表达树突状细胞靶向HIV Gag蛋白的新城疫病毒诱导小鼠产生Gag特异性免疫应答^▿

全长rNDV-LaSota cDNA的制备。

为了生成全长rNDV-LaSota cDNA，LaSota基因组被分为9个片段，每个片段都是使用从NDV-LaSota病毒纯化的RNA通过逆转录（RT）-PCR获得的，然后克隆到pGEM-T载体（Promega）并测序。然后将每个片段消化、连接并插入载体pSL1180的HindIII和BssHII位置(22). 最后，从rNDV-Hitchner B1 cDNA质粒中消化出一段含有δ型肝炎病毒（HDV）核酶和T7终止子序列的片段(22)使用BssHII酶并连接到包含全长rNDV-LaSota cDNA的质粒的BssHI位置。可根据要求提供引物序列。

产生rNDV疫苗载体。

以质粒pE-mISO-olla-P41和pE-mDEC-olla-P41为模板，分别编码scCont-Gagp41和scDEC-Gagp41，通过PCR获得了scFv-Gagp41开放阅读框序列(25). 以pEGFP-C1（BD Biosciences-Clontech）为模板，通过PCR获得绿色荧光蛋白（GFP）ORF序列。将扩增的cDNA克隆到含有NDV特异性基因起始和结束序列的NDV转录单位中。ATG的上游还包括一个最优的Kozak翻译序列。为了遵循NDV复制所必需的六法则，需要时在终止密码子后插入核苷酸。将scFv-Gagp41和GFP转录单位插入NDV-LaSota基因组P和M基因之间的SacII位点。获得的质粒被用于使用先前描述的方法拯救重组病毒(22). 拯救的病毒rNDV-L-scDEC-Gagp41、rNDV-L-scCont-Gagp41和rNDV-L-GFP在鸡蛋中传代三次，并通过限制鸡蛋中的稀释来分离病毒克隆。克隆用于生成载体库，插入片段通过RT-PCR扩增并测序。在用不同稀释的载体感染的Vero细胞中，通过间接免疫荧光滴定表达scFV-Gagp41-的rNDV载体，并通过使用抗NDV兔血清，然后用异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的抗兔免疫球蛋白G（IgG）（Sigma-Aldrich）孵育。用Vero细胞直接荧光滴定rNDV-L-GFP病毒。

鸡胚中rNDV的生长动力学。

用每种不同rNDV载体的100个荧光形成单位（FFU）感染10日龄卵子。在感染后24、48、72和96小时采集尿囊液。通过表达scFv-Gagp41的载体在Vero细胞上的间接免疫荧光和rNDV-L-GFP的直接荧光测量病毒滴度。

转基因表达谱。

Vero细胞接种每个rNDV载体，感染倍数（MOI）为1。在感染后12、24和36小时收集细胞裂解物和细胞上清液。蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素膜上。然后将膜与抗NDV兔血清孵育，然后与抗兔IgG过氧化物酶标记抗体（Amersham）孵育以检测NDV蛋白。为了检测scFv-Gagp41，将膜与抗HIV1 p24单克隆抗体（Abcam）和抗小鼠IgG过氧化物酶标记抗体（Amersham）孵育。

DEC205绑定。

Vero细胞感染rNDV-scDEC-Gagp41或rNDV-scCont-Gagp41，MOI为5。感染后24小时，收集上清液，并通过10000 rpm离心30分钟将其从细胞碎片中清除。然后将上清液与CHOneo或CHOmDEC205细胞在4°C下孵育30分钟。用FITC-标记的小鼠抗-大肠杆菌OmpF连接子和小鼠langerin融合序列（抗OLLAS）抗体在4°C下保持30分钟，然后清洗细胞并用流式细胞仪进行分析。

小鼠免疫。

4-6周龄女性CxB6 F组₁鼻内免疫5×10的小鼠⁵rNDV-L-scDEC-Gagp41、rNDV-L-scCont-Gagp41或rNDV-L-GFP的FFU。四周后，用10⁶相同矢量的FFU。

用Vac-gag和Vac-Wt挑战感染。

增强后四周，CxB6 F组₁用10只小鼠（每组5只）进行攻击⁶表达HIV-1 Gag的痘苗病毒（Vac-Gag）或野生型痘苗病毒的PFU（Vac-Wt）。激发6天后，处死小鼠，提取其肺部并使其均质，以便在CV-1细胞上滴定痘苗病毒。感染后2天，固定CV-1细胞，用0.1%结晶紫溶液染色，计数痘苗病毒斑块数。

剂量反应实验。

6-8周龄雌性BALB/c小鼠组(n个=10）以相同的预接种和增强疫苗方案进行鼻内免疫，分级剂量（10倍稀释）为rNDV-L-scDEC-Gagp41或rNDV-L-scCont-Gagp41。小鼠在最佳状态和增强状态之间休息3周。使用以下组：用5×10预处理的小鼠⁵FFU，增加10⁶NDV-L-scDEC-Gagp41的FFU（DEC A组），用5×10引物的小鼠⁵FFU，增加10⁶NDV-L-scCont-p41的FFU（Cont A组），用5×10引物的小鼠⁴FFU增加10⁵NDV-L-scDEC-Gagp41的FFU（DEC B组），用5×10引物的小鼠⁴FFU，增加10⁵NDV-L-scCont-p41的FFU（Cont B组），用5×10引物的小鼠^三FFU，增加10⁴NDV-L-scDEC-Gagp41的FFU（DEC D组），以及用5×10^三FFU，增加10⁴NDV-L-scCont-p41（Cont D小鼠）的FFU。阴性对照小鼠（GFP组）用5×10⁵rNDV-L-GFP的FFU并增加10⁶相同矢量的FFU。最后一次免疫后三周，小鼠(n个=5）鼻内挑战10⁶Vac-gag或Vac-Wt的PFU。激发五天后，提取肺部并使其均质，并使用CV-1细胞上的斑块试验测定痘苗病毒滴度。

血清抗体滴度。

为了检测HIV Gagp41特异性抗体，将高蛋白结合酶联免疫吸附测定（ELISA）板在4°C下涂上0.2μg/ml磷酸缓冲盐水（PBS）中的Gagp41蛋白过夜。用PBS-Tween 20（0.02%）清洗平板三次，并在室温下用PBS-1%牛血清白蛋白（BSA）封闭2 h。用PBS-Tween 20清洗平板，并在37°C下用小鼠血清系列稀释液培养3 h。用PBS-Tween 20（0.02%）清洗平板五次，并在37°C下用碱性磷酸酶标记的抗鼠IgG（Southern Biotech）抗体孵育3 h。在添加对-硝基苯磷酸盐溶液（Sigma）。对于NDV特异性抗体的检测，遵循相同的方案，不同之处在于用蔗糖缓冲液（30%）纯化的rNDV LaSota以0.5μg/ml的浓度包被培养基蛋白结合板，并用碱性磷酸酶标记的抗小鼠重加轻链（H+L）检测结合的抗NDV抗体抗体（Southern Biotech）。

细胞内细胞因子染色。

用沿着HIV-1 Gagp41序列每4个氨基酸交错排列的15肽的0.2μg/ml HIV Gagp41池混合物或2μg/ml非反应肽（HIV Gag p17池1）作为阴性对照物重新刺激大体积脾细胞（洛克菲勒大学蛋白质组学资源中心）在2μg/ml抗CD28抗体（eBioscience）存在下6 h，最后4 h添加brefeldin A（Sigma-Aldrich）。阻断Fcγ受体（大鼠抗小鼠CD16/CD32；BD Bioscienses）后，在37°C下用抗体CD3-Pacific Blue、CD8-FITC和CD4-peridinin叶绿素蛋白（PerCP）对细胞进行染色20 min。使用Aqua Live/Dead染色（Invitrogen）排除死细胞。细胞在室温下清洗、固定（Cytofix/Cytoperm Plus；BD Biosciences）、用PermWash渗透，并用IFN-γ（Alexa Fluor 700）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）（CY7-藻红蛋白[PE]）和白细胞介素-2（IL-2）（别藻蓝蛋白）（eBioscision）抗体染色15分钟。使用BD-LSRII仪器对染色样品进行流式细胞术分析，并使用Flowjo软件（Tree Star）进行数据分析。数据是三个实验的代表性数据，每个实验中汇集了两只小鼠的脾脏。我们在live-cell/CD3中获得了100000个活动⁺闸门；这个x个轴指示CD8⁺/CD4细胞⁺单元格，以及年axis表示细胞因子表达（IFN-γ、TNF-α和IL-2）。为了检测多细胞因子表达的T细胞，我们选通了CD3⁺CD4细胞⁺或CD3⁺CD8（CD8）⁺对一种细胞因子也呈阳性的T细胞，并检测表达其他两种细胞因子中的一种或两种的细胞总数。细胞因子形成细胞的平均总数计算为Gag刺激的样品与用未反应肽刺激的样品之间的差异。

四聚体染色。

在室温下用Fc阻断剂（大鼠抗鼠CD16/CD32；BD Bioscience）阻断分离的脾细胞和肺细胞1h。然后用荧光活化细胞分选仪（FACS）缓冲液（2%BSA-PBS）清洗细胞，并用PE-Gag四聚体（H-2K）染色30分钟^d日-限制性AMQLMLKETI表位；Beckman Coulter）和CD3（太平洋蓝）、CD8（FITC）和CD4（PerCP）抗体（电子生物科学）。使用Aqua Live/Dead染色（Invitrogen）排除死细胞。使用BD-LSRII仪器对染色样品进行流式细胞术分析，并使用Flowjo软件（Tree Star）进行数据分析。

表达DEC205靶向HIV-1 Gag抗原的rNDV可改善Gag特异性但非载体特异性抗体反应。

DEC205靶向抗原先前被证明在由质粒DNA疫苗编码时可增强抗原特异性抗体反应(25). 为了检测rNDV疫苗接种诱导的抗体谱，6组CxB6 F₁用5×10免疫小鼠⁵rNDV-L-scDEC-Gagp41、rNDV-L-scCont-Gagp41或rNDV-L-GFP的FFU。四周后，给小鼠注射10⁶同一疫苗载体的FFU。通过使用ELISA检测蔗糖缓冲纯化的rNDV LaSota的总抗体来定量rNDV特异性抗体（图。2A和B). 3组接种过疫苗的小鼠在初次接种后30天的NDV特异性抗体滴度没有显著差异（图。​（图2A）2安培)或在升压后30天（图。​（图2B）。2B型). 正如预期的那样，rNDV疫苗载体的增强增加了各组的载体特异性抗体反应（图。2A和B). 接下来，进行ELISA检测针对Gagp41蛋白的总血清IgG。Gag-特异性总IgG抗体在孕期后30天低于我们的检测限（数据未显示）；然而，增强后30天，接种rNDV-L-scDEC-Gagp41的小鼠血清中Gag-特异性IgG的水平显著高于接种非靶向载体的小鼠血清（图。​（图2C）。2摄氏度). 这些数据表明，尽管所有3组接种小鼠的载体特异性抗体反应相似（意味着小鼠的复制动力学具有可比性），但与表达非靶向抗原的rNDV相比，表达DEC205靶向HIV Gagp41抗原的rNEV确实增强了抗原特异性体液免疫反应。

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图2。

接种后血清抗体滴度。（A和B）CxB6 F中抗NDV血清总抗体滴度₁小鼠（每组6只）在第一次免疫后30天或初次免疫后（A）和增强后30天（B）进行测定。（C） 注射后30天测定抗Gag IgG抗体。

诱导HIV Gagp41特异性细胞免疫反应。

复制能力强的病毒疫苗载体的特点是诱导有效的抗原特异性细胞免疫反应(31). 为了评估表达DEC205靶向抗原的rNDV产生的T细胞免疫，我们测量了rNDV-L-scDEC-Gagp41免疫诱导的HIV Gag特异性T细胞反应，并将其与rNDV-scCont-Gagp41和rNDV-L-GFP诱导的反应进行了比较。六组CxB6 F₁在使用上述每种疫苗载体的同源原辅疫苗方案中免疫小鼠。在两个时间点，即黄金期后7天和增强期后7天后，采集肺部和脾脏。随后将脾细胞用于多参数细胞内细胞因子分析，以测量T细胞对代表整个HIV-1 Gagp41序列的15肽库的细胞因子反应；非反应肽混合物（P17池）作为阴性对照（图。​（图3A）。3A级). 正如预期的那样，接种rNDV-L-GFP的小鼠只显示了表达细胞因子的T细胞的背景水平。首次免疫后7天，接种scFv-Gagp41表达载体的小鼠表现出类似水平的细胞因子产生T细胞（图。3A至C). 然而，在增强7天后，Gag特异性CD4的数量⁺T细胞和CD8⁺在接受DEC205靶向疫苗的小鼠中，产生IFN-γ、TNF-α和IL-2的T细胞高于接受非靶向疫苗（图。3A至C). rNDV-L-scDEC-Gagp41疫苗接种诱导产生细胞因子的CD8数量增加2倍⁺T细胞与非靶向对照疫苗的比较（图。3A和C，比较深灰色和深蓝色条）。用对照肽混合物脉冲的脾细胞仅显示出细胞因子产生的背景水平（图。​（图3A）。3A级). 由于产生多种细胞因子的T细胞与保护性免疫密切相关(17)，我们检测了疫苗诱导的T细胞分泌多种细胞因子的能力，如IFN-γ、IL-2和TNF-α（图。3B和C). DEC205靶向接种诱导更多多功能CD4⁺和CD8⁺比非靶向疫苗产生2种或更多细胞因子的T细胞。三细胞因子生成CD4⁺和CD8⁺T细胞（IFN-γ阳性[IFN-γ⁺]，IL-2⁺和TNF-α⁺)在增强7天后接种DEC205靶向疫苗的小鼠中占优势（图。3B和C). 此外，rNDV-L-scDEC-Gagp41疫苗接种诱导更多CD4⁺共表达TNF-α和IL-2的T细胞（图。​（图3B）第3页)和更多CD8⁺与rNDV-scCont-Gagp41疫苗相比，增强后7天同时表达IFN-γ和TNF-α的T细胞（图。3B和C). 这些数据表明，将rNDV表达的抗原靶向树突状细胞可以提高诱导有效且广泛的抗原特异性T细胞介导的免疫反应。检测疫苗诱导的Gag特异性CD8的积累⁺T细胞，我们用MHC I类Gag四聚体（H-2K）对免疫小鼠的肺和脾脏制备的单细胞悬浮液进行染色^d日-限制性表位）。用表达DEC205靶向Gagp41抗原的rNDV接种小鼠后，CD3显著增加⁺CD8（CD8）⁺增强7天后，脾脏和肺部的Gag四聚体阳性淋巴细胞（图。​（图3D）。三维). 接种rNDV-L-GFP的小鼠显示四聚体阳性细胞的背景水平较低（图。​（图3D）。三维). Gag四聚体染色结果与细胞因子表达分析一致，在该分析中，我们观察到scFv-Gagp41表达载体在初筛后7天诱导抗原特异性T细胞的能力差异极小，而DEC205靶向载体在增强后的表现明显优于非靶向载体。这些数据表明，DC靶向疫苗增强了抗原特异性细胞免疫反应的数量和质量。

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图3。

疫苗诱导的HIV Gag特异性免疫反应。（A） 在初次注射后1周和增强后1周，对大量脾细胞进行T细胞免疫评估。用未反应肽（p17池1）或HIV Gagp41肽混合物重新刺激脾细胞6 h，通过CD3细胞内细胞因子染色评估IFN-γ、TNF-α和IL-2的生成⁺CD4细胞⁺T细胞和CD3⁺CD8（CD8）⁺T细胞。箭头表示CD8⁺T细胞。CD3的（B和C）细胞因子谱⁺CD4细胞⁺T细胞（B）和CD3⁺CD8（CD8）⁺接种疫苗的小鼠在初次接种后1周和增强后1周的T细胞（C）反应。G、 IFN-γ表达细胞；T、 TNF-α表达细胞；五十、 IL-2表达细胞。（D） Gag-特异性CD8的累积⁺激发后1周和增强后1周脾脏（左侧）和肺部（右侧）的T细胞。接种CxB6 F后脾脏和肺部的HIV Gag特异性T细胞反应₁用总CD8的HIV-Gag四聚体染色检查小鼠⁺CD3（CD3）⁺细胞。数据代表了3个不同的实验；每个实验中收集2只小鼠的数据。

防止病毒攻击。

接下来，我们想评估疫苗诱导的Gag特异性免疫反应的增强是否与更好的保护性免疫相关。由于HIV-1不能感染小鼠，可以通过用表达HIV Gag蛋白（Vac-Gag）的痘苗病毒感染接种过的小鼠来测试不同rNDV载体在粘膜部位引发Gag特异性保护性免疫反应的能力。更有效的疫苗应能更好地控制Vac-gag复制。因此，我们挑战了之前接种过CxB6 F的人群₁老鼠(n个=5）带10⁶在最后一次免疫后4周，通过鼻内途径将Vac-gag或野生型痘苗病毒（Vac-Wt）的PFU作为背景对照（图。​（图4）。4). 接种rNDV-L-scDEC-Gagp41的五分之四的小鼠在激发6天后能够清除Vac-gag感染（图。​（图4A）。4A级). 接种rNDV-L-scCont-Gagp41的小鼠无法清除Vac-gag感染，但与接种rNDV-L-GFP的小鼠或接种Vac-Wt的小鼠相比，显示出更低的痘苗病毒肺滴度负荷（图。​（图4A）。4A级). 此外，接种DEC205靶向疫苗的小鼠在Vac-gag激发后3天停止减肥，并且在病毒激发后的第6天能够恢复其初始体重，而接种对照疫苗rNDV-L-scCont-Gagp41的小鼠在Vac-gag刺激后的第5天之前没有开始恢复体重（图。​（图4B）。4B类). 正如预期的那样，所有接受Vac-Wt攻击的小鼠组均未表现出对病毒攻击的保护作用，这表明疫苗接种产生的免疫反应是Gag特异性的（图。​（图4C）。4摄氏度). 这些数据表明，与表达非靶抗原的rNDV相比，表达DEC205靶抗原的r NDV显著增强了抗原特异性细胞介导的免疫反应，重要的是，这种增强与控制病毒感染的卓越能力相关。

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图4。

用Vac-gag对NDV-L-scFv-Gagp41病毒免疫的小鼠进行挑战。10组女性CxB6 F₁小鼠经鼻内接种10⁵NDV-L-scDEC-Gagp41或NDV-L-scCont-Gagp41的FFU。阴性对照小鼠接种NDV-L-GFP。四周后，动物被喂食10粒⁶同一病毒的FFU。增强后四周，每组5只小鼠用10⁶Vac-Wt或Vac-gag的PFU。（A） 感染痘苗病毒6天后，处死小鼠，用1ml PBS使肺部均匀化，并测定CV-1细胞中的痘苗病毒滴度。（B和C）在Vac-gag（B）和Vac-Wt（C）挑战后连续6天每天监测体重下降。

该研究项目部分得到了NIH HIVRAD拨款sP0IAI08325（发给A.G.-S）和U54AI057158（发给P.P.）以及比尔和梅琳达·盖茨基金会（发给P.P、R.M.S.和A.G.-S.）的拨款支持。