公共医学][谷歌学者]
  • Judson RL、Babiarz JE、Venere M、Blelloch R.胚胎干细胞特异性微RNA促进诱导的多能性。国家生物技术。2009;27:459–461. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kim J，Chu J，Shen X，Wang J，Orkin SH.胚胎干细胞多能性的扩展转录网络。单元格。2008;132:1049–1061. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kramer OH，Zhu P，Ostendorff HP，Golebiwski M，Tiefenbach J，Peters MA，Brill B，Groner B，Bach I，Heinzel T等。组蛋白脱乙酰酶抑制剂丙戊酸选择性诱导HDAC2的蛋白酶体降解。EMBO J。2003;22:3411–3420. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Krek A、Grun D、Poy MN、Wolf R、Rosenberg L、Epstein EJ、MacMenamin P、da Piedade I、Gunsalus KC、Stoffel M等。组合微RNA靶预测。自然遗传学。2005;37:495–500.[公共医学][谷歌学者]
  • Lagarkova MA、Shutova MV、Bogomazova AN、Vassina EM、Glazov EA、Zhang P、Rizvanov AA、Chestkov IV、Kiselev SL。人类内皮细胞多能性的诱导在基因组水平上重设表观遗传学特征。细胞周期。2010年；9:937–946.[公共医学][谷歌学者]
  • Lengner CJ、Camargo FD、Hochedlinger K、Welstead GG、Zaidi S、Gokhale S、Scholer HR、Tomilin A、Jaenisch R.Oct4表达不需要小鼠体细胞自我更新。细胞干细胞。2007;1:403–415. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mali P、Chou BK、Yen J、Ye Z、Zou J、Dowey S、Brodsky RA、Ohm JE、Yu W、Baylin SB等。丁酸通过促进表观遗传重塑和多潜能相关基因的表达，极大地促进了人类诱导多潜能干细胞的衍生。干细胞。2010年；28:713–720. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Melton C，Judson RL，Blelloch R.反对microRNA家族调节小鼠胚胎干细胞的自我更新。自然。2010年；463：621–626。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Moretti A、Bellin M、Jung CB、Thies TM、Takashima Y、Bernshausen A、Schiemann M、Fischer S、Moosmang S、Smith AG等。小鼠和人诱导的多能干细胞作为多能Isl1+心血管祖细胞的来源。美国财务会计准则委员会J。2010年a；24:700–711.[公共医学][谷歌学者]
  • Moretti A、Bellin M、Welling A、Jung CB、Lam JT、Bott-Flugel L、Dorn T、Goedel A、Hohnke C、Hofmann F等。长QT综合征患者特异性诱导多能干细胞模型。N英格兰J医学2010年b[公共医学][谷歌学者]
  • Raya A、Rodriguez-Piza I、Navarro S、Richaud-Patin Y、Guenechea G、Sanchez-Danes A、Consiglio A、Bueren J、Izpisua Belmonte JC。描述体细胞和后续iPS细胞的遗传校正的协议。国家协议。2010年；5:647–660.[公共医学][谷歌学者]
  • Rosa A、Spagnoli FM、Brivanlou AH。miR-430/427/302家族通过物种特异性靶点选择控制肠系膜上皮的命运规范。开发单元。2009;16:517–527.[公共医学][谷歌学者]
  • Seki T、Yuasa S、Oda M、Egashira T、Yae K、Kusumoto D、Nakata H、Tohyama S、Hashimoto H、Kodaira M等。从人类终末分化循环T细胞中生成诱导多能干细胞。细胞干细胞。2010年；7:11–14.[公共医学][谷歌学者]
  • Shu W，Jiang YQ，Lu MM，Morrisey EE。Wnt7b调节肺间充质细胞增殖和血管发育。发展。2002;129:4831–4842.[公共医学][谷歌学者]
  • Si-Tayeb K、Noto FK、Nagaoka M、Li J、Battle MA、Duris C、North PE、Dalton S、Duncan SA。从诱导的多能干细胞高效生成人类肝细胞样细胞。肝病学。2010年；51:297–305. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sommer CA、Stadtfeld M、Murphy GJ、Hochedlinger K、Kotton DN、Mostoslavsky G。使用单个慢病毒干细胞盒诱导多能干细胞生成。干细胞。2009;27：543–549。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Takahashi K、Tanabe K、Ohnuki M、Narita M、Ichisaka T、Tomoda K、Yamanaka S。通过特定因子从成人成纤维细胞诱导多能干细胞。单元格。2007;131：861–872。[公共医学][谷歌学者]
  • Takahashi K，Yamanaka S.通过特定因子从小鼠胚胎和成年成纤维细胞培养物中诱导多能干细胞。单元格。2006;126:663–676.[公共医学][谷歌学者]
  • Trivedi CM、Lu MM、Wang Q、Epstein JA。心脏中Hdac3的转基因过表达可增加出生后心肌细胞的增殖，但不会诱导肥大。生物化学杂志。2008;283:26484–26489. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wang Y、Baskerville S、Shenoy A、Babiarz JE、Baehner L、Blelloch R.胚胎干细胞特异性微RNA调节G1-S转换并促进快速增殖。自然遗传学。2008;40:1478–1483. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wang Y，Blelloch R.胚胎干细胞中微RNA对细胞周期的调节。癌症研究。2009;69:4093–4096. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wang Y、Medvid R、Melton C、Jaenisch R、Blelloch R.DGCR8对微RNA生物生成和沉默胚胎干细胞自我更新至关重要。自然遗传学。2007;39:380–385. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Warren L、Manos PD、Ahfeldt T、Loh YH、Li H、Lau F、Ebina W、Mandal PK、Smith ZD、Meissner A等。利用合成修饰的mRNA高效重编程实现人类细胞的多能性和定向分化。细胞干细胞。2010年；7:618–630. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yoshida Y、Takahashi K、Okita K、Ichisaka T、Yamanaka S。缺氧促进诱导多能干细胞的生成。细胞干细胞。2009;5:237–241.[公共医学][谷歌学者]