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单元格。作者手稿；可在PMC 2011年6月23日获得。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2010年12月23日；143(7): 1084–1096.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2010.12.008
PMCID公司：项目经理3039484
尼姆斯：美国国立卫生研究院261394
PMID：21183072

哺乳动物代谢基因表达的父代诱导跨代环境重编程

本杰明·卡隆,1,* 卢卡斯·福基尔,1,* 内奥米·哈比卜,2,三，* 杰里米·谢伊,1,* 卡罗琳·哈特,1 李若旺,4 克里斯托夫·博克,5 李成建,1 菲利普·D·扎莫尔,1,6 亚历山大·迈斯纳,5 翁志平,4 汉斯·霍夫曼,7 尼尔·弗里德曼,2,8和奥利弗·兰多1,†
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总结

表观遗传信息可以通过哺乳动物的生殖系遗传，是环境信息的合理代际载体。为了测试环境信息的跨代遗传是否发生在哺乳动物身上，我们对响应父亲的饮食。与喂食控制饮食的雄性后代相比，喂食低蛋白饮食的雄性的后代表现出参与脂质和胆固醇生物合成的许多基因的肝脏表达升高，胆固醇酯水平降低。子代肝脏的表观基因组分析显示，根据父亲的饮食，胞嘧啶甲基化有许多适度（约20%）的变化，包括在关键脂质调节物PPARα的可能增强子上甲基化的可再现变化。这些结果，结合最近的人类流行病学数据，表明父母的饮食可以影响后代的胆固醇和脂质代谢，并定义了一个模型系统来研究遗传表观基因组的环境重编程。

简介

在过去的几十年里，我们对遗传的理解有了重要的扩展，因为人们描述了各种各样的表观遗传特征(Jablonka和Lamb，1995年,2005;Rando和Verstrepen，2007年). 表观遗传系统的一个含义是，它们提供了一种潜在的机制，父母可以通过这种机制将他们所经历的环境信息传递给后代。换句话说，存在的机制可以让生物体“告知”其后代当前的环境条件。在某些历史环境下，例如，在进化过程中反复暴露于持续数十代的中等毒性环境中，这种非孟德尔信息传递可能是适应性的（参见(Jablonka和Lamb，1995年;Rando和Verstrepen，2007年)). 生物体能否继承祖先环境诱导的性状具有深远的意义，这种遗传方式在早期进化理论家J.B.拉马克之后被称为“拉马克”遗传，尽管值得注意的是，达尔文和拉马克都相信后天性格的遗传。

尽管有这些理论上的考虑，但目前很少有证据表明环境的跨代影响，尤其是在哺乳动物中。所描述的跨代环境影响的大多数例子都是母亲的影响（参见(Harris和Seckl，2010年;怀特劳和怀特劳，2008年;Youngson和Whitelaw，2008年)供审查），包括各种啮齿动物光周期信息的宫内传递(霍顿，2005)大鼠应激反应和母体梳洗行为的文化遗传(Meaney等人，2007年;Weaver等人，2004年)，以及人类和啮齿动物胎儿营养不良的代谢和精神后遗症(Hales and Barker，2001年;Harris和Seckl，2010年;Symonds等人，2009年). 然而，母体影响很难与宫内环境暴露对后代的直接影响区分开来。

少数研究已经确定可遗传的环境扰动对后代的表观遗传效应。用内分泌干扰物vinclozolin治疗怀孕大鼠母亲会导致后代生育能力下降和行为改变(Anway等人，2005年;Crews等人，2007年). 在另一项研究中，阻止怀孕雌性小鼠的甲基供体导致阿古提活黄色细胞的胞嘧啶甲基化降低A类vy（虚拟）报告者轨迹(Waterland和Jirtle，2003年)，并且改变的胞嘧啶甲基化特征在第一代之后一直存在(Cropley等人，2006年).

虽然在使用母体治疗方案来排除后代对宫内环境的简单塑性反应时，证明多代变化（如F2效应）很重要，但父系效应避免了这个问题，因为父亲对后代的贡献通常只比精子多一点点。文献中记录了少数父系效应——据报道，雄性小鼠交配前禁食会影响后代的血糖水平(Anderson等人，2006年)雄性大鼠长期接触高脂肪饮食会影响其后代的胰岛生物学(Ng等人，2010年). 此外，来自人群的流行病学数据将父辈祖父的饥荒经历与两代人之后的肥胖和心血管疾病联系起来(Kaati等人，2002年;彭布雷等人，2006年). 这些结果激发了对交配前父亲饮食对后代表型影响机制的深入探索。

因此，确定什么环境条件对哺乳动物具有代际影响，并描述调节这些影响的机制，是非常有意义的。在这里，我们描述了父辈饮食对小鼠后代基因表达跨代影响的基因组筛查。喂食低蛋白饮食的雄性后代中数百个基因的表达发生了变化，同时脂质和胆固醇生物合成途径也发生了相应的上调。子代肝脏的表观基因组分析确定了关键脂质转录因子PPARα的假定增强子处胞嘧啶甲基化的变化，这些变化与子代中该基因的下调相关。有趣的是，我们没有发现父亲饮食对精子中该基因座甲基化的影响，在不同的饮食制度下，精子胞嘧啶甲基化模式基本保持不变。这些结果为研究饮食的跨代影响建立了一个近交、遗传可分的模型系统，并可能对几种主要人类疾病的流行病学具有启示。

结果

实验范式

雄性小鼠从断奶到性成熟期间，喂食对照组或低蛋白饮食（11%而非20%蛋白质，剩余的体重由蔗糖构成）。注意，虽然本实验中的相关饮食变化可能是蛋白质含量、蔗糖含量、脂肪/蛋白质比率等，但为了简单起见，我们在全文中将饮食称为低蛋白饮食。然后将两种饮食中的小鼠与对照饮食中饲养的雌性小鼠交配(图1A,第1部分). 交配一到两天后，父亲被赶走，将其对后代的影响限制在交配本身。在整个实验过程中，所有母亲都坚持控制饮食。出生后，这些后代与母亲一起饲养，直到三周大，此时采集它们的肝脏进行RNA分离。DNA微阵列用于分析两种杂交后代肝脏中的总体基因表达差异(表S1).

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父亲饮食调控基因的筛选

(A类)实验设计。雄性小鼠从断奶到性成熟期间被喂食对照组或低蛋白（11%）饮食，然后与在对照饮食中饲养的雌性小鼠交配。雄性在交配一到两天后被移除。在三周时从后代中采集肝脏，制备RNA，标记并与寡核苷酸微阵列杂交。（B）微阵列数据概述，比较喂养不同饮食的同胞雄性后代——红色方框表示低蛋白后代中的RNA水平高于对照后代，绿色方框表示对照后代中的高表达。顶部的方框表示两个雄性（紫色）或两个雌性（黄色）后代之间的比较。每列显示一对后代的比较结果。只有基因通过显著变化的严格阈值(图S1B)如图所示。数据按实验（列）和基因（行）进行聚类。（C）微阵列数据验证。定量RT-PCR用于测定角鲨烯环氧化酶水平(Sqle（方形）)相对于对照基因Vitronectin(Vtn公司)这表明微阵列数据集没有变化。动物按父亲的饮食和性别分组，数据表示为ΔCT型之间Sqle（方形）和Vtn公司，相对于对照组女性的平均值进行标准化。其他验证如所示图S1A.第页使用t检验计算值。另请参见表S1,图S1和S2.

对来自两个F1组的26对配对小鼠进行差异测试，我们发现差异表达基因显著过剩，这与父母治疗不影响后代的无效假设有关（1595个基因的错误发现率（FDR）为0.001，图S1B-C). 我们还确定了一组更稳健的445个基因（t-test with null hypothesis of mean change 0.2，FDR为0.01），其表达强烈依赖于父亲的饮食(图1B). 在我们的分析中，我们将重点放在这组更强健的基因上，然而，下面描述的所有现象对于更大的基因组也是如此。在三个不同的动物设施进行的为期几年的实验中，在13窝（7窝低蛋白，6窝对照）中观察到这些基因表达的变化(图S2A-B). 原则上，考虑到检测到的后代数量，随机因素应该在我们两组之间平均分布，但我们直接解决了一些潜在的伪影，包括细胞数量、昼夜节律周期、产仔数、牺牲顺序和笼子位置的变化(图S2，请参阅实验程序).

我们通过q-RT-PCR证实了我们的结果(图1C,第1部分). 角鲨烯环氧化酶(Sqle（方形）)在我们的微阵列数据中，它催化甾醇生物合成的第一个氧化步骤，在低蛋白队列中增加了约3倍，q-RT-PCR在超过25只动物中显示出类似的平均表达差异，这些动物在相隔几年进行的杂交中收集(图1C). 我们观察到的差异发生在雄性和雌性后代中(图1C,S2C公司)尽管这些饮食历史依赖性差异叠加在性别差异表达的基线上。

低蛋白后代中增殖和脂质生物合成基因的上调

为了帮助定义我们队列之间的生理差异，我们计算了差异表达基因中各种基因本体（GO）过程的丰富程度。在我们的治疗组后代中上调的基因丰富了许多与脂肪和胆固醇生物合成有关的基因，包括脂质生物合成(第页< 9 × 10−26)，类固醇生物合成(第页< 3 × 10−19)，胆固醇生物合成(第页< 2 × 10−12)和氧化还原(第页< 4 × 10−10). 另一组上调基因被注释为与S期有关，如DNA复制(第页< 2 × 10−9)和相关注释。下调基因被富集用于GO注释，如序列特异性DNA结合(第页< 6 × 10−6)和配体依赖性核受体活性(第页< 6 × 10−5)尽管与这些注释匹配的基因数量很少（分别为14和5个）。

S期基因的增加可能表明存在过度增殖状态，而代谢表达差异表明这些动物的脂质代谢发生了改变。为了探索这些改变基因表达程序的机制，我们询问观察到的基因表达差异是否反映了少数通路的调节改变。我们用120个公开可用的小鼠肝脏基因表达数据集的概要检查了在我们的低蛋白后代中观察到的基因表达谱的显著重叠(实验程序). 我们的低蛋白后代基因表达谱显著(第页<.05（Bonferroni校正后）28个已发表的基因表达谱中重叠的基因表达变化(图2,表S2)包括与调节胆固醇和脂质代谢的转录因子扰动相关的基因表达谱（SREBP(Horton等人，2003年)，KLF15(格雷等人，2007年)，PPARα(Rakhshandehroo等人，2007年)和ZFP90(Yang等人，2009年)). 我们的基因表达数据集还与多种突变影响生长激素（GH）和胰岛素样生长因子1（IGF-1）水平的小鼠的肝脏基因表达显著匹配(Boylston等人，2004年;Madsen等人，2004年;Tsuchiya等人，2004年). 根据丰富的公共资料进行的层次聚类揭示了我们数据中两类突出的基因功能：DNA复制(第页< 6 × 10−14)和脂质或胆固醇生物合成(第页< 2 × 10−27) (图2). 在许多不同的转录因子和生长因子谱中观察到的部分重叠表明，在低蛋白后代中观察到基因表达谱的改变可能与多种不同途径的重新编程有关

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父亲饮食影响多种途径

上调基因表达谱与肝脏基因表达公共数据集概要的比较。根据28个重要基因的标记，我们上调基因的聚类(第页＜0.00025）来自在各种条件和遗传扰动下120个公开可用的鼠肝脏特征的汇编汇编的重叠特征（GEO(Horton等人，2003年;Yang等人，2009年). 对于每个重要的特征，大多数重叠的基因显示为黄色，而具有相反调节的基因（即数据集中的向下而不是向上）显示为蓝色。这些基因分为两个不同的簇，一个富含DNA复制，另一个富含脂肪和胆固醇生物合成的各种类别。另请参见表S2和图S3.

为了评估后代的重编程状态是否会再现父亲对低蛋白饮食的反应，我们测量了一对断奶以控制或低蛋白饮食喂养的动物肝脏中的全球基因表达变化，如图1A.后代中发生变化的基因与这些方案在亲代中诱导的基因不同(图S3). 相反，喂食低蛋白饮食的雄性上调免疫反应和凋亡相关基因，下调羧酸代谢相关基因（分析未显示）。

跨代对脂质代谢的影响

我们进一步关注胆固醇生物合成基因。在低蛋白父亲的后代中观察到胆固醇代谢相关基因的一致上调(图3A).图3B显示了我们的上调数据集和已发布数据之间的更详细比较(Horton等人，2003年)胆固醇代谢的主要转录调节因子SREBP激活的基因。以前研究表明，在低蛋白后代中，许多上调的基因通过SREBP-1a或SREBP-2的过度表达而上调，或通过SREBP激活基因的缺失而下调，Scap公司.

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低蛋白队列中胆固醇代谢的改变

（A）胆固醇生物合成。图中显示了被注释为胆固醇生物合成基因的基因，颜色表示低蛋白与对照组比较中表达的平均差异。（B）低蛋白队列中许多上调的基因是SREBP靶点。升级的群集图1B显示，以及来自(Horton等人，2003年). 基因在参考文献的两个复制品中得分均为高(Horton等人，2003年)显示为黄色，得分为向下的基因为蓝色。柱显示转基因小鼠过度表达SREBP-1a或SREBP-2的数据，或scap（风景）−/−敲除小鼠。（C）低蛋白后代肝脏中的胆固醇水平降低。三只对照动物和三只低蛋白动物肝脏组织的脂质剖面数据显示为平均+/-标准偏差。红线表示无变化。第页通过对数转换的脂质丰度数据的配对t检验计算值。胆固醇酯；磷脂酰乙醇胺；游离胆固醇；三酰甘油（TAG）；磷脂酰胆碱，PC；心磷脂，CL；磷脂酰丝氨酸；游离脂肪酸；溶血磷脂酰胆碱；和二酰甘油，DAG。另请参见表S3.

为了探讨肝脏基因表达与生理学之间的对应关系，我们测量了三对对照和治疗肝脏的脂质水平，以确定脂质水平的变化是否导致脂质生物合成基因水平的增加(图3C,实验程序). 在低蛋白饮食父亲的队列中，胆固醇和胆固醇酯（其水平降低了两倍以上）被耗尽。在特定的脂质类别中发现了额外的差异，例如低蛋白后代的饱和心磷脂、饱和游离脂肪酸以及饱和和单不饱和三酰甘油酯的相对水平显著增加(表S3). 总之，这些结果表明，父亲的饮食会影响后代中具有关键生物医学重要性的代谢物。

子代中的microRNA

最近，小（19-35）RNA如microRNAs（miRNAs）与小鼠的表观遗传有关(Wagner等人，2008年). 为了确定改变的小RNA群体是否会驱动我们的重编程效应，我们通过高通量测序对来自对照组和低蛋白子代肝脏的小RNA（19–35 bp）群体进行了表征(Ghildiyal等人，2008年)，并将读取映射到已知的microRNA(表S4). 一些miRNAs在低蛋白饮食父亲的后代中的表达发生了变化(图4). 变化幅度通常很小（约50%），但在四个对照组与低蛋白比较（配对t检验）中重现，并且考虑到这些RNA的测序读取次数，这种差异幅度远远超出了计数误差(表S4). 低蛋白队列后代上调miR-21、let-7、miR-199和miR-98，下调miR-210。其中许多上调的miRNAs与肝脏增殖相关，miR-21和miR-199均与肝细胞癌相关(Jiang等人，2008)而let-7是众所周知的肿瘤抑制剂(Jerome等人，2007年). 生长相关miRNA的增加与在低蛋白饮食父亲的后代中观察到的过度增殖基因表达谱一致。

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增殖相关microRNA对父亲饮食的反应

从八个后代（四个对照，四个低蛋白）的肝脏中分离出小（<35 nt）RNA，并进行高通量测序。显示了在所有四对动物中表现出一致变化的微RNA，平均变化显示为条形图，个体比较显示为点。另请参见表S4.

我们没有发现统计上显著的重叠(第页>0.05）在此处miRNA的预测靶点和我们观察到的基因表达变化之间，尽管我们观察到miRNA丰度的细微变化（约50%）可能对mRNA影响不大，即使特定的miRNA被人工引入细胞，对于大多数预测靶点，靶mRNA的下调低于2倍(亨德里克森等人，2008年). 因此，我们的结果表明，miRNAs可能是重编程途径的额外靶点，但可能不是整个反应的直接上游调节器（但参见(Wagner等人，2008年)).

后代中的胞嘧啶甲基化

如何通过父亲的饮食重新规划后代？胞嘧啶甲基化是一种广泛存在的DNA修饰，具有环境响应性，至少在代际间携带一些遗传信息(Bartolomei等人，1993年;Cropley等人，2006年;霍利迪，1987年;Rakyan等人，2003年;Waterland和Jirtle，2003年). 印迹基因座通常参与生长控制(摩尔和黑格，1991年)，我们首先询问在低蛋白后代中，候选印迹位点的子集是否表现出胞嘧啶甲基化的改变(图S4A). 由于这些基因座在甲基化方面没有表现出显著的变化，因此我们转向基因组规模的作图研究，以寻找对照和低蛋白后代之间的差异甲基化基因座。

我们进行了减少代表性的亚硫酸氢盐测序（RRBS(Meissner等人，2008年))以约1%的小鼠基因组单核苷酸分辨率表征胞嘧啶甲基化(表S5). 对来自一对对照组和低蛋白后代的肝脏进行RRBS，并计算甲基化CpG的分数，用于各种特征，如启动子、增强子和其他非基因CpG岛。总的来说，我们发现胞嘧啶甲基化在对照组和低蛋白后代之间有很好的相关性(图5A、B). 然而，我们确实观察到两个样品之间的CpG甲基化发生了广泛的适度（约10–20%）变化（图5A、B)与许多观察结果一致，环境变化往往对胞嘧啶甲基化有较小的定量影响(Blewitt等人，2006年;Heijmans等人，2008年;Ng等人，2010年;Weaver等人，2004年). 重要的是，启动子甲基化的变化与后代中基因表达的变化没有全局相关性，这表明后代中的基因表达程序不太可能在每个单独的基因中表观遗传地指定(图5C). 当然，少数上游调控因子的改变可能导致广泛的基因表达差异，许多差异甲基化区域与胆固醇或脂质相关基因有关(表S5).

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父亲饮食对肝胞嘧啶甲基化的跨代影响

（A）对来自对照组和低蛋白后代肝脏的基因组DNA进行亚硫酸氢盐还原-重表达测序。对于所有带注释的启动子，对照样品（x轴）与低蛋白样品（y轴）相比，显示了甲基化的CpG的平均分数。红色和绿色圆点表示启动子具有显著的(第页<0.05）甲基化变化超过10%。（B）如中所示(A类)非成因CpG岛屿。（C）启动子胞嘧啶甲基化变化与基因表达变化无关。对于每个启动子，将胞嘧啶甲基化的平均变化与图1B。另请参阅表S5和图S4.

最有趣的是，我们发现在基因间CpG岛上游约50 kb处甲基化显著增加（约30%）Ppara公司(图6A). 这个基因座可能是Ppara公司，因为它与增强子染色质标记H3K4me1相关(Heintzman等人，2007年)在小鼠肝脏中（F.Yue和B.Ren，个人通信）。Ppara公司在大多数（但不是所有）子代肝脏中下调(表S1,图6B)，我们后代肝脏的总体基因表达谱与ppara公司−/−敲除小鼠(图2)这表明，这一单一基因座的表观遗传调控可能导致后代中观察到的基因表达变化的很大一部分Ppara公司仅mRNA水平就可以解释整个基因表达数据集中约13.7%的变异（尽管这当然不能确定因果关系）。

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父亲饮食对推测基因甲基化的影响Ppara公司增强剂

（A）推测的差异甲基化Ppara公司增强剂。顶部面板显示了15号染色体的示意图：85360000–85640000。放大区域表示chr15:85514715–85514920。一对对照和一对低蛋白后代的RRBS数据如下所示，检测的CpG用彩色方框表示，以指示甲基化克隆的%。左边的数字表示甲基化%，括号中的序列读取数涵盖CpG。（B）Ppara公司在大多数低蛋白后代肝脏中被下调。方框图显示了表S1.（C）假定增强子甲基化与Ppara公司下调监管。对来自8个对照组和9对低蛋白子代肝脏的DNA进行亚硫酸氢处理，每个动物至少分析了13个克隆。%该区域12个CpG中每个CpG的甲基化在y轴上绘制，数据显示为平均+/-SEM。（D）显示了三个对照和三个低蛋白后代的亚硫酸氢盐克隆。白色圆圈表示未甲基化的CpG，黑色圆圈表示甲基化CpG。用于变化的微阵列数据Ppara公司成对动物之间的RNA水平显示在左侧，以对数表示2。每个亚硫酸氢盐分组下的值表示总甲基化%，括号中分析了克隆数。

因此，我们通过亚硫酸氢盐测序在另外17个后代肝脏（8个对照肝脏和9个低蛋白肝脏）中检测了该基因座的甲基化状态，发现该基因座中几个CpG的低蛋白肝脏和对照肝脏之间甲基化的平均差异高达8%(图6C). 重要的是，这些汇集的数据低估了该基因座在重编程中的潜在作用，因为它们包括在Ppara公司基因表达-个体动物对在Ppara公司mRNA水平在该位点的不同胞嘧啶中表现出高达30%的差异。图6D显示了三对不同程度的亚硫酸氢盐克隆动物Ppara公司下调（并非所有用于甲基化分析的动物都通过微阵列进行分析）。综上所述，这些结果确定了一个差异甲基化位点，该位点很可能是肝脏基因表达反应的上游控制器之一。

精子中的胞嘧啶甲基化、RNA和染色质

父亲饮食和子代甲基化模式之间的联系使我们考虑到父亲饮食影响精子中胞嘧啶甲基化模式的假设。因此，我们从食用对照或低蛋白饮食的雄性动物的附睾尾部分离出高纯度（>99%）精子。我们分析了Ppara公司亚硫酸氢盐测序的甲基化增强子，但发现食用对照或低蛋白饮食的雄性之间没有显著变化(图S4B). 这些结果表明，精子中的胞嘧啶甲基化不是该基因座上父亲传递的相关饮食信息（但在发育过程中的某些时候会发生变化——(Blewitt等人，2006年))或者，我们捕获了后代在相关基因表达上不会出现显著变化的动物，如图1B或​或6B，6亿,Ppara公司下调对低蛋白后代具有不同的渗透性。

为了在全球范围内研究父亲饮食对精子胞嘧啶甲基化的影响，我们从四名男性中分离出精子，其中两名男性食用对照饮食，一名男性食用低蛋白饮食，另一名男性接受热量限制疗法。然后，我们通过MeDIP-Seq（使用针对5me-C的抗体进行免疫沉淀，然后进行深度测序）调查了整个基因组的胞嘧啶甲基化模式(哈辛托等人，2008年;韦伯等人，2005年)) (图7A,S5A、S6系列). 值得注意的是，任何一对样本之间的整体胞嘧啶甲基化谱都高度相关，这表明精子的“表观基因组”在很大程度上对饮食中的这些差异没有反应(图7B–D,S5B–E型). 的确，不同饮食的室友(图7B、C)与来自不同窝的对照动物相比，启动子甲基化的相关性更好(图7D). 虽然这些结果并不排除精子中的胞嘧啶甲基化是父代饮食表观遗传信息的相关载体，但样本之间的高度相关性，加上在精子中胞嘧啶甲基化度的缺失Ppara公司精子中的增强子，使我们考虑包括RNA在内的其他表观遗传信息载体(Rassoulzadegan等人，2006年;Wagner等人，2008年)和染色质(Arpanahi等人，2009年;Brykczynska等人，2010年;Hammoud等人，2009年;Ooi和Henikoff，2007年).

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饮食对精子表观基因组的适度影响

（A）显示了母体甲基化区域的两个肝脏样本（前两个轨道）和四个精子样本（后四个）的MeDIP序列数据(格纳斯，左）和父系甲基化区域(Rasgrf1型，右侧）。（B）对照组和低蛋白甲基化的比较。对于每个启动子，TSS周围8 kb的平均甲基化水平，对照精子（x轴）和低蛋白精子（y轴）的值被分散绘制。x轴和y轴绘制在对数刻度上（C）如（B）所示，但用于控制与热量限制。（D）如（B）所示，但对于一对对照样品。当聚焦TSS周围的1 kb时，发现（B–D）的类似结果（未显示）。请参阅图S7用于分析低蛋白精子和对照精子之间一致的RNA和染色质差异。

我们用Affymetrix微阵列分析了三对雄性和两个匹配的附睾样本的RNA水平(图S6、S7A). 奇怪的是，与对照样品相比，低蛋白和热量限制样品始终显示出更多“类精子”RNA群体（与附睾RNA相对）(图S7B–C). 这是否反映了系统性污染问题或精子成熟度或质量的生物学差异，目前尚不清楚，尽管我们注意到，我们一直证实精子特异性水平较高Dnahc3号机组在额外7/8个低蛋白精子样本中进行q-RT-PCR(图S7E). 我们注意到，通过显微镜检测，对照精子样本的精子率通常大于99.5%(图S6)但无论如何，我们不能完全排除系统性污染问题。考虑到这种可能性，我们通过校正潜在的附睾污染，确定了对照组与低蛋白精子的基因包装差异(图S7B–F). 有趣的是，我们观察到一些转录因子和染色质调节因子的下调，如Smarcd3号机组和帕德，尽管由于动物间的高度变异性，q-RT-PCR验证在统计上不显著(图S7F).

尽管Smarcd3号机组未经q-RT-PCR显著证实，这可能反映了上述子代父亲饮食的可变外显率。考虑到染色质重塑中的杂合突变体可以影响后代的表型，即使突变等位基因分离(Chong等人，2007年)，我们使用精子中总组蛋白保留（pan-H3 ChIP）丰度的初始全基因组定位（未显示）和关键表观遗传组蛋白修饰H3K27me3来确定单基因座分析的目标。我们观察到低蛋白精子中H3K27me3在毛阿（单胺氧化酶）在5/5对精子样本中，H3K27me3在埃夫图德14/5配对样本(图S7G–H). 这些结果证明了精子表观基因组受饮食条件调节的原理，尽管这些观察的生物学意义尚不清楚。

讨论

综上所述，我们的结果表明，父亲的饮食影响近交小鼠后代中脂质和增殖相关基因的表达，精子中的表观遗传信息载体对环境条件作出反应。这些结果对人类健康有潜在影响，并提出了许多机械问题，下文将对此进行讨论。

父亲的饮食影响后代的新陈代谢

我们的结果清楚地确定了一组对父亲饮食敏感的生理通路。具体来说，我们发现肝脏中参与增殖和胆固醇生物合成的基因的表达可以通过父亲的饮食来调节，这些变化反映在几种脂质代谢产物的水平上。结合数据显示子代血糖水平受父亲禁食小鼠的影响(Anderson等人，2006年)这些结果表明，父亲的饮食对啮齿动物后代的代谢具有广泛的影响。有趣的是，Ng等人最近的一项研究(Ng等人，2010年)据报道，雄性大鼠长期接触高脂肪饮食与雌性后代的胰岛β细胞功能障碍有关。在不久的将来，比较高脂肪和低蛋白饮食的跨代效应自然会引起极大兴趣，尽管一个明显的区别是，在我们的系统中，在两个性别后代中都观察到了跨代效应。

我们观察到的对胆固醇代谢的影响在低蛋白条件下是否有利还有待测试，但重要的是研究生态相关的饮食，以便更坚定地推测任何观察到的转基因效应的适应性意义。例如，目前我们无法确定男性感觉到低蛋白饮食的哪一方面——后代代谢可能受到整体蛋白质摄入、高蔗糖、脂肪/蛋白质比率甚至微量营养素水平的影响，因为我们的男性随意饮食，因此可能过度摄入低蛋白饮食。

重编程状态：肝脏

重编程基因表达状态的机制基础是什么？子代肝脏中胞嘧啶甲基化的基因组尺度分析确定了几个与脂质相关的基因，这些基因根据父亲的饮食发生差异甲基化。最值得注意的是，主要脂质调节物PPARα的假定增强子在低蛋白后代中的甲基化水平普遍高于对照后代。该基因座的甲基化在动物之间是可变的，与部分外显率一致Ppara公司数据集中的下调。在低蛋白后代中观察到的总体基因表达谱与在ppara公司−/−小鼠(Rakhshandehroo等人，2007年)导致了表观遗传学的假设Ppara公司通过增强子甲基化的下调是一个上游事件，影响重组动物的整个下游调节子。请注意，虽然Ppara公司我们不能排除肝脏基因表达的变化是由肝脏自身表观遗传改变引起的全球生理变化引起的Ppara公司在其他一些组织中。

有趣的是，Ppara公司肝脏中的表达也受母亲饮食&食用高脂肪饮食的雌性小鼠后代表现出肝脏改变Ppara公司表达，出生时表达增加，但断奶时表达减少(山口等，2010年). 结合我们的数据，这些结果表明Ppara公司是整合祖先饮食信息以控制后代新陈代谢的关键纽带。

跨代父亲效应的机制基础

父亲的饮食可能通过许多不同的机制影响后代的表型。虽然我们在这里关注表观遗传系统，但重要的是要注意父母的信息也可以通过社会或文化遗传系统传递给后代(Avital和Jablonka，2000年;2001年香槟和美食;Jablonka和Lamb，1995年;Meaney等人，2007年;Weaver等人，2004年). 虽然这种由母亲提供的社会遗传在我们的父系效应系统中不太可能发生——雄性通常只在雌性笼子里呆一天——但众所周知，在一些动物中，雌性可以判断交配质量并相应地分配资源(普雷克和格里菲斯，2009年)精液可以影响果蝇雌性种群后行为(Fricke等人，2008年;沃尔夫纳，2002年). 目前不能排除这些和其他可能的跨代信息载体——正在进行的人工授精和体外受精实验将确定精子是否在我们的系统中携带相关的代谢信息。

在这里，我们关注的假设是，父亲的饮食信息确实存在于精子表观遗传信息载体中。首先，已知精子中胞嘧啶甲基化模式的一个子集是可遗传的(Chong等人，2007年;Cropley等人，2006年;Rakyan等人，2003年;Waterland和Jirtle，2003年). 其次，一些报告表明，精子中的RNA分子可以影响后代的表型(Rassoulzadegan等人，2006年;Wagner等人，2008年). 第三，染色质结构被认为携带表观遗传信息，因为精子基本上不含组蛋白，但保留在发育重要位点的子集上(Arpanahi等人，2009年;Brykczynska等人，2010年;Chong等人，2007年;Hammoud等人，2009年). 最后，可以想象，额外的或新的表观遗传调节剂（如朊病毒）被包装在精子中，或者精子质量受到饮食的影响，或者遗传变化受环境的影响（尽管重要的是要强调在本研究中使用了近交系小鼠）。

在这里，我们报告了从控制饮食、低蛋白饮食和热量限制饮食的小鼠获得的精子中胞嘧啶甲基化模式和RNA含量的全基因组特征。从全球来看，三种情况下的胞嘧啶甲基化模式都是相似的，这表明精子表观基因组在很大程度上不受这些饮食的影响。尽管如此，相对较少的基因座的变化可能会对发育中的动物产生深远影响，我们的数据并不排除通过精子胞嘧啶甲基化进行遗传的可能性，特别是考虑到MeDIP不太可能识别出少量胞嘧啶甲基化约10-20%的差异。重要的是Ppara公司(图6)精子中没有差异甲基化。因此，未来将非常有兴趣确定在发育过程中何时在肝脏中观察到差异甲基化，并确定导致差异甲基化的上游事件(Blewitt等人，2006年).

有趣的是，我们确实确定了饮食对精子RNA含量和染色质包装的影响。例如，来自对照动物的精子持续缺乏高度精子特异性Dnahc3号机组基因(图S7)相对于低蛋白动物的精子。我们目前无法确定这是否代表了污染、精子成熟度或其他方面的可复制差异。最后，根据我们的观察，低蛋白精子往往会耗尽编码大量染色质调节因子的基因，我们已经开始研究饮食对精子染色质结构的影响。有趣的是，我们发现毛阿启动子持续缺失多囊相关染色质标记H3K27me3(图S7G)作为一种概念证明，精子基因组的染色质包装对环境具有响应性，并促使全基因组研究饮食对精子染色质的影响。考虑到在其他跨代遗传范式中观察到的常见行为变化，H3K27me3毛阿影响后代行为（可能通过改变后代对母亲压力的反应-(Harris和Seckl，2010年))将来会有很大的兴趣。

与人类疾病的相关性

这些结果可能与人类疾病有关，因为母亲人类饥饿与儿童肥胖和糖尿病相关(Lumey等人，2007年)但值得注意的是，父辈祖父的有限食物也与孙子的糖尿病和心血管疾病风险的改变有关(Kaati等人，2002年;彭布雷等人，2006年). 有趣的是，在这些研究中，祖先获得食物和疾病风险与下一代的疾病风险无关，而仅与F2疾病风险相关。然而，重要的是要注意到，食物供应对父辈祖父的跨代影响取决于童年时期接触丰富或贫乏饮食的确切时间(彭布雷等人，2006年)而我们的实验方案涉及从断奶到交配的持续低蛋白饮食。因此，未来的研究需要确定父亲接触低蛋白饮食何时以及如何影响后代代谢的表观遗传程序。

总之，这些结果建议重新思考糖尿病、心脏病或酗酒等复杂疾病流行病学研究中的基本做法。我们认为，未来的环境暴露史需要包括父母的暴露史以及患者的暴露史，以便将诱导的表观遗传效应与当前认为的复杂疾病的遗传和环境因素区分开来。我们的观察为代谢表型的跨代重编程提供了一个近交哺乳动物模型，该模型将能够解剖重编程所需的暴露历史，对重编程所涉及的机制进行遗传分析，并提出了一些可能成为表观遗传重编程直接靶点的特定途径。

实验程序

老鼠饲养

所有动物护理和使用程序均符合机构动物护理和使用委员会的指导方针。C57/Bl6小鼠取自Jackson实验室和Charles River实验室（用于本实验的不同迭代）。所有实验都是用用控制饮食饲养至少两代的小鼠进行的，以尽量减少从动物提供者提供的食物过渡到控制饮食的任何跨代影响。对于所有显示的比较，雄性小鼠在21天大的时候从母亲那里断奶，兄弟雄性小鼠被放在低蛋白或控制饮食的笼子里（用水润湿，让小鼠打破硬颗粒）。雌性断奶后控制饮食。雄性大鼠在9-12周龄之前一直在饮食中喂养，然后与雌性大鼠一起放置一到两天。对照组和低蛋白交配笼总是相互穿插。请注意，我们总是使用处女，以避免混淆雌性产仔数的影响，尽管这会导致许多产仔丢失，因为第一胎往往是由它们的母亲消耗的。一到两天后，雄性被移走，怀孕的雌性被单独留下来进行控制饮食和牧羊舍，直到它们的幼崽三周大。在三周大时，用异氟醚和颈椎脱位处死子代，迅速解剖肝脏中叶，并在N液体中骤冷2.

饮食

膳食来源于Bio-serv，成分列于表S7在大多数实验中，只有低蛋白饮食在Bio-serv按照标准方案进行了消毒。在随后的实验中，这两种饮食都进行了消毒。

RNA提取

肝脏样本用液态N2冷却研钵和杵研磨。使用Trizol从肝粉中提取用于微阵列分析的总RNA。

微阵列杂交

使用4μg随机六聚体和4μg寡核苷酸dT在42℃下用Superscript II逆转录酶标记30μg总RNA 2小时。将Cy3和Cy5标记的样品与家庭用“MEEBO”微阵列杂交。MEEBO信息可访问http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GPL6352将微阵列在65℃下杂交16小时，如前所述洗涤(Diehn等人，2002年)，并使用Axon Genepix 4000B微阵列扫描仪进行扫描。

数据可用性

本研究中使用的所有微阵列数据和深度测序数据均已存入GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/)，注册号GSE25899。

与公开小鼠肝脏微阵列数据的比较

我们建立了一个公共微阵列数据概要，包括在各种条件和遗传扰动下小鼠肝脏中120个基因表达谱。差异表达基因的特征使用两个单尾t检验的组合来确定，FDR校正为0.1。在低蛋白后代中，上调或下调基因显著丰富的剖面由超几何定义第页-多个假设修正后的值<=0.05(第页<0.00025).

血脂测量

将来自六只动物（三对）的约50–100 mg研磨肝组织送往Lipomics，以“Truemass”质谱表征450个脂质水平(表S4). 请注意，样品73-1和76-1来自PBS灌注的肝脏，而其他四个样品在未灌注的情况下进行解剖。

小RNA克隆和测序

使用mirVana（Ambion）从地面肝组织中分离总RNA。从100μg总RNA中纯化18–35 nt小RNA，连接到适配器，扩增、凝胶纯化，并使用Solexa基因组分析仪（Illumina）测序(Ghildiyal等人，2008年).

RRBS公司

如前所述，进行了减少代表性的亚硫酸氢盐测序(Meissner等人，2008年). 数据可在http://frience-ypigenome.computational-epigenetics.org

精子分离

将处死动物的尾部附睾解剖，穿刺，并在37 C的M2培养基（Sigma）中培养30分钟。取上清液，造粒（3000g，5分钟），用PBS洗涤2倍，1倍于水，并在体细胞溶解缓冲液中培养。仅使用经显微镜评估纯度>99.5%的精子制剂，根据附睾特异性基因之间的比率，q-RT-PCR也用于拒绝任何精子样本演员b>或我的11与精子特异基因相比Smcp公司或奇数1(图S6).

MeDIP公司

甲基-DNA免疫沉淀基本上如所述进行(韦伯等人，2005年;Weber等人，2007年). 使用Covaris机器将4μg纯化的基因组DNA片段化为平均大小300bp，变性，并用5mC抗体（Eurogentec）免疫沉淀。对ChIP材料进行了Solexa测序，每个库具有约2100万个唯一可映射的读取。

补充材料

01

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致谢

我们感谢D.Haig对本实验的初步讨论，感谢K.Ahmad、P.Kaufman、C.Meiklejohn、Y.Nahmias和Rando实验室成员对手稿的批判性阅读。OJR部分获得了Burroughs Wellcome基金会生物医学科学职业奖、NIGMS马瑟斯基金会GM088618资助，是麻省大学糖尿病内分泌学研究中心（DK32520）的成员。NF得到了NIH和美国-以色列两国科学基金会（BSF）的资助。HAH由美国国家科学基金会、阿尔弗雷德·斯隆基金会奖学金、德怀特·怀特和布兰奇·费耶·里德系统和进化生物学百年奖学金资助。PDZ由NIGMS拨款GM62862和GM65236支持。NH得到了美丹奖学金的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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