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自然细胞生物学。作者手稿；PMC 2011年3月16日发布。
以最终编辑形式发布为：
自然细胞生物学。2010年3月；12(3): 235–246.
2010年2月21日在线发布。 数字对象标识：10.1038/ncb2023
预防性维修识别码：项目经理3058354
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院271203
PMID：20173741

通过长程表观遗传沉默（LRES）将癌症基因组整合到抑制性染色质结构域降低了转录可塑性

马塞尔·库伦,1,7 克莱尔·斯特扎克,1,7 珍妮·Z·宋,1,8 亚伦·L·斯坦森,1,8 泽娜·卡斯尔,1 卡洛斯·莫雷诺,2 安德鲁·N·杨,2 维杰·瓦尔马,2,三 Terence P.速度,4 马克·考利,5 保罗·拉卡泽,5 沃伦·卡普兰,5 马克·D·罗宾逊,1,4和苏珊·J·克拉克1,6
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

在致癌过程中，单个基因的沉默可能通过遗传和表观遗传学过程发生，但其潜在机制尚不清楚。通过使用平铺阵列创建一个完整的前列腺癌表观基因组图，我们发现由于长程表观沉默（LRES），基因抑制的相邻区域通常会发生。我们在前列腺癌中发现了47个新的LRES区域，通常跨越约2Mb，包含约12个基因，肿瘤抑制基因和miRNAs普遍存在。我们的数据表明，LRES与区域组蛋白脱乙酰化结合不同表观遗传重塑模式的亚结构域有关，包括抑制性组蛋白和DNA甲基化标记的重新融合、获得或交换。正常前列腺上皮细胞和人类胚胎干细胞中基因的转录和表观遗传状态在确定癌症相关表观遗传重塑模式中起着关键作用。我们认为，由于LRES和LOH的结合或基因组缺失，癌症基因组的巩固或有效减少通常发生在结构域中，导致这些区域内的转录可塑性降低。

关键词：染色质/表观遗传调控，癌症，转录

简介

表观遗传和遗传损伤是肿瘤发生的基础，两者在破坏人类癌症的关键细胞过程中起着关键作用1CpG岛的DNA超甲基化是癌细胞的一个普遍特征，与转录抑制相关，在功能上等同于基因的物理缺失2染色质结构也决定基因的功能状态三组蛋白尾部的修饰通常在癌症中被解除管制4多梳组蛋白是组蛋白相关蛋白，在发育过程中的基因沉默中发挥作用5以及癌症的表观遗传沉默6–11与胚胎干（hES）和祖细胞多能性相关的CpG岛相关基因通常由组蛋白3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）多梳标记标记12有趣的是，正是这些多梳靶基因构成了癌细胞中常见的高甲基化基因的重要组成部分8,9,11，表明H3K27me3可能通过DNA甲基化机制的招募触发异常DNA甲基化。

癌症表观遗传学最新研究的一个推动力是寻找癌症中通常甲基化的基因，为癌症检测或预后提供新的生物标记物。先前使用候选基因方法或全球阵列调查的研究发现，数百个离散的CpG岛相关基因可以在癌症中差异甲基化。此前，我们在结直肠癌染色体2q14.2上发现了一个4Mb区域，其中DNA超甲基化并不局限于离散的CpG岛或单个基因，而是包含多个相邻的CpG-丰富区域，具有一致的基因沉默13,14邻近非甲基化基因的抑制与染色质重塑有关，这一过程我们称为长程表观沉默（LRES）。相邻CpG岛基因启动子的类似一致甲基化也被报道用于癌症中的许多基因簇15–17包括HOXA公司基因簇18最近的基因组规模分析还发现了其他大型染色体区域，其中包含几个CpG岛，这些岛在癌症中通常被甲基化和转录抑制14,19–21这表明，大区域的协同表观遗传控制可能是一种常见现象。

我们现在已经使用综合基因组学方法来调查前列腺癌中LRES的频率，并确定区域表观遗传抑制的共同特征。我们发现，在局部范围内，相邻基因通常表现出相同的表观遗传沉默状态。然而，在LRES区域，表观遗传抑制被扩展到包括多个基因，这些基因的特征是活性组蛋白标记的整体丢失、局部替换和/或抑制组蛋白和DNA甲基化标记的重新增强。我们的结论是，与人胚胎干细胞和正常前列腺上皮细胞中发现的二价和/或许可状态相比，与LRES区域转录可塑性整体降低相关的区域中的癌表观基因组通常被解除调控。

结果

长期表观遗传沉默（LRES）在临床前列腺癌中很常见

为了确定LRES是否在癌症中常见，我们试图确定与匹配的正常组织相比，前列腺癌中经常显示一致基因沉默的基因组区域。首先，我们使用计算滑动窗口算法重新分析了两个公开的表达数据集，以确定临床样本中的差异基因表达，该算法识别了坐标下调区域(补充信息、材料和方法). 为了确定潜在的表观遗传抑制区域，而不是由于基因组缺失或LOH而缺乏表达，我们重新分析了第三个数据集，该数据集由四个前列腺癌细胞系（LNCaP、DU145、PC3和MDA-2A）组成，这些细胞系经DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-dC处理22(图1a;补充信息、材料和方法). 如果以下区域被归类为LRES候选区域：1）包含检测来自两个临床数据集的前列腺癌样本中四个或四个以上被抑制或沉默的连续基因的探针集；2） 基本上没有上调的探针集，并且3）在5-Aza-dC治疗后的四个前列腺癌细胞系中至少有两个含有上调的探针组。图1b总结了7号染色体的组合数据，其中确定了三个假定的LRES区域（22-24），以及补充信息1总结了所有染色体上的假定-LRES区域（1-47）。此外，在九项大型Oncomine前列腺癌研究中比较了候选LRES区域的基因表达水平23–31比较215例正常前列腺和380例局部前列腺癌样本的结果。图1c显示了区域24的Oncomine数据，该数据显示了4.1 Mb区域的常见基因抑制(补充信息2总结了所有LRES地区）。如果从这些比较研究中没有获得进一步的区域基因抑制证据，则排除假定的-LRES区域。

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公共表达微阵列数据的滑动窗口分析

(一)对于每个数据集，使用计算滑动窗口算法沿基因组以1kb的增量移动，记录500kb区域内下调、上调和低于检测探针的百分比。沿基因组绘制百分比，以便直观显示（右侧面板；绿色条：%下调探针；红色条：%上调探针；淡蓝色线：%下调或低于检测水平的探针）。(b条)7号染色体的滑动窗口分析显示。最初，在这两个实验数据集中，在这条染色体上识别出9个区域（虚线列）具有一致的下调（实验1：肿瘤（T）vs正常（N）65; 实验2：肿瘤（T）与正常（N）68). 结果与5-Aza-dC（Aza）治疗的前列腺癌细胞系的表达研究相结合31检测潜在的表观遗传抑制。编号的黄色列显示具有LRES潜能的区域：临床样本中有四个或更多连续被抑制的基因，没有上调的探针集，加上细胞系样本中5-Aza-dC治疗后上调的证据：区域22（7p15.2-p15.1）包含HOXA公司簇，区域23（7q22.1）与几个细胞色素P450(CYP公司)和锌指(ZNF公司)基因和区域24（7q31.1-q31.2），其中11个基因包括CAV1型和CAV2型.带星号的虚线列是从进一步分析中删除的区域，因为它们只包含一个或两个基因（带有多个探针集的大基因）和/或在5-Aza-dC实验中没有显示任何上调。(c（c）)对于实验1和实验2（T vs N），每个探针组的基因抑制显示在跨越7q31的4.1 Mb区域，对于实验2，转移（M）前列腺与正常（N）前列腺分别显示。九项大型Oncomine研究也显示了每个探针组的基因抑制，其中局部前列腺癌与正常前列腺样本进行了比较。基因位置、CpG岛和染色体坐标如下所示。

使用这种严格的综合方法，我们确定了47个候选LRES区域，在多个前列腺癌数据集中具有一致的基因抑制(表1;补充信息，表1). LRES区域的平均大小为1.9 Mb（范围：0.2–5.1 Mb），包含约12个基因（范围：5–28），71%具有CpG岛相关启动子，总跨度为基因组的2.9%。通常，与局限性癌相比，转移性癌的抑制区域更广，这表明LRES在进展过程中可能会扩散。例如，在1号染色体上，转移样本（Exp2）中的区域1-7都显示出增强的区域抑制，而LRES区域2-3似乎收敛(补充信息1). 具有高LRES覆盖率的染色体为18、6和X（分别为7.5%、5.6%和5.5%），而最小的染色体（19、20、21和Y）、13和14号染色体以及着丝粒和端粒区域根据这些严格的标准没有任何LRES区域(补充信息，图S1). LRES区域在较轻的细胞遗传学G带中占主导地位，79%的LRES区域与占基因组68%的染色较轻的Giemsa区域重叠(补充信息，图S1). 然而，发现LRES区域相对于整个基因组的基因或CpG密度的富集最小；此外，DNA重复元件（LINE、SINE、LTR）的丰度或预测的甲基化-脯氨酸/抗性基序的丰度几乎没有差异32，层关联域33或高度保守的非编码元素34(补充信息，生物信息学数据). 有趣的是，据报道，68%（32/47）的LRES区域在一些前列腺癌中被删除(补充信息，表1)34%（16/47）含有已知的肿瘤抑制剂或癌相关基因，30%（14/47）包含miRNA基因(表1)26%（12/47）含有基因簇(表1). 在位于47个LRES区域的547个基因中，基因本体（GO）术语富集分析(补充信息，表2)显示了对先天免疫反应、发育、生长和形态发生等生物过程的高度显著丰富。

表1

前列腺癌中推测的LRES区域

对于47个LRES区域（标识符）中的每个区域，显示了染色体带和坐标、区域内基因的大小（Mb）和数量（#）、启动子处带有CpG岛的基因数量（#CGI）以及每个区域内的基因名称。基因簇下划线。‡：LNCaP细胞中具有重叠抑制的区域；*：miRNA。有关更多详细信息，请参阅补充表1.

标识符乐队染色体坐标大小（Mb）#基因#CGI公司基因（簇下划线）
1* 第16.11页 chr1:24352234–25562439 1.211310 IL28RA、GRHL3、C1orf201、NPAL3、RCAN3、C1or f130、SRRM1、CLIC4、RUNX3、SYF2、C1orf63、RHD、TMEM50A
2* 第11.3页 chr1:63827908–67304849 3.481714 PGM1、ROR1、UBE2U、CACHD1、RAVER2、JAK1、AK3L1、DNAJC6、LEPR、LEPROT、PDE4B、SGIP1、TCTEX1D1、INSL5、WDR78、MIER1、SLC35D1
三* 第11.3页至第31.2页 chr1:67922332–68689230 0.7754 GADD45A、GNG12、DIRAS3、GPR177、RPE65
4* 第11.3页 chr1:97314887–99933823 2.6254 DPYD、SNX7、PAP2D、LPPR4、PALMD
5* 第13.3页 chr1:109883032–110086183 0.2096 GPR61、GNAI3、GNAT2、AMPD2、，GSTM4、GSTM2、GSTM1、GSTM5、GSTM3
6 第13.1页至第12页 chr1:117253202–117973534 0.7275 PTGFRN、IGSF2、TTF2、TRIM45、VTCN1、MAN1A2、FAM46C
7* 1q32.2 chr1:205327810–208023288 2.70158 C4BPB、C4BPA、，CD55、CR2、CR1、CR1L、CD46、CD34、，PLXNA2、LOC642587、CAMK1G、LAMB3、G0S2、HSD11B1、TRAF3IP3
8 第2季度14.2–第14.3季度 chr2:120725884–122124522 1.4065 RALB、INHBB、GLI2、TFCP2L1、RNU4ATAC、clas1
9 第2季度31.2 chr2:177784668–179838744 2.051513 HNRNPA3、NFE2L2、AGPS、TTC30B、TTC30 A、PDE11A、RBM45、OSBPL6、PRKRA、DFNB59、FKBP7、PLEKHA3、TTN、CCDC141、SESTD1
10* 第24.1页至第22.3页 电话：29296947–32387817 3.0987 RBMS3、TGFBR2、GADL1、STT3B、OSBPL10、ZNF860、GPD1L、CMTM8
11* 第14.3页 电话：57717068–58550685 0.83107 SLMAP、FLNB、DNASE1L3、ABHD6、RPP14、PXK、PDHB、KCTD6、ACOX2、FAM107A
12* 3季度27.3–28季度 表3:188920859–191523911 2.6072 BCL6、FLJ42393、LPP、TPRG1、TP63、LEPREL1、CLDN1
13* 第4季度31.3 电话：154082585–154930678 0.8586 FHDC1、TRIM2、ANXA2P1、MND1、KIAA0922、TLR2、RNF175、SFRP2
14* 第4季度35.1 chr4:184244130–185646718 1.40108 C4orf38、WWC2、CLDN22、CDKN2AIP、ING2、RWDD4A、C4orf41、STOX2、ENPP6、IRF2
15 第5季度11.2 电话：5:50713715–53015925 2.3077 ISL1、ITGA1、PELO、ITGA 2、MOCS2、FST、NDUFS4
16 第12.2季度至第13.1季度 电话：5:63496427–67638162 4.141614 RNF180、RGS7BP、SFRS12IP1、SDCCAG10、ADAMTS6、CENPK、PPWD1、TRIM23、C5orf44、SGTB、NLN、ERBB2IP、SFRS12、MAST4、CD180、PIK3R1
17* 第5季度22.1–第22.2季度 电话：5:109931047–112876763 2.951614 FLJ43080、SLC25A46、TSLP、WDR36、CAMK4、STARD4、C5orf13、C5orf26、SNORA13、EPB41L4A、APC、SRP19、REEP5、DCP2、MCC、TSSK1B
18* 6p12.1–p11.2 chr6:55146009–57622335 2.48129 HCRTR2、GFRAL、HMGCLL1、BMP5、COL21A1、DST、BEND6、KIAA1506、ZNF451、BAG2、RAB23、PRIM2
19* 6季度14.3–15季度 电话：84625089-89731065 5.112421 CYB5R4、MRAP2、KIAA1009、TBX18、NT5E、SNX14、SYNCRIP、SNORD50A、SNORD 50B、SNHG5、HTR1E、CGA、ZNF292、GJB7、C6orf162、C6orf165、SLC35A1、RARS2、ORC3L、NCRNA00120、AKIRIN2、SPACA1、CNR1、RNGTT
20 第6季度21 chr6:107579454–108690157 1.1176 PDSS2、SOBP、SCML4、SEC63、OSTM1、NR2E1、SNX3
21* 第6季度21 chr6:111725924–112683605 0.9675 REV3L，TRAF3IP2，FYN，W ISP3，管1，C6或225，LAMA4
22* 第7页第5.2页至第5.1页 电话：27096595–28187962 1.091616 HOXA1、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9、HOXA10、HOXA11、HOXA11AS、HOXA13、，EVX1、HIBADH、TAX1BP1、JAZF1
23 7季度22.1 chr7:98907449–99366179 0.46137 ZNF789、ZNF394、，ZKSCAN5、C7或38，ZNF655、ZNF498、，CYP3A5、CYP3A7、CYPAA4、CYP3A43、，OR2AE1、TRIM4、GJC3
24* 2011年第7季度至2012年第31季度 chr7:112245438–116363646 4.12127 C7orf60、GPR85、LOC401397、PPP1R3A、FOXP2、MDFIC、TFEC、TES、CAV2、CAV1、MET、CAPZA2
25 8p23.1–p22 chr8:11177927–13417767 2.242410 MTMR9、AMAC1L2、TDH、FAM167A、BLK、GATA4、NEIL2、FDFT1、CTSB、，DEFB137、DEFB136、DEBB134、DEVB130、，ZNF705D、LOC392196、DUB3、FAM86B1、，DEFB130、DEFB109PI、，FAM86B2、LONRF1、LOC340357、C8或79、DLC1
26 第8季度第22.3季度至第23.1季度 chr8:105459828–108580459 3.1264 DPYS、LRP12、ZFPM2、OXR1、ABRA、ANGPT1
27* 第94页 chr9:203865–2184624 1.9876 C9或66，DOCK8，KANK1，DMRT1、DMRT3、DMRT2、，SMARCA2系列
28* 第9季度22.2–22.31 电话：92602890–93918511 1.3255 SYK、AUH、NFIL3、ROR2、SPTLC1
29* 9季度31.3 chr9:112155785–113598354 1.44107 SVEP1、MUSK、LPAR1、OR2K2、KIAA0368、ZNF483、PTGR1、C9orf29、DNAJC25、C9or f84
30* 10季度23.2 图表10:86074898–88721652 2.65106 KIAA1128、GRID1、WAPAL、OPN4、LDB3、BMPR1A、MMRN2、SNCG、C10orf116、AGAP11
31* 10季度26.13 电话：10:123205637–124265414 1.0685 FGFR2、ATE1、NSMCE4A、TACC2、BTBD16、PLEKHA1、ARMS2、HTRA1
32* 11页15.3–15.2 电话：11:11937958–14247232 2.31119 DKK3、MICAL2、MICALCL、PARVA、TEAD1、RASSF10、ARNTL、BTBD10、PTH、FAR1、SPON1
33* 第12页第11.23页至第11.22页 chr12:26948381–27740763 0.7996 C12orf11、FGFR1OP2、TM7SF3、MED21、C12orf71、STK38L、ARNTL2、PPFIBP1、REP15
34* 12季度21.2 chr12:75680499–78854366 3.1775 ZDHHC17、CSRP2、E2F7、NAV3、SYT1、PAWR、PPP1R12A
35* 23年第15季度–24.1季度 电话15:68901948–70472322 1.571411 LARP6、THAP10、LRRC49、THSD4、hCG_2004593、NR2E3、SENP8、MYO9A、GRAMD2、PKM2、PARP6、BRUNOL6、C15或f34、HEXA
36* 16季度12.2–13季度 chr16:54069589–55276609 1.212622 MMP2、LPCAT2、CAPNS2、SLC6A2、，CES4、CES1、CES7、，GNAO1、AMFR、NUDT21、OGFOD1、BBS2、，MT4、MT3、MT2A、MT1L、MT1E、MT1M、MT1A、MT1DP、MT1B、MT1F、MT1G、MT1H、MT1IP、MT1X
37* 2016年第23.3季度–第24.1季度 chr16:82643869–83686337 1.041515 MBTPS1、HSDL1、LRRC50、TAF1C、ADAD2、KCNG4、WFDC1、ATP2C2、KIAA1609、COTL1、KLHL36、USP10、CRISPLD2、ZDHHC7、KIAA0513
38* 17季度21.2 电话17:36909759–37102424 0.1982 KRT13、KRT15、KRT19、KRT9、KRT14、KRT16、KRT17、，环境影响一级
39* 18页11.22–11.21页 chr18:9697228–11899779 2.2097 RAB31、TXNDC2、VAPA、APCDD1、NAPG、FAM38B、GNAL、CHMP1B、MPPE1
40* 18季度21.33–22季度1 图表18:58940559–62423389 3.48165 BCL2、KDSR、VPS4B、，丝氨酸蛋白酶b5、丝氨酸蛋白酶b12、丝氨酸蛋白酶b13、丝氨酸蛋白酶b4、丝氨酸蛋白酶b3、丝氨酸蛋白酶b11、丝氨酸蛋白酶b7、丝氨酸蛋白酶b2、丝氨酸蛋白酶b10，HMSD、，SERPINB8系列，CDH7、CDH19
41* 22季度12.3 电话22:31112563–32647410 1.5365 C22或28、BPIL2、FBXO7、TIMP3、SYN3、大型
42* 22季度13.1 电话22:37739208–38112526 0.37135 APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC 3G、APOBEC3H、，CBX7、PDGFB、SNORD83B、SNERD83A、RNU86、SNORD 43、RPL3、SYNGR1
43 Xp22.31–第22页 chrX:8391871–11229802 2.841310 VCX3B、KAL1、FAM9A、FAM8B、TBL1X、GPR143、SHROOM2、WWC3、CLCN4、MID1、HCCS、AMELX、ARHGAP6
44* Xp21.1–第11.4页 chrX:37428928–38434118 1.0195 XK、CYBB、DYNLT3、CXorf27、SYTL5、SRPX、RPGR、OTC、TSPAN7
45 Xq22.1–q22.2 chrX:101791973–102974838 1.182213GPRASP1、GPRASP2、BHLHB9、RAB40AL、，BEX1、NXF3、，BEX4系列,TCEAL8、TCEAL5、，BEX2公司,TCEAL7公司、WBP5、NGFRAP1、RAB40A、，TCEAL4、TCEAL3、TCEAL1、MORF4L2、TMEM31、GLRA4、PLP1、RAB9B
46 Xq22.3号机组 chrX:106842107–108864277 2.02137 TSC22D3、MID2、TEX13B、VSIG1、PSMD10、ATG4A、COL4A6、COL4-A5、IRS4、GUCY2F、NXT2、KCNE1L、ACSL4
47* Xq26.3号机组 chrX:133993062–135423171 1.432213 FAM127A、FAM127B、NCRNA00087、CXorf48、ZNF75D、ZNF449、NCRNA00086、DDX26B、，CT45-1、CT45-2、CT45-4、CT45-3、CT45.4、CT45-5、CT45-6、SAGE1、MMGT1、SLC9A6、FHL1、MAP7D3、GPR112、BRS3、HTATSF1
平均值 1.89兆字节 128 26%的区域包含基因簇
*LNCaP细胞重叠

前列腺癌细胞系中LRES区域受到抑制

为了确定临床样本中假定的-LRES区域是否也出现在前列腺癌细胞系中，我们使用类似的计算方法检测了两个正常初级前列腺细胞（PrEC）和三个前列腺癌细胞株中的基因表达(补充信息、材料和方法). 与PrEC相比，临床数据中候选LRES区域约74%的LNCaP（35/47）、57%的DU145（27/47）和45%的PC3（21/47）也显示该区域内四个或更多的连续基因受到抑制(补充信息，表3). PrEC和LNCaP细胞之间七个假定的LRES区域相对基因表达的散点图示例；三个基因簇，HOXA公司集群（区域22），韩元集群（区域38），瑟平布簇（区域40）和四个带有单拷贝基因（区域7、12、24和32），如所示图2。所有35个重叠LRES区域的散点图如所示补充信息，图S2为了确保LNCaP中的基因阻遏不仅仅是由于染色体缺失，我们覆盖了LNCaP细胞的拷贝数变异（CNV）数据，发现30/35没有缺失的证据，而5个LRES区域显示一个等位基因缺失(补充信息，表1).

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LRES区在PrEC和LNCaP细胞中的表达状态

在基因1.0ST微阵列上分析正常前列腺上皮细胞（PrEC）和前列腺癌细胞系LNCaP的RNA样本，并将所有杂交信号（log2）绘制为散点图（左上角）。每个面板中的水平线和垂直线表示检测阈值（杂交信号低于5.0），而线x=y表示PrEC和LNCaP细胞中的转录水平相等。散点图显示了七个示例LRES区域，这些区域是从临床前列腺癌样本中识别出来的，在LNCaP细胞中也显示出一致的基因抑制。

为了进行表达阵列验证，我们对LRES区域24（7q31.1–q31.2）内和两侧的基因进行了q-RT-PCR(图3a和3c). 由九个连续的基因组成85加仑/分到遇见跨度为4 Mb，在LNCaP细胞中被抑制或在癌细胞和正常PrEC细胞中都被抑制。的表达式级别85加仑/分,PPP1R3A型,FOXP2公司和TFEC公司在两个细胞系中都低于检测阈值，而基因MDFIC公司,TES公司,CAV2型,CAV1型和遇见在LNCaP细胞中显示出大于两倍的下调。FLJ31818型和CAPZA2系列似乎标记了LRES区域24的边界，因为LNCaP癌细胞中这些基因的基因表达没有下调。

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LNCaP和PrEC细胞中7q31.1-q31.2的表观遗传景观

(一)通过微阵列杂交信号分析LNCaP和PrEC细胞中LRES区域24（7q31.1-q31.2）的表达。灰色背景突出显示低于检测的信号（低于5.0的混合信号）。(b条)使用Affymetrix GeneChip人类启动子1.0R拼接阵列分析H3K9ac、H3K9 me2、H3K27me3组蛋白修饰和DNA甲基化。对于每个基因和每个修改，显示了输入状态的富集以及差异模式（Pr[绿色轨迹]：PrEC；LN[红色轨迹]：LNCaP；Δ[黑色轨迹]：L NCaP减去PrEC）。虚线框突出显示了受抑制的域，这些域显示了染色质修饰和DNA甲基化的明显重组，对应于4.0Mb的LRES区域24的更沉默状态85加仑/分到遇见.边界基因TMEM168型,FLJ31818型,CAPZA2系列和ST7标准在两种细胞系中都没有获得抑制性标记，并且K9乙酰化水平较高。还显示了600 kb的下游区域，包括WNT2型,ASZ1标准,CFTR公司和CTTNBP2型该区域在PrEC中已经沉默，但在LNCaP中重构，H3K27me3缺失，DNA甲基化增加。该区域的基因组信息来自UCSC基因组浏览器。(c（c）)平铺数组结果的验证。实时qPCR用于验证基因表达和ChIP-on-ChIP结果，而Sequenom DNA甲基化分析用于验证MeDIP-on-ChIP结果。显示了三次试验的结果（平均值加S.E.M.）。

前列腺正常细胞和癌细胞LRES区的表观基因组分析

为了研究临床样本和LNCaP细胞共有的35个候选-LRES区域是否表现出表观遗传变化，我们使用Affymetrix Human Promotor 1.0R分片阵列杂交（ChIP-ChIP和MeDIP-ChIP）测定了PrEC和LNCa细胞中H3K9ac、H3K9 me2和H3K27me3的相对水平以及DNA甲基化。区域24（7q31.1–q31.2）的平铺阵列信号和qPCR验证摘要如所示图3b和3c在那里我们观察到表观遗传景观的交替组织85加仑/分到遇见首先，整个4Mb区域相对去乙酰化，LNCaP细胞转录起始位点周围H3K9ac完全缺失或大量减少；最显著的是基因TES公司,CAV2型,CAV1型和遇见(图3b，c)其在PrEC细胞中活性表达。其次，在一组基因中观察到H3K9me2的富集(MDFIC公司,CAV2型,CAV1型和MET）第三，H3K27me3在所有基因中都富集，除了TES公司(图3b，c). 第四，观察到DNA甲基化的差异，甲基化的局部增加限制在MDFIC公司,CAV2型,CAV1型和遇见(图3b，c). 基于MALDI-TOF MS的序列分析验证单个CpG单位的DNA甲基化(补充信息，图S3)，确认完全甲基化CAV2型和部分甲基化（40–60%）MDFIC公司,CAV1型和遇见.85加仑/分和PPP1R3A型PrEC中已经甲基化，与正常前列腺细胞中缺乏表达相关。有趣的是，CpG站点位于PPP1R3A型LNCaP细胞中的非CpG岛启动子去甲基化，与H3K27me3中的局部升高一致(图3b，c;补充信息，图S3). 5′基因(TMEM168型,FLJ31818型)和3′基因(CAPZA2系列和ST7标准)侧翼区24在正常PrEC细胞和LNCaP细胞之间表现出较小的表观遗传差异。

区域24下游，包含四个基因的0.6 Mb区块(WNT2型,ASZ1标准,CFTR公司和CTTNBP2型)观察到另一个显著的表观遗传差异域。尽管这些基因在PrEC或LNCaP细胞中没有表达，但在癌细胞中的所有四个基因中都观察到不同或升高水平的抑制标记，包括H3K27me3的缺失、H3K9me2的增强和DNA甲基化的增加(图3a、b、c).ASZ1标准然而，在PrEC中被甲基化WNT2型,CFTR公司和CTTNBP2型未甲基化。在LNCaP中，整个区块被广泛甲基化(图3c;补充信息，图S3). 其他六个示例LRES区域的平铺阵列数据的表观基因组摘要显示在补充信息3所有这些都显示出与癌症相关的表观遗传修复障碍。

LRES在前列腺癌临床中的应用

为了确认临床样本中是否也存在LNCaP细胞中观察到的表观遗传状态，我们检测了5例局部前列腺癌和匹配的正常样本DNA中跨越区域24（7q31.1–q31.2）的基因的表达和DNA甲基化。对单个患者样本的分析证实了区域基因表达的下降(图4a). DNA甲基化水平也与LNCaP数据相似MDFIC公司和TES公司临床样本中显示出最小的DNA甲基化，而CAV1型,CAV2型、和CFTR公司显示出显著的DNA超甲基化(图4b). 对于WNT2型,CAV1型和CAV2型亚硫酸氢盐克隆测序分析显示，大约一半的分子在某些位点（患者16和29）被甲基化，这与该区域的等位基因特异甲基化一致(图4c)或被正常细胞污染。这些结果为临床前列腺癌中LRES区域也容易发生DNA甲基化提供了支持性证据。

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临床前列腺癌样本中7q31.1–q31.2的表观遗传抑制

(一)五对局部前列腺癌和邻近正常组织中LRES区24内基因的表达变化。实验集1中LRES区域24的单个临床样本中连续基因表达减少65; （绿色：减少表达；红色：增加表达；蓝色：低于检测水平[log2信号<5.0]；*：ASZ1标准未在这些表达式数组上进行查询。）(b条)对来自相同临床样本的基因组DNA进行定量DNA甲基化Sequenom MALDI-TOF分析。显示了询问区域的平均甲基化比率。为了进行比较，还绘制了PrEC和LNCaP细胞的平均甲基化比率。可以清楚地看到，在一个样本中，该区域内的多个基因都是DNA高甲基化的，例如在患者29（PT29）中，在CAV2型,CAV1型,WNT2型和CFTR公司发起人。CAV1型上游是基因启动子中CpG岛上游的基因组区域CAV1型基因。(c（c）)通过克隆亚硫酸氢盐甲基化测序进一步检测患者16（PT16）和29（PT29）两个临床样本的DNA甲基化水平。黑色和白色圆圈分别表示甲基化和非甲基化CpG位点，每行代表一个克隆。这个CAV2型,CAV1型和WNT2型启动子在两种癌症样本中都显示出高甲基化的迹象，而TES公司和遇见基本上没有甲基化。为了进行比较，显示了克隆亚硫酸氢盐测序结果CAV2型和遇见在PrEC和LNCaP细胞中。

LRES区域癌相关表观遗传学变化综述

对LNCaP细胞中35个常见LRES区域内376个基因启动子的基因表达、组蛋白修饰和DNA甲基化进行了综合分析。与PrEC细胞相比，LRES相关基因在LNCaP中始终显示较低的RNA和H3K9ac信号（Wilcoxon秩和检验；P（P）<0.0001) (图5a). 抑制标记H3K9me2仅显示出适度的差异，而H3K27me3和DNA甲基化的变化更为显著和多样，与PrEC相比，大多数基因在LNCaP中显示出更强的H3K17me3和DNA甲基化信号(P（P）<0.0005) (图5a). 在PrEC和LNCaP细胞中检测到RNA和H3K9ac水平正相关(图5b;补充信息，表4). H3K9ac和H3K9me2信号是互斥的，H3K9ac和H3K27me3信号也是互斥的。RNA与H3K9me2和H3K27me3之间也存在类似的负相关(补充信息，表4). 在高H3K9ac信号的基因中，DNA甲基化水平较低，而缺乏H3K8ac与DNA甲基化的低或高状态有关。H3K9me2和H3K27me3信号可以在相同的基因上发现（正相关），而当H3K17me3较高时，DNA甲基化出现缺失，尤其是在LNCaP细胞中(补充信息，表4). 比较PrEC和LNCaP之间的标记差异时(补充信息，图S4)我们注意到，较低的RNA水平与H3K9ac的缺失相关，而抑制标记H3K9 me2、H3K27me3和DNA甲基化水平通常较高。令我们惊讶的是，在LRES区域中，H3K9me2、H3K27me3和DNA甲基化的变化之间没有观察到明确的相关性，这表明除了全局脱乙酰化外，还涉及不同表观遗传沉默模式的组合。

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所有LRES基因的表观遗传标记散点图

对所有LRES基因的RNA信号以及总结的ChIP和MeDIP信号进行了比较。（对于每个基因，根据其转录起始位点在−2kb、−1kb、TSS和+1kb处的MAT得分求和。显示了透明的数据点，叠加的信号被乘以，以便于全面解释。）(一)比较PrEC和LNCaP细胞中RNA、H3K9ac、H3K9me2、H3K27me3和DNA甲基化（meDNA）信号的散点图。靠近x=y线的数据点反映了在细胞系之间没有改变标记的基因。Wilcoxon标记秩检验表明，与PrEC细胞相比，LNCaP中的RNA和H3K9ac信号显著减少，而H3K27me3和meDNA水平总体增加（所有P（P）数值小于0.0005）。(b条)每个细胞系内信号的矩阵散点图（PrEC细胞：绿色；LNCaP细胞：红色）。当RNA水平较高时，H3K9ac信号较高。H3K9me2和H3K27me3信号只有在H3K9-ac或RNA水平较低或关闭时才高。每个图中的水平线和垂直线分别表示y=0和x=0。

癌表观基因组整合成抑制染色质区域

从详细的表观遗传学分析中可以明显看出，LRES相关的变化主要发生在多个连续基因块中(图6a–c). 所有LRES区域的共同点是H3K9乙酰化的整体缺失，这与基因转录减少有关。我们还观察到表观遗传标记在域中经常出现聚集（Wald-Wolfowitz检验，补充信息、材料和方法)但LRES区域内的亚结构域分布在抑制标记的组合中有所不同。例如，区域24包含一个大的抑制结构域，在H3K9乙酰化中缺失，获得H3K27me3(图6a). 区域24下游的第二个抑制域在H3K9ac中也很低，但在H3K27me3中耗尽。相反，DNA超甲基化定位于特定基因和/或基因块，并与H3K27me3水平的高低显著相关。包含基因家族的LRES区域(图6b)或独特的基因(图6c)也显示了表观遗传沉默标记的优势域的不同组合。例如，区域22(HOXA公司基因簇）的特征是DNA超甲基化的显性结构域和H3K9me2富集和H3K27me3缺失的亚结构域。区域38（1型角蛋白家族）富含H3K9me2和H3K27me3结构域，而区域40(瑟平布家族）具有H3K27me3升高的显著域和H3K9me2增益的亚域。在区域7中，有一个大的H3K9me2富集域，包含2个亚域，显示出H3K27me3的损失和增益；在区域12中，有一个域显示H3K27me3的富集，另一个较小的域显示DNA甲基化的缺乏，而在区域32中，有高H3K9me2的离散块，一个较大的域显示H3C27me3升高，还有3个亚域显示DNA超甲基化。

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LRES区域的表观遗传变化在连续基因域中聚集

LNCaP和PrEC细胞中七个示例LRES区域内的表观遗传特征热图显示出保守变化块：(一)7q31.1–q31.2上的区域24；(b条)包含基因家族的三个LRES区域：区域22(HOXA公司)，区域38(韩元)和区域40(瑟平布)、和(c（c）)没有任何基因家族的三个LRES区域：分别是区域7、12和32。图中的每一行代表一个基因，基因根据其染色体坐标（5′到3′）进行排序。为了简单起见，MAT分数以固定的时间间隔显示在转录起始点（−2000、−1000、0、+1000bp），顶部的箭头表示转录的开始。面板下方显示了颜色图例(c（c）). 黑匣子突出显示了显示相同表观遗传图谱或表观遗传标记变化的连续基因，星号标记了类似变化的重要结构域（Wald-Wolfowitz检验；P（P）< 0.05). (d日)表观遗传变化聚集在整个癌症基因组中。对基因组中显示相同表观遗传变化的相邻基因对数量的统计分析表明，聚类发生的频率远高于偶然发生的频率（***：P（P）< 1*10−09或−10日志10(P（P）) > 9; 看见补充材料和方法详细信息）。所有被查询的表观遗传标记都会发生聚类，这两个方向都意味着癌症表观基因组被解除调控，进入包含多个基因的域（上调：左图；下调：中图；对数转换P（P）更改值：右图）。

前列腺癌相关LRES区域位于hES细胞的允许染色质域

越来越多的证据以及一些争论35,36认为癌细胞具有正常未分化（多能干细胞）干细胞的许多特征，可能反映了肿瘤起源于组织干细胞或肿瘤发展过程中干细胞样基因表达模式的去分化和激活。由于对人类前列腺癌起源的细胞知之甚少，我们研究了LRES区域是否更类似于多能干细胞或PrEC细胞的表观遗传状态。对hES细胞的分析表明，相对于PrEC细胞，许多LRES基因在LNCaP和hES细胞中均未表达或低水平表达(补充信息，图S5). 然而，相对于hES和PrEC细胞，LNCaP的LRES区域中的活性H3K9ac标记明显缺失(补充信息，图S5). 此外，与PrEC相比，LNCaP的LRES区域中H3K4me3也普遍耗竭，相对于hES细胞更明显耗竭。有趣的是，与hES细胞相比，PrEC细胞中也有H3K4me3的明显缺失。相比之下，抑制性多梳H3K27me3信号水平在所有三种细胞类型之间分布更广（参见补充信息、结果更多详细信息）。这些结果表明，LRES区域没有总的趋势恢复到与多能性hES细胞类似的染色质状态，但支持在分化过程中从许可和/或二价状态进行表观基因组重构的概念，在肿瘤发生过程中跨结构域逐渐获得抑制性组蛋白标记。

相邻基因表观遗传变化的聚类

为了解决区域表观遗传抑制标记是否局限于LRES区域，我们计算了与PrEC和LNCaP细胞相比，相邻基因在相同方向上显示显著表观遗传变化的频率(补充信息、材料和方法). 对于所有表观遗传标记，观察到的变化数量明显大于预期(P（P）< 1*10−9在转录起始位点）(图6d). H3K27甲基化增加是相邻基因表观遗传变化聚集的最有力证据。有趣的是，在hES细胞中，我们还发现相邻基因的概率更大(P（P）< 1×10−22（Kolmogorov-Smirnof test）具有相同的表观遗传标记（H3K9ac、H3K4me3和H3K27me3）(补充信息，图S6). 这些数据进一步支持了这样的观察，即在局部范围内，邻近基因更有可能在肿瘤发生过程中遵循相同的表观遗传变化，正如我们在LRES区域所观察到的那样。

讨论

这项研究是首次将多研究临床前列腺癌表达数据与复杂的多层表观基因组数据进行查询和整合的研究之一。我们构建了一个全面的前列腺癌表观基因组图，以回答有关LRES在前列腺癌中的发病率和作用模式的重要问题。我们的数据显示，LRES是前列腺癌中的常见事件，影响了癌症基因组的很大一部分。

LRES基因组位置的主要共同特征之一是与前列腺癌和其他癌症中报道的基因组缺失或LOH区域重叠37–39普遍认为，遗传和/或表观遗传过程可以沉默参与肿瘤发生的单个基因。我们现在提出，LOH和LRES独立或同时作用于不同的等位基因，也可以导致癌症的区域基因抑制。LOH/基因组缺失和LRES区域的共同重叠可能反映了在癌症中起作用的基因的存在，表达缺失提供了生长优势。事实上，超过三分之一的LRES地区含有已知的肿瘤抑制剂，与肿瘤相关13,39–46和miRNA基因47–51将基因组缺失和/或LOH与LRES联系起来的机制关系尚不清楚。可能有潜在的染色体特征使这些基因组区域容易发生区域表观遗传沉默或缺失，或者表观遗传静默本身可能预先处理一个区域，使其随后发生缺失。研究表明，双链断裂和DNA修复可能导致表观遗传重塑和组蛋白修饰52,53或者相反，受损的染色质对DNA双链断裂修复的效率较低，并且容易发生染色体畸变54.

除了基因组特征外，我们还研究了前列腺癌细胞中与LRES区域相关的表观基因组特征。最重要的特征是H3K9乙酰化的整体缺失，这不仅发生在正常前列腺中活跃的邻近基因中，也发生在在正常前列腺或hES细胞中沉默的基因中。除了全局去乙酰化外，我们还惊讶地发现表观遗传沉默标记的不同组合，跨越每个LRES区域域中的多个基因。发现了三种主要类型的表观遗传学上不同的癌症相关结构域（总结于图7). 首先，将压制性标记“重新强制”到一个更明确的压制状态；在正常前列腺和hES细胞中主要受抑制的区域发生再强迫症，表现为H3K9ac水平更低，H3K9 me2富集，H3K27me3水平更高，在某些情况下局部出现DNA甲基化。第二，在正常前列腺和人胚胎干细胞中明显活跃并与H3K9高乙酰化相关的区域出现多个抑制标记；这些抑制性标记包括H3K9ac的完全缺乏和H3K27me3的存在，也可能包括H3K9me2升高和DNA超甲基化。第三，在正常前列腺和hES细胞中不活跃或低表达的基因中可以看到抑制标记的“交换”；“交换”通常涉及H3K27me3标记的相对缺乏和较高的DNA甲基化，尤其是在hES细胞中通常带有二价标记的基因中，或在PrEC细胞中活性（H3K9ac）和抑制（H3K27me3）标记的组合中。然而，在某些情况下，尤其是在非CpG岛相关基因中，可以观察到DNA甲基化缺乏，H3K27me3和H3K9me2标记升高。正常细胞中该基因的转录状态通常预示着癌细胞中观察到的表观遗传重塑模式。我们认为，LRES区域内发生的所有三种主要重塑模式都有助于巩固或减少可用于癌细胞中任何正常转录反应的可访问基因组。在整个基因组中，我们发现，对于所有表观遗传标记，相邻配对在癌症中更有可能存在一致性差异。这支持了这样一个概念，即许多局部染色体区域处于协调的表观遗传控制之下，并且我们用于识别LRES区域的严格标准选择了更普遍现象的子集。

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LRES将癌表观基因组整合为抑制染色质区域

在癌症的LRES区域内，以及整个癌症基因组的其他区域内，表观遗传学变化经常发生在连续基因的结构域中。可以确定三种类型的域：（1）压制标记可以重新强制到更明确的压制状态。这种区域的完全抑制通常标记为H3K27三甲基化的增加和偶发的DNA超甲基化。（2） 在正常状态下，在明显活跃并与H3K9高乙酰化相关的区域中经常观察到（多个）抑制性标记的增加。（3） 在正常细胞中仅显示低表达水平的区域，可以看到抑制标记从H3K27me3到DNA甲基化或相反的交换。

最近有报道称，单个基因经历了不同的表观遗传重编程模式，最显著的是“表观遗传转换”，发生在正常细胞中沉默并与H3K27me3相关的发育基因中，但在癌症中，这些基因易受DNA甲基化的影响，并失去多梳标记55然而，还没有报道在集群中发生表观遗传转换。染色质标记在正常细胞中一定程度上会聚集。例如，基因组中常染色质和异染色质的组织已经建立，G和R带被认为与抑制性组蛋白标记的富集或缺失有关56最近，两项研究描述了在正常（小鼠）基因组中形成结构域的单个表观遗传标记；发现H3K9me2结构域（LOCKs）在正常细胞分化过程中获得，并与大区域的基因沉默相关57; H3K27me3（BLOCs）的结构域似乎跨越了正常成纤维细胞中的沉默基因58与分化细胞相比，未分化hES细胞的染色质浓缩程度较低，可塑性较高59–62.

我们认为，癌症中的LRES导致基因组进一步巩固，跨大域形成更明确的表观遗传抑制状态，影响多种表观遗传标记，导致转录可塑性降低。事实上，在转移性疾病中，一些LRES区域似乎扩展到邻近基因，这表明LRES在肿瘤进展中的作用，这可能是由参与癌症发生的一个或多个关键基因的表观遗传沉默所播种的。我们的研究对发展基于表观遗传学的癌症治疗策略具有重要意义，这些策略可能需要重新激活染色体域中覆盖有多个抑制性表观遗传学标记的基因。

材料和方法

细胞系和培养条件

如前所述培养LNCaP前列腺癌细胞63在添加胎牛血清的RPMI 1640培养基（Gibco）中培养DU145和PC3。正常前列腺上皮细胞的两种独立培养物PrEC细胞（Cambrex Bio-Science分类号CC-2555：PrEC1和PrEC2; 组织采集编号13683和13639）按照制造商的说明在前列腺上皮生长培养基（PrEGM Cambrex生物科学分类号CC-3166）中培养。

基因表达阵列分析

根据制造商的方案，使用Trizol试剂（Invitrogen）从细胞系中提取RNA，并使用安捷伦生物分析仪确认其完整性。根据Affymetrix GeneChip全转录（WT）感官靶点标记分析手册（P/N 701880 Rev.4）标记300 ng RNA，并按照附录P/N 702577 Rev.1中的说明进行更改。使用GeneChip人类基因1.0ST阵列（Affymetrix），并根据制造商的说明进行杂交，并使用Expression控制台版本1.1（Affymetrix）和默认参数进行阵列分析。所有原始和分析的表达阵列数据都已保存在NCBI的基因表达总览（GEO）中GSE19726.

定量实时RT-PCR验证分析

根据制造商的说明，使用SuperScript III RNase H-逆转录酶（Invitrogen）从1μg总RNA中用150 ng随机六聚体（Roche）逆转录cDNA。如前所述，使用ABI PRISM 7900HT序列检测系统定量表达13。用于RT-PCR扩增的引物列于补充表4。反应一式三份，并使用比较方法计算标准偏差（ABI PRISM 7700序列检测系统，用户公告#21997）。

通过MeDIP进行甲基化分析

在1×IP缓冲液（pH 7.0的10 mM磷酸钠、140 mM氯化钠和0.05%Triton X-100）中对4μg超声基因组DNA（300–500 bp）进行MeDIP分析。将10μg抗5-甲基胞嘧啶小鼠单克隆抗体（Calbiochem克隆162 33 D3 Cat No.NA81）在500μl 1×IP缓冲液中培养过夜，并用80μl蛋白A/g PLUS琼脂糖珠（Santa Cruz sc-2003）收集DNA/抗体复合物。在4°C下用1×IP缓冲液清洗珠子3次，在室温下用1 ml TE缓冲液清洗两次。用新制备的1%十二烷基硫酸钠和0.1 M NaHCO洗脱免疫复合物三，并通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀纯化DNA，并重悬于30μl H中2O.并行处理输入样本。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

ChIP测定是根据制造商的方案（Upstate Biotechnology）进行的。简言之，~1×106细胞在一个10厘米的培养皿中，通过添加最终浓度为1%的甲醛并在37°C下培养10分钟来固定。用含有蛋白酶抑制剂（1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、1μg/ml抑肽酶和1μg/ml胃蛋白酶抑制素A）的冰冷PBS清洗细胞两次，收集细胞并用SDS裂解缓冲液在冰上处理10分钟。对产生的裂解产物进行超声波处理，将DNA剪切到200到500个碱基对的片段长度。用乙酰化组蛋白H3赖氨酸9（H3K9ac）（Millipore#06-599）、三甲基化组蛋白H1赖氨酸4（H3K 4me3）（Abcam#ab8580）、二甲基-甾酮H3赖胺酸9（H 3K9me2）（Abcam#ab1220）和三甲基-甾醇H3赖素27（H3k 27me3）（Mililipore#07-449）特异性抗体免疫沉淀复合物。每次免疫沉淀使用10μl抗体。每个ChIP分析也没有包括抗体对照，通过实时定量PCR（qPCR）分析也没有观察到沉淀。输入样本并行处理。用鲑鱼精子DNA/蛋白A琼脂糖浆液或蛋白A/G PLUS琼脂糖珠（Santa Cruz sc-2003）收集抗体/蛋白复合物，并多次洗涤。用1%SDS和0.1 M NaHCO洗脱免疫复合物三样品用蛋白酶K处理1小时，通过苯酚/氯仿萃取、乙醇沉淀纯化DNA，并在30μl H中重新悬浮2O。

全基因组扩增和启动子阵列分析

根据制造商的说明，使用GenomePlex Complete Whole Genome Amplifation（WGA）Kit（Sigma Cat.No.#WGA2）对来自MeDIP和ChIP免疫沉淀的免疫沉淀DNA和输入DNA进行扩增，每个扩增反应中使用50 ng DNA。使用cDNA净化柱（Affymetrix#900371）对反应进行净化，并根据Affymetix染色质免疫沉淀分析协议P/N 702238 Rev.3对7.5μg扩增DNA进行片段化和标记。使用基因芯片杂交清洗和染色试剂盒（P/N 900720）对Affymetrix基因芯片人类启动子1.0R阵列（P/N.900777）进行杂交。使用基于模型的倾斜阵列分析（MAT）对免疫沉淀信号与输入进行阵列分析64带宽为1kb，使用生物复制品。输入信号的标准化校正了细胞系之间拷贝数的变化。MAT中使用的所有其他参数都是默认值。S的MeDIP不锈钢将I甲基化的DNA与Affymetrix启动子阵列重复杂交，以促进MAT评分的解释。使用集成基因组浏览器（IGB-Affymetrix）显示LNCaP和PrEC细胞之间MeDIP和ChIP信号的富集。所有原始和分析的瓷砖阵列数据都已保存在NCBI的基因表达总览（GEO）中GSE19726.

通过定量实时PCR分析验证ChIP-ChIP阵列

进行定量实时PCR分析以验证ChIP-ChIP拼接阵列结果。使用ABI Prism 7900HT序列检测系统通过实时PCR测量靶免疫沉淀量。用于验证的扩增引物列于补充表4根据7900HT应用生物系统序列检测器的序列检测系统纲要（V2.1）建立PCR反应。在396孔板中使用Power SYBR Green PCR Master Mix（2×）进行10μl反应，一式三份。每个PCR中使用3μl免疫沉淀DNA（稀释为1:10），无抗体控制或输入染色质。采用通用热循环条件；50°C持续2分钟，然后95°C持续10分钟，接着95°C保持15秒，60°C保持1分钟，重复40个循环。对于每个样本，平均CT型获得了免疫沉淀材料和输入染色质的值。C中的差异T型值（增量CT型)反映了免疫沉淀物质的数量相对于输入染色质数量的差异（ABI PRISM 7700序列检测系统用户公告#21997（P/N 4303859））。使用比较法计算标准偏差（ABI PRISM 7700序列检测系统用户公告#1997（P/N 4303859））。

使用亚硫酸氢盐测序和Sequenom分析进行DNA甲基化分析

使用Puragene提取试剂盒（Gentra Systems）从细胞系中提取DNA。肿瘤和正常前列腺样本的DNA65用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen）制备。根据制造商的说明，使用EZ-96 DNA甲基化金试剂盒（Zymo Research:Cat No.D5008）进行亚硫酸氢盐处理。18μl用于含有180 ng DNA的亚硫酸氢盐反应。亚硫酸氢盐处理的DNA在50μl中重新悬浮，每次PCR中使用2μl。如前所述，对细胞系DNA进行亚硫酸氢处理66在亚硫酸氢盐转化后，使用中列出的引物对DNA进行PCR扩增，共扩增三份补充表4如前所述进行后遗症甲基化分析67为了进行克隆分析，进行了三个独立的PCR反应，并将产物合并，以确保具有代表性的甲基化特征。PCR产物使用Wizard PCR DNA纯化系统进行纯化，并使用快速连接缓冲系统（Promega）克隆到pGEM-T-Easy载体（Promeca）中。对单个克隆进行纯化和测序，并确定每个CpG位点的甲基化状态。

补充材料

生物信息学Supp

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Supp信息2

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辅助材料和方法

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Supp结果

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补充表1

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补充表2

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补充表3

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补充表4

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补充表5

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补充图1

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Supp Fig图例

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Supp信息1

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致谢

我们感谢P.Molloy和T.Hulf审阅手稿。我们感谢新南威尔士大学（澳大利亚悉尼）拉马西奥蒂中心的阵列杂交。这项工作得到了新南威尔士州癌症研究所（CINSW）项目（SJ Clark）、CINSW奖学金（MW Coolen）和CINSW学生（AL Statham）拨款以及国家卫生和医学研究委员会（NH&MRC）项目（427614、481347）和奖学金拨款（SJ克拉克&T Speed）的支持。

脚注

竞争性财务利益作者声明没有竞争性的经济利益。

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