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单元格。2011年2月18日；144(4): 566–576.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2011.013
预防性维修识别码：下午3087504
PMID：21335238

卵母细胞DNA损伤导致质量控制因子TAp63α从二聚体转变为四聚体

格雷戈·B·多伊奇,1,12 伊丽莎白·M·齐埃隆卡,2,三，12 丹尼尔·库坦丁,1,12 托比亚斯·韦伯,1 比吉特·施费尔,1 延斯·汉内沃尔德,4 劳拉·M·卢,1 弗洛里安·杜斯特,1 易卜拉欣,5 扬·霍夫曼,6 弗兰克·H·尼森,8 艾肯·塞特尤克,7 哈娜·昆克尔,10 伯恩德·布鲁奇,6 恩里科·施莱夫,5 斯特凡·克纳普,8,9 Amparo Acker-Palmer公司,7 曼纽尔·格雷兹,10 麦基翁,2,三，11和沃尔克·多奇1,∗
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关联数据

补充资料

摘要

TAp63α是p53抑癌基因的同源物，是女性生殖系的质量控制因子。值得注意的是，已经未受损的卵母细胞表达高水平的蛋白，这表明TAp63α的活性受到抑制机制的严格控制。生化研究表明，抑制需要C末端反式激活抑制域。然而，TAp63α抑制的结构机制仍然未知。这里，我们表明TAp63α保持在非活性二聚体状态。我们发现，抑制的解除导致四聚体的形成，具有约20倍的DNA亲和力。在体内，磷酸化触发的TAp63α四聚体通过去磷酸化是不可逆的。此外，我们还表明，p63齐聚结构域中的螺旋对四聚体的稳定至关重要，并与反式激活结构域竞争相同的结合位点。我们的结果证明了复杂结构域相互作用是如何抑制TAp63α的，这为调节卵母细胞的质量控制提供了基础。

集锦

► TAp63α在二聚状态下被复杂的结构域-结构域相互作用抑制►DNA损伤时磷酸化触发的TAp63β活化需要四聚体►四聚体稳定需要四聚域的第二螺旋H2►反式激活域的四聚体域结合由螺旋H2竞争

介绍

在哺乳动物中，p53抑癌基因家族包含另外两个成员，p73和p63(Kaghad等人，1997年；Schmale和Bamberger，1997年；Senoo等人，1998年；Trink等人，1998年；Yang等人，1998年). 最初，他们的发现引发了一种猜测，即肿瘤抑制可能是通过p53样因子的整个网络实现的。然而，详细的研究表明这两种p53同源物都具有重要的发育功能(Mills等人，1999年；Yang等人，1999年，2000年). p73基因敲除小鼠患有海马发育不全、慢性感染和炎症，以及信息素感觉通路异常。p63缺失会导致更严重的缺陷，包括肢体截断、缺乏多层皮肤和其他上皮结构。这些表型导致在人类中识别出六种以肢体变形和/或皮肤异常为特征的p63相关综合征(Celli等人，1999年；McGrath等人，2001年). 与这些明确的发育功能相反，这两种蛋白质是否也起到肿瘤抑制剂的作用仍然存在争议。

由于p63和p73的许多不同亚型的存在，以及这两种蛋白质之间可能形成混合低聚物，这两种蛋白的生理作用的研究进一步复杂化(Coutandin等人，2009年；Joerger等人，2009年) (图1A） ●●●●。通过组合几个不同的C端子拼接变体来创建等轴测图(De Laurenzi等人，1999年；Kaghad等人，1997年；Yang等人，1998年)带有两个不同的启动子，它们可以产生带有（TA亚型）或不带有（ΔN亚型）N-末端反式激活结构域的亚型(Yang等人，1998年).

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TAp63α保持在非活性二聚体状态

（A） 比较p53、TAp63α、TAp65γ和ΔNp63α的结构域结构，显示反式激活（TA）域、DNA结合域（DBD）、寡聚化域（OD）、无菌α-动机（SAM）域和反式激活抑制（TI）域。

（B） 纯化自大肠杆菌。显示了表观分子量。具有相应分子量的球形标准蛋白的空隙体积和洗脱体积显示在x轴上。

（C） 通过结合马来酰亚胺-生物素共轭物监测MBP-TAp63α（黑色）和MBP-TAp 63αFTL（红色）中半胱氨酸的相对可及性的条形图。MBP-TAp63α的值设置为100%。误差条显示标准偏差。

（D–G）微分折射率（dRI，实线）和蛋白质峰分子量（M）的变化W公司，虚线）。显示计算的分子量。

另请参见图S1和表S1.

在p63的情况下，详细的分析已经开始揭示一些同种型的生理功能。ΔNp63α是由第二启动子与最长C-末端剪接变异体结合产生的亚型，通过在基底层维持干细胞数量，在包括皮肤在内的分层上皮组织的发育中起着重要作用(Senoo等人，2007年). 这种亚型的失活似乎是导致基因敲除小鼠和p63突变的人类患者出现严重发育缺陷的原因。相反，TAp63α是一种包含长αC末端和全N末端反式激活结构域的亚型，具有完全不同的功能。在卵母细胞中发现，它作为质量控制因子，监测这些细胞的遗传稳定性(Suh等人，2006年). TAp63α在小鼠卵母细胞中的表达可以在E18.5天和P5天检测到，当小鼠卵母细胞核在第一次减数分裂前期停滞时，所有卵母细胞都表现出强烈的核表达。在卵母细胞被招募用于排卵后，TAp63α表达缺失。先前的实验表明，γ射线照射会导致TAp63α磷酸化，然后清除所有早熟卵母细胞，而不表达p63的成熟卵母细胞则不会受到影响(Suh等人，2006年).

由于TAp63α具有诱导细胞死亡的能力，因此必须严格调控其活性。与p53相反，p53在非应激细胞中的浓度很低，只有在致癌信号触发时才会增加(布鲁克斯和顾，2006；Wade等人，2010年)，TAp63α在非应激卵母细胞中已经达到高表达水平(Suh等人，2006年). 这一观察结果表明，TAp63α的活性必须通过保持其处于非活性状态来调节。在基于细胞培养的转录激活实验中，TAp63α确实只显示出非常低的转录活性。通过缺失突变，我们在之前的实验中发现TAp63α的最后70个氨基酸作为反式激活抑制域（TID）。该TI结构域的缺失或突变使TAp63α的低转录活性增加了几倍(Serber等人，2002年；Straub等人，2010年；Yang等人，1998年). 然而，TID如何抑制TAp63α活性的确切机制尚不清楚。

这里，我们在体外和体内都表明，TAp63α在非应激卵母细胞中保持着封闭的二聚体构象，而γ射线引发的磷酸化促进活性四聚体的形成。TAp63α的活性状态通过其四聚结构域的特殊结构而稳定，使活化过程基本上不可逆。

结果

TAp63α形成闭合二聚构象

为了研究TID的抑制机制，我们在小鼠体内表达了TAp63α大肠杆菌令人惊讶的是，对纯化的TAp63α进行的尺寸排除色谱（SEC）分析表明，它形成二聚体而不是预期的四聚体(图1B） ●●●●。p53蛋白家族的所有哺乳动物成员都使用高度保守的寡聚结构域（OD）来形成四聚体，这些四聚体被证明是活性状态(Chan等人，2004年；陈，2001年；Jeffrey等人，1995年；Lee等人，1994年). SEC实验中使用的TAp63α浓度比K高几个数量级（3–15μM）D类用于p63（12 nM）的四聚(Brandt等人，2009年)，排除了简单稀释可以解释四聚体缺失的可能性。这一结果意味着TAp63α采用二聚体的非活性构象，进一步表明p63的活化可能与四聚体的形成有关。为了解决这个问题，我们对缺乏TID的转录活性TAp63γ亚型进行了SEC分析。获得可溶性TAp63γ需要以N-末端麦芽糖结合蛋白（MBP）融合的形式表达。为了便于比较，我们还表达了与MBP融合的TAp63α。MBP-TAp63γ的SEC分析表明，尽管其每个单体含有193个氨基酸较少，但其表现为比MBP-TAp 63α大得多的蛋白质(图1B） ●●●●。

在之前的TID丙氨酸扫描实验中，我们发现三重突变体F605A T606A L607A（TAp63αFTL）显示出高转录活性，表明该突变破坏了TID的抑制功能(Straub等人，2010年). SEC分析表明，MBP-TAp63αFTL也表现为比MBP-TAp 63α大得多的蛋白质，其保留体积与MBP-TAp-63γ相似(图1B） ●●●●。

TAp63α作为二聚体的分类基于SEC柱与致密球状蛋白的校准。TAp63α的预测分子量为160 kDa，MBP-TAp63β的预测分子质量为266 kDa分别与150和232 kDa的二聚体的理论值非常相似。然而，对MBP-TAp63αFTL和MBP-TAp 63γ的分子量的估算结果表明，到目前为止，其值超过了假设四聚体的理论值。如果活性形式采用比四聚体更高的低聚物状态，如果蛋白质聚集，或者如果四聚体的构象偏离球状折叠，则可以解释这些发现。为了通过独立于形状的质量测定来研究所有蛋白质的低聚物状态，我们使用了多角度光散射（MALS）分析。结果如所示图1D–1G证实TAp63α和MBP-TAp63β形成二聚体，而MBP-TAp 63αFTL和MBP-TAp63γ作为四聚体存在。MALS分析证明的SEC峰的同质性进一步排除了蛋白质聚集的可能性。交联实验进一步证明了聚合的缺失和特定低聚物状态的形成（参见图S1A–S1D可在线获取），通过质谱（LILBID）分析(图S1E） 沉降平衡分析超速离心(图S1F和表S1). 所有这些数据的组合表明，表观分子量与计算值的偏差源于开放的非小叶构象的形成。为了进一步研究这一假设，我们进行了半胱氨酸可及性分析，结果表明MBP-TAp63αFTL突变株中的半胱氨酸比非突变型更容易被化学修饰(图1C类；图S1一） ●●●●。此外，沉降速度超速离心实验的分析支持了开放构象的形成(图S1G和S1H）。

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TAp63α形成非活性的闭合二聚体，而活性形式是四聚体和开放的，与图1

（A–D）考马斯染色SDS-PAGE分析纯化自大肠杆菌与戊二醛交联。如图所示，使用不同的蛋白质浓度和不同的反应时间。与单体、二聚体和高级低聚物蛋白质相对应的蛋白质带分别用箭头、星号和箭头标记。

（E） MBP-TAp63α的LILBID阴离子光谱。使用约10μM的蛋白质浓度记录光谱，平均超过200个液滴。标尺指示232 kDa分子的电荷分布。激光能量调整为8mJ/脉冲。质量对应于电荷在1和6之间的二聚体蛋白质。三电荷四聚体的一个小峰出现在155×10三m/z（峰值起点）。

（F） MBP-TAp63α（黑色）、MBP-TAp 63αFTL（红色）和MBP-TAp-63γ（蓝色）的AUC沉降平衡吸光度扫描（280 nm）。蛋白质浓度为4μM，转速为7000 rpm。

（G和H）MBP-TAp63α（黑色）和MBP-TAp63αFTL（红色）以及MBP-TAp63γ（蓝色）（H）根据其沉降系数的物种分布，由45000rpm下的AUC沉降速度确定。蛋白质浓度为4μM。单体（M）、二聚体（D）和四聚体（T）的位置如图所示。如星号所示，MBP-TAp63αFTL和MBP-TAp 63γ的其他可见峰表明其他物种（三聚体、五聚体等）的浓度较低。四聚体MBP-TAp63αFTL和MBP-TAp 63γ与野生型二聚体的表观沉降系数和摩擦比的比较支持四聚体形式的开放构象。

（一） 显示检测MBP（黄色）和马来酰亚胺-生物素共轭物的绝对信号强度的条形图，该共轭物共价连接到从大肠杆菌BSA和作为阴性对照缓冲液，在三个实验中取平均值。误差条显示标准偏差。

磷酸化触发体内活性TAp63α四聚体的形成

在小鼠中，TAp63α的表达可从胚胎第18.5天开始检测，当小鼠卵母细胞在第一次减数分裂前期被阻滞时，所有卵母细胞均在第P5天表现出强烈表达（节律阻滞）(Suh等人，2006年). p63的表达一直维持在较高水平，直到卵母细胞被招募用于排卵。在此期间，DNA损伤会触发p63的激活和卵母细胞的破坏。为了研究我们在体外获得的结果是否可以解释TAp63α在卵母细胞中的行为，我们用SEC分析了5日龄小鼠体内TAp63的寡聚状态。图2A表明，0.52 Gy的γ射线照射小鼠可触发TAp63α的磷酸化，并导致其浓度相对于未照射的卵母细胞降低。对从未受辐射小鼠获得的样品的SEC组分的分析显示，二聚体组分（1.55 ml）中有强信号，四聚体组份（1.3 ml，用细菌表达的p63亚型校准；图S2A–S2C和图2A–2C）。相反，从辐照小鼠中获得的样品在四聚体部分显示出显著信号(图2A、 2D和2E）。辐照卵母细胞中四聚体TAp63α的体内浓度预计将显著高于SEC实验中的浓度，因为卵母细胞裂解和SEC分析导致样品稀释至少10倍。我们证实，在SEC实验中，稀释通过降低细菌表达的MBP-TAp63γ的浓度，将平衡转移到二聚体(图S2C–S2G）。虽然MBP-TAp63γ在浓度为3-15μM时几乎完全是四聚体，但在30 nM时，二聚体和四聚体之间的分布几乎相等(图S2). 这些结果表明，未应激卵母细胞中的TAp63α保持二聚体和闭合构象，DNA损伤触发体内四聚体的形成。未辐照细胞与辐照细胞中TAp63α的浓度显著高于辐照细胞，这进一步表明，四聚体的形成不是通过保持低细胞内浓度来抑制的（正如对p53的讨论一样），而是通过涉及TID的结构域相互作用来积极抑制的。

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卵母细胞磷酸化激活TAp63α导致四聚体

（A） 小鼠卵母细胞样本的Western blot。显示了小鼠卵母细胞裂解液中的p63信号，未辐照（NIRR）和γ辐照（IRR）卵母细胞在1.3 ml（四聚体蛋白）和1.55 ml（二聚体蛋白质）的SEC洗脱部分。

（B） 1.2至1.65 ml NIRR卵巢裂解物SEC洗脱组分的Western blot。

（C） 显示蛋白质印迹相对p63信号强度的条形图，如（B）所示。所有部分的强度之和设置为100%。

（D和E）IRR卵巢裂解物的相应数据和分析。

另请参见图S2.

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MBP-TAp63γ的稀释导致四聚平衡向二聚体转移，与图2

（A） 纯化自大肠杆菌在Superose 6 PC 3.2/30柱上显示四聚体和二聚体部分的重叠量。显示了表观分子量。具有相应分子量的球状标准蛋白的空隙体积和洗脱体积显示在x个轴。色谱图显示，p63形式在Superose 6 PC3.2/30柱上显示出与Superose6 10/300 GL柱上相同的相对洗脱曲线（结果如图5B） ●●●●。由于Superose 6 PC 3.2/30色谱柱的分辨率较低，因此两个色谱柱之间峰值的预测质量出现偏差。

（B和C）条形图，显示TAp63α（B）和MBP-TAp63γ（C）相对于（A）所示SEC色谱各自总强度的强度。每个值代表1.2至1.65 ml洗脱体积之间的50μl分数。（B）中的图表显示了约1.55 ml（二聚体部分）的最大洗脱体积，（C）中的图显示了约1.35 ml（四聚物部分）的洗脱体积。这两种蛋白质的浓度约为5μM。

（D） 在1.2和1.65 ml 100 nM MBP-TAp63γ之间纯化的50μl SEC洗脱组分的Western blot大肠杆菌.

（E） 显示MBP-TAp63γ信号强度相对于（D）中Western blot所有强度总和的条形图。

（F和G）30 nM MBP-TAp63γ（F）1.2和1.65 ml之间50μl SEC洗脱组分的Western blot和相应的条形图（G）。

四聚体增加DNA结合亲和力

接下来我们研究了四聚体形成的功能后果。先前在卵母细胞中的实验表明，磷酸化可将TAp63α的DNA结合亲和力提高约20倍(Suh等人，2006年). 为了研究DNA亲和力的增加是否可以用四聚体的形成来解释，我们测量了KD类使用荧光各向异性测定MBP-TAp63α、MBP-TAp 63αFTL和MBP-TAp-63γ与p21启动子响应元件的结合值。图3A–3C（和图S3A和S3B）揭示了二聚体MBP-TAp63α与p21启动子反应元件结合D类7.51±1.32μM。对于四聚体MBP-TAp63αFTL和MBP-TAp 63γ，KD类测量值分别为0.38±0.04μM和0.34±0.08μM。这些测量结果表明，从封闭的二聚体状态变为开放的四聚体状态会使DNA结合亲和力增加约20倍，与在卵母细胞中进行的研究类似。

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四聚体形成的功能后果

MBP-TAp63α（A）、MBP-TAp63αFTL（B）和MBP-TAp 63γ（C）的（A–C）DNA结合大肠杆菌对p21响应元件进行荧光各向异性测量。实线显示适合于双绑定站点模型（请参见补充信息). 误差条显示标准偏差。

（D） 未经λ-磷酸酶处理的1.1至1.7 ml IRR卵巢裂解液之间SEC洗脱组分的Western blot。

（E） 表示（D）中所示western blot的相对p63强度的条形图。

（F和G）经λ-磷酸酶处理的IRR裂解物的相应western blot和条形图分别显示在（F）和（G）中。

（H） 条形图显示了未经（IRR–λPP）和（IRR+λPP”λ-磷酸酶处理的卵巢裂解物SEC洗脱组分的四聚体（1.10–1.40 ml）和二聚体（1.45–1.70 ml）组分的信号强度之和之间的比率。

另请参见图S3.

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TAp63的DNA结合是特异性的，而λ-磷酸酶处理导致完全去磷酸化，与图3

（A和B）从大肠杆菌使用荧光各向异性对300 nM SELEX DNA（见方法部分）（A）或随机序列（见方法章节）（B）进行检测。在（A）中，除MBP-TAp63αR外，所有TAp63形式都与SELEX DNA结合，MBP-TAp 63αFTL和MBP-TAp-63γ的亲和力高于MBP-TAp63α。在（B）中，没有TAp63形式与随机序列结合。

（C） 体外磷酸化试验，其中MBP-TAp63α从大肠杆菌（泳道1；3-8）在不存在（泳道1）或存在（泳道2-8）裂解的IRR卵巢（泳道2）的情况下，用10μCi[γ-32P] -ATP。反应受到5 Uλ-磷酸酶（λ-PP）（第4车道）、磷酸酶抑制剂（第5车道）、100μM ATP（第6车道）、100M GTP（第7车道）或100M ADP（第8车道）的挑战。用SDS样品缓冲液停止反应，并用10%SDS-PAGE对样品进行分析。通过放射自显影术观察磷酸化情况。

（D） 与（C）相对应的凝胶考马斯染色显示MBP-TAp63α作为负荷控制。

保持四聚体状态不需要磷酸化

先前的研究表明，用λ-磷酸酶处理磷酸化的TAp63α不会将DNA结合亲和力降低到其原始值(Suh等人，2006年). 这一结果表明磷酸化是激活过程的触发因素，但不是维持活性状态所必需的。由于活性状态是四聚体，脱磷酸不应影响齐聚平衡。为了研究磷酸化状态对寡聚体状态的影响，我们对从辐照卵母细胞获得的经λ-磷酸酶处理的TAp63α进行了SEC分析。与磷酸化TAp63α相比，去磷酸化样品确实显示出高百分比的四聚体，二聚体浓度仅相对较小的增加(图3D–3H）。体外对照实验表明，λ-磷酸酶处理可导致完全脱磷酸(图S3C和S3D）。这一结果表明，四聚体的形成构成了磷酸化触发的几乎不可逆的激活开关。最近，我们和其他人发现p63在其寡聚结构域（OD）中含有一个额外的螺旋，而p53 OD中不存在(Coutandin等人，2009年；Joerger等人，2009年). 第二个螺旋通过到达四聚体界面来稳定四聚体。由于该螺旋必须在封闭的二聚体状态中采用不同的构象或取向，因此可能是磷酸化诱导活化后将TAp63α锁定为四聚体形式的元素。该模型得到以下观察结果的支持：该螺旋的缺失使活性态模拟突变体TAp63αFTL二聚体，而缺失对TAp63(图4). 此外，反式激活分析表明，第二螺旋的缺失显著降低了转录活性(图S4).

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TD的第二螺旋对四聚体的形成至关重要

（A） 使用抗myc抗体对兔网织红细胞裂解物（RRL）中表达的1.05至1.70 ml TAp63α之间的SEC洗脱组分进行Western blot。

（B） 显示蛋白质印迹相对p63强度的条形图，如（A）所示。分别在（C和D）、（E和F）和（G和H）中显示了TAp63αFTL、TAp63βΔ螺旋和TAp63γFTLΔ螺旋的相应数据和分析。

另请参见图S4.

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TD中的第二螺旋H2对稳定四聚体的形成至关重要，与图4

TAp63γ、TAp63α、不含螺旋H2的TAp63β（TAp63？αΔHelix）、TAp63-αFTL和不含螺旋H2的TAp63-αFTL（TAp63-FTLΔHelex）在SAOS2细胞中p21启动子的转录活性，TAp63Γ活性设置为100%。实验一式三份。误差条显示标准偏差。

四聚结构域对形成闭合构象至关重要

这种通过控制齐聚状态来调节p63活性的模型为四聚结构域指定了一个关键角色（作为TD，我们定义了带有第二螺旋的OD）。TD的结构是二聚体的二聚体(Jeffrey等人，1995年；Lee等人，1994年). 最明显的模型可以解释通过选择性阻断四聚界面而不影响二聚界面对TAp63α的抑制作用。为了探讨四聚体界面的重要性，我们将Met374突变为Gln，将Ile378突变为Arg（TAp63αMI）。据报道，p53类似物位置的突变可触发二聚体(Davison等人，2001年) (图5A和5B）。这些突变显著增加了转录活性，达到野生型TAp63γ活性的55%(图5E） ，类似于二聚体p53和TAp63γ突变体的活性(Davison等人，2001年；Straub等人，2010年). 先前的GST下拉分析表明TID和TA结构域相互作用(Serber等人，2002年；Straub等人，2010年). 与野生型TAp63α相比，在使用外部TI结构域的下拉分析中，TAp63βMI突变被有效地下拉(图5F和5G），表明TAp63αMI形成开放构象，其中TA可用于相互作用。因此，该结果预测TAp63αMI中的TID也应可用于与外部TA结构域的相互作用。事实上，这一假设在下拉实验中得到了证实(图5H和5I）。总之，这些结果表明，这种双重突变通过破坏TID介导的抑制机制来诱导开放构象。

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TAp63α的TD在维持抑制二聚态中起着重要作用

（A） 人类p73和小鼠p63的TDs序列比对。根据人类p73的结构，建立了小鼠p63的结构模型。受保护的区域用灰色框表示。p63中突变的氨基酸显示为红色、青色和橙色。

（B–D）人类p73 TD的结构（PDB登录代码：2KBY）。与p63中突变的氨基酸同源的残基侧链以与（A）中相同的颜色显示。（B） 显示TAp63αMI突变，（C）显示TAp65αL突变，（D）显示TAp 63αLM突变。

（E） SAOS2细胞中p21启动子的转录活性归一化为TAp63αLM、TAp63βL、TAp65αMI、TAp62α和TAp63γ的蛋白浓度。误差条显示标准偏差。

（F） 使用固定化TID对来自RRL的TAp63αLM、TAp63βL、TAp65αMI、TAp62α和TAp63γ的下拉实验进行Western blot。每个蛋白质都显示了输入（IP）和下拉（PD）。

（G） 条形图显示了（F）中下拉实验的定量分析。误差条显示标准偏差。

（H和I）Western blot（H）和相应的柱状图（I）显示了使用固定化TA结构域对来自RRL的TAp63α、TAp63γ、TAp63-αFTL、TAp63/αMI和TAp63-LM的下拉实验进行的定量分析。误差条显示标准偏差。

另请参见图S5.

Met374和Ile378位于四聚反应界面的中心。我们还将位于其边缘的Leu384和Met385突变为Ala(图5A、 5C和5D）。L384A和L384A/M385A突变体（TAp63αL和TAp63βLM）在反式激活分析中表现出非常低的活性，在与外部TID或TA结构域的下拉实验中没有相互作用(图5E–5I），证明只有四聚结构域中心区域的突变通过产生开放的二聚体形式破坏抑制机制(图S5).

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TAp63αTD四聚界面突变的SEC分析图5

（A和B）使用抗myc抗体（A）和Western blot强度条形图（B）对兔网织红细胞裂解物中表达的1.04至1.69 ml TAp63αMI的SEC洗脱组分进行Western blot分析。

（C–F）TAp63αL和TAp63βLM的相应数据和分析分别显示在（C和D）和（E和F）中。在TAp63αMI四聚体界面中心引入M374Q/I378R二聚体突变导致抑制性TA-TID相互作用的失稳。这导致二聚体蛋白具有更开放的构象，其中TA结构域和TID至少部分可用于与下拉分析中相应的外部相互作用伙伴的相互作用。在四聚体界面边缘引入的突变（TAp63αLM和TAp63βL）不影响TID和TA结构域之间的相互作用，表明TD的特定区域参与了TID介导的抑制机制。

抑制机制的一个吸引人的模型可以解释通过TID与四聚体界面的直接相互作用形成二聚体TAp63α。原则上，核磁共振滴定实验将允许直接映射结合位点。然而，p63 OD是四聚物，其浓度通常用于NMR（即使没有第二螺旋），使得四聚物界面无法与TID进行潜在的相互作用。因此，p63 OD与源自含有FTL基序的TID（601–616）的肽的核磁共振滴定没有显示任何相互作用。有趣的是，已知存在二聚体和四聚体混合物的p73 OD的滴定实验(Coutandin等人，2009年)p63 TID肽通过形成可溶性聚集体导致所有峰消失。用形成稳定四聚体的p73 TD重复此滴定，未显示任何相互作用（数据未显示）。尽管这些实验是非常间接的，涉及p63和p73结构域的混合，但它们表明p63 TID可以与p73 OD相互作用，但不能与p73 TD相互作用。不同的是，p73 ODs与具有可访问的四聚体界面的二聚体形式处于平衡状态。

N-末端反激活结构域与p63的OD结合

基于先前的下拉实验，我们认为TAp63α闭合状态的形成涉及N端反式激活域（TA）和C端TID(塞尔伯等人，2002年). 为了进一步研究TA结构域对闭合构象形成的重要性，我们对ΔNp63α进行了SEC分析，这是一种缺乏前45个氨基酸的天然亚型(Yang等人，1998年). 如所示图6A、 ΔNp63α是四聚体，证明TA和TI结构域的同时存在对于形成闭合的二聚构象是必要的。

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p63 TA1与p63的齐聚结构域结合

（A） His-MBP-ΔNp63α的SEC色谱图PPR公司纯化自大肠杆菌缺少最后25个非结构残基。显示了表观分子量。具有相应分子量的球形标准蛋白的空隙体积和洗脱体积显示在x轴上。

（B） 添加p63 TA1后，p63 OD（彩色编码）和p63 TD（灰色）上的化学位移扰动（CSP）。OD残留物用蓝色表示，CSP>0.1 ppm的残留物以红色表示，CSP>0.05 ppm的残渣以橙色表示。

（C和D）[15N、，1H] -TROSY光谱15N标记的p63 OD存在（红色）和不存在（蓝色）p63 TA1（C）和p63 TA1FWL（D）。

（E） 基于人类p73 TD结构的p63 TD模型。残留物根据（B）中的代码着色。TD（白色）的螺旋H2位于TA1-OD交互界面的顶部。H2要么显示为带状物，要么显示为填充空间模型。

（F） p63 TA1和p63 TA1FWL的序列，具有额外的F10W紫外线突变280纳米-基于量化。

使用抗myc抗体在RRL中表达的1.05至1.70 ml TAp63αFWL之间SEC洗脱部分的（G和H）Western blot（G）和相应的条形图（H）。

用TAp63αFWL和来自RRL的ΔNp63α通过固定化TA结构域进行下拉实验的（I和J）Western blot（I）和相应的条形图（J）。每个蛋白质的输入（IP）和下拉（PD）如（I）所示。为了进行比较，TAp63α和TAp63γ的下拉结果来自图5图中显示了H。误差条显示标准偏差。

为了测试OD是否能与TA结构域相互作用，我们用来自反式激活结构域TA1（9–32）和TA2（49–78）区域的肽滴定p63 OD(Burge等人，2009年). 虽然TA2肽没有相互作用，但与TA1肽的滴定在快速交换体系中显示出强烈的化学位移扰动（CSP）(图6B、 6C和6F）。将这些CSP映射到OD结构上表明，该肽的结合位点与TD内第二螺旋的位置重叠(图6E） ●●●●。该结果预测TA1肽不应与含有第二螺旋的p63的TD相互作用。用p63 TD重复滴定实验确实只显示出非常小的化学位移变化(图6B） ，表明TD的第二螺旋和TA1肽都竞争相同的结合位点。

p53的N末端反式激活域包含三个重要的残基，即Phe19、Trp23和Leu26，已知这三个残基参与结合转录辅激活子和Mdm2(Horikoshi等人，1995年；Kussie等人，1996年；Lu和Levine，1995年；Thut等人，1995年). p53反式激活域与Mdm2复合物中衍生的肽的晶体结构表明，这三种氨基酸形成螺旋的一个面，该螺旋深埋在Mdm2的疏水口袋中。这三种氨基酸在p63中都是保守的。我们假设，如果N末端反式激活结构域与OD的结合有助于抑制，那么最可能的机制将涉及掩埋这三种氨基酸，以防止它们与转录机制相互作用。将这些残基突变为丙氨酸会导致与OD完全失去相互作用，这表明它们确实对结合很重要，可能是通过形成螺旋的一面(图6D和6F）。

通过突变这三个重要残基来破坏TA结构域和OD之间的相互作用，将暴露第二螺旋的结合位点，可能导致四聚体状态的形成。事实上，将TAp63α中的F16、W20和L23突变为丙氨酸（TAp63 a-FWL）会导致四聚体的形成(图6G和6H）。此外，使用外部TA结构域的下拉实验表明，TID可用于开放和四聚体状态的预期交互作用(图6I和6J）。这些数据表明，TAp63αFWL的行为与ΔNp63α相似，ΔNp63α缺乏TA结构域的N-末端部分。

p63活性的结构调控模型

这里报告的数据表明，以下模型可以调节卵母细胞中TAp63α的活性。在尚未进行排卵的非应激卵母细胞中，蛋白质保持在二聚体、封闭和不活跃的构象中(图7). N端交易激活域和C端TID都需要形成这种闭合状态。TD作为一种结构整合结构域发挥着重要作用，它在一侧与TA相互作用，并可能在四聚界面上与TID相互作用。下拉实验显示了TA和TI域之间的其他直接接触(Serber等人，2002年；Straub等人，2010年). 这种紧密的二聚体形式的活性通过降低其DNA结合亲和力而降低，可能还通过埋藏TA的重要氨基酸而进一步降低。激活需要磷酸化，磷酸化触发构象开关，释放抑制相互作用，使TAp63α四聚并通过其TA与转录机制相互作用。活性四聚体状态由TD的第二螺旋稳定，该螺旋穿过界面并占据TA的结合位点。该模型解释了TAp63α如何在卵母细胞中达到高表达水平而不会导致细胞死亡。然而，TAp63α的激活是一个“不可逆”过程，一旦启动，就会导致卵母细胞的破坏。

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TAp63α抑制模型

（A） TAp63α的示意图显示了反式激活域（TA）、四聚化域（TD）和反式激活抑制域（TI）。

（B） 激活TAp63α需要破坏TA-TID-TD相互作用网络，从而产生开放构象，从而实现四聚反应。然后，四聚体在TD中被螺旋H2稳定，该TD穿过四聚体界面。

讨论

TAp63α转录活性调控模型与该蛋白家族最著名的成员p53的模型存在显著差异。决定p53活性的主要调节机制似乎是其稳定性。在非应激细胞中，p53通过E3泛素连接酶Mdm2和Mdmx的快速降解而保持在低浓度(Wade等人，2010年). 致癌信号导致p53的稳定，从而导致细胞浓度增加。另一方面，TAp63α在非应激卵母细胞中已经高度表达。DNA损伤引发构象变化，激活蛋白质。与p53相反，这种活性形式似乎比不活性形式更容易降解(图2A） ●●●●。这种解释得到了细胞培养实验的支持，该实验表明，转录不活跃的p63形式积累的浓度远高于活性形式(Straub等人，2010年). 此外，已经证明，有效的退化需要一个可访问的TA域(Ying等人，2005年). 我们的核磁共振数据表明，对p53与Mdm2结合很重要的三种氨基酸以及在p63中保守的氨基酸很可能无法在抑制的二聚体构象中获得。虽然p63与Mdm2的相互作用仍存在争议，但很明显，相互作用和可能的降解只能在TAp63α活化并形成开放状态后发生。调节TAp63α的细胞内浓度很可能涉及其他机制，例如其他E3连接酶。为此，Hect-domain E3连接酶ITCH已被证明泛素化并促进p63的降解(Rossi等人，2006年). 另一种可能是封闭二聚构象特有的机制是发生在TAp63αC末端的sumoylation，此处存在经典的Sumo酰化位点。在细胞培养实验中，sumoylation位点的突变增加了TAp63α的细胞内浓度(Straub等人，2010年). 因此，被抑制的二聚体形式可能通过sumoylation缓慢降解，而活性形式可能被E3连接酶如ITCH或Mdm2泛素化。激活的TAp63α可能在显示亚致死量DNA损伤的卵母细胞中降解。剂量-反应曲线的测量表明，0.1 Gy的γ辐照平均会导致每个细胞出现一条双链断裂。大多数卵母细胞在这种情况下存活下来，只有一小部分TAp63α被磷酸化。然而，0.45 Gy的辐射平均每细胞产生10条双链断裂，并导致几乎所有早产卵母细胞的消除(Suh等人，2006年). 因此，活性TAp63α的降解可能有助于建立诱导卵母细胞死亡的特定阈值。

TAp63α和p53之间的另一个区别是，TAp63β在减数分裂I前期阻滞的细胞中表达，因此推测仅诱导细胞死亡而非细胞周期阻滞（尽管p63原则上可以诱导细胞周期阻滞；郭等人，2009). 从进化的观点来看，卵母细胞遗传完整性的质量控制似乎是p53家族的原始功能，细胞周期阻滞和肿瘤抑制进化后期发展的能力(Coutandin等人，2010年). 这个假设是基于无脊椎动物物种中p53类基因的鉴定，例如，秀丽隐杆线虫(Pearson和Sanchez Alvarado，2010年). 这种蠕虫没有可再生组织，寿命相对较短，不需要肿瘤抑制机制。然而，它的生殖细胞表达一种p53样蛋白，即Cep-1。Cep-1在结构和功能上与p63相似(Derry等人，2001年；Ou等人，2007年)表明p63和生殖细胞中的质量控制是该蛋白家族的祖先成员和功能。

实验程序

蛋白质的表达和纯化大肠杆菌

小鼠TAp63α、TAp63γ、TAp65αFTL和TAp63βR基因（TAp63 a携带DBD中R279H突变；Celli等人，1999年)被克隆到pMAL-c4X载体（新英格兰生物实验室，NEB）中。所有蛋白质都有一个额外的C末端His6-标签。TAp63α的基因也被克隆到pBH4载体（来自加州大学旧金山分校Wendell Lim实验室的礼物）中，用于N末端His的表达6-标签。缺失最后25个氨基酸（ΔNp63α）的小鼠基因PPR公司)被克隆到一个改良的pMAL载体中，得到一个具有N末端His的融合蛋白6-标记后接MBP（His-MBP-ΔNp63αPPR公司). 蛋白质在T7表达能力中表达大肠杆菌细胞（NEB），并根据标准协议使用Ni-Sepharose Fast Flow（GE Healthcare）和直链淀粉树脂（NEB。在10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.6）和200 mM氯化钠中，使用制备的Superose 6柱（GE Healthcare）通过尺寸排除色谱法（SEC）进一步纯化蛋白质。如果没有不同的表示，则在该存储缓冲区中执行以下所有实验。

兔网织红细胞裂解物（RRL）中的蛋白表达

N-末端myc标记的小鼠TAp63α、TAp63 a-FTL，以及TD中缺乏螺旋H2的TAp63 a和TAp63-αFTL（TAp63，和ΔNp63α在RRL中从pcDNA3.1载体表达(Straub等人，2010年). 蛋白质用Superose 6 PC 3.2/30柱进行SEC分析（GE Healthcare）。

尺寸排除色谱法

表达于大肠杆菌在16°C下使用Superose 6 10/300 GL色谱柱（GE Healthcare）进行检测，并使用Blue Dextran 2000、甲状腺球蛋白（669 kDa）、铁蛋白（440 kDa(图1A和5A；图S2A） ●●●●。所有其他SEC实验均在4°C下使用Superose 6 PC 3.2/30色谱柱（GE Healthcare）进行（流速0.05 ml/min；粒径50μl）。western blotting分析相关SEC组分。

半胱氨酸可及性测定

该分析遵循前面描述的方案(Lambert等人，2009年)，进行了修改。MBP-TAp63α、MBP-TAp 63αFTL、BSA和储存缓冲液与2.4μM马来酰亚胺-PEG孵育2-生物素（Pierce）在室温下培养1小时。通过添加44μM半胱氨酸，然后培养1小时，停止反应。将样品固定在96孔镀镍板（Pierce）上1小时。然后用PBS清洗微孔三次，用PBS中的5%脱脂牛奶封闭微孔1小时，用Avidin-HRP结合物（Pierce）或HPR结合抗MBP抗体（NEB）探测微孔50分钟，再用PBS清洗七次，并按所述进行处理。三口井的平均强度。亲和素-HRP结合物和HRP结合抗MBP抗体信号强度的比值对应于半胱氨酸可及性。MBP-TAp63α的比率设置为100%。每个实验进行三次，并对结果进行平均。

多角度光散射

SEC-MALS实验在室温下使用Superdex 200 5/150 GL色谱柱（GE Healthcare）以0.3 ml/min的流速进行。使用Optilab rEX折射率检测器和Dawn Heleos II在658 nm的激光波长下检测80μl浓度为～1 mg/ml的纯化蛋白质的洗脱（怀亚特技术）以确定重均摩尔质量M（M）¯W公司峰值位置。使用ASTRA软件包5.3.4.11（Wyatt Technology）处理数据。

小鼠与辐射

根据世界卫生组织（瑞士日内瓦）制定的指南进行动物护理和处理。从Charles River Laboratories购买五日龄（P5）雌性CD-1小鼠。动物分为两组，NIRR（未辐照）和IRR（辐照）。IRR小鼠在旋转转台上接受0.52 Gy的全身γ射线照射137Cs辐照器，剂量率为2.387 Gy/min。6小时后采集两组卵巢。

小鼠卵巢提取物的分析

在50 mM磷酸钠（pH=7.2）、150 mM氯化钠（NaCl）、0.1%Triton X-100、无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Roche）和磷酸酶抑制剂混合物（罗氏）中，用机械力溶解NIRR或IRR小鼠的16个卵巢，总体积为70μl。在4°C下以20000×g离心15分钟后，将上清液注入Superose 6 PC 3.2/30色谱柱（GE Healthcare）中，用50 mM磷酸钠、100 mM氯化钠、不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物在4°C下平衡，并按上述方法洗脱。在4°C的MOPS缓冲液中使用10%Bis-Tris NuPAGE凝胶（Invitrogen）分离收集的组分，然后使用XCell II印迹模块（Invit罗gen）转移到Hybond-P膜上（GE Healthcare）。然后在含有0.1%吐温-20的TBS缓冲液中用5%脱脂牛奶封住斑点，并在4°C下用4A4彻夜探测(Suh等人，2006年)抗体。使用山羊抗小鼠IgG过氧化物缀合物（Sigma-Aldrich）进行检测。使用Biometra BioDocAnalyze 2.0软件对印迹进行量化。

荧光各向异性

使用Jasco荧光光谱仪FP-6500（Jasco Labortechnik）在室温下进行FA实验。纯化自大肠杆菌添加到15nM的5′-荧光素标记的dsDNA中，其具有p21启动子响应元件序列（5′-GGCCAGGAACATGTCCCAACATGTTGAGCCG-3′），最终单体浓度在0.1和15μM之间，总体积为500μl。蛋白质和DNA在室温下培养30分钟，然后在488 nm激发和516 nm发射下进行测量。每个实验系列重复三次（MBP-TAp63α和MBP-TAp 63αFTL）或两次（MBP-TAp 63γ）并取平均值。使用软件Origin（OriginLab Corporation）分析数据。解离常数KD类通过将数据拟合到如下所示的方程（类似于双结合位点模型）进行计算：

Y（Y）=A类C类1K（K）2[P（P）]+A类C类2[P（P）]2+K（K）1K（K）2A类D类K（K）1K（K）2+K（K）2[P（P）]+[P（P）]2,

Y是测量的FA，AC1类，A指挥与控制、和AD类含有一个与DNA结合的p63低聚物的络合物的FA值，含有两个与DNA连接的p63齐聚物的络合物和游离DNA的FA分别为[P]蛋白质和K的单体浓度1和K2这两个结合常数。对于MBP-TAp63αFTL和MBP-TAp 63γ，KD类第二个结合位点的值分别为47.1±115.7μM和20.8±18.0μM，表明它们代表非特异性结合。对于MBP-TAp63αa负KD类获得了−0.021±0.02μM的值，我们目前无法解释。如前所述，使用MBP-TAp63α、MBP-TAp 63αFTL、MBP-TAp63γ和MBP-TAp-63αR进行对照实验。5′-荧光素标记的dsDNA（300 nM），具有基于SELEX设计的p63结合序列(奥特和辛哈，2006年)使用筛选（5′-CTTATTCTAGACATGTGAGGACATGTCGATACTTATTCC-3′）或随机序列（5′-CGAGTGTAAGTCGAATTGATACCATAATGCACTACACG-3′）。

λ-磷酸酶处理

在50 mM磷酸钠（pH 7.2）、150 mM氯化钠、无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）和1.25 mM氯化锰中溶解IRR小鼠的30个卵巢2如上所述，最终体积为120μl。向一半的15μlλ-蛋白磷酸酶（NEB）裂解液中添加15μl的λ-蛋白质磷酸酶存储缓冲液。将两个样品在30°C下培养45分钟。按照上述方法，对样品进行离心，并通过SEC和western印迹法进行分析。

细胞培养实验

如前所述，对p63亚型和突变体进行反激活分析以及相应的western blot分析(Straub等人，2010年). 每次测量均进行三次并取平均值。

下拉实验

如前所述，对RRL和固定化GST-TID（aa 569–616）或GST-TA（aa 1–136）中表达的p63亚型和突变体进行下拉实验，并进行相应的蛋白质印迹分析(Straub等人，2010年). 每个实验进行三次，并将结果取平均值。

Western印迹

如前所述进行Western blot分析(Straub等人，2010年).

核磁共振滴定法

如所述，克隆并表达人类p63 OD（358-391）和人类p63 TD（358-141）(Coutandin等人，2009年). 肽（p63 TA1[9-32]和p63 TA1FWL，具有三重突变F16A、W20A、L23A和突变F10W）从Genscript（美国新泽西州皮斯卡塔韦）订购。核磁共振滴定实验（超过肽15倍）15在质子频率为900和800MHz的Bruker-Avance光谱仪上，在303K下对25mM HEPES、50mM Arg、50mM Glu（pH 7.5）中的N标记蛋白质样品（100μM）进行检测。使用UCSF SPARKY 3.114进行光谱分析。使用Pymol 1.0说明了基于人类p73 TD（PDB ID 2KBY）结构的人类p63 OD的结构模型。

戊二醛交联剂

纯化自大肠杆菌浓度为0.5、2和10μM时，TAp63α与0.125%（w/v）戊二醛（Merck）交联。样品在16°C下培养3、20和68分钟，然后立即使用4%-12%Bis-Tris NuPAGE凝胶（Invitrogen）进行SDS-PAGE分析，然后进行考马斯染色。

LILBID质谱法

使用上述LILBID-MS方法记录质谱(霍夫曼等人，2009年；Morgner等人，2007年). MBP-TAp63α表达于大肠杆菌在不含NaCl的情况下，用10 mM磷酸钾（pH 7.6）透析一晚。

分析超速离心

在配备Ti-50转子的Beckman XL-I分析型超离心机中，使用吸光度（280 nm）和干涉光学技术监测单体浓度为1-8μM、温度为4°C的样品在20 mM磷酸钾（pH 7.5）、200 mM氯化钠（NaCl）和2 mM二硫苏糖醇中的沉降。沉积速度实验在45000 rpm的转子速度下进行，而平衡条件一旦建立，则采用7000 rpm和9000 rpm的转子转速进行平衡实验。使用SEDFIT分析速度数据(Lebowitz等人，2002年)，而异构体分析(科尔，2004年)和ULTRASPIN(网址：www.ultraspin.mrc-cpe.cam.ac.uk)为了确定沉淀物物种的平均重量，将平衡扫描（每蛋白：三种浓度和两种速度）全局拟合到简单的非关联模型。

体外磷酸化

如前所述，对MBP-TAp63α进行放射标记(Schleiff等人，2003年). 通过考马斯染色和放射自显影术观察磷酸化情况。

致谢

该研究由DFG（DO 545/2-1）、EU-Grant EPISTEM（LSHB-CT-019067）、生物分子磁共振中心（BMRZ）和法兰克福卓越集群（大分子复合物）资助。F.M.承认ANR和ERC的支持。哥伦比亚特区得到了博林格·英格尔海姆基金会博士奖学金的支持。结构基因组协会是一家注册慈善机构（编号1097737），通过安大略省基因组研究所、葛兰素史克公司、卡罗林斯卡研究所、克努特和爱丽丝·沃伦伯格基金会、，安大略创新信托基金、安大略研究与创新部、默克公司、诺华研究基金会、瑞典创新系统机构、瑞典战略研究基金会和威康信托基金会。J.Hannewald是默克公司达姆施塔特分公司的员工。

笔记

发布日期：2011年2月17日

脚注

补充信息包括五个数字和一个表格，可以在本文中在线找到doi:10.1016/j.cell.2011.013.013.

补充信息

表S1。通过分析超速离心鉴定二聚态TAp63α，与图1相关：
单击此处查看。（262K，pdf）
文件S1。第十条补充信息：
单击此处查看。（240万，pdf）

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