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基因发育。2011年3月1日；25(5): 460–470.
数字对象标识：10.1101/gad.2016311
预防性维修识别码：下午3049287
PMID：21317241

激活的Ras需要自噬来维持氧化代谢和肿瘤发生

杰西·燕翔（Jessie Yanxiang Guo），1,2,三，8 陈心怡，1,2,8 罗宾·马修，1,4,8 京凡，5,8 安妮·斯特罗赫克（Anne M.Strohecker），1,4 吉泽姆·卡斯利·乌松巴斯，1,2 Jurre J.Kamphorst先生，5 陈光华，1,2 Johanna M.S.柠檬，5 瓦西里基·卡兰察，1,6 希拉里·科勒，1,7 罗伯特·迪波拉，1,6 赛琳·吉利纳斯，1,三，4 约书亚·D·拉比诺维茨，1,5和艾琳·怀特1,2,4,9
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

自噬是细胞用来支持新陈代谢以应对饥饿和清除受损蛋白质和细胞器以应对压力的分解代谢途径。我们在这里报告H-ras公司V12版本或K-ras公司V12版本癌基因上调基础自噬，这是肿瘤细胞在饥饿和肿瘤发生中生存所必需的。在Ras表达细胞中，有缺陷的自噬体形成或货物运输导致异常线粒体的积聚和氧气消耗的减少。自噬缺陷也会导致三羧酸（TCA）循环代谢物和饥饿时的能量消耗。由于线粒体在饥饿中维持Ras表达细胞的生存能力，因此需要自噬来维持支持Ras驱动的肿瘤生长所需的功能性线粒体库。携带Ras激活突变的人类癌症细胞系通常具有高水平的基础自噬，其中一部分，下调基本自噬蛋白的表达会损害细胞生长。由于Ras突变的癌症预后较差，这种“自噬成瘾”表明，靶向自噬和线粒体代谢是治疗这些侵袭性癌症的有价值的新方法。

关键词：自噬，p62，Ras，癌症，代谢，线粒体

必需自噬基因的产物(自动变速箱)-第5天，atg6/beclin1，一个tg7型、和lc3/atg8其中，对饥饿作出反应，形成吞噬细胞蛋白质、脂质和细胞器的双层吞噬细胞，将其捕获在溶酶体中降解的自噬体中(莱文和克罗默2008). 这种分解代谢的细胞自我分级提供了一种机制，可以在营养限制期内通过细胞内循环产生大分子合成的积木并维持能量平衡(拉比诺维茨与怀特2010). 在已建立的肿瘤中，自噬在缺氧肿瘤区域上调，促进生存，表明癌细胞利用自噬的分解代谢功能来耐受应激(Degenhardt等人，2006年;Mathew等人2007a，b条，2009). 由于自噬主要产生氧化代谢底物，因此自噬促进缺氧存活的方式尚不清楚。

自噬还通过防止未折叠和聚集蛋白、脂质和受损细胞器的毒性积聚来减轻细胞损伤。自噬的废物清除功能对细胞生存和肿瘤抑制都很重要(Mathew等人，2007年a;莱文和克罗默2008;怀特等人，2010年). 自噬缺陷会导致含p62和泛素（Ub）的蛋白质聚集体积聚，并破坏细胞器，尤其是线粒体(Hara等人，2006年;小松等人，2006年，2007;Mathew等人，2009年). 这与活性氧（ROS）的产生、基因组损伤和自发肿瘤的发展有关，表明自噬抑制慢性组织损伤和癌症的发生(Mathew等人，2009年). 由于自噬既能减轻损伤，又能维持能量平衡，我们假设自噬在癌症的发生和肿瘤的形成中起着相反的作用。虽然减轻损伤对抑制肿瘤的发生很重要，但在侵袭性癌症中，应激微环境中的生长反而可能导致依赖自噬生存。我们设想自噬对肿瘤的促进作用是双重的：在营养限制时期提供能量底物，并保留细胞生长所需的细胞器功能。为了验证这个假设，我们检测了侵袭性癌症模型中的自噬水平，重点是那些H-ras和K-ras激活突变的肿瘤。事实上，活性Ras的引入促进了肿瘤的发生，但也上调了基础自噬，这是维持线粒体代谢、细胞生长和肿瘤体内外细胞活力所必需的。由于具有活性Ras的人类癌细胞系也同样依赖于自噬，这表明通过自噬抑制靶向肿瘤细胞代谢可能是治疗具有Ras突变的侵袭性癌症的一种有价值的方法。

结果

激活Ras公司-表达细胞依赖自噬生存饥饿

我们测试了一个假设，即激活一个强大的细胞生长致癌基因，如H-ras公司V12版本或K-ras公司V12版本会改变自噬的要求。具体而言，我们假设表达活化Ras的细胞在饥饿期间减少代谢支出的能力较弱；因此，它们可能更依赖于自噬。H-ras公司V12版本或K-ras公司V12版本将基因导入不朽、非肿瘤性幼鼠肾上皮（iBMK）细胞（补充图S1A、S2A）。iBMK细胞系中Ras的表达水平与激活Ras突变的人类癌症细胞系中的Ras表达水平相当（见下文）。

通过细胞显示自噬体成分报告子LC3膜移位的频率以及评估内源性LC3-I到LC3-II的蛋白水解过程来测量自噬。在没有Ras的iBMK细胞系中，在营养充足的条件下，基础自噬水平较低（0%–5%），并且在饥饿时上调了10倍以上（Hank的平衡盐溶液[HBSS]）(图1A、B; 补充图S1D、S2B、C）。相反，H-ras的表达V12版本或K-rasV12版本（Ras）基础自噬增加10倍，饥饿诱导的自噬有限(图1A、B; 补充图S1B、D、2B、C）。缺乏必需自噬基因的等基因iBMK细胞系第5天或第7天完全有自噬缺陷(图1A、B，补充图S1D、S2B、C）和基本自噬基因的等位基因缺失贝克林1产生了部分自噬缺陷（补充图S1B，C）。只有当自噬在体外（补充图S1A、S2A）或体内（见下文）发生遗传损伤时，才能观察到自噬底物p62的积累，这表明Ras的过度表达不会干扰自噬通量。尽管激活的mTOR抑制自噬并被Ras激活，但Ras表达细胞中仍出现高水平的自噬，因为Ras表达的细胞和对照细胞之间的磷酸化S6水平相当（补充图S1E）。这表明Ras引起的高基础自噬不是由于mTOR的下调，而是由mTOR依赖机制引起的。

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H-ras公司V12版本-表达细胞依赖自噬生存饥饿。(A类)自噬能力(第5天+/+和第7天+/+)或自噬缺陷(第5天−/−和第7天−/−)表达H-ras的细胞V12版本或载体瞬时转染荧光自噬体标记物p-tFL-LC3，并进行饥饿处理。典型图像描述了RFP-LC3定位。数字表示LC3易位到自噬体的细胞百分比（点状定位）。(B)内源性LC3-I到LC3-II的加工评估表明自噬诱导和caspase-3激活（凋亡）。(C类)将表达Ras的细胞用HBSS处理12-20小时，并通过基于台盼蓝排斥的细胞活力分析仪检测细胞活力，并在饥饿开始时将其标准化为未处理的细胞。(天)在中处理的单元格C类在正常培养基中恢复2d，并评估克隆存活率。

在营养充足的条件下，自噬缺陷对Ras表达细胞的增殖或存活没有影响(图1C、D; 补充图S2C，E）。在饥饿状态下，Ras表达的自噬活性细胞存活，而自噬缺陷细胞则没有存活，生存能力的丧失伴随着caspase-3的激活(图1B; 补充图S2D）。自噬缺陷细胞的饥饿敏感性依赖于Ras，因为自噬状态不会显著影响无Ras细胞的存活(图1C、D; 补充图S1F）。饥饿时的存活障碍与自噬缺陷的严重程度相关，如Ras-表达第5天−/−和第7天−/−细胞对饥饿更敏感(图1C、D; 补充图S1F、S2D、E）比那些等位基因缺失的贝克林1（补充图S1G，H）。自噬缺陷对缺血（葡萄糖缺乏和1%氧气）中的细胞死亡同样敏感（数据未显示），但对促凋亡ATP-竞争性非选择性激酶抑制剂staurosporine不敏感（补充图S1I），这表明自噬依赖性存活是代谢应激特有的。甲基丙酮酸（补充图S1J）或活性氧清除剂（补充图S1K）不能挽救Ras表达的自噬缺陷细胞的凋亡，活性氧的产生也不明显（补充图S-1L），这表明存活障碍不是由于线粒体底物限制或氧化应激升高所致。自噬缺陷并没有改变GTP-结合Ras的水平（补充图S1M），表明自噬独立于Ras活性促进生存。因此，当营养物质受到限制时，Ras表达以自噬依赖的方式促进细胞存活。

自噬支持已激活Ras公司-介导肿瘤发生

为了评估自噬在Ras介导的肿瘤发生中的作用，用Ras转导的非肿瘤原性iBMK细胞可显著促进肿瘤形成(图2A、D; 补充图S2F；Degenhardt等人，2006年)，在裸鼠中生长。Ras-expressing公司第5天−/−和第7天−/−细胞显示肿瘤生长减少(图2 A、B、D、E; 补充图S2F，G）和肿瘤显示异常组织学、活性caspase-3、p62和Ub积聚(图2C、F; 补充图S2H）。肿瘤发生缺陷在第5天−/−和第7天−/−细胞比那些有贝克林1+/负极仅在Ras高表达的情况下导致肿瘤生长受损(贝克林1+/+Hras2-15和贝克林1+/负极Hras2）（补充图S3 A–C）。因此，完全的自噬缺陷对Ras的肿瘤发生更有效。自噬促进肿瘤发生是Ras特异性的，因为无Ras的肿瘤生长不会因自噬缺陷而减少(Degenhardt等人，2006年;Mathew等人2007b，2009). 稳定表达自噬报告子LC3的自噬互补性和自噬缺陷性Ras表达肿瘤显示点状LC3分布，表明自噬体在肿瘤细胞中形成第5天-依赖性方式（补充图S3D），证明自噬在Ras-driven肿瘤中是活跃的。

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自噬支持Ras肿瘤发生。(A类)Ras-expressing的肿瘤生长第5天+/+和第5天−/−细胞。误差条表示标准误差。(*)P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.01 (t吨-测试）。(B)注射后第13天（51和10天）或第15天（49和24天）具有代表性的荷瘤小鼠A类. (C类)肿瘤中活性caspase-3、p62或Ub的组织学（H&E）和免疫组织化学A类. (D–F)Ras-expressing公司第7天−/−肿瘤显示生长减少，凋亡增加，p62和Ub积聚。误差条表示标准误差。(*)P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.01 (t吨-测试）。

第62页通过以下方式实现有效的肿瘤发生Ras公司

自噬货物受体p62结合修饰蛋白质上的LC3和Ub，包括去极化线粒体等细胞器上的蛋白质，从而将货物靶向自噬体进行降解(Pankiv等人，2007年;Geisler等人，2010年). 有趣的是，p62缺乏会在致癌物激活后损害小鼠自发性肺腺癌的发展K-ras公司等位基因(Duran等人，2008年). 我们验证了以下假设：p62缺乏会损害货物向自噬体的转运，从而通过与缺乏相同的机制损害Ras肿瘤的发生第5天或第7天.Ras-expressing公司第62页−/−iBMK细胞(图3A)在饥饿中生存能力下降(图3B、C; 补充图S4A）和与第62页+/+和p62重组对照(图3D、E、G、H). Ras-expressing公司第62页−/−肿瘤组织学异常、凋亡（活性caspase-3）和Ub积聚(图3F，I)，与Ras-expressing无法区分第5天−/−和atg7型−/−肿瘤。因此，干扰自噬体的转运或形成具有阻碍Ras依赖性肿瘤发生的共同特征。

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Ras高效肿瘤发生需要p62。(A类)HA-标记的H-rasV12版本在中稳定表达第62页+/+和第62页−/−其中重组p62表达的iBMK细胞。Western blot显示HA-Hras的蛋白质水平V12版本、Flag-HA-p62、EGFP-p62和内源性p62。(B，C类)第62页−/−-赫拉（Hras）V12版本表达载体或p62的细胞用HBSS处理16 h，然后分析其生存能力(B)和克隆生存(C类)如中所述图1，C和D. (天)Ras-expressing的肿瘤发生，第62页+/+，或第62页−/−iBMK细胞。误差条表示标准误差。(*)P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.01 (t吨-测试）。(E类)小鼠在注射后第16天天. (F类)肿瘤组织中活化caspase-3和Ub的H&E和免疫组织化学研究天. (G公司)肿瘤生长第62页−/−-赫拉（Hras）V12版本iBMK细胞表达EGFP或EGFP-p62。误差条表示标准误差。(*)P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.01 (t吨-测试）。(H（H）)老鼠来自G公司注射后第15天。(我)肿瘤的H&E和免疫组织化学G公司.

高基础自噬在人肿瘤细胞系中的表达Ras公司突变

为了进一步证实自噬在激活Ras突变的人类癌细胞系的生长和生存中起作用，我们评估了自噬抑制的后果。我们评估了T24（膀胱癌细胞系，H-ras）生长和生存的自噬需求g12伏突变），H1299（肺癌细胞系，N-rasG12C系列突变），H460（大细胞肺癌细胞系，K-rasQ61H问题突变），PANC-1（胰腺癌细胞系，K-rasG12伏突变），HCT-116（结直肠癌细胞系，K-rasG13D（G13D）突变）和PC-3（前列腺癌细胞系，野生型Ras）。人类癌症细胞系中激活Ras的表达水平与iBMK细胞系中的激活Ras表达水平相当(图4A). 除PC3外，人类肿瘤细胞系具有高磷酸化ERK(图4A)与Ras途径的高通量一致。通过两种方式评估自噬：通过免疫荧光检测自噬体标记物串联标记的p-FL-LC3的膜易位频率，以及通过检测内源性LC3-I到LC3-II的蛋白水解过程(图4B、C). 在营养充足的条件下，除H460外，人类癌细胞的基础自噬上调。在H460中，LC3点状细胞很少，LC3-I占优势，而其他人类癌细胞系中LC3点阵细胞和LC3-II占优势，增加了几倍，表明基础自噬水平较高(图4B、C).

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激活Ras突变的人类癌细胞系对自噬抑制的敏感性。(A类，顶部面板）Western blot显示HA-K-ras的蛋白质水平V12版本在iBMK细胞系中，内源性Ras、磷酸化p42/44和人类癌症细胞系中的p42/44。这个底部图中显示了Ras水平相对于β-肌动蛋白的定量。(B)用荧光自噬体标记物p-tFL-LC3瞬时转染人癌细胞，并在营养充足的条件下培养。典型图像描述了RFP-LC3定位。数字表示LC3易位到自噬体的细胞百分比（点状定位）。(C类，顶部小组）在营养充足的条件下培养人癌细胞，并在30%的汇流处收集，以评估内源性LC3-I到LC3-II的过程。(底部面板）LC3-II与LC3-I表达的比率以图表形式定量显示。(天)评估CQ（30μM）治疗下人类癌细胞株内源性LC3-I到LC3-II的处理，以阻断自噬途径的流量。人类癌细胞在营养充足的条件下培养，当细胞融合25%-30%时用CQ处理，并与CQ给药开始时的细胞进行比较。(E类)30μM CQ处理6种不同癌细胞株的生长曲线天. (F类，顶部面板）Western blot显示Atg5和Atg7的表达。(底部小组）六种不同癌症细胞系对慢病毒shRNA击倒重要自噬调节因子Atg5和Atg7的细胞活性的反应。

自噬体的积累可能是由于诱导自噬或通过自噬途径抑制通量所致。为了评估通量，在氯喹（CQ）存在的情况下监测自噬底物LC3和p62，氯喹可阻止溶酶体酸化、自噬体内容物降解和通过通路的通量。所有细胞株在CQ存在下都积累了LC3-II和p62，这表明自噬通量很高，尽管H460的自噬动力学较慢，正如预期的那样(图4D). 因此，人类肿瘤细胞系中高水平的自噬体形成是由于高基础自噬。

自噬促进活性肿瘤细胞系的生长和存活Ras公司

为了测试具有激活Ras的人类癌细胞系的生长或存活是否需要高基础自噬，在自噬抑制剂CQ存在的情况下监测生存能力。在具有高基础自噬的细胞系中，CQ显著抑制T24的生长，并减弱H1299、PC-3、PANC-1和HCT116的生长(图4E). 相反，CQ不影响H460的增殖，H460具有较低的基础自噬性(图4E).

为了进一步探讨具有Ras突变的人类癌症细胞系中自噬的意义，评估了慢病毒击倒重要自噬调节因子Atg5和Atg7的功能后果。靶向shRNAs抑制了Atg5和Atg7的表达，这与T24、H1299和HCT116细胞系（对CQ也敏感）的细胞存活率显著降低有关，但与其他细胞系无关(图4F). 综上所述，我们的研究结果表明，Ras基因突变激活的一部分人类癌细胞系依赖自噬维持正常生长和生存。

自噬通过维持线粒体代谢功能和能量水平支持癌细胞生存

为了开始解决Ras被激活时自噬缺陷损害生存和肿瘤发生的机制，通过电子显微镜检查了野生型或自噬缺陷的等基因iBMK肿瘤。在Ras-expressing中第5天−/−，第7天−/−，贝克林1+/负极、和第62页−/−肿瘤中，异常、肿胀的线粒体明显堆积，与有缺陷的线粒体吞噬相一致(图5A; 补充图S5A）。线粒体去极化、E3连接酶Parkin向线粒体的易位和线粒体蛋白的泛素化触发线粒体自噬，导致p62结合和自噬体靶向(Wild和Dikic 2010). 为了评估饥饿时有丝分裂的启动，Ras-expressing第5天+/+和第5天−/−用标记的Parkin表达载体转染细胞，并在饥饿前后检测线粒体易位(Narendra等人，2008年). Ras-expressing低水平出现Parkin易位第5天+/+和第5天−/−细胞在营养充足的条件下，由线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯肼（CCCP）或饥饿诱导，与自噬功能状态无关（补充图S5B）。第5天饥饿后缺乏削弱Parkin的清除，与有丝分裂缺陷一致(图5B). 线粒体蛋白Tom20的持续高水平也表明，在饥饿状态下，自噬缺陷细胞无法参与由线粒体吞噬介导的线粒体降解(图5B; 补充图S5C）。为了测试线粒体功能是否是饥饿生存所必需的，用CCCP对线粒体去极化，并评估饥饿生存率。虽然线粒体去极化对细胞在营养充足条件下的存活没有影响，但饥饿状态下的存活率与自噬状态无关(图5C; 补充图S6A）。因此，线粒体功能对细胞在饥饿状态下的生存至关重要。

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自噬维持线粒体氧化代谢。(A类)典型的EM显示Ras表达、自噬缺陷肿瘤的畸形线粒体（箭头）堆积。嵌入式显示典型的线粒体形态。(B)用HBSS处理表达mCherry-Parkin的细胞7h，然后固定并用线粒体标记物Tom20染色。典型图像显示线粒体清除第5天+/+饥饿期间的细胞（Parkin和Tom 20阳性细胞减少）。数字表示Parkin表达细胞的百分比。(C类)用CCCP（20μM）预处理表达Ras的自噬或自噬缺陷细胞4h以诱导线粒体解偶联，然后再进行HBSS+CCCP处理4h。细胞恢复20h并评估克隆存活率。DMSO用于CCCP控制。(天)主要TCA循环中间产物的池大小第5天+/+-赫拉斯和第5天−/−-Hras细胞在营养充足和饥饿条件下。显示HBSS中LC-MS在指定时间内主要TCA代谢物的细胞数归一化相对池大小（任意单位[a.u.]）的图表。(E类)添加FCCP（1.5μM）以建立最大呼吸能力，添加复合III抑制剂抗霉素（20μM）抑制线粒体呼吸后，细胞在营养充足条件下的耗氧率。在不含丙酮酸钠（0.11 g/L）的DMEM中进行测量(顶部面板）或在HBSS中(底部面板）。(F类)EC（[ATP]+[0.5ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]）英寸第5天+/+和第5天−/−在营养充足和饥饿条件下不含或含Ras的细胞。

为了测试自噬缺陷是否损害线粒体功能，检查了线粒体膜电位的维持。当饥饿时，自噬缺陷细胞更容易丧失膜电位，且影响的严重程度与自噬不足水平相关，与线粒体功能降低一致（补充图S5D）。为了测试应激诱导的异常线粒体积累是否影响线粒体代谢，Ras-expressing中三羧酸（TCA）循环中间产物的相对池大小第5天+/+和第5天−/−细胞在营养充足（无丙酮酸DMEM）和饥饿（HBSS）条件下通过LC-MS进行检测。所有TCA代谢物均显示出明显的基础水平第5天+/+和第5天−/−细胞，在饥饿下急剧减少(图5D). 重要的是，线粒体中专门产生的TCA代谢物（柠檬酸盐、乌头酸盐和异柠檬酸盐）显示Ras表达水平降低第5天−/−单元格与第5天+/+基础和饥饿条件下的细胞(图5D; 数据未显示），柠檬酸盐在饥饿期间耗尽到几乎无法检测到的水平第5天−/−Hras细胞。TCA代谢物也可以从氨基酸碳骨架（谷氨酰胺中的α-酮戊二酸，天冬氨酸中的富马酸和苹果酸）的胞浆中产生，但情况并非如此(图5D). 当肿瘤发生与Ras（Bcl-2）以外的癌基因有关时，在自噬缺陷细胞中未观察到柠檬酸盐和异柠檬酸盐的消耗，表明Ras特异性效应（补充图S6B）。丙酮酸是糖酵解的最终产物，线粒体可以利用丙酮酸生成乙酰辅酶A，从而生成柠檬酸盐第5天−/−细胞。因此，自噬缺陷可能通过在Ras表达下破坏丙酮酸和/或脂肪酸向乙酰辅酶A和柠檬酸的线粒体转化，耗尽线粒体产生的TCA循环代谢物。众所周知，Ras可以促进丙酮酸转化为乳酸，并抑制脂肪酸的氧化(Kim and Dang 2006年)这可能会增加自噬的需求，为线粒体代谢提供底物，并保护线粒体功能。

为了测试自噬缺陷是否也导致线粒体呼吸受损，在不使用和使用解偶联剂（对三氟甲氧基羰基氰化苯腙[FCCP]）的情况下检测耗氧量（OCR），以评估剩余呼吸能力（SRC）(Choi等人，2009年)，细胞生物能量功能潜在储备能力的指标(Dranka等人，2010年). 在营养充足的条件下，Ras表达的自噬活性细胞表现出明显的OCR，这在FCCP和丙酮酸的作用下升高，在饥饿状态下降低(图5E; 补充图S6C）。因此，自噬活性细胞有效地调节线粒体呼吸以满足ATP需求和底物可用性。相反，Ras表达的自噬缺陷细胞OCR水平降低，FCCP和丙酮酸反应迟钝，饥饿反应迟钝。因此，与代谢底物的缺乏不同，Ras表达的自噬缺陷细胞在线粒体呼吸中受到根本性损害(图5E; 补充S6C）。

鉴于Ras表达肿瘤细胞中的自噬缺陷导致线粒体呼吸缺陷，检测了ATP、ADP、AMP和能量电荷（EC）的水平。基础EC（[ATP+half-ADP]/[ATP+ADP+AMP]）是衡量细胞整体能量状态的指标，在有Ras和无Ras的自噬能力和自噬缺陷细胞中具有可比性。Ras表达导致EC下降第5天+/+饥饿后的细胞，由于自噬缺陷而进一步减少(图5F). Ras表达、自噬缺陷细胞中EC的降低伴随着ATP/ADP比率的降低和AMP水平的升高（补充图S6D）。尽管线粒体活性氧的产生与Ras驱动的肿瘤发生有关(Weinberg等人，2010年)这些关于EC的数据暗示了线粒体的能量生成功能。Ras的表达加剧了饥饿时的能量消耗，使细胞依赖自噬，通过保护线粒体功能和可能通过产生分解代谢衍生的代谢底物来缓冲这一需求。在自噬缺陷细胞中，饥饿时的代谢不足会产生急性能量危机，导致细胞死亡。

讨论

小鼠的自噬缺陷会导致组织线粒体肿胀，呼吸减少，与ATP耗竭相关，但也会导致蛋白质和脂质稳态的破坏，目前尚不清楚是什么导致了疾病的表现(Kuma等人，2004年;Komatsu等人，2005年，2006，2007;Hara等人，2006年;Mathew等人，2009年;Wu等人，2009年). 在有丝分裂后的组织中，自噬蛋白底物的积累可能具有特别的毒性，导致组织损伤和疾病。相反，肿瘤可以通过细胞分裂减少受损蛋白质的积累，而受损的线粒体由于在应激的微环境中增殖可能更有害。重要的是，功能性线粒体是Ras转化细胞在饥饿中生存所必需的(图5C)和体内(Weinberg等人，2010年)这表明，当营养素受到限制时，通过有丝分裂控制线粒体质量对于维持氧化代谢和能量平衡至关重要。因此，自噬抑制癌症的发生，同时促进恶性肿瘤的生长。在前者中，自噬可以防止组织损伤，从而促进癌症的发生和早期癌症的进展。在后者中，自噬维持线粒体代谢功能，对恶性肿瘤的生长至关重要，从而产生“自噬成瘾”

肿瘤具有不同程度的线粒体生物能量功能(Wu等人，2007年)归因于控制新陈代谢的致癌突变和信号通路的激活(Vander Heiden等人，2009年)或TCA循环酶突变(戈特利布和汤姆林森2005)促进有氧糖酵解（Warburg效应）(Warburg 1956年). 由于一些致癌事件抑制了自噬(怀特和迪保罗2009)底物限制和有丝分裂缺陷导致的直接线粒体功能障碍也可能导致Warburg效应。在前者中，通过突变对代谢途径进行基因重编程，促进有氧糖酵解，这是生成合成代谢前体所必需的，也是生成新细胞所必需的生物合成途径(Vander Heiden等人，2009年). 在后者中，线粒体质量控制失败可能会阻止肿瘤细胞依赖氧化代谢来维持细胞生物能量学。根据需要，这可能会增加或选择依赖糖酵解来支持代谢，正如Warburg（1956）最初所描述的那样。

Ras中激活突变发生率高的癌症（如肺癌、胰腺癌和结肠癌）具有预后特别差的不幸区别。我们发现许多Ras基因激活突变的人类癌细胞系具有较高的基础自噬性，有些细胞依赖自噬来维持正常生长（T24、H1299和HCT116）(图4E). 人类癌症细胞系之间自噬依赖性的差异可能是由于不同的附加突变所致。另一个有趣的可能性是，自噬依赖性可能与Ras的高活性和Ras通路的高通量有关，Ras通路发生在更具侵袭性的癌症中，在转导Ras的iBMK细胞中也有类似情况。这些发现表明，这些具有高水平突变Ras的癌症最有可能对自噬、线粒体自噬或线粒体代谢的抑制做出反应。事实上，自噬在胰腺癌细胞系和对自噬抑制敏感的肿瘤中升高(Yang等人，2011年)与自噬成瘾模型一致。诸如羟基氯喹（HCQ）等在自噬降解的最后阶段干扰溶酶体功能的药物已进入临床，以测试抑制自噬是否可以提高癌症的治疗效果(怀特和迪保罗2009). 这些数据现在为评估自噬抑制剂临床试验中Ras的激活突变提供了更个性化的方法。然而，值得注意的是，HCQ的功能可能与阻断自噬体形成起始的Atg5 shRNA或Atg7 shRNA介导的自噬抑制不等效。开发特异性自噬抑制剂并确定自噬途径中的最佳点以降低癌细胞存活率显然是有保证的。此外，线粒体缺陷的肿瘤可能对干扰葡萄糖利用的药物特别敏感，同时对依赖线粒体产生有毒ROS进行细胞杀伤的治疗产生耐药性。

材料和方法

细胞培养和试剂

将幼鼠iBMK细胞培养在含有10%胎牛血清（FBS）和1%Pen-Strep的DMEM（GIBCO/Invitrogen）中，培养温度为38.5°C，CO含量为8.5%2对于人类肿瘤细胞系，H460和PC-3细胞在含有10%FBS和1%Pen-Strep的RPM1640中培养；T24和H1299细胞在含有10%FBS和1%Pen-Strep的10%DMEM中生长；HCT116细胞在含有10%FBS和1%Pen-Strep的McCoy’s 5A培养基中培养；PANC-1细胞在含有10%FBS、1%丙酮酸钠和1%Pen-Strep的DMEM中培养。所有人类癌细胞在37°C和5%CO下培养2为了评估基本的自噬水平，人类癌细胞在营养充足的条件下培养，并在30%的汇流处收集。在饥饿条件下，用磷酸盐缓冲盐水（PBS；GIBCO/Invitrogen）冲洗生长在多孔板中的细胞两次，并将其放入HBSS（GIBCO/Invitrogen。细胞活力由台盼蓝排他细胞活力分析仪（Vi-Cell，Beckman Coulter，Inc.）评估，并在饥饿开始时将其归一化为未经处理的细胞。在正常或饥饿条件下，通过恢复正常生长介质（DMEM+10%FBS）进行克隆存活分析，然后通过Giemsa（Sigma-Aldrich）染色平板来观察恢复的细胞。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、甲基丙酮酸、staurosporine、CCCP、bafilomycin A1、抗霉素和FCCP购自Sigma-Aldrich。

结构和蛋白质表达

pEGFP-p62和pEGFP表达载体是Terje Johansen博士赠送的，pmCherry-Parkin表达载体由Richard Youle博士慷慨提供，p-tFL-LC3串联标记LC3表达载体是Tamotsu Yoshimori博士赠送的。通过将人类全长p62融合到N末端表位标签，生成标记有Flag-HA的p62，并克隆到pCDNA3.1（+）（Invitrogen）中。为了制备兔多克隆抗p62抗体，将全长人p62 cDNA克隆到EcoRI和SalI酶切位点的pMal-C2x（NEB）中。MBP-p62融合蛋白在BL21（DE3）中表达大肠杆菌通过IPTG诱导，用直链淀粉柱纯化亲和力，然后用麦芽糖洗脱。Cocalico Biologicals，Inc.使用MBP-p62融合蛋白作为抗原，生成兔多克隆抗p62抗体。

细胞系的产生

如前所述生成永生细胞系(Degenhardt等人，2002a，b条). 获得稳定表达H-ras的细胞V12版本或K-rasV12版本，第5天+/+和第5天−/−iBMK细胞系与选择标记质粒pcDNA3.1/Zeo（Invitrogen）和pCGN-HA-Hras共转染V12版本，pCGN-HA-KrasV12版本或控制载体pCGN，然后选择佐菌素（Invitrogen）；第7天+/+，第7天−/−，贝克林1+/+、和贝克林1+/负极iBMK细胞系转染pCGN-HA-HrasV12版本或控制载体pCGN，然后选择潮霉素B（Sigma-Aldrich）；第62页+/+和第62页−/−选择标记质粒pCMV-BSD（Invitrogen）与pCGN-HA-Hras共转染iBMK细胞系V12版本或使用控制载体pCGN，然后选择速效杀菌素（GIBCO/Invitrogen）。p62重组细胞系来源于第62页−/−通过与pcDNA3.1/Zeo和pEGFP-p62或pcDNA3.1（+）-Flag-HA-p62共转染，然后选择zeocin，将Hras细胞工程化以稳定表达EGFP-p62或Flag-HA-p62。第5天+/+Hras mCherry Parkin和tg5型−/−Hras-mCherry-Parkin iBMK细胞系来源于第5天+/+Hras或第5天−/−用pmCherry-Parkin转染Hras细胞株，然后进行基因选择（GIBCO/Invitrogen）。第5天+/+Hras-GFP-RFP-LC3和第5天−/−Hras-GFP-RFP-LC3细胞系来源于第5天+/+Hras或第5天−/−用p-tFL-LC3转染Hras细胞，然后进行基因选择。pLKO.1衍生载体与靶向人类的shRNAs第5天或第7天从Sigma-Aldrich购买（TRCN0000151963、TRCN0000330394、TRCN0000007584和TRCN00000007587）。病毒是使用第二代包装系统在293T细胞中产生的，如所述(Root等人2006). 在收集分析或实验使用之前，在嘌呤霉素存在下选择细胞72小时。

抗体

以下抗体用于Western blotting、免疫组织化学和免疫荧光：p62（上述MBP全长人p62的抗血清或从Enzo Life Sciences购买的抗血清）；Beclin1（H-300）和Tom20（FL-145）（圣克鲁斯生物技术公司）；ATG5-ATG12（Cosmo Bio公司）；HA（12CA5）（罗氏应用科学）；β-肌动蛋白和Ras（Sigma-Aldrich）；LC3和Ub（Ubi-1）（Novus Biologicals）；和活性caspase-3（Asp175）、磷酸化-S6、S6、磷酸化-p42/44和p42/44（细胞信号技术公司）。如前所述进行蛋白质印迹、免疫组织化学和免疫荧光程序(Degenhardt等人，2002b;Nelson等人，2004年;Mathew等人，2009年).

电子显微镜

肿瘤来自第5天−/−，第7页−/−，贝克林1+/负极，第62页−/−，或表达H-ras的野生型对照iBMK细胞V12版本或K-rasV12版本在注射后第11天将其切除，并固定在含有2.5%戊二醛、4%多聚甲醛和8μM CaCl的0.1 M二羧酸缓冲液中2如前所述，使用JOEL 1200EX电子显微镜进行分析(Degenhardt等人，2006年).

自噬和有丝分裂评估

为了量化自噬诱导，用p-tFL-LC3报告子瞬时转染细胞（Amaxa，Lonza），并让其在一夜之间恢复。用1nM巴非霉素A1处理细胞以促进自噬体的可视化，并在固定和安装之前与HBSS孵育指定的时间。图像分析为60倍。在三个重复实验中，每个条件下至少有200个细胞被评分。显示了表达RFP-LC3点的细胞百分比。在三个独立的实验中，通过测定100个荧光细胞群中显示点状（而非弥散）荧光的细胞数量来量化mCherry-Parkin易位细胞的百分比。

肿瘤生长分析

如前所述进行肿瘤形成测定和体内LC3易位(Degenhardt等人，2002b;Nelson等人，2004年;Mathew等人，2009年). 简单地说，每个细胞系三只小鼠和每个基因型两个独立衍生的细胞系用于评估肿瘤形成。单元格（107) (106在里面图3D; 补充图S2F，右图）皮下注射到裸鼠体内，并在指定的时间点监测生长。统计显著性计算方法为t吨-测试。采用机构动物护理和使用委员会批准的方案进行肿瘤形成分析。

组织学

对于石蜡切片，肿瘤在10%的福尔马林缓冲溶液（福尔马林-新鲜，Fisher Scientific）中固定过夜并切片。为了在体内对p-tFL-LC3串联标记的LC3进行荧光定位，将肿瘤固定在10%的福尔马林缓冲溶液中过夜，然后在15%的脱水溶液中脱水6小时，然后在30%的蔗糖溶液中过晚并切片。

OCR速率测量

如前所述，使用Seahorse Biosciences细胞外通量分析仪（XF24）测量OCR率(Wu等人，2007年). 简单地说，细胞接种在2.3×104每个孔的细胞数（0.32 cm2)在XF24板中加入250μL DMEM（10%FBS，1%Pen-Strep），并在38.5°C和8.5%CO下培养20–24小时2在XF分析之前。在无丙酮酸钠（Invitrogen）和有丙酮酸盐（Invitro）的HBSS和DMEM中进行基本OCR测量。SRC（最大呼吸量-基础呼吸率）和总储备量(Choi等人，2009年;Dranka等人，2010年)在这些条件下，通过从XF24试剂端口分别注射线粒体解偶联剂FCCP（1.5μM）和复合物III抑制剂抗霉素（20μM）来测量。所有测量值均归一化为每百万个细胞的OCR。

LC-MS代谢组学分析

如前所述，使用LC-MS测量主要TCA循环中间产物中的池大小(Munger等人，2006年). 简单地说，细胞在完全培养基（DMEM，10%透析FBS，1%Pen-Strep）中培养20–24小时，然后在指定的时间内用HBSS替换培养基。通过去除培养基并在−80°C下添加4 mL甲醇：水（80:20）来抑制代谢。在氮气流下干燥提取的代谢物，在350μL水中重组，并通过LC-MS进行测量。选择主要TCA代谢物并使用MatLab计算细胞数标准化池大小，作为三次重复测量的平均值。对于ATP、ADP和AMP测量，单个池大小被标准化为细胞数量和已知数量的均匀15N-标记的ATP（4.89 nmol/mL）和13将C标记的ADP（2.27 nmol/mL）和AMP（0.35 nmol/mL）添加到萃取介质中。EC使用公式EC=（ATP+半ADP）/（ATP+ADP+AMP）计算。采用双向方差分析和Bonferroni后验计算统计显著性。

线粒体膜电位、活性氧水平和Ras活性的评估

在生长条件下，用25 nM MitoTracker-Red CMXRos（Molecular Probes/Invitrogen）和25 nM MitoTracker-Green FM（Moleculer Probes/Invitrogen）荧光染料对活细胞染色30分钟，用生长介质洗涤，并用流式细胞仪（BD内流细胞分选仪，BD Biosciences）进行分析。如前所述，使用10μM 2′-7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCF-DA，分子探针）测定活性氧水平(Mathew等人，2009年). 按照制造商建议（赛默飞世尔科学公司）进行Ras活性测定。简言之，将80μg GST-Raf1-Ras-binding结构域（RBD）与谷胱甘肽树脂在500 mg细胞裂解液中于4℃孵育1 h。孵育后，取回蛋白珠，清洗，在12%SDS-PAGE上溶解，并用抗Ras小鼠单克隆抗体进行Western blot。

致谢

我们感谢小松先生第7天−/−老鼠，石井T代表第62页−/−小鼠，R.Youle代表pmCherry-Parkin，T.Yoshimori代表p-tFL-LC3，T.Johansen代表p62表达载体。我们还感谢R.Patel提供的EM、A.Roberts和CINJ流式细胞术和组织分析服务以及DNA测序核心设施。这项工作得到了NIH（R37 CA53370和RO1 CA130893，授予E.W.；RC1 CA147961，授予E.W、H.A.C.和J.D.R.；R00 CA133181，授予V.K.）、新泽西癌症研究委员会（09-1083-CCR-EO，授予E.W-、C.G.、H.C.、J.D.R.和R.S.D.）和DOD（W81XWH06-1-0514和W81XWH05，授予E.W/R.S.D）的资助。

脚注

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期在线http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.2016311.

本文有补充材料。

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文章来自基因与发育由提供冷泉港实验室出版社